Спосіб отримання реагенту для визначення т-супресорів людини

Спосіб отримання реагенту для визначення Тсупресорів людини шляхом фіксації еритроцитів кролика глютаральдепдом, який відрізняється тим, що обробку еритроцитів кролика здійснюють 2% розчином глютаральдепду протягом ЗО хвилин на крижаній бані з подальшим відмиванням еритроцитів тричі у фізіологічному розчині шляхом центрифугування по 15 хвилин при 1500 об/хв, потім тричі дистильованою водою, потім з фіксованих еритроцитів готують на фізіологічному розчині 0,5% суспензію Изобретение относится к области клинической иммунологии, а именно к иммунодиагностике и может быть использовано в работе практических иммунологических лабораторий для определения Т - супрессоров человека несущих на своей поверхности рецепторы к эритроцитам кролика Определение Т - супрессоров, наряду с основными видами иммунокомпетентных клеток, важно потому, что активация Т - супрессоров при дисбалансе с Т - В - лимфоцитами общих популяций является указанием на угрозу нарушения противовирусной и противобактериальной защиты, а снижение Т - супрессорного потенциала при дисбалансе с названными лимфоцитами может указывать на развитие аутоиммунных процессов Свойства лимфоцитов связывать эритроциты различных видов животных делают возможным выявлять различные популяции и субпопуляции этих клеток, присоединяя к поверхности рецепторов лимфоцитов соответствующий рецептору вид эритроцитов (реакция розеткообразования) У Т - супрессоров на поверхности есть рецептор для IgG, для выявления которого необходима соответствующая обработка эритроцитов быка IgG против этого вида эритроцитов (Павлюк А,С , Крюков В В , Петров Р В и др , 1982, 121, Новиков Д К , 1987, /3/) Метод трудоемок, длителен и малодоступен для практического применения В последние годы стало известно, что эритроциты кролика могут использоваться в реакции розеткообразования для определения Т - клеток супрессоров, так как кроличьи эритроциты присоединяются к лимфоцитам человека, несущим на своей поверхности, помимо рецепторов к эритроцитам кролика, рецепторы IgG, что относит их к Т супрессорной субпопулящи /3/ Т - супрессоры, предлагаемые авторами изобретения, также обладают рецепторами для IgG, что относит их к Т - супрессорной субпопуляции, но также имеют рецепторы для эритроцитов кролика, что делает доступным их для выявления в реакции розеткообразования с эритроцитами кролика, минуя длительный и сложный путь выявления этих клеток путем связывания Т - лимфоцита с эритроцитом через IgG - рецептор, Прототипом изобретения является способ фиксации эритроцитов кролика, предложенный Лещинской Л Ц и Каральником В,В , 1983, /4/ для определения Е - РОК у морских свинок Сущность прототипа заключается в том, что фиксацию осуществляют ацетальдегидом, смешивая равные объемы 18% взвеси отмытых фосфатным буфером нативных эритроцитов кролика и предварительно нейтрализованного едким натром (рН-7,2) раствора, ацетальдегида в концентрации 3,6 - 7,2, смесь инкубируют при 20° С в течении 10 суток, а затем используют в реакции розеткообразования с лимфоцитами морской свинки для определения числа Е - РОК Число Е РОК с фиксированными ацеталъдегидом эритроцитами кролика сравнивают с числом Е - РОК, образованных с нативными эритроцитами Эритроциты, фиксированные в указанном режиме, О о о (О ю 52600 обеспечивают определение Е - РОК морской свинки с той же чувствительностью, что и нативные эритроциты К недостаткам прототипа следует отнести 1) предварительную обработку фиксатора, 2) длительность технического решения - 10 суток контакта эритроцитов кролика с фиксатором, 3) ограниченность области его применения Способ (Bmg D Н , Weyand J G , Stavitsky А В , 1967, /1/), предложенный для фиксации эритроцитов барана, более прост в техническом решении, однако авторы прототипа /4/ не смогли его использовать, поскольку обработка глутаральдегидом эритроцитов кролика приводила к утере ими способности образовывать розетки с лимфоцитами морской свинки В иммунодиагностике практических иммунологических лабораторий большое значение имеет стабильный реагент для определения Т - супрессоров человека, несущих на своей поверхности рецепторы к эритроцитам кролика В основу изобретения поставлена задача упростить способ фиксации эритроцитов кролика, получить стабильный реагент, который обеспечил бы тождественность результатов определения относительного числа Т - супрессоров в реакции розеткообразования с эритроцитами кролика, фиксированными предлагаемым способом и полученным при использовании нативных эритроцитов, изменить область применения реагента с целью использования его в иммунодиагностике для определения Т - супрессоров иммунной системы человека Поставленная задача достигается тем, что способ (Bmg D Н ,et al , 1967, /1/), предложенный для фиксации глутаральдегидом эритроцитов барана, модифицирован нами для эритроцитов кролика, применив для более надежного связывания эритроцитов с лимфоцитами 2% раствор фиксатора вместо 0,5%, снизили скорость отмывания эритроцитов центрифугированием от глутаральдегида в 2 раза и время их осаждения с целью сохранения целостности мембранно - рецепторного аппарата эритроцитов кролика При таком режиме эритроциты кролика не лизируются длительное время и не теряют способность образовывать розетки, т е получен стабильный реагент для определения Т - супрессоров человека Одновременно упрощается метод получения реагента за счет использования нового компонента - глутаральдегида - изменения его концентрации и условий фиксации, а также области применения полученного реагента Использование в качестве фиксатора глутаральдегида предлагаемым способом позволяет сократить следующие операции по сравнению с прототипом время фиксации эритроцитов кролика с 10 дней до 1 дня и использование их для выявления количества Т - супрессоров в день приготовления Способ осуществляют следующим образом кровь от трех кроликов собирают в пул, ресуспендируют в растворе Алсевера 1 1, центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин , осадок трижды отмывают в 0,15 М физиологическом растворе, осадок эритроцитов помещают в ледяную баню при 4° С Глутаральдегид разводят фосфатным буфером с рН - 8,2 (1 объем 0,15 М Na3P04 x 12Н20, 9 объемов 0,15 М NaCI и 5 объемов дистиллированной воды) до 2% концентрации Эритроциты кролика разводят 2% раствором глутаральдегида на фосфатном буфере до 2% концентрации, помещают на 30 минут в ледяную баню при 4° С, периодически встряхивают для лучшего контакта эритроцитов с глутаральдегидом После окончания фиксации эритроциты отмывают 3 раза в 0,15 М физиологическом растворе центрифугированием при 1500 об/мин, при комнатной температуре - от глутаральдегида, а затем, при тех же условиях, еще 3 раза в дистиллированной воде Осадок эритроцитов ресуспендируют в дистилированной воде и хранят при 4° С (можно при добавлении консерванта, но желательно без последнего, для чего все растворы и посуда долнжы быть стерилизованы) Использование стабилизированных глутаральдегидом эритроцитов кролика для выявления Т - супрессоров дает более стабильные результаты, не зависящие от изменения рецепторного аппарата нативных эритроцитов и его свойств в зависимости от пола, возраста, условий содержания животного, сезонных изменений и других внешних и внутренних факторов Работа с одной и той же серией стабилизированного реагента позволяет сравнивать результаты в динамике исследования, а также сопоставлять данные, получаемые в разных лабораториях До настоящего времени применение глутрадьдегида в качестве фиксатора эритроцитов кролика и сам способ фиксации использованы не были Фиксация эритроцитов кролика предлагаемым способом делает их устойчивыми к внешним воздействиям и сохраняет их рецепторную активность на протяжении длительного времени, достоверно сходную с активностью нативных эритроцитов, что видно на данных таблицы 1 по сравнительному использованию в качестве реагента для определения числа Т - супрессоров человека в реакции розеткообразования нативных и фиксированных предлагаемым способом эритроцитов кролика Процент розеткообразующих клеток, выявляемый с помощью нативных эритроцитов, практически не отличается от процента розеткообразующих клеток, выявляемых с помощью фиксированных предлагаемым способом эритроцитов кролика, так как при подсчете числа "розеток" на каждые 100 - 200 лимфоцитов допускается, принятая в иммунологии, ошибка подсчета ± 5,0% Примеры подтверждающие возможность осуществления изобретения Пример 1 У больного Ш , 20л , per №14к, с диагнозом идиопатическая кардиомиопатия (ИКМП), гипертония, лимфоциты выделяли из 5 мл гепаринизированной крови, для чего кровь разводили 1 3 физиологическим раствором хлорида натрия, наслаивали на градиент фиколл верографина с плотностью 1,077, центрифугировали при 400 G 30 - 40 мин Кольцо лимфоцитов, 52600 лежащее на границе градиента с плазмой, собизования нативных эритроцитов Осадок отмывали рали, отмывали в физиологическом растворе, редистиллированной водой и ресуспендировали его суспендировали в среде 199 до концентрации 2 х в 2 - 3 каплях дистиллированной воды, после чего 106 кл/мл и использовали эту взвесь для постаподсчитывали число "розеток" на 100 - 200 лимновки реакции розеткообразования с 1% нативфоцитов ными эритроцитами кролика (Велоцкий С М ,1981, Результаты реакции розеткообразования /5/) и, параллельно, с 1% фиксированными предпредставлены в таблице 2, из данных которой лагаемым методом эритроцитами, для чего смевидно, что процент Т - лимфоцитов с рецепторами шивали лимфоциты и эритроциты в равном объедля эритроцитов кролика, определяемый при исме (0,1 мл) Смесь осаждали центрифугированием пользовании нативных эритроцитов, достоверно при 200 G в течении 5 мин , осадок выдерживали в не отличался от процента тех же клеток, выявлентечении 1 часа при 4° С Затем реакцию розетконых при использовании фиксированных предлаобразования прерывали добавлением 0,05 мл гаемым методом эритроцитов кролика 0,6% раствора глутаральдегида в случае испольТаблица 1 Количество Т - супрессоров у обследуемых, выявляемое в реакции розеткообразования с нативными и фиксированными предлагаемым способом эритроцитами кролика ( в % ) № серии реагента 1 Срок исследования реагента с момента приготовления в день приготовления Через 2 месяца 2 Через Одну неделю Через Две недели 3 Через 2 месяца Через 3 месяца Через 4 месяца Через 2 месяца Через 3 месяца через 4 месяца 4 Регистр № Уровень Т-супрессоров в реакции РОБ обследуемого С нативными эр С фиксированными П W кролика эр крол 22 >0,05 1д 17 2д 24 25 >0,05 Зд 27 31 >0,05 5д 5 8 >0,05 6д 22 22 >0,05 2 >0,05 1к 2 2к 3 11 0,05 Юк 5 4 >0,05 4к 2 3 >0,05 5к 5 6 >0,05 7к 1 1 >0,05 8к 4 5 >0,05 222д 2 1 >0,05 5 4 >0,05 7 4 >0,05 222д 2 5 >0,05 5 8 >0,05 7 9 >0,05 Примечания реакция РОВ - реакция розеткообразования, "д" - донор, "к" - кардиологический больной Таблица 2 Уровень Т - супрессоров больного Ш в реакции розеткообразования с нативными и фиксированными предлагаемым способом эритроцитами кролика Диагноз ИКМП Доверительные границы нормы N серии реагента 5 % Т-лимфоцитов с рецепторами к эритроцитам кролика нативным эритр, (фиксированным эритр) Р 5 7 >0,05 Пример 2, 3 выполнялись аналогичными способами Пример 2 У донора крови М , 39 лет, per № 49д, в анамнезе - грипп, осложнившийся инфекци 5,3-8,4 (56чел Д95) онно - аллергическим полиартритом, исследовали уровень Т - супрессоров в реакции розеткообразования с на-тивными и фиксированными предлагаемым способом эритроцитами кролика 7 52600 8 Результаты исследования, представленные в была в пределах ошибки подсчета ( ± 5,0% ) И в таблице 3, указывают, что процент РОК с нативтом и другом случае был зафиксирован повышенными и фиксированными эритроцитами достоверный уровень Т - супрессоров но не отличался, так как разность между ними Таблица 3 Уровень Т - супрессоров у донора крови М в реакции розеткообразования с нативными и фиксированными предлагаемым способом эритроцитами кролика Диагноз Инфекц аллерг полиар-трит Доверит границы нормы N серии реагента 6 % Т- лимфоцитов с рецепторами к эритроцитам кролика нативным эритр фиксированным эритр Р 15,0 10,0 >0,05 53-84 (56 чел ,Д95) Пример 3 У больного Б , 27 лет, per № 4к с диагнозом идиопатическая кардиомиопатия, исследовали уровень Т - супрессоров в реакции розеткообразования с нативными и фиксированными предлагаемым способом эритроцитами кролика В таблице 4 представлены результаты реак ции розеткообразования, которые показали характерное для этого заболевания снижение Т - супрессоров активности (по сравнению с нормой) как при использовании нативных, так и при применении фиксированных эритроцитов кролика, что подтверждается данными статистического анализа Таблица 4 Уровень Т - супрессоров у больного В в реакции розеткообразования с нативными и фиксированными предлагаемым способом эритроцитами кролика Диагноз ИКМП Доверит границы нормы N серии реагента 2 % Т- лимфоцитов с рецепторами к эритроцитам кролика нативным эритр фиксированным эритр Р 2,0 3,0 >0,05 5,3-8,4 (56 чел ,Д95) Приведенные примера иллюстрируют тождественность результатов определения относительного числа Т-супрессоров в реакции розеткообразования с эритроцитами кролика, фиксированными предлагаемым способом, результатам, полученным при использовании нативных эритроцитов Таким образом, предлагаемый способ получения стабильного реагента для выявления Т - супрессоров человека обладает следующими преимуществами по сравнению с прототипом 1) упрощает способ фиксации эритроцитов, 2) сокращает время фиксации с 10 дней до 1 Дня, 3) изменяет область применения фиксированных кроличьих эритроцитов, что позволяет в условиях практических лабораторий определять Т супрессорный потенциал иммунной системы человека СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 Bmg D Н , Weyand J G Stavitsky А В Неmagglutmation with aldehyde - fixed erythrocytes for assay of antigens and antibodies - Proc Soo exp Biol (NY), 1967, v124, 4 - P 1166-1170 2 Павлюк А С , Крюков Б В , Петров Р В и др Оценка субпопуляций Т - лимфоцитов у человека Т - супрессоры и Т -помощники /Методические рекомендации М , 1982, МЗРСФСР - 28 с 3 Новиков Д К Справочник по клинической иммунологии и аллергологии / Минск, "Беларусь", 1987-с 165-169 4 Лещинская Л П , Каральник Б В Стабильный реагент для определения Е - розеткообразующих клеток у морских свинок/ Иммунология 1983, N6 -с 73-74 5 Белоцкий С М Методы оценки функции фагоцитов и состояние Т - и В - систем иммунитета при гнойной хирургической инфекции/ Методические рекомендации Института хирургии им А В Вишневского М , 1981 -27 с ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24