Спосіб підготовки біологічного об’єкта для визначення токсичності води

1. Спосіб підготовки біологічного об'єкта для визначення токсичності води, що включає відбір біологічного об'єкта, за який використовують риб, який відрізняється тим, що відбирають однорідні за масою і довжиною особини та витримують останні у контрольному сольовому середовищі 1014 діб при температурі 18-22 °С, із вмістом вугле3 кислого газу - 2,5-4,5 мг/дм та кисню 6,5-8,5 3 мг/дм і рН 6-8. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що для прісноводних риб солевміст контрольного середовища складає: 3 3 СаСl2 - 280-310 мг/дм ; MgSO4 - 110-140 мг/дм ; 3 3 NaHCO3 - 50-70 мг/дм ; КСl - 4-7 мг/дм . 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що для морських риб солевміст контрольного середовища складає: 3 3 СаСl2 - 300-350 мг/дм ; MgSO4 - 130-180 мг/дм ; 3 3 NaHCO3 - 70-110 мг/дм ; КСl - 24-47 мг/дм . (19) UA (11) (21) a201012982 (22) 01.11.2010 (24) 10.01.2012 (46) 10.01.2012, Бюл.№ 1, 2012 р. (72) ГОНЧАРУК ВЛАДИСЛАВ ВОЛОДИМИРОВИЧ, ВЕРГОЛЯС МАЙЯ РОЗМЕТІВНА (73) ІНСТИТУТ КОЛОЇДНОЇ ХІМІЇ ТА ХІМІЇ ВОДИ ІМ. А.В. ДУМАНСЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Cytogenotoxicity biomarkers in fat snook Centropomus parallelus from Cananeia and Sao Vicente estuaries, SP, Brazil / Aline A., Kirschbaum, Robson Seriani, Camilo D. S., Pereira, Andrea Assuncao; Denis M. and Souza Abessa // Genetics and Molecular Biology. - 2009. - Vol.32, no.1, P. 151154. Rodriguez-Cea A. Micronucleus test in freshwater fish species: an evaluation of its sensitivity for application in field surveys / A.Rodriguez-Cea, F.Ayllon, E.Garcia-Vazquez // Ecotoxicology and Environmental Safety. -2003. - Vol. 56. -P. 442-448. RU 2215291 C1, 27.10.2003. RU 2370540 C2, 20.10.2009. UA 27484 U, 12.11.2007. RU 2008147342 A, 10.06.2010. JP 2003083954 A, 19.03.2003. Территория нефтегаза /Архив номеров за 2007 г./ Методика оценки токсической опасности огнетушащих пенообразователей для пожаротушения на ихтиофауну водоѐмов, прилегающим к морским C2 2 97199 1 3 Відомий спосіб підготовки біологічного об'єкта (риби) для визначення токсичності води [Cytogenotoxicity biomarkers in fat snook Centropomus parallelus from Cananeia and Sao Vicente estuaries, SP, Brazil / Aline A., Kirschbaum, Robson Seriani, Camilo D. S., Pereira, Andrea Assuncao; Denis M. and Souza Abessa // Genetics and Molecular Biology. - 2009. - Vol.32, nol], [2]. Спосіб полягає у відборі як біологічного об'єкта риби товстий робало (Centropomus parallelus) з довжиною 72-311 мм і масою 16,2-111,2 г та наступному розміщенні відібраних 20 особин, по 10 особин у контрольну воду та 10 особин у досліджувальну воду. При здійсненні експерименту за допомогою тест-організмів риб та їх клітин, а саме клітин крові -еритроцитів - визначають цито- та генотоксичність водного середовища. Як недолік відомого способу [2] можна відмітити неточність отриманих даних до виявлення негативного впливу на організм наявних у воді шкідливих речовин при визначенні токсичності водного середовища. Найбільш близьким аналогом до винаходу за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб підготовки біологічного об'єкта для визначення токсичності водного середовища [RodriguezCea A. Micronucleus test in freshwater fish species: an evaluation of its sensitivity for application in field surveys / A.Rodriguez-Cea, F.Ayllon, E.GarciaVazquez // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2003. - Vol. 56. -P. 442-448.] [3]. Суть способу полягає в наступному. Як тест-об'єкт використовують риб, наприклад, три види риб, що мешкають в прісноводній воді: кумжа (Salmo trutta), європейський вугор {Ангілья Ангілья) і європейський гольян (Phoxinus Phoxinus), та морську рибу - кефаль-лобан (Mygil sefalus). Відбирали по 20 особин з кожного виду риб і по 10 розміщали у контрольну та дослідну воду (розчин солі кадмію, концентрація 1,0 мг/дм). Час експозиції у водному середовищі складав 4 доби. Після експозиції відбирали риб, які вижили як у контрольному, так і дослідному водному середовищі та визначали токсичний ефект на клітинному рівні. Для визначення токсичності води використовували організм риб та їх клітини, а саме досліджували кров та зяброві тканини риб, які були в контрольній воді та у забрудненій токсикантами воді. Досліджували вплив токсикантів на кожен тест-організм. У досліджуваних риб відбирали кров із хвостової вени, брали шматок зябрової тканини і готували із останніх цитологічні препарати за методом А1-Sabti К. [Al-Sabti К. Comparative micronucleated erythrocyte cell induction in three cyprinids by five carcinogenic-mutagenic chemicals // Cytobios. 1986. -V.47.-P. 147-154.] [4]. Із відібраної крові робили мазки, фіксували 96% етиловим спиртом 30 хв., висушували та фарбували 15 хв. розчином азур-еозину за Романовським. Шматочки зябрової тканини фіксували сумішшю гліцерину, оцтової кислоти і води при об'ємному співвідношенні (1.1:10), відповідно. 97199 4 Одержані відбитки тканин також фарбували за Романовським протягом 45 хвилин. Аналіз препаратів крові та тканини зябер проводили під світловим мікроскопом, загальне збільшення х1000, і визначали кількість клітин з мікроядрами та подвійними ядрами в контрольній та досліджуваній групах. Потім проводили порівняльний аналіз кількості утворених мікроядер та подвійних ядер. Частота утворення мікроядер (МЯ) та подвійних ядер (2Я), а саме величина відхилення від контролю була використана для оцінки генотоксичності води. Отримані дані представлені в таблиці 1, де показники аномалій ядер (МЯ та 2Я) виражені у абсолютній величині і проміле. Проміле (лат. "pro mille" - за тисячу) - одна тисячна частка якої-небудь величини, позначається сим-3 волом "%о". 1 %о = 10 = 0,001 =0,1 %. Як впливає із даних таб. 1, у відомому способі [3] протягом експозиції спостерігалася загибель риб як у контрольному (табл. 1, графа 2), так і дослідному (табл. 1, графа 7) водному середовищі. Наприклад, для риби кефаль-лобан (Mygil sefalus) у контрольній групі вижили 7 особин, у дослідній групі вижили 6 особин. Згідно з нормативним документом [ДСТУ 4074-2001 Якість води. Визначання гострої летальної токсичності хімічних речовин та води на прісноводній рибі Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae). Частина 1. Статичний метод (ISO 7346-1:1996, MOD)] [5] загибель риби у досліді не повинна перевищувати 10 %, що від загальної кількості рибин п=10 становить одну рибину. Однак, при реалізації відомого способу спостерігається загибель кефалі-лобана у контрольному середовищі - 30 %, у дослідному середовищі - 40 %, що перевищує нормативний показник 10 %. Високий відсоток загибелі тест-об'єкту негативно впливає на точність визначення токсичності водного середовища на клітинному рівні. Так, при визначенні за показниками мікроядер (МЯ) і подвійних ядер (2Я) відзначалась наявність аномалії ядер навіть у контрольній групі: наявність в клітинах крові 1,33 %о мікроядер та 0,67 %о подвійних ядер і в клітинах зябрової тканини 0,67 %о мікроядер та 0,33 %о подвійних ядер. Наявність аномалії ядер (МЯ, 2Я) та загибель тест-об'єктів у контрольній групі впливає на визначення аномалії ядер у дослідній групі. Так, у досліджуваній групі спостерігається наявність в клітинах крові 1,66 %о мікроядер та 0,67 %о подвійних ядер, у клітинах зябрової тканини 0,67 %о мікроядер та 0,66 %о подвійних ядер. Це свідчить про неправильну підготовку тест-організмів для визначення токсичності водного середовища, що впливає на точність та інформативність щодо визначення впливу токсичних речовин на тест-об'єкт. Таким чином, основним недоліком способу [3] слід відмітити, невисоку точність та інформативність щодо визначення різних видів токсичності водного середовища за рахунок недостатньо повної підготовки біологічного об'єкту для визначення токсичності води, що призводить до загибелі рибин в контрольному середовищі та в свою чергу до утворення аномалії ядер при мікроядерному аналізі. 5 Задача, на вирішення якої направлений винахід, - удосконалити спосіб підготовки біологічного об'єкту для визначення токсичності води, в якому проведення адаптації відібраних рибин у заявленому контрольному сольовому середовищі забезпечило б практично повне виживання тест-об'єктів у контрольному і досліджуваному розчинах та відсутність утворення аномалії ядер при мікроядерному аналізі в різних тканинах у риб в контрольному розчині. Все вказане вище призведе до підвищення точності та інформативності визначення показників різних видів токсичності: загальної токсичності, цитотоксичності та генотоксичності водних зразків. Для вирішення поставленої задачі запропоновано спосіб підготовки біологічного об'єкта для визначення токсичності води, що включає відбір біологічного об'єкта за який використовують риб, в якому, згідно з винаходом, відбирають однорідні за масою і довжиною особини та витримують останні у контрольному сольовому середовищі 10-14 діб при температурі 18-22 °С із вмістом вуглекислого 3 3 газу - 2,5-4,5 мг/дм та кисню 6,5-8,5 мг/дм і рН 68, причому для прісноводних риб солевміст контрольного середовища складає: СаСl2 - 280-310 3 3 мг/дм ; MgSO4 - 110-140 мг/дм ; NaHCO3 - 50-70 3 3 мг/дм ; KCl - 4-7 мг/дм , а для морських риб солевміст контрольного середовища складає: СаСl2 3 3 300-350 мг/дм ; MgSO4 - 130-180 мг/дм ; NaHCO33 3 70-110 мг/дм ; КСl - 24-47 мг/дм . Нами запропонований спосіб підготовки біологічного об'єкта для визначення токсичності водного середовища, який оснований на адаптуванні тесторганізмів у контрольних сольових розчинах. При експозиції тест-об'єктів в сольовому розчині створюються умови реабілітації відібраних особин; тобто, здійснюється адаптація риб після стресового відбору. Розміщення адаптованих риб у контрольному і досліджуваному розчинах забезпечує відсутність як летального виходу рибин, так і утворення аномалії ядер при мікроядерному аналізі у контрольному розчині. Це забезпечує виявлення дії токсичних речовин безпосередньо на організм риби у воді, а не дії інших факторів на організм, наприклад різка зміна гідрологічних показників, а саме температури, рН, сольового складу, вміст кисню та вуглекислого газу, що вносить похибку в одержані дані при оцінці токсичності водного середовища. При реалізації заявленого способу досягається достатньо точний результат визначення токсичності водного середовища за рахунок попереднього адаптування риби, особливо для тест-організмів, які є високочутливими та мають різну специфічність, тобто диференційовану реакцію на речовини різної природи. Таким чином сукупність суттєвих ознак запропонованого способу підготовки біологічного об'єкту (риби) для визначення токсичності водного середовища, є необхідною і достатньою для досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату - значного покращення результатів щодо отримання об'єктивної, повної та достовірно точної оцінки різних видів токсичності: загальної токсичності, цитотоксичності та генотоксичності водних зразків. 97199 6 Спосіб реалізується наступним чином. В способі підготовки біологічного об'єкта для оцінки токсичності водних зразків відбирали по 2530 особин, вагою 12-15 г, довжиною 8-10 см з кожного виду тест-організмів (риб) - карась сріблястий (Carassius auratus gibelio, золота рибка (Carassius auratus auratus), короп (Cyprinus carpio), кефальлобан (Mygil sefalus). Відібрані особини адаптували, з одночасним підтримуванням життєдіяльності, 3 в окремих акваріумах об'ємом 60 дм впродовж 1014 діб, при температурі 18-22 °С у сольовому середовищі, із вмістом вуглекислого газу - 2,5-4,5 3 3 мг/дм та кисню 6,5-8,5 мг/дм і рН 6-8, причому для прісноводних риб солевміст контрольного се3 редовища складала: СаСl2 - 280-310 мг/дм ; 3 3 MgSO4 - 110-140 мг/дм ; NaHCO3 - 50-70 мг/дм ; 3 КСl - 4-7 мг/дм , а для морських риб солевміст контрольного середовища складала: СаС12 - 300-350 3 3 мг/дм ; MgSO4 - 130-180 мг/дм ; NaHCO3- 70-110 3 3 мг/дм ; КСl - 24-47 мг/дм . Після підготовки, тобто адаптування організмів, дослідження проводили за наступною схемою: відбирали чотири дослідні групи риб по 20 особин в кожній групі: 10 особин для контрольного зразка, 10 особин для досліджуваного зразка. Як контрольний зразок використовували підготовлену лабораторну воду (відстояна водопровідна вода), яка відповідала стандартним рівням гідрохімічних показників: вміст О2 у воді акваріумів становив 3 3 7,52+0,19 мг/дм , СО2 - 2,34+0,13 мг/дм , а значення рН - 7,64+0,13, температура складала 20±2 °С [Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90. - М, 1991. - 29 с] [6]. Як об'єкт дослідження брали водний розчин 3 солі кадмію, який містив кадмію (Cd) 1,0 мг/дм [ГОСТ 4330-76 Реактивы. Кадмий хлористый 2,5водный. Технические условия] [7]. Дослідну групу розміщали у водний зразок з 3 концентрацією Cd 1,0 мг/дм , а другу групу - у контрольну воду, та витримували протягом 96 годин. Після експозиції риб у водних зразках, через 96 год., у всіх риб відбирали тканини зябер та венозну кров і готували препарати для цитологічного аналізу. Фрагменти зябрової тканини фіксували сумішшю гліцерину, оцтової кислоти і води при об'ємному співвідношенні (1:1:10), відповідно. Одержані відбитки тканин фарбували за Романовським протягом 45 хвилин. Кров відбирали з хвостової вени, краплю крові наносили на попередньо знежирене предметне скло. Препарати висушували на повітрі, попереджуючи попадання пилу, фіксували в 96 %-му етанолі 30 хв і знову висушували. Фіксовані препарати зберігались в сухому місці до проведення цитологічного аналізу. Препарати фарбували безпосередньо перед аналізом: на мазок наливали піпеткою 10-15 крапель готового барвника-фіксатора Мая-Грюнвельда, через 3-5 хвилин додавали по краплинах стільки ж води і продовжували забарвлення іще 1 хвилину, після чого барвник змивали дистильованою водою і мазок висушували на повітрі. На висушений мазок наливали свіжоприготований розчин барвника Романовського 2% на 8-15 хв. (в залежності від температури в приміщенні), змивали барвник водою і мазок висушували. 7 Цитологічні препарати аналізували під світловим мікроскопом із загальним збільшенням х1000. Кількість клітин, проаналізованих для кожної риби, складала 3000. Статистична обробка проводилася стандартними методами, токсичний ефект вважається дійсним при статистично достовірній різниці із контролем [Лакин Г. Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1980. - 293 с] [8]. Для якісного визначення токсичного ефекту водного середовища, за допомогою тест-об'єктів (риб), їх цито- та генетичних показників клітин, нами були здійснені досліди з визначення впливу токсичної речовини (Cd) на вибрані показники (на ядра клітин крові та зябер). Для визначення аномалії ядер підраховували частоту утворення мікроядер та подвійних ядер на 3000 клітин еритроцитів та клітин зябрової тканини, а потім підраховували відсоток кожного виду аномалій ядер в проміле (%о). Визначені показники -частоти утворення аномалії ядер, порівнювали з контрольними і оцінювали цито- та генотоксичність водного середовища. Приклади реалізації за винаходом. Приклад 1. Як тест-організм використовували морську рибу кефаль-лобан (Mygil sefalus). Відібрали 30 особин, вагою 12-15 г, довжиною 8-10 см і поміщали в 3 акваріум об'ємом 60 дм , що містив сольове сере3 довище із вмістом СаСl2 -300-350 мг/дм ; MgSO4 3 3 130-180 мг/дм ; NaHCO3 - 70-110 мг/дм ; КСl - 243 47 мг/дм та вмістом вуглекислого газу - 2,5-4,5 3 3 мг/дм , кисню 6,5-8,5 мг/дм , рН 6-8 і температурою 18-22 °С. Процес адаптування здійснювали протягом 14 діб; причому спостерігалася загибель тільки однієї особини, що становить 3 % (табл. 2, графи 2, 3). Після адаптації тест-організмів відібрали 20 особин: 10 особин для контрольного зразка, 10 особин для досліджуваного зразка. Готували досліджуваний розчин з концентрацією кадмію 1,0 3 3 мг/дм у ємності об'ємом 30 дм та розміщали в ній дослідну групу; а другу групу поміщали у ємність 3 об'ємом 30 дм з контрольною водою та витримували особини в обох ємностях протягом 96 годин. Після експозиції риб у водних зразках, через 96 год., у всіх риб відбирали тканини зябер та венозну кров для цитологічного аналізу. Препарати готували як описано вище (стор. 7). Цитологічні препарати аналізували під світловим мікроскопом із загальним збільшенням х1000. Кількість клітин, проаналізованих для кожної риби, складала 3000. Статистична обробка проводилася стандартними методами, токсичний ефект вважається дійсним при статистично достовірній різниці із контролем. Як видно із даних таблиці 2 у риби кефальлобан (Mygil sefalus), протягом експозиції (96 годин) не спостерігалася загибель риб як у контрольному (табл. 2, графа 4), так і досліджуваному 97199 8 (табл. 2, графа 9) водних середовищах. При дослідженні на ядерному рівні у дослідної групи визначалася наявність мікроядер в клітинах крові 3 %о та подвійних ядер 2,33 %о, і в клітинах зябрової тканини 2,66 %о мікроядер та 1,33 %о подвійних ядер. У контрольній групі риб аномалії ядер не спостерігалася. Це свідчить про правильну підготовки заявленого способу. Слід відмити, що при реалізації відомого способу [3] спостерігається загибель кефалі-лобана у контрольному середовищі - 30 %, у досліджуваному - 40 %, що перевищує нормативній показник 10 % (таблиця 1, приклад 2 і 7), а також визначається наявність аномалій ядер у контрольному середовищі. Приклад 2. Як тест-організм використовували прісноводну рибу золота рибка (Carassius auratus auratus). Відібрали 30 особин, вагою 12-15 г, довжиною 8-10 3 см і поміщали їх в акваріум об'ємом 60 дм , що містив сольове середовище із змістом СаС12 280-310 мг/дм ; MgSO4 - 110-140 мг/дм ; NaHCO3 3 3 50-70 мг/дм ; КСl - 4-7 мг/дм та вмістом вуглекис3 3 лого газу - 2,5-4,5 мг/дм , кисню 6,5-8,5 мг/дм , рН 6-8 і температурою 18-22 °С. Процес адаптування здійснювали протягом 14 діб; загибель тесторганізмів не спостерігалася (табл. 2, графа 2, 3). Після адаптації визначення токсичності водного середовища здійснювали аналогічно прикладу 1. Дані представлені в таблиці 2. Як видно із даних таблиці 2 у риб золота рибка (Carassius auratus auratus), протягом експозиції не спостерігалася загибель риб як у контрольному (табл. 2, графа 4), так і дослідному (табл. 2, графа 9) водних середовищах. При дослідженні на цитолгичному рівні у дослідної групи визначалася наявність мікроядер в клітинах крові 2,33 %о та подвійних ядер 2 %о, і в клітинах зябрової тканини 1 %о мікроядер та 1,33 % подвійних ядер. У контрольної групи риб аномалії ядер не спостерігалася. Це свідчить про правильну підготовку заявленого способу. Реалізація способу підготовки біологічного об'єкту для визначення токсичності води, що заявляється, забезпечує правильність проведення досліджень, запобігає загибелі організму під час досліджень, приводить до підвищення чутливості організму на клітинному рівні до дії токсичності водного середовища, забезпечує одержання більш точної інформації про токсичну дію різних токсикантів у водному середовищі на клітинному рівні, а саме на структуру генетичного апарата організму. Це є необхідною і достатньою для досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату значного покращення результатів щодо отримання об'єктивної, повної та достовірно точної оцінки різних видів токсичності: загальної токсичності, цитотоксичності та генотоксичності питної води. 9 97199 10 Таблиця 1 3 Контрольна група Клітини Клітини крові зябер Кількість Кількість особин, що особин, що МЯ МЯ вижили вижили 2Я 2Я % % n=10 1 Кумжа (Salmo trutta) Вугор (Ангілья Ангілья) Гольян (Phoxinus Phoxinus) Кефальлобан (Mygil sefalus). 2 3 4 5 Дослідна група (Cd 1,0 мг/дм ) Клітини крові Клітини зябер МЯ 2Я МЯ 2Я Відх. Відх. Відх. Відх. від від від від контр. контр. контр. контр. 8 9 10 11 12 13 14 15 6 7 1 8 0,67 + 0,67 0,67 + 1,33 + 0,67 8 1 0,33 0,33 0,67 9 1 0,33 0,67 0,33 8 1 0,67 + 1 + 0,33 7 1,33 0,67 0,67 0,33 6 1,66 + 0,67 0,67 0,67 + 8 0,33 0,67 0,33 9 0,67 0,33 0 Таблиця 2 n=10 1 Карась сріблястий (Carassius auratus gibelio) Золота рибка (Carassius auratus auratus) Короп (Cyprinus carpio) Кефальлобан (Mygii sefalus) Контрольна група Дослідна група (Cd 1,0 мг/дм^) Клітини Клітини Адаптування Клітини крові Клітини зябер 14 діб. Кіль- Кількість крові зябер Кількість особин, МЯ 2Я МЯ 2Я кість особин особин, що вижищо вижиМЯ Відх. Відх. Відх. Відх. МЯ 2Я 2Я ли ли % % від % від % від % від ДО після контр. контр. контр. контр. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 30 30 10 0 0 0 0 10 1,66 + 1,33 + 1 + 1,67 + 30 30 10 0 0 0 0 10 2,33 + 2 + 1 + 1,33 + 10 0 0 0 0 10 2 + 1,33 + 1,67 + 1 + 10 0 0 0 0 10 3 + 2,33 + 2,66 + 1,33 + 30 30 зо 29 Комп’ютерна верстка М. Мацело Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601