Спосіб забарвлення гістологічних препаратів

Реферат: UA 80457 U UA 80457 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до патологічної анатомії і гістологічної техніки, і може використовуватися для визначення планіметричних показників і результатів імуногістохімічної реакції на одному гістологічному зрізі. Мікроскопічне дослідження патологічних процесів у людини сьогодні є одним з найбільш інформативних методів діагностики [1]. При онкологічних захворюваннях діагностичне значення гістологічного дослідження є абсолютно домінуючим, оскільки від встановленого гістологічного типу пухлини безпосередньо залежить спосіб лікування і, відповідно, його ефективність [2]. Для об'єктивізації гістологічних досліджень широко використовуються методи морфометрії, які часто не тільки дають можливість встановити діагноз, а також визначити стадію хвороби або ступінь злоякісності пухлини [3]. Особливе місце у патогістологічних дослідженнях займає імуногістохімічний метод, що значно підвищив точність діагностики і змінив уявлення про форми деяких хвороб [4]. Найближчим аналогом є загальноприйнятий спосіб забарвлення гістологічних зрізів після проведення імуногістохімічної реакції (ІГХ-реакції) ядерними барвниками [Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry/ D.J. Dabbs. - 3 rd ed. - New York: Ch. Livingstone, 2010. - 941 p.] Позитивним у аналозі є те, що даний спосіб дозволяє отримати специфічну імуногістохімічну реакцію із візуалізацією основних структурних елементів тканин, що досліджуються. Недоліком аналога є те, що після ІГХ-реакції складно отримати повну, детальну картину мікроскопічної будови, яку, можна отримати загальногістологічними методами. Складнощі виникають при зіставленні між собою мікроскопічної картини препаратів, забарвлених загальногістологічними методами та після проведення ІГХ-реакції. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб забарвлення гістологічних препаратів шляхом проведення ІГХ-реакції до етапу візуалізації після хромогену, інкубації препарату в ацетатному буфері та проведенні забарвлення в модифікованому розчині азур ІІеозину, що дасть можливість якісніше оцінити не тільки ІГХ-реакцію та загальну морфологію тканинних компонентів, а й дозволить визначити поправки для співставлення гістологічної будови та морфометричних показників. Поставлена задача вирішується наступним чином: Забарвлення гістологічного зрізу після проведеної ІГХ-реакції здійснювалось в модифікованому розчині азур ІІ-еозином, який складається з розчину азуру II 0,1 % - 10 мл, розчину еозину (натрієва сіль) 0,1 % - 6 мл, розчину натрію ацетату 0,1 М - 8 мл, розчину оцтової кислоти 0,1 М - 2 мл, дистильована вода - до 100 мл, (рН 5,2,), завдяки чому візуалізуються тканинні елементи, максимально схожі з такими, що виявляються в результаті забарвлення зрізів за стандартною гістологічною методикою. Перевагами способу є чітка візуалізація не тільки ядра, а й цитоплазми клітин та елементів міжклітинної речовини. Це, при порівнянні двох серійних зрізів (забарвлених азур ІІ-еозином з та без попередньої постановки ІГХ-реакції), дає можливість оцінити ІГХ реакцію з топічною прив'язкою до конкретних клітинних елементів (наприклад у онкоцитах і виключити реакції у нормальних клітинах строми, запальної інфільтрації, тощо) та, при необхідності, визначається поправка для морфометричних параметрів (площа перерізу ядер, площа клітини, питома щільність клітин, тощо). Послідовність виконання способу: 1. Виготовляють 2 гістологічні (або, при необхідності, більше) серійні зрізи, кожний з яких монтують на окреме предметне скельце. 2. Один зріз забарвлюють за способом забарвлення азур ІІ-еозином [5] і заключають у бальзам бід покривне скельце. Результат: ядра блакитні, цитоплазма від блакитної до рожевої. 3. На іншому гістологічному зрізі проводять ІГХ реакцію (у відповідності до протоколу). 4. Зріз, на якому проведена ІГХ-реакція, промивають дистильованою водою і поміщають на 5 хв у розчин, що містить: розчин натрію ацетат 0,1 М 8 мл розчин оцтової кислоти 0,1 М 2 мл дистильована вода до 100 мл. 5. Забарвлюють гістологічні зрізи, на яких була поставлена ІГХ-реакція, протягом 2-х годин в розчині, який складається з: розчин азур II 0,1 % 10 мл розчин еозину (натрієва сіль) 6 мл 0,1 % розчин натрію ацетат 0,1 М 8 мл розчин оцтової кислоти 0,1 М 2 мл дистильована вода до 100 мл. 1 UA 80457 U 5 10 15 20 25 30 35 рН розчину барвника доводять до 5,2. Розчин готується безпосередньо перед використанням, повторне використання його не допускається. Результат: ядра клітин синього кольору, забарвлення цитоплазми варіює від блакитного до рожевого. На цьому фоні чітко візуалізується хромоген (коричневого або червоного кольору) в клітинах з позитивною ІГХреакцією. 6. Проводять морфометричні визначення однотипних тканинних утворень на зрізі, забарвленому азур ІІ-еозином та на зрізі після проведення ІГХ-реакції. Апробація способу забарвлення гістологічних препаратів проведена на базі науководослідного відділу патологічної анатомії Національного інституту раку при топічному визначенні експресії мембранного антигену CD44 у нейробластомі після проведення поліхіміотерапії. Приклад конкретного виконання 1. У хворого Ж., 2011 р.н.,(патогістологічне дослідження № 39393-401/2012 р) виявлена пухлина заочеревного простору, яка за результатами біопсії була верифікована як нейробластома. Пацієнту проведена поліхіміотерапія, після чого утворення було видалено оперативно. Патогістологічне дослідження операційного матеріалу засвідчило діагноз: "Нейробластома наднирника після лікування, з яскраво вираженим лікувальним патоморфозом". Матеріал пухлини фіксували у 10 % забуференому формаліні й ущільнили у парапласт. З отриманих блоків виготовлені серійні гістологічні зрізи товщиною 4 мкм. Один гістологічний зріз був забарвлений азур II-еозином за загальноприйнятим способом [5], інший, після постановки ІГХ-реакції з CD44 (Monoclonal Mouse Antibody to Human CD44/HCAM, Clone 156-3C11 (Diagnostic BioSystems (Mob256-05), USA)), дозабарвлений азур II-еозином за запропонованим способом. Отримані препарати вивчали та фотографували за допомогою мікроскопа Nikon Eclipse 80i з камерою DS-5SMc та блоком контролю L2 за стандартизованих умов. Обробку цифрових зображень здійснювали за допомогою системи аналізу зображення Image J 1,4. Візуальна оцінка гістологічного препарату пухлини, забарвленого азур ІІ-еозином за загальноприйнятим способом показала, що після поліхіміотерапії в пухлині виявляються множинні осередки некрозів і крововиливів, які складають до 80 % її об'єму. Між ними знаходяться невеличкі ділянки, що містять резидуальні клітини нейробластоми. Усі частини новоутворення характеризуються наявністю виразної запальної інфільтрації. Слід зазначити, що нейробластома за будовою відноситься до дрібнокруглоклітинних пухлин і наявна в ній значна кількість лімфоцитів, які схожі з клітинами пухлини і також експресують CD44, може призводити до невірної інтерпретації ІГХ-реакції та помилок в діагностиці. За цих умов принципово важливим завданням є розрізнити на препараті, де проведено виявлення експресії антигену CD44, клітини нейробластоми та лімфоцити. На препаратах пухлини, які забарвлені азур ІІ-еозином за загальноприйнятим способом та після проведення ІГХ-реакції, проведено визначення площ ядер лімфоцитів і ядер клітин нейробластоми (Табл.). Таблиця Площа ядер лімфоцитів та клітин нейробластоми в новоутворенні на гістологічних препаратах з і без попереднього проведення ІГХ-реакції Клітини Лімфоцити Клітини нейробластоми Спосіб забарвлення загальний після ІГХ загальний після ІГХ М  m р 13,95 17,8 21,85 26,93 2,16 2,8 5,14 8,33 0,29 0,63 0,44 0,71 0,02 0,02 0,02 0,03 Примітка: Загальний - загальноприйнятий спосіб забарвлення азур II-еозином[5]; Після ІГХ - забарвлення азур II-еозином після ІГХ за запропонованим способом; М - середнє значення;  - середнє квадратичне відхилення; m - помилка середнього; р - достовірність середнього; t (1,984) - коефіцієнт Ст'юдента (табличне значення) 40 2 t (1,984) 6,11 7,19 UA 80457 U 5 10 15 20 25 Оцінка ІГХ-реакції у новоутворенні показала, що клітини нейробластоми, які мають площу перерізу ядра 26,93±8,33 не експресують поверхневий антиген CD44. Отже, резидуальні клітинні елементи нейробластоми відносяться до таких, що мають високий потенціал до метастазування. Таким чином, проведені спостереження показали, що постановка ІГХ-реакції суттєво впливає на планіметричні показники клітин. Запропонований спосіб забарвлення гістологічних препаратів дозволяє екстраполювати результати ІГХ-реакції на загальну мікроморфологічну будову зразків тканин, що досліджуються. Джерела інформації: 1. Патологическая анатомия: национальное руководство/ под ред. М.А. Пальцева, Л.В. Кактурский, О.В. Зайратьянц. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 1264 с. 2. Cancer Facts and Figures 2011/ American Cancer Society. - Atlanta, 2011. - P. 2. 3. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия/ Г.Г. Автандилов. -М.: Медицина, 1990. - 384 с. 4. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry/ DJ. Dabbs. - 3 rd ed. - New York: Ch. Livingstone, 2010. - 941 p. (прототип) 5. Грабовий О.М. Забарвлення гістологічних зрізів азур II-еозином: інформаційний лист/ О.М. Грабовий, Л.М. Яременко, Л.М. Іващенко. -К., 2011. - 4 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб забарвлення гістологічних препаратів, що включає стандартну методику проведення імуногістохімічної реакції до етапу візуалізації препарату після хромогену, який відрізняється тим, що гістологічний препарат інкубують при кімнатній температурі протягом 5 хв в розчині з 8 мл 0,1 М натрію ацетату, 2 мл 0,1 М розчину оцтової кислоти, доводять об'єм до 100 мл дистильованою водою, а подальше забарвлення препарату проводять в модифікованому розчині азур II-еозину, що складається з розчину азуру II 0,1 % 10 мл розчину еозину (натрієва сіль) 0,1 % 6 мл розчину натрію ацетату 0,1 М 8 мл розчину оцтової кислоти 0,1 М 2 мл дистильованої води до 100 мл з доведенням рН розчину до 5,2. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3