Спосіб визначення стану рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин

1. Спосіб визначення стану рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин, що включає оцінку фізіологічного стану рослини та оцінку впливу екологічних факторів за біологічним показ 3 Недоліком відомого способу є можливість його застосування тільки для певного виду рослин, а саме яблуні. З іншого боку, стан рослинного організму характеризує природні або антропогенні фактори, що впливають на неї, і може застосовуватись для оцінки умов довкілля. Наприклад, для оцінки якості середовища запропоновано ряд методів біотестування з використанням рослинних організмів: Морфологічний підхід: - біотестування забруднення води за допомогою ряски малої (Lemna minor L); Фізіологічний підхід: - визначення якості води за зміною біомаси хлорели; - використання кисневої продуктивності водоростей для виявлення токсикантів; - використання ростових властивостей відрізків колеоптилів для визначення забруднення середовища важкими металами. Генетичний підхід: - виявлення аберацій хромосом в клітинах кореневої меристеми рослин для індикації мутагенів; - використання традесканції для оцінки мутагенної та токсичної дії факторів навколишнього середовища ([3]; - використання деревних рослин для фітоіндикації зовнішнього середовища (О. А. Неверова. Экологическая оценка состояния древесных растений и загрязнений окружающей среды промышленного города: Дис, д-ра биол. наук: 03.00.16 : Кемерово, 2004, 358 с. РГБ ОД, 71:05-3/33, [5]). Проте кожен з цих методів має певні обмеження. Так, ряд методів призначений тільки для водної рослинності. Крім того, практично всі зазначені методи спрямовані на виявлення дії токсикантів і мутагенів за порушеннями на генетичному або морфологічному рівнях, тобто після необоротного пошкодження організму, що тестується, і не вирішують завдання ранньої індикації стресового стану. Найбільш близьким є спосіб визначення стану рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин, що включає оцінку фізіологічного стану рослини та оцінку впливу екологічних факторів за біологічним показником зразку рослини, що знаходиться під впливом цих екологічних факторів, в якому як біологічний показник використовують активність пероксидази берези повислої [5]). Недоліками такого методу є неможливість вирішувати завдання ранньої індикації стресового стану через значні зміни ферментної активності при транспортуванні зразків рослинного матеріалу до лабораторії, а також прив'язаність до конкретного виду рослини. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу визначення стану рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин, в якому за рахунок запропонованих дій і умов їх проведення забезпечується можливість ранньої індикації стресового стану будь-якої рослини. Поставлена задача вирішується запропонованим способом визначення стану рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин, що включає оцінку фізіологічного стану рослини та оцінку 65170 4 впливу екологічних факторів за біологічним показником зразку рослини, що знаходиться під впливом цих екологічних факторів, в якому як біологічний показник використовують вміст білків теплового шоку 70 кДа (heat shock proteins 70 kDa, Hsp70) у зразку рослини, визначений шляхом імунодетекції. Як зразок рослини використовують листя рослини. Для імунодетекції використовують моноклональні антитіла, які є специфічними до білків теплового шоку 70 кДа широкого кола організмів, включаючи рослинні. В результаті запропонованого використання як біологічного показника вміст білків теплового шоку 70 кДа у зразку рослини, визначений шляхом імунодетекції вирішується складне питання ранньої діагностики стресового стану рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин. При цьому використання білків теплового шоку 70 кДа та їх імунодетекція за допомогою первинних антитіл, специфічних до білків теплового шоку 70 кДа широкого кола організмів, включаючи рослинні, робить можливою оцінку стану широкого кола видів рослин, різних за своєю екологією - наземних, повітряно-водних і водних. Результати тестування рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин з використанням способу, який заявляється, можуть застосовуватися для біоіндикації змін факторів довкілля, несприятливих для рослин. Як варіант виконання, проводиться за загальноприйнятими методиками імуноблотингу (Western-blotting), який включає наступні етапи: 1) електрофоретичний розподіл білків зразку рослинного матеріалу в поліакриламідному гелі у денатуруючих умовах; 2) перенос розподілених білків з поліакриламідного гелю на мембрану (наприклад, нітроцелюлозну); 3) імунодетекцію білків теплового шоку 70 кДа на мембрані з використанням моноклональних антитіл, специфічних до білків теплового шоку 70 кДа широкого кола організмів, включаючи рослинні, вторинних антитіл, специфічних до первинних антитіл, та візуалізацію вторинних антитіл. Запропонований спосіб здійснюється таким чином: - зі зразку рослинного матеріалу (листя) екстрагують білки відомим способом; - в екстракті визначають концентрацію сумарного білка одним з відомих способів; - певний об'єм білкового розчину, який містить достатню кількість сумарного білка (від 10 до 100 мкг в залежності від розміру електрофоретичного приладу) наносять на поліакриламідний гель; - електрофоретичний розподіл білків здійснюють у поліакриламідному гелі у денатуруючих умовах (Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - 227 (5259)/ - P. 680 [6]); - проводять перенос білків з поліакриламідного гелю на нітроцелюлозну мембрану; - проводять імунодетекцію білків теплового шоку 70 кДа на мембрані з використанням первинних антитіл, специфічних до білків теплового шоку 70 кДа широкого кола організмів, включаючи рос 5 линні. З первинними антитілами, зв'язаними з білком теплового шоку 70 кДа, зв'язують вторинні антитіла, вибір яких залежить від обраного способу візуалізації. Для візуалізації рекомендується використання авідин-біотинової системи, ферментативної детекції або хемілюмінесцентної детекції. Відпрацювання способу визначення стану рослин природних екоценозів та інтродукованих рослин проводили на ряді видів покритонасінних рослин, різних за своєю екологією: мальва пульхелла (Malva pulchella, сорт Сильва) і мальва лісова (Malva sylvestris, сорт Красавка), верба пурпурова (Salix purpurea L), вех широколистний (Sium latifolium L), епіпремнум золотистий (Epipremnum aureum Linden & Andre), щитолистник мутовчастий (Hydrocotyle verticillata Thunb) та інших. Рослини досліджувалися за умов впливу водного дефіциту, затоплення і теплового стресу в природних умовах або в експерименті. Оцінку стану рослин здійснювали таким чином. Заморожений рослинний матеріал гомогенізували в замороженій порцеляновій ступці з буфером для екстракції (склад буферу: 25 мМ ТрисНСl, рН 8,0, 20 мМ NaCl, 1 мМ Na-EDTA, 1 мМ фенілметилсульфонілфлуорид) у співвідношенні 200 мкл на 100 мкг рослинного матеріалу. Гомогенат центрифугували 15 хв. при 6000 об./хв. і температурі 4 °С. Аліквоту екстракту змішували у співвідношенні 1:1 з буфером (склад буферу: 0,125 М Трис-НСl, рН 6,8, 4 % мас. додецилсульфат натрію, 20 % мас. гліцерин і 5 % об. меркаптоетанол). Електрофоретичний розподіл білків здійснювали у поліакриламідному гелю (10 %-ному) у денатуруючих умовах на приладу Hoeffer Studier II. На гель наносили по 30-50 мкг білка кожного зразку. Електрофоретичний розподіл білків проводили за режимом: 20 і 30 мА при проходженні зразками концентруючого і розподіляючого гелю відповідно ([6]). Контроль білка у зразку здійснювали забарвленням Кумасі. Для проведення імуноблотингу білки з поліакриламідного гелю переносили на нітроцелюлозну мембрану в трансблотері. Ефективність перенесення білків контролювали забарвленням білків на мембрані розчином Понсо С (Ponceau S). Імунодетекцію білка теплового шоку Hsp 70 здійснювали на мембрані з використанням моноклональних мишачих антитіл (N H5147, Sigma), які є специфічними до білків теплового шоку 70 кДа широкого кола організмів, включаючи рослинні. Інкубацію з мишачими антитілами, розведеними у співвідношенні 1:400 у 1 %-му розчині сухого молока у фосфатно-сольовому буфері (рН 7,4) при кімнатній температурі протягом 2 годин або при 4 °С протягом ночі. Для візуалізації первинних антитіл, зв'язаних з білком теплового шоку 70 кДа, використовували вторинні антитіла, а саме кон'юговані з біотином кролячі антитіла, зв'язані з комплексом авідинпероксидаза (N B8520, Sigma). Суть корисної моделі, яка заявляється, пояснюється прикладами та графічними зображеннями. На графічних зображеннях показано: 65170 6 Фіг. 1 - Вестерн-блот-аналіз білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) (а) і фрагмент електрофореграм сумарного білка як контроль завантаження білка на гель (б) листків Salix purpurea: 1 - на перезволоженому ґрунті (за умов поливу); 2 - без поливу за умов природного зволоження ґрунту при температурі повітря 17 °С; Фіг. 2 - Вестерн-блот-аналіз білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) листків Malva pulchella, сорт Сильва (1, 2) і Malva sylvestris, сорт Красавка (3, 4): а - Вестерн-блоти Hsp70, б - їх денситометричні сканограми, 1, 3 - за умов помірного зволоження ґрунту при температурі повітря 17 °С; 2, 4 - в посушливий період при температурі повітря 41 °С; Фіг. 3 - Вестерн-блоти білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) (а) і фрагмент електрофореграм сумарного білка як контроль завантаження білка на гель (б) листків Pistia stratioites: 1 - плаваючі рослини при температурі води 21 °С; 2 - рослини, які росли на суші при температурі повітря 20 °С; Фіг. 4. - Вестерн-блоти білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) (а) і фрагмент електрофореграм сумарного білка як контроль завантаження білка на гель (б) листків Hydrocotyle verticillata: 1 - рослини росли у воді при температурі води 21 °С; 2 - рослини росли на суші при температурі повітря 20 °С; 3 - водні рослини, інкубовані при 40 °С протягом 2 годин (тепловий стрес). Приклад 1. Верба пурпурова (Salix purpurea L, родина Salicaceae) - кущ, для якого найбільш сприятливими є пухкі та помірно зволожені суглинок та супісок. Рослини S. purpurea аналізувались за різних умов водозабезпечення при інших рівних умовах. Зразки листків S. purpurea відбирались за умов високої та помірної вологості ґрунту (вміст води в ґрунті відносно сухої маси складав відповідно 64,3 % і 28,7 %) при температурі повітря 17 °С. Визначення стану рослини S. purpurea та оцінку впливу екологічних факторів проводили за вмістом білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) у зразку рослини, визначеного шляхом імунодетекції, як описано вище. Було виявило велику кількість білка Hsp70 у рослин, які зростали за умов високої вологості ґрунту, і дуже малу його кількість за умов помірної вологості ґрунту (Фіг. 1). Таким чином, велика кількість білка Hsp70 в листках рослин S. purpurea детектувалася за умов високої вологості ґрунту, тобто за умов, які є несприятливими для цього виду за його екологічною характеристикою, і навпаки, білок був присутнім в незначній кількості за умов помірної вологості ґрунту, близьких до оптимальних для цього виду. Приклад 2. Два види мальви: мальва пульхелла і мальва лісова (Malva pulchella Bernh. і М. sylvestris L, ро 7 дина Malvaceae) - аналізувались за умов, контрастних відразу за двома факторами - вологістю ґрунту і температурою. А саме, зразки листків відбиралися за умов тривалої посухи при середній денній температурі повітря 41 °С і в умовах помірної вологості при температурі повітря 17 °С (вміст води в ґрунті 5,1 % і 30,0 % від сухої маси, відповідно). Визначення стану рослин: мальва пульхелла і мальва лісова - та оцінку впливу екологічних факторів проводили за вмістом білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) у зразку відповідної рослини, визначеного шляхом імунодетекції, як описано вище. Застосування способу, який заявляється, показало, що в обох видів мальви білок Hsp70 виявлявся за жарких посушливих умов і був відсутнім за умов помірної вологості та температури (Фіг. 2). Відомо, що підвищення температури більш, ніж на 10 °С від оптимальної для даного виду, є тепловим стресом, а вміст води в ґрунті близько 5 % водним стресом для рослини суходолу. Сумісна дія цих двох негативних факторів в природних умовах індукувала синтез білка Hsp70 у обох видів мальви, що тестувались. Приклади використання білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) для визначення стану інтродукованих рослин. Приклад 3. Водну плаваючу рослину Pistia stratioites L. (Araceae) аналізували як за умов існування у воді, оптимальних для цього виду, так і за умов росту на суходолі, де вона може вкорінюватися після пересихання водойми. Листки Р. stratioites відбирали з рослин, плаваючих у водоймі при температурі води 21 °С, та за умов росту на суші при температурі повітря 20 °С. 65170 8 Визначення стану рослини Pistia stratioites L та оцінку впливу екологічних факторів проводили за вмістом білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) у зразку рослини, визначеного шляхом імунодетекції, як описано вище. Застосування запропонованого способу показало наявність білка Hsp70 у рослин за умов росту на суходолі, які для водної рослини є стресовими (Фіг. 3, вар. 2). У плаваючих рослин цей білок не виявлявся (Фіг. 3, вар. 1). Приклад 4. Запропонований спосіб визначення стану рослин дозволив виявити більш оптимальні умови існування для повітряно-водної рослини Hydrocotyle verticillata Thunb. (Аріасеае), яка здатна рости як у прибережній водній зоні, так і на суші, що візуально визначити неможливо. Визначення стану рослини Hydrocotyle verticillata Thunb. (Apiaceae) та оцінку впливу екологічних факторів проводили за вмістом білка теплового шоку 70 кДа (Hsp70) у зразку рослини, визначеного шляхом імунодетекції, як описано вище. Застосування запропонованого способу показало наявність білка Hsp70 у рослин, які зростали в умовах суходолу, і його відсутність у рослин у воді (Фіг. 4, вар. 1, 2). У водних рослин, витриманих у воді при температурі 40 °С протягом 2 годин (тепловий стрес), показана індукція білка Hsp70 (Фіг. 4, вар. 3). Виходячи з того, що синтез цього білка індукується в клітині за стресових умов, що підтверджено для цього виду у водних рослин за умов теплового стресу, запропонований спосіб дозволив визначити, що умови зростання Н. verticillata на суші є менш сприятливими, ніж у воді. 9 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 65170 Підписне 10 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601