Спосіб підвищення рухливості сперміїв людини

HllKG A 61 К 31 /52 A 01 N1/02 Спосіб підвищення рухливості спе рміїв людини. Винахід відноситься до області кріобіології і кріомедицини і може бути використаний для лікування безпліддя. . Відомий спосіб підвищення рухливості сперміїв людини, шляхом додавання до еякуляту розчину кофеїну в кінцевій концентрації 6 мМ [1]. Однак цей спосіб дозволяє підвищити рухливість сперміїв людини тільки на 22%, а висока концентрація біостимулятора кофеїну може негативно вплинути на клітини [2]. Окрім цього недоліком даного способу є тривалий (1 година) інкубаційний період досягнення сперміями максимального рівня рухливості. Найбільш близьким до заявленого є спосіб підвищення рухливості сперміїв людини шляхом додавання до них 3,6 мМ розчину пентоксіфіліну ЛІФ/ [3]. Згідно з цим методом попередньо виділяють активно-рухливу фракцію клітин. Для цього на зразки сперми нашаровують середовище Ерла, що містить 10% сивороточного альбуміна людини, інкубують в атмосфері СО2 при 3?°С протягом 1 години, після цього видаляють супернатант і центріфугують при 300 g 20 хвилин. Отриманий осад ресуспендують у середовищі Ерла до концентрації клітин 10-5 0x10 б/мл. Після цього додають ПФ до кінцевої концентрації 3.6 мМ. Недоліком цього методу є те, що він дозволяє підвищити рухливість сперміїв тільки на 13.8%. При цьому він потребує великих витрат зусиль і часу, тому що процедура виділення активно-рухливих форм клітин, що включає центрифугування, ресуспендування, инкубацію в середовищі Ерла, є складною і займає близько двох годин. Крім цього, в процесі виділення можливі структурні пошкодження сперміїв, що призводять до втрати ними запліднюючої здатності. В основу винаходу покладене завдання створення такого способу підвищення рухливості сперміїв людини, у якому шляхом додаткового впливання на клітини фізичним фактором забезпечувалася б Інтенсивна стимуляція біоенергетичних процесів у сперміях і за рахунок цього досягався більш високий рівень їх рухливості. Це завдання вирішується тим, що в способі підвищення рухливості сперміїв людини шляхом додавання до них ПФ, еякулят попередньо піддають заморожуванню з наступним відігрівом, а ПФ вводять після відігріву в концентрації 2.0-2.5 мМ. Заморожування надає вираженого стимулюючого впливу на клітини, що дозволяє знизити концентрацію ПФ і завдяки цьому зменшити ризик його негативного впливу на морфофункціональні властивості сперміїв. Крім цього заморожування дозволяє виключити етап виділення найбільш життєздатних сперміїв з еякулята внаслідок природньої селекції їх в процесі заморожування-відіїріву. Після стимуляції сперміїв заявленим способом їх рухливість збільшується на 27-29% у порівнянні з вихідними показниками і на 14-15% у порівнянні з прототипом. Тривалість способу - 20-30 хвилин. Спосіб здійснюється таким чином. Еякулят об'ємом від 2 до 5 мл, з загальною кількістю сперміїв не менше 20 млн/мл, з них активно-рухливих форм 25 - 50%, змішують з глюкозо-цитратножовтковим кріозахисним середовищем, що містиіь 2.5% гліцерину, вміщують до контейнера і заморожують шляхом занурення у порошок окису алюмінію, охолоджений до температури рідкого азоту [4]. Відігрів здійснюють на водяній бані при 40 - 41°С. Зразки розмороженої сперми переносять до пробірок і термостатують при 37°С протягом 5 - 10 хвилин. Після цього додають ПФ до кінцевої концентрації 2.0-2.5 мМ. Прикладі. Для досліду брали сперму з концентрацією клітин 95 млн/мл, з них активно рухливих 39%. До 1 мл еякулята додавали 0.1 мл глюкозо-цитратножовткового середовища, що містить 2.5% гліцерину, вміщували до контейнера і заморожували шляхом занурення в порошок окису алюмінію, охолодженого до температури рідкого азоту. Відігрів здійснювали на водяній бані при 4ГС. Після відігріву протягом 5 хвилин інкубувалн в термостаті при 37°С, Після цього додавали ПФ до його концентрації в пробі 2.0-2.5 мМ і - зпротягом 15 хвилин інкубували при 37°С. Рухливість сперміїв визначали за допомогою лабораторного лічильника ЛЛ-1 і світлового мікроскопу МБЇ-10 Результати представлені в табл. 1 у порівнянні з прототипом. Таблиця 1. Рухливість сперміїв в залежності від способу стимуляції (п^б). Спосіб стимуляції Час, хв. Рухливість, % 15 60 120 105 125 180 19 X 240 103 109 300 Прототип: До стимуляції Після стимуляції 109 122 109 129 100 108 Заявлений: До стимуляції Після стимуляції 42+2,3 85+1,5 38+3,7 27+3,0 19+1,5 10+2,4 5,5+1,1 80+2,9 62+2,1 47+1,7 25+1,8 12+1,7 105,16 118,67 23,58 51,83 Дані табл. 1 свідчать про те, що після стимуляції заявляємим способом кількість активно-рухливих сперміїв на 14-15% більша, ніж у прототипі . Приклад 2. Для досліду брали сперму з концентрацією клітин 85 млн/мл, з них кількість рухливих сперміїв не менше 25%. До проб еякулята об'ємом 1.0 мл додавали по 0.1 мл глюкозо-цитратно-жовткового середовища, що містить 2.5% гліцерину, вміщували до контейнера і заморожували шляхом занурення в порошок окису алюмінію, охолодженого до температури рідкого азоту. Відігрів здійснювали на водяній бані при 4ГС. ПФ додавали до проб у концентрації 0; 0.2; 1.5; 2.0 2.5; 3.0; і 4.5 мМ. Після 5 хвилин інкубації при ЗТС визначали рухливість сперміїв. Результати представлені в табл. 2. -4 Таблиця 2. Рухливість сперміїв в залежності від концентрації ПФ (п=6). Концентрація ПФ, мМ Рухливість сперміїв,% 0 36,0+2,3 0,2 41,2+3,7 1,5 56,0+1,7 2,0 85,0±1,5 2,5 88,5+1,2 3,0 44,5+2,1 4.5 35,0±2,4 З даних таблиці 2 видно, що найвища рухливість сперміїв досягається при додаванні ПФ у концентрації 2,0-2,5 мМ. Джерела інформації: 1.М.М. Abdel Kader, A.A. El-Ktribi, L. Soiiman, Abuzahra, M.M. Moussa Effect of some heterocyclic compounds on human semen composition and biology. Acta biol. med. germ. 1978, 37,11/12 p 1701-1705. 2.Downs S.M, Daniel SAX, Bomslager E.A., Hoppe P.C., Epptg J.J.iMaintenance of meiotic arrest in mouse oocytes by purinep: modulation of cAMP levels and cAMP phosphodiestera.se activity. Gamete Res 23:323, 1989. 3.SheenaE,V., Lewis., James M. Moohan., William Thompson Effects of pentoxifylline on human sperm motility in normospermic individuals using computer-assisted analysis. /7 Fertil . Steril.-1993.- 59.-p.418-.423. 4. Пат. РФ № 1660651, A01N1/00, A61B17/36, 1991г.