Спосіб диференційованого виявлення b1-лімфоцитів в гістологічних препаратах

Реферат: Спосіб диференційованого виявлення В1-лімфоцитів в гістологічних препаратах шляхом підготовки гістологічних препаратів, блокування ендогенної пероксидази. Інкубації з кон'югатом лектину конконоваліну А з пероксидазою хрону, виявлення пероксидази хрону діамінбензидином, дегідратації, заключення препарату, мікроскопії. Після постановки реакції кон'югації з першим лектином - лектином конконоваліну А і проявленням продуктів реакції діамінбензидином, на тому ж самому гістологічному препараті ставлять другу реакцію кон'югації з лектином сої з проявленням продуктів реакції -нафтолом, дофарбованим метиловим зеленим. UA 89088 U (12) UA 89088 U UA 89088 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить медицини, а саме гістології, анатомії та імунології, і може бути використана для виявлення В1-лімфоцитів в м'якій тканині пародонта. Існує лектингістохімічний спосіб виявлення В-лімфоцитів (як В1-, так і В2-лімфоцитів) в гістологічних препаратах по наявності рецепторів до лектину сої. Основний клас антитіл імунної системи слизових - IgA-антитіла - синтезується двома популяціями В-лімфоцитів слизової оболонки - В1- і В2-лімфоцитами (Kіуоnо Н. et al., 2001). Лектин сої (SBА) приєднується до проліл-тріонінових і проліл-серинових амінокислотних послідовностей важких ланцюгів імуноглобулінових рецепторів цих лімфоцитів. Тому лектингістохімічним методом з виявленням рецепторів лише до одного лектину не можливо розрізнити дві популяції лімфоцитів однакової морфології. Одночасно, В1-лімфоцити мають не тільки імуноглобулінові рецептори, що виявляються лектином сої, а і антигенрозпізнаючі маннозні рецептори, які виявляються лектином конконоваліну (Соn А). Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у виявленні антигенпрезентуючих клітин в гістологічних препаратах лектингістохімічним методом по наявності маннозних рецепторів до лектину конконоваліну А, який полягає у підготовці гістологічних препаратів, блокуванні ендогенної пероксидази, інкубації з кон'югатом лектин конконоваліну-А-пероксидаза хрону, виявленні пероксидази хрону діамінбензидином, дегідратації, заключенні препарату, мікроскопії (Sallusto F., Cella M., Danieli C, Lanzavecchia A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II comparment: dowregulation by cytokines and bacterial product J. Exp. med. - 1995. - Vol. 182. № 2. - P. 283-288). Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є такі: підготовка гістологічних препаратів; блокування ендогенної пероксидази; інкубація з кон'югатом лектин конконоваліну А - пероксидази хрону виявлення пероксидази хрону діамінбензидином; дегідратація; заключення препарату; мікроскопія. Цей спосіб є недостатньо ефективним для виявлення саме В1-лімфоцитів, тому що він є обмеженим внаслідок виявлення вуглеводного залишку антигенної детермінанти, притаманної для всіх антигенпрезентуючих клітин різного походження (дендритних клітин, макрофагів, ендотеліальних клітин та ін.). Це викликає необхідність у розробці нових способів по одночасному виявленню двох вуглеводних залишків-рецепторів, так як В1-лімфоцитам притаманні дві функції - розпізнавання антигену та його презентація та синтез антитіл. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу виявлення В1лімфоцитів в гістологічних препаратах використовуючи комбінацію з двох лектинів і, відповідно, дві системи візуалізації, що забезпечить ефективність додаткового високоспецифічного виявлення В1-лімфоцитів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який полягає у підготовці гістологічних препаратів, блокуванні ендогенної пероксидази; інкубації з кон'югатом лектину конконоваліну А з пероксидазою хрону, виявленні пероксидази хрону діамінбензидином, дегідратації, заключенні препарату, мікроскопії, згідно з корисною моделлю, після постановки реакції кон'югації з першим лектином - лектином конконоваліну А і проявленням продуктів реакції діамінбензидином, на тому ж самому гістологічному препараті ставлять другу реакцію кон'югації з лектином сої, з проявленням продуктів реакції а-нафтолом, дофарбованим метиловим зеленим. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Як ми доводимо, достовірність методу підтверджується застосуванням лектингістохімічного методу з комбінуванням двох лектинів з двома різними системами візуалізації. Рецептори до першого лектину - конконоваліну А на В1-лімфоцитах виявляються за допомогою бензидинової коричневої мітки, а рецептори до другого рецептору, рецептору сої - візуалізуються -нафтолом підфарбованим метиловим зеленим, тобто зеленої мітки. Одночасно на досліджуваній клітині виявляються коричневі і зелені продукти реакцій. Постановка комбінованої лектингістохімічної реакції з двома лектинами - лектином конконоваліну А і лектином сої для виявлення В1-лімфоцитів в гістологічних препаратах дозволить високоточніше ідентифікувати дані клітини і зменшити помилки при підрахунку цих клітин в гістологічних препаратах, тому що подвійна комбінація лектинів є можливістю диференціювати В1-лімфоцити від В2-лімфоцитів. 1 UA 89088 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Запропонований спосіб дозволяє високоспецифічно диференціювати В1-лімфоцити в гістологічних препаратах. Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних моментів дозволить підвищити ефективність виявлення В1-лімфоцитів в гістологічних препаратах і більш досконало вивчати будову лімфоїдної тканини. Спосіб здійснюють таким чином. Для лектингістохімічного дослідження тканину фіксують в розчині Буєна. Шматочки зневоднюють в висхідній батареї спиртів, починаючи з 40 %. Отримують парафінові зрізи товщиною 5 мкм. Гістохімічне визначення рецепторів до лектину конконоваліну А проводять з використанням прямої реакції з кон'югатом - лектин конконоваліну А і пероксидаза хрону. Рецептори до лектину виявляють по нашаруванню коричневих часточок бензидину на поверхні цитоплазматичної мембрани клітин. Для виявлення рецепторів до лектину сої використовують кон'югат - лектин сої і пероксидаза хрону. Візуалізуацію результатів другої лектингістохімічної реакції здійснюють за допомогою -нафтолу, дофарбованого метиловим зеленим, що виявляє накопичення імуноглобулінів в цитоплазмі клітини і на поверхні цитоплазматичної мембрани у вигляді часточок зеленого кольору. Перехрещене відкладання бензидинових коричневого кольору міток і часточок -нафтолу, дофарбованих метиловим зеленим, що надає їм зеленого кольору, вказує на морфофункціональні особливості досліджуваних клітин і підтверджує, що даним клітинам притаманні імуноглобулінові рецептори і антигенрозпізнаючі рецептори. + + Морфометричний підрахунок SBA Con А -клітин, які мають на своїй поверхні коричневу бензидинову мітку, кон'юговану з лектином конконоваліну А Conovalia ensiformis (Con А) і зелену -нафтолу мітку, кон'юговану з лектином сої Glycine hispada (SBA), проводять за допомогою окулярної сітки при імерсійному збільшенні мікроскопа. Приклад. Після фіксації шматочків пародонту лабораторного щура в рідині Буєна, їх зневоднюють у висхідній батареї спиртів, отримують парафінові зрізи товщиною 5 мкм та виготовляють гістологічні препарати. Лектингістохімічне визначення рецепторів до Маn і NAcDGal проводять з використанням двох послідовних прямих реакцій з кон'югатом лектина конконоваліну А і пероксидази хрону і лектину сої і пероксидази хрону. Перший лектиновий комплекс виявляють діамінбензидином, другий - -нафтолом, підфарбованим метиловим зеленим. В1-лімфоцити мають розміри 12-16 мкм. Частіше вони подовженої форми з ексцентрично розташованим ядром, розмірами 5 мкм. Контури цитоплазматичної мембрани і каріолеми трохи хвилястої форми. Ядро клітин світле, непрофарбоване. В цитоплазмі і на поверхні цитоплазматичної мембрани виявляються нашарування дрібних часточок зеленого кольору, що ідентифікують імуноглобулінові рецептори до лектину сої. Одночасно на цитоплазматичній мембрані візуалізуються коричневі вкраплення, що вказує на наявність рецепторів до маннози і + + підтверджує антигенпрезентуючі властивості даних клітин. Взагалі SBA Con А -лімфоцити мають коричнево-світло-зелене забарвлення. Розташовані вони де по інде в епітелії ясневої борозни, в епітелії зубоясневого прикріплення і в сполучній тканині сосочка в особистій пластинці, що характерно для клітин неспецифічної ланки імунітету некапсульованої лімфоїдної тканини слизових оболонок. В епітелії клітини розташовані на рівні базального та шипуватого шарів. В особистій пластинці частіше, біля судин і мають значно подовжену еліпсоїдну форму. Відмічається поодиноке виявлення клітин і кількість їх незначна на одиницю площі вимірювання. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 Спосіб диференційованого виявлення В1-лімфоцитів в гістологічних препаратах шляхом підготовки гістологічних препаратів, блокування ендогенної пероксидази; інкубації з кон'югатом лектину конконоваліну А з пероксидазою хрону, виявлення пероксидази хрону діамінбензидином, дегідратації, заключення препарату, мікроскопії, який відрізняється тим, що після постановки реакції кон'югації з першим лектином - лектином конконоваліну А і проявленням продуктів реакції діамінбензидином, на тому ж самому гістологічному препараті ставлять другу реакцію кон'югації з лектином сої з проявленням продуктів реакції -нафтолом, дофарбованим метиловим зеленим. 2 UA 89088 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3