Засіб для визначення супресорної ланки імунного статусу людини та спосіб визначення супресорної ланки імунного статусу людини

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Применение трофобластического бета-1-гликопротеина (ТБГ) в качестве средства для определения супрессорного звена иммунного статуса человека,

2. Способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека, включающий сбор периферической крови, получение суспензии мононуклеарных клеток (МНК), деление их на две равные части, культивирование МНК первой из частей без активатора супрессоров, а второй - с активатором супрессоров, отмывание МНК от среды культивирования, блокировку пролиферации, добавление в каждую из частей МНК свежевыделенных МНК здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином в равных соотношениях для получения тест-культур, культивирование их, последующую оценку пролиферации тест-культур и определение величины супрессии по соотношению уровней пролиферации в тест-культуре, отличающийся тем, что в качестве активатора супрессоров используют трофобластический бета-1-гликопротеин (ТБГ), причем ТБГ используют в дозах от 3 до 120мкг на мл суспензии МНК.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что суспензию МНК готовят из клеток, полученных в результате разделения в одноступенчатом градиенте фиколл-уротраст.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование МНК осуществляют 48ч.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что блокировку пролиферации осуществляют путем обработки МНК митомицином C.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование каждой из тест-культур проводят в течение 72ч.

Текст

1. Применение трофобластического бета-1-гликопротеина (ТБГ) в качестве средства для определения супрессорного звена иммунного статуса человека. 2. Способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека, включающий сбор периферической крови, получение суспензии мононуклеарных клеток (МНК), деление их на две равные части, культивирование МНК первой из частей без активатора супрессоров, а второй - с активатором супрессоров, отмы вание МНК от среды культивирования, блокировку пролиферации, добавление в каждую из частей МНК свежевыделенных МНК здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином в равных соотношениях для получения тест-культур, культивирование их, последующую оценку пролиферации тест-культур и определение величины супрессии по соотношению уровней пролиферации в тест-культуре, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве активатора супрессоров используют трофобластический бета-1-гликопротеин (ТБГ), причем ТБГ используют в дозах от 3 до 120 мкг на мл суспензии МНК. 3. Способ по п. 2, отличающ и й с я тем, что суспензию МНК готовят из клеток, полученных в результате разделения в одноступенчатом градиенте фиколл-уротраст. 4. Способ по п. 2, о т л и ч а гащ и й с я тем, что культивирование МНК осуществляют 48 ч. 5. Способ по п. 2, отличающ и й с я тем, что блокировку пролиферации осуществляют путем обработки МНК митомицином С. 6. Способ по п. 2, отличающ и й с я тем, что культивирование каждой из тест-культур проводят в течение 72 ч. Изобретение относится к области медицины. Более точно оно касается методов диагностической оценки активности Т-супрессоров, а именно к способу определения супрессорного звена иммунного статуса человека и в средствам реализации этих способов. Известен препарат бета-1-гликопротеин плацентарного происхождения, являющийся аналогом трофобластического 26940 бета-1-гликопротеина (ТБГ), который применяют в качестве стимулятора роста и пролиферации гематопоэтических кроветворных клеток (Патент США № 5169835, кл. А 61 К 35/50 от 1989 г.). Однако - известный препарат не используют для определения супрессорного звена иммунного статуса человека. Известно применение ТБГ в диагностике и прогнозе течения беременности (Сотникова Л.Г. и др. "Роль бета-1-гликопротеина трофобласта в диагностике и прогнозе течения беременности". Методические рекомендации. М., 1984). Однако в этой работе не раскрыты возможности использования ТБГ для определения супрессорного звена иммунного статуса человека. Известен способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека, включающий сбор периферической крови, получение суспензии чистых лимфоцитов для культивирования тест-культур с активатором супрессии и без него и дальнейшей оценки уровней пролиферации f 1}. Однако известный способ требует ис пользования в качестве активатора супрессии дефицитного и дорогостоящего импортного препарата - конканавалина А. Известен способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека» включающий сбор периферической крови, получение суспензии мононуклеарных клеток (МНК), деление их на две равные части, культивирование МНК первой из частей без активатора супрессоров, а второй -с активатором супрессоров, отмывание МНК от среды культивирования и блокировку пролиферации, добавление в каждую из частей МНК свежевыделенной МНК здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином в равных соотношениях для получения тест-культуРі культивирование их, последующую оценку пролиферации тест-культур и определение величины супрессии по соотношению уровней пролиферации в тест-культурах (см. Bv Lien Shov, Stanley A. Schwartz and Robert A. Good, Suppressor cell activity after concanavaiin A treatment of lymphocytes from normal donors. J. Exp. Med., 1976, v. 143, N 5, p. 1100-1110). Однако и этот известный способ требует использования дефицитного дорогостоящего импортного продукта - конканавалина А. В основу изобретения положена задача удешевления процесса определения супрессорной активности иммунного статуса человека путем использования неде» 5 10 Т5 20 25 30 35 40 45 50 55 фицитного препарата, обладающего иммуннокорригирующими свойствами и не вызывающего аллергических реакций. Эта задача решается тем, что в качестве средства для определения супрессорного звена иммунного статуса человека применяют 6ета-1-гликопротеин (ТБГ), а в способе определения супрессорного звена иммунного статуса человека, включающем сбор периферической крови, получение суспензии МНК, деление их на две равные части, культивирование МНК первой из частей без активатора супрессоров, а второй - с активатором супрессоров, отмывание МНК от среды культивирования, блокировку пролиферации, добавление в каждую из частей МНК свежевыделенных МНК здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином в равных соотношениях для получения тесткультур, культивирование их, последующую оценку пролиферации тест-культур и определение величины супрессии по соотношению уровней пролиферации в тесткультурах, согласно изобретению в качестве активатора супрессоров используют трофобластический бета-1 -гликопротеин (ТБГ), который используют в дозах от 3 до 120 мкг на t мл суспензии МНК. Суспензия МНК может быть приготовлена из клеток, полученных в результате разделения в одноступенчатом градиенте фиколл-уротраст, при этом культивирование МНК осуществляют 48 ч. Блокировку пролиферации можно осуществлять путем обработки МНК митомицином С, а культивирование каждой из тест-культур проводить в течение 72 ч. Экспериментальным и клиническим путем установлены новые свойства ТБГ как активатора супрессоров, пригодного для определения супрессорного звена иммунного статуса человека. Предпочтительный вариант осуществления изобретения. На первом этапе суспензии МНК готовят из клеток, полученных в результате разделения в одноступенчатом градиенте фиколл-уротраст (метод Boyum). Периферическую кровь берут у диагностируемого больного путем венопункции в одно и то же время и помещают в пробирки с раствором гепарина из расчета f мл крови - 20-30 единиц гепарина. Далее кровь разводят раствором Хэнкса в соотношении 1:2 без Са++ и Мд + + и наслаивают на градиент фиколл-уротраст (плотность 1,078). Затем производят центрифугирование в режиме 400д в течение 30 мин. Взвесь 26940 МНК из интерфазы переносят в центрифужную пробирку, добавляют раствор Хэнкса без Са ++ и Мд + + и производят 3 последовательных центрифугирования по 10 мин для отмывания клеток от раствора фиколл-уротраст. После 3-го центрифугирования осадок МНК ресуспензируют в 1 мл среды 199 и подсчитывают количество мононуклеарных клеток (МНК) с помощью камеры Горяева. На втором этапе МНК делят на две равные части, первую из которых культивируют без активатора супрессоров, вторую - с активатором супрессоров, в качестве которого используют трофобластический бета-1-гликопротеин (ТБГ). МНК культивируют в пенициллиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками No 14,5 при 37°С. Среда культивирования РРШ-1640 с добавлением 20% сыворотки IV (АВ) группы и глютамина 300 мг. В каждой флаконе культивируют 5x10* клеток в 2,0 мл полной среды. S культуре для индукции супрессоров добавляют ТБГ в дозах 3-120 мкг. Культивирование клеток осуществляют 48 ч. После этого МНК отмывают от среды культивирования и осуществляют блокировку пролиферации путем обработки митомицином С - 40 мкг/мл в течение 30 мин при 37°С. Затем отмывают средой 199 с 5% сыворотки IV (АВ) (охлажденной) трижды. Осадок клеток ресуспенди5 руют, подсчитывают количество ядросодержащих клеток» определяют процент жизнеспособности клеток с помощью 0,1% трипанового синего раствора и разводят до необходимой концентрации. При этом 10 все операции делают раздельно с контрольными клетками и со стимулированными ТБГ, а для отмывания клеток используют силиконированную посуду. 15 На следующем этапе в каждую из частей контрольных и стимулированных ТБГ лимфоцитов добавляют свежевыделенные лимфоциты здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином 20 (ФГА), которые служат отвечающими тестклетками в равных соотношениях (0,5x10* : 0,5x106 клеток/мл) для получения тесткультур. Культивирование их проводят в течение 72 ч. После этого с помощью Н325 митидина оценивают пролиферацию тесткультур и о величине супрессии судят по степени снижения пролиферации в них. Индекс супрессии (ИС) определяют по формуле 30 ИС = И число имп/мин в тест-культуре с ТБГ \ . IQQ% * " число имп/мин в тест-культуре без ТБГ Для оценки супрессорного звена здорового человека были проведены диагностические исследования по ранее известной методике и предлагаемому способу на группе здоровых лиц - 100 человек. На основании полученных результатов норма активности Т-супрессоров при индукции конканавалином А составляет 56,8% ± 4%, а по предлагаемому способу - 63,4% ± 4,7%. П р и м е р 1. Больной В., 30 лет, поступил в клинику с диагнозом рассеянный склероз - цереброспинальная форма, находясь в стадии обострения процесса. Активность Т-супрессоров периферической крови при индукции конканавалином А - 15%, определенная по ранее известной методике определения супрессорного звена иммунного статуса человека. Одновременно по предлагаемой методике определяли активность Т-супрессоров периферической крови этого же больного при индукции ТБГ, которая составила 17%. П р и м е р 2. Больная С , 40 лет, поступила в клинику с диагнозом рас 35 сеянный склероз - цереброспинальная форма, находясь в стадии обострения. Активность Т-супрессоров периферической крови при индукции конканавалином А 16% при известном способе диагностики. 40 Одновременно по предлагаемой методике определяли активность Т-супрессоров этой же больной при индукции ТБГ, которая составила 19%. Проведена диагностика 150 больных 45 с рассеянным склерозом и ревматоидным артритом. Отмечено, что активность t-супрессоров при определении предлагаемым способом соответствует известному способу определения. 50 Таким образом, доказана высокая эффективность препарата ТБГ в качестве средства для определения супрессорного звена иммунного статуса человека. Изложенные преимущества предлагае55 мого способа определения супрессорного звена иммунного статуса человека и средств для его осуществления обеспечивают им возможности широкого применения как в научных исследованиях, так и в практической деятельности. 26940 Причем следует указать, что использование конканавалина А для лечения вышеуказанных заболеваний противопоказано из-за его токсичности, в то время как ТБГ, вырабатываемый трофоб- 5 8 ластом человека, не обладает токсичностью и не вызывает аллергической реакции. Это делает возможным его использование также и в качестве лечебного препарата. Упорядник Техред М. Келемеш Коректор М.Куль Замовлення 540 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

The mean for determiantion of a suppressor link of human immune status and the method for determination of a suppressor link of human immune status

Автори англійською

Holovistikov Ivan Nikolaevich, Alikhanov Khallar Abdumuslimovich, Kacharava Leonid Yazonovich

Назва патенту російською

Средство для определния супрессорного звена иммунного статуса человека и способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека

Автори російською

Головистиков Иван Николаевич, Алиханов Халлар Абдумуслимович, Качарава Леонид Язонович

МПК / Мітки

МПК: C12Q 1/02, G01N 33/50, G01N 33/74, G01N 33/68

Мітки: засіб, спосіб, статусу, імунного, людини, супресорної, визначення, ланки

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/4-26940-zasib-dlya-viznachennya-supresorno-lanki-imunnogo-statusu-lyudini-ta-sposib-viznachennya-supresorno-lanki-imunnogo-statusu-lyudini.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Засіб для визначення супресорної ланки імунного статусу людини та спосіб визначення супресорної ланки імунного статусу людини</a>

Подібні патенти