Спосіб підвищення виживання сперміїв

Реферат: Спосіб підвищення виживання сперміїв, за яким у розріджувачі сперми додають таурин. Як розріджувачі сперми використовують лактозо-жовтково-гліцериновий або фосфатно-сольовий буфер, причому у лактозо-жовтково-гліцериновий розріджувач таурин додають у концентраціях 0,175-0,350 ммоль/л, а у фосфатно-сольовий буфер - 0,7 ммоль/л. UA 84569 U (54) СПОСІБ ПІДВИЩЕННЯ ВИЖИВАННЯ СПЕРМІЇВ UA 84569 U UA 84569 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біології і може бути використана у репродуктивній біотехнології та штучному осіменінні тварин для забезпечення збереженості і тривалого виживання та підвищення запліднювальної здатності сперміїв. Відомий спосіб підвищення антиоксидантних властивостей сперми, який базується на збільшенні часу існування сперміїв (Van Den El shout W. Method for improving the fertility of animals, EP 1714674 A1, 1PC A61K 31/715), за яким у середовище розрідження сперми додають суміш амінокислот - аланіну та тирозину. Проте не вказується доза сполуки, яка могла б забезпечити позитивний ефект - підвищення тривалості існування й запліднювальної здатності сперміїв. Відомий спосіб підвищення кріопротекторних властивостей сперми (Farley S. J., Ostermeier С. G., Tail R., Wiles V. M. Sperm cryoprotective media EP 2043431 A2, TPC A23K1/165), за яким до середовища замороження або до сперми додають індол-3-фосфат та аргінін, які підвищують опірність сперміїв до набрякання та оксидативного стресу, що виникають під час розмороження. За способом таурин використовують як антиоксидантну добавку для зниження продукції вільних радикалів кисню, проте не вказується точна концентрація сполуки та не описується конкретне середовище розрідження сперми. Найближчим за технічною суттю прототипом є спосіб, за яким таурин додають до безпротеїнових середовищ. Сперму чоловіка розріджують середовищем, до складу якого входить суміш солей та амінокислот, серед яких є таурин (Bredahl L., Nordbo В. Protein-Free Culture Media Products, US 20120258533 A1, TPC С12N5/071). Недоліком цього способу є відсутність поживного середовища, яке б продовжувало існування сперміїв. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб підвищення виживання сперміїв, шляхом додавання антиоксиданту до середовища розрідження сперми, що дасть змогу подовжити існування статевих клітин та підвищити їх запліднювальну здатність. Технічний результат досягають тим, що як розріджувач сперми використовують фосфатносольовий буфер та лактозо-жовтково-гліцериновий розріджувач, з додаванням до фосфатносольового буферу розчини таурину у концентрації 0,7 ммоль/л або до лактозо-жовтковогліцеринового розріджувача - таурину у концентраціях 0,175-0,35 ммоль/л. Спосіб ґрунтується на здатності таурину знижувати вільнорадикальне окиснення і забезпечувати цілісність клітинної мембрани статевих клітин, захищати ланки дихального ланцюга від утворених вільних радикалів Оксигену і, отже, підвищувати ефективність використання субстратів розріджувачів, що забезпечує високе виживання, величина якого позитивно корелює з запліднювальною здатністю сперміїв. Спосіб можна проілюструвати прикладом дослідження залежності виживання сперміїв бугая від вмісту таурину у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ; NaCI-0,8 г, КСl-0,02 г, Na2HPO4-0,11 г, КН2РО4-0,02 г, MgCl2-0,01 г, Н2О до 100 мл) та лактозо-жовтково-гліцериновому розріджувачі (ЛЖГР; лактоза - 11,5 г, жовток курячих яєць - 20 мл, гліцерин - 5,0 мл, вода - 100 мл). Сперму бугаїв розріджують вказаними розріджувачами і ділять на дві частини, контрольну без додавання таурину та дослідну, в яку додають вказану сполуку у концентраціях 0,175, 0,35, 0,525 і 0,7 ммоль/л. Дихальну активність сперми досліджують полярографічно (нг-атом О / 0,1 мл сперми за хв.) з використанням електрода Кларка, вмонтованого у термостатовану комірку (38,5 °C) об'ємом 1 мл з автоматичного реєстрацією перебігу процесу. Для дослідження впливу таурину на виживання сперміїв розбавлену розріджувачами у звичайному для даного еякуляту відношенні (1:4) сперму зберігали у холодильнику при температурі 0-4 °C. Для оцінювання виживання сперміїв з контрольних і дослідних зразків один раз на добу брали краплю сперми, наносили на підігріте до 37 °C предметне скло, змішували з краплею 2,9 % натрію цитрату, накривали покривним склом і досліджували під мікроскопом при збільшенні: об'єктив 10, окуляр 10-15. Виявляли активні з прямолінійно-поступальним рухом спермії. При дослідженні дихальної активності сперміїв у середовищі ФСБ додавання таурину у концентрації 0,175 ммоль/л знижує дихальну активність на 16,7 % (20,0 нг-атом 0/0,1 мл сперми за хв.). Збільшення дози таурину вдвічі, а саме 0,35 ммоль/л зменшує дихальну активність на 27,9 % (17,6 нг-атом О / 0,1 мл сперми за хв.). Внаслідок додавання таурину у концентрації 0,525 ммоль/л інтенсивність дихання знижується на 32,8 % (до 16,4 нг-атом О / 0,1 мл сперми за хв.), а при збільшенні дози до 0,7 ммоль/л дихальна активність сперми бугая найнижча і становить 13,6 нг-атом О / 0,1 мл сперми за хв., що менше на 44,3 % порівняно із контролем (табл. 1). 60 1 UA 84569 U Таблиця 1 Інтенсивність дихання сперми бугаїв за додавання таурину у середовище розрідження еякулятів бугаїв, нг-атом О/0,1 мл сперми за хв. Середовище ФСБ M±m n 24,4±1,94 5 Умови досліду Прототип Дослід (за додавання таурину, ммоль/л): 0,175 0,35 0,525 0,70 n 5 ЛЖГР M±m 39,6±2,55 5 20,0±1,26 5 39,2±2,01 5 5 5 17,6±1,04* 16,4±1,31** 13,6±0,67*** 5 5 5 38,4±2,49 35,2±2,30 28,8±3,03* Примітки: * - різниця статистично вірогідна порівняно до контролю з Ρ < 0,05; **- з Ρ < 0,01; ***- з Ρ < 0,001 5 10 Інтенсивність дихання сперміїв у пробах за прототипом та за додавання таурину у концентраціях 0,175 і 0,35 ммоль/л до лактозо-жовтково-гліцеринового розріджувача у межах похибки середнього арифметичного, що становить 38,4-39,6 нг-атом О / 0,1 мл сперми за хв. Дихальна активність сперми знижується на 11,2 % (до 35,2 нг-атом О / 0,1 мл сперми за хв.) внаслідок додавання таурину у концентрації 0,525 ммоль/л; за максимальної дози таурину (0,7 ммоль/л) величина досліджуваного показника зменшується на 27,3 % - до 28,8±3,03 нг-атом 0/0,1 мл сперми за хв. Додавання таурину у наростаючих дозах (0,175, 0,35, 0,525 та 0,70 ммоль/л) до фосфатносольового буферу підвищує виживання сперміїв бугая. Зокрема, за концентрацій таурину 0,1750,525 ммоль/л виживання сперміїв зростає на 15,4 % і становить 124,8 год., а за максимальної дози таурину (0,70 ммоль/л) - на 18,5 % і становить 129,6 год. Отже, найбільш ефективною дозою таурину за розрідження сперми бугая фосфатно-сольового буферу є найвища з використаних доз 0,70 ммоль/л (табл. 2). 15 Таблиця 2 Виживання сперміїв за додавання таурину у середовище розрідження еякулятів бугаїв, год. n 5 Середовище ФСБ M±m 105,6±8,59 n 5 ЛЖГР M±m 1201.11,76 5 124,8±8,03 5 134,4±8,59* 5 5 5 124,8-112,52 124,8112,52 129,6±8,59* 5 5 5 134,4±12,88* 129,6110,95 120±11,76 Умови досліду Прототип Дослід (за додавання таурину, ммоль/л): 0,175 0,35 0,525 0,70 Примітка: * - різниця статистично вірогідна порівняно до контролю з Ρ < 0,05 20 25 Внаслідок розрідження сперми бугая лактозо-жовтково-гліцериновим розріджувачем величина фізіологічного показника при концентраціях таурину 0,175 і 0,35 ммоль/л підвищується на одну і ту ж величину - 10,7 %, порівняно з контролем. За додавання таурину у концентрації 0,525 ммоль/л виживання сперміїв вище на 7,4 % порівняно з контролем, однак на 5,3 год. нижче, ніж при значеннях 0,175 і 0,35 ммоль/л. Внаслідок додавання таурину у концентрації 0,70 ммоль/л величина фізіологічного показника повертається до вихідної величини (120:1:] 1,76 год.), що нижче максимального виживання сперміїв на 14,4 год. (табл. 1). Отже, найбільш ефективною дозою таурину за розрідження сперми бугая лактозо-жовтковогліцериновим розріджувачем є 0,175 і 0,35 ммоль/л. 2 UA 84569 U 5 Використання таурину у складі розріджувачів фосфатно-сольового буферу чи лактозожовтково-гліцеринового розріджувача забезпечує підвищення виживання сперміїв порівняно із прототипом. Для виживання сперміїв оптимальною є доза таурину 0,7 ммоль/л за додавання у фосфатно-сольовий буфер і 0,35 ммоль/л.- за додавання у лактозо-жовтково-гліцериновий розріджувач, що підтверджує передбачений технічний результат. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб підвищення виживання сперміїв, за яким у розріджувачі сперми додають таурин, який відрізняється тим, що як розріджувачі сперми використовують лактозо-жовтково-гліцериновий або фосфатно-сольовий буфер, причому у лактозо-жовтково-гліцериновий розріджувач таурин додають у концентраціях 0,175-0,350 ммоль/л, а у фосфатно-сольовий буфер - 0,7 ммоль/л. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3