Спосіб контролю детоксикації токсинів дифтерії

Реферат: Спосіб контролю детоксикації токсинів дифтерії виконують в два етапи і визначають утворення стабільних анатоксинів на другому етапі при застосуванні хребетних тварин за статистичними даними. На першому етапі досліджень визначають потенційні анатоксини шляхом вимірювання флуоресценції в інтервалі довжин хвиль 300-600 нм та визначення інтенсивностей флуоресценції у максимумах флуоресценції на довжинах хвиль 360 нм та 450 нм. Наявність детоксикації нативних токсинів визначають шляхом реєстрації змін інтенсивностей максимумів флуоресценції на 360 нм та 450 нм. UA 80581 U (12) UA 80581 U UA 80581 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до способів аналізу біологічних матеріалів за допомогою флуоресцентної спектроскопії, і може бути використана у мікробіологічних (бактеріологічних) лабораторіях науково-дослідних інститутів та біотехнологічних виробництв. Відомий спосіб визначення вмісту ретинолу в еритроцитах [1] шляхом вимірювання флуоресценції гексанового екстракту ретинолу при довжині хвилі збудження 335 нм і флуоресценції - 460 нм. Паралельно з основними вимірюваннями ставлять контрольні проби з буферним розчином і стандартним розчином ретинолу замість гексанового розчину ретинолу. При здійсненні способу вимірюють інтенсивність флуоресценції у всіх трьох випадках і розраховують вміст ретинолу в організмі за математичною формулою. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі контроль за вмістом досліджуваної речовини в організмі здійснюють шляхом збудження монохроматичним випромінюванням попередньо підготованої досліджуваної речовини при визначеній довжині хвилі опромінення, вимірювання інтенсивності флуоресценції на визначених довжинах хвиль і визначення вмісту досліджуваної речовини в організмі при виконанні вимірів на досліджуваній і контрольних пробах. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є незадовільна точність визначення вмісту досліджуваної речовини, зумовлена вимірюванням інтенсивності флуоресценції тільки на визначених довжинах хвиль флуоресценції. Це робить відомий спосіб непридатним для контролю детоксикації токсинів дифтерії. Крім цього спосіб досить складний, що зумовлено розрахунком параметрів за математичною формулою, для встановлення коефіцієнтів якої потрібні додаткові відомості і час. Відомий спосіб визначення типу солей урини в організмі людини [2], який здійснюють шляхом опромінення проби урини, нанесеної на поліровану поверхню пластини з термостабільного матеріалу, при цьому пробу у вигляді 2-3 крапель досліджуваної речовини наносять на попередньо нагріту пластину, висушують, після чого пластину опромінюють монохроматичними променями оптичного діапазону в інтервалі довжин 250-550 нм, реєструють спектральні зміни свічення в інтервалі довжин хвиль 400-800 нм і визначають максимальні значення інтенсивності смуги свічення при різних довжинах хвиль флуоресценції, що відповідає різним складам солей в урині. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі стан досліджуваних речовин в пробі визначають шляхом опромінення проби монохроматичними променями у визначеному діапазоні, визначають максимальні значення інтенсивності флуоресценції в цьому діапазоні, за якими судять про склад солей в пробі урини. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є обмеженість області використання способу визначенням типу солей урини. Прототипом вибраний спосіб контролю детоксикації токсинів дифтерії, який здійснюють на хребетних тваринах [3]. Спосіб складається з двох етапів, на першому з яких визначають потенційні анатоксини, для чого піддослідним тваринам (мурчакам вагою 350-400 гр чи кролям вагою 2-3 кг) голять шкіру з боків ближче до спини та вводять внутрішньошкірно 0,2 мг нативного анатоксину. Паралельно з дослідними ставлять контрольні проби (завідомо позитивну і негативну). За тваринами спостерігають впродовж 72 годин. Епідермальні реакції на першому етапі оцінюють наступним чином: 0 - відсутність характерних ознак пошкодження епідермісу, І - гіперемія, II - наявність інфільтрату, III - некроз. Якщо досліджуваний препарат не викликає місцевих реакцій або викликає пошкодження І ступеня, які минають впродовж 72 годин, то він визнається нетоксичним. Дослідження проводять щонайменше на 2 тваринах для кожної проби, включаючи контрольні (позитивну і негативну). На першому етапі детоксикація може носити зворотний характер і токсичність препарату може відновлюватися. Для запобігання цьому введений другий етап, на якому встановлюють стабільні форми анатоксину дифтерії. На другому етапі визначають безпечність дифтерійного анатоксину щонайменше на 2 тваринах (мурчаки вагою 350-400) гр, яким вводять підшкірно по 2,5 мл потенційного анатоксину, одержаного на 1 етапі, у кожний бік (загалом 5,0 мл). За тваринами спостерігають 45 чи 21 добу відповідно. Препарат визнають безпечним, якщо тварини набирають вагу впродовж всього часу спостереження. До того ж у них повинні бути відсутні паралічі, парези та місцеві реакції. Згідно з нормативною документацією, в місці введення препарату допускається утворення невеликих ушкоджень, які можуть зберігатися впродовж 30 і більше діб. Тварини, які загинули, підлягають розтину та детальному вивченню патологоанатомічної картини внутрішніх органів. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі контролю детоксикації токсинів дифтерії контроль виконують в два етапи і визначають утворення стабільних анатоксинів на другому етапі при застосуванні хребетних тварин за статистичними характеристиками. 1 UA 80581 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату є висока вартість і довготривалість способу-прототипу, а також складнощі, пов'язані з виконанням вимог нормативних документів: ДВСТ 421-88 "Тварини лабораторні. Технологічний процес з дотримання основних положень Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовуються в експериментальних наукових цілях" (18.03.1986), Директива ЄВС за № 609 від 24.11.1986 p., Наказ МОЗ України за № 281 від 01.11.2001р. При здійсненні способу прототипу при дослідженні тільки однієї серії анатоксину дифтерії потрібні щонайменше 8 тварин, Саме тому пошук методів досліджень, завдяки яким буде надано можливість не використовувати на певних етапах виробництва хребетних тварин, є дуже актуальною проблемою. Задачею, на вирішення якої спрямована запропонована корисна модель, є створення способу контролю детоксикації токсинів дифтерії. Технічний результат, який може бути одержаний при використанні запропонованої корисної моделі, полягає в зменшенні часу на здійснення способу та зменшенні кількості лабораторних тварин (з 8 до 2) при дослідженні однієї серії анатоксину. Суть запропонованої корисної моделі полягає в тому, що в способі контролю детоксикації токсинів дифтерії, відповідно до якого спосіб виконують в два етапи і визначають утворення стабільних анатоксинів на другому етапі при застосуванні хребетних тварин за допомогою статистичної обробки результатів досліджень, на першому етапі досліджень визначають потенційні анатоксини шляхом вимірювання флуоресценції в інтервалі довжин хвиль 300-600 нм та визначення інтенсивностей флуоресценції у максимумах флуоресценції на довжинах хвиль 360 нм та 450 нм, при цьому наявність детоксикації нативних токсинів визначають шляхом реєстрації змін інтенсивностей максимумів флуоресценції на 360 нм та 450 нм. Запропонований спосіб відрізняється від прототипу тим, що на першому етапі досліджень визначають потенційні анатоксини шляхом вимірювання флуоресценції в інтервалі довжин хвиль 300-600 нм та визначення інтенсивностей флуоресценції у максимумах флуоресценції на довжинах хвиль 360 нм та 450 нм, при цьому наявність детоксикації нативних токсинів визначають шляхом реєстрації змін інтенсивностей максимумів флуоресценції на 360 нм та 450 нм. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом існує такий. Визначення потенційних анатоксинів на першому етапі контролю детоксикації токсинів дифтерії, яке відбувається шляхом реєстрації змін інтенсивностей максимумів флуоресценції на 360 нм та 450 нм у спектрах флуоресценції проб дериватів бактеріальних токсинів, дозволяє значно (з 72 годин до 10 хвилин, тобто пропонований спосіб є експресним) скоротити час проведення першого етапу досліджень і, відповідно, всього часу контролю, при цьому перший етап досліджень проводять без використання хребетних тварин, а загальна кількість хребетних тварин протягом всього дослідження зменшується з 8 до 2, що відповідає положенням Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовуються в експериментальних наукових цілях. Наведений приклад та графік підтверджують отримання передбачуваного технічного результату. Згідно з прикладом, контроль детоксикації токсинів дифтерії здійснюється таким чином. До 13,5 мл фізіологічного розчину з рН 7,2 і додають 1,5 мл речовини, яка досліджується - токсин або можливий анатоксин. Суміш ретельно перемішують та вимірюють її флуоресценцію на флуориметрі (Hitachi F3210) в інтервалі довжин хвиль 300-600 нм. Довжина хвилі збудження флуоресценції становила 292 нм. Довжину хвилі збудження було вибрано так, щоб збудити флуоресценцію триптофанів, які входять до складу токсинів дифтерії. Флуоресценція токсинів або анатоксинів дифтерії спостерігається в інтервалі довжин хвиль 300-600. Паралельно проводять дослідження контрольної проби з фізіологічним розчином, який не має власної флуоресценції. Згідно з наведеним прикладом, спектр флуоресценції токсинів (1) значно відрізняється від відповідних спектрів анатоксинів. На кривій (1) при реєстрації флуоресценції токсинів значення інтенсивностей максимумів флуоресценції на 360 нм та 450 нм становлять 10 та 6 відносних одиниць відповідно, тоді як при реєстрації флуоресценції анатоксинів (2) значення інтенсивностей максимумів флуоресценції на 360 нм та 450 нм становлять 25,5 та 20,5 відносних одиниць, відповідно. При дослідженнях частково детоксикованого токсину (крива 3) різниця інтенсивності флуоресценції нативних диференційних токсинів незначна. Результати досліджень на 1 етапі контролю свідчать про перехід (крива 1 та 2) нативних токсинів дифтерії в анатоксини. 2 UA 80581 U 5 10 15 20 Оскільки токсичність препарату має зворотний характер і може відновлюватись необхідним є проведення другого етапу контролю, на якому можна встановити утворення стабільно безпечного анатоксину [3]. Другий етап контролю детоксикації дифтерійного токсину виконують аналогічно прототипу. Точність визначення переходу дифтерійного токсину у анатоксин була підтверджена стандартними [3] методами перевірки з застосуванням хребетних тварин. Результати досліджень доводять, що запропонований спосіб придатний для більш швидкого, точного і зручного визначення переходу токсину в анатоксин без застосування на першому етапі хребетних тварин. Джерела інформації: 1. Пат. RU 2362145 С2. МПК G01N21/64 (2006.01) Способ дифференциальной диагностики микробов и сложных аминокислот [Текст] / Александров М.Т., Васильєв Е.Н., Воропаева М.И., Гапоненко О.Г., Иванова М.А., Кульмин Г.П., Макарова М.В., Милонич А.И., Хоменко В.А.; заявитель ООО "Научно-производственный центр медицинских и промышленных биотехнологий Спектролюкс". - № 2007112513/28; заяв. 05.04.2007; опубл. 10.10.2008, Бюл. № 20, 2009 г. 2. Пат. UA 4600 U 7. G01N 33/49 Спосіб визначення вмісту ретинолу [Текст] / Шикаєва Ф.В., Єфименко Н.Ф.; заявник Запорізька медична академія післядипломної освіти. - № 20040604723; заявл. 16.06.2004; опубл. 17.01.2005, Бюл. № 1, 2005 р. 3. Руководство по вакцинному и сывороточному делу [Текст] / под ред. П.Н. Бургасова. - М.: "Медицина", 1978. - 440 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб контролю детоксикації токсинів дифтерії, який виконують в два етапи і визначають утворення стабільних анатоксинів на другому етапі при застосуванні хребетних тварин за статистичними даними, який відрізняється тим, що на першому етапі досліджень визначають потенційні анатоксини шляхом вимірювання флуоресценції в інтервалі довжин хвиль 300-600 нм та визначення інтенсивностей флуоресценції у максимумах флуоресценції на довжинах хвиль 360 нм та 450 нм, при цьому наявність детоксикації нативних токсинів визначають шляхом реєстрації змін інтенсивностей максимумів флуоресценції на 360 нм та 450 нм. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3