Фрагмент днк, який детермінує стерильність оgurа та надає цитоплазматичну чоловічу стерильність при наявності його в мітохондріальному геномі рослин, проба днк для гібридизації з даним фрагментом

1. Фрагмент ДНК, детерминирующий стерильность Ogura и сообщающий цитоплазматическую мужскую стерильность при наличии его в митохондриальном геноме растений, со следующей нуклеотидной последовательностью: (21) 93004577 (22) 20.09.91 (24) 30.08.99 (31)9011670 . (32) 21.09.90 (33) FR (86) РСТ/ЕР9Т/00741 (20.09.91) (46) 30.08.99. Бюл. № 5 (56) 1. GB № 2211205, кл. С 12 N 15/00, 1989. 2. WO № 8701726, кл. С 12 N 15/00, 1987. (72) Бономм Сандрін (FR), Бюдар Франсуаз (FR), Ланселен Домінік (FR), Пелетьє Жорж (FR) (73) Енстітю насьональ де ля рєшерш агроиомік (FR) С GTTTCATTCTGCATCACTCTCCCTGTCGTTATC — + *+ + 960 961 GACATCGCAAGOTTTTTGAAACGGCCGAAACGGGAAGTGACAATACCGCTTTTCTTCAGC + + _ + + + *• 1020 ATATAAATGCAATGATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCACTC Ю21 + + + ' * + * 1 0 8 ° CTACTGAATGTAAAGTTAGTGTAATAAGTTTCTTTCTTTTAGCTTTTTTACTAATGGCCC ATATTTGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACGATCTA + + + + + + 1200 GAGAAGTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATA 1201 + + + + * *• 12 60 26445 AAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGCGGAA + + + + + 4- 13 20 12 61 ATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAA 1381 AAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATTGACCG + + * --+ + + AGAAAATAATGCTTTGTGAACCCAATTGCTTTGACAAAAATAAAGAAAGAAGCAAAATCT + ' + + + + + 1500 . 144 1 1501 CATTCAATTTGAAATAGAAGAGATCTCTATGCCCCCTGTTCTTGGTTTTCTCCCATGCTT . + + • + + * 1560 TTGTTGGTC 1561 2. Проба ДНК для гибридизации с фрагментом ДНК по п. 1, имеющая не менее 10 последовательно расположен ных нуклеотидов, меченных радиоактивными или нерадиоактивными средствами, последовательности: * __ + gg0 + + + CAAAGTAAGACGTAGTGAGAGGGACAGCAATAG 9 61 + + 1 + + • Ю20 » CTGTAGCGTTCCAAAAACTTTGCCGGCTTTGCCCTTCACTGTTATGGCGAAAAGAAGTCG 10 2 1 + + * • • + ЮвО TATATTTACGTTACTAATGGAAAAAGCTTTTTAACAGGTGAAAAACAGTATTAGAGTGAG 1081 •» * • + * + *• 1 М О GATGACTTACATTTCAATCACATTATTCAAAGAAAGAAAATCGAAAAAATGATTACCGGG + + + + *• + 1200 TATAAACCGATTCGACCAAAAGATTGTTGGTTGTAACAAATGCTTGGTACTCTGCTAGAT . _ - _ _ _ * . _ _ _ _ _ _ _ _ _ - * . _ - _ —_ _ _ _ _ . * . _ _ _ _ _ _ _ - . _ * * і ? £ i l CTCTTCAATTTTTAAGGTATACTTAAAGTCATACCCACCGATCCACAGTTTTAATGTTAT 12 61 + + + * + + 13 20 TTTAGTTTACATGGATTGCTACTTCACTGCTTTTTTCAGAGTGGATAGTAATTTCCCCTT 1321 + * * + •• * * TATCTCCCCTTTCTCCTTTTTTTTCTCCCCTTTCCCCTTTATCTCCCCTTTCTCCT T ГТТ І ІВ0 5 1381 + 26445 + • + • б -- + + + що TTTCTCCCCTTTCCCCTTTATCTCCCCTTTCTCCTTTTTTTTCTCCACCTTTTAACTGGC 14 4 1 + + + + * • +1500 TCTTTTATTACGAAACACTTGGGTTAACGAAACTGTTTTTATTTCTTTCTTCGTTTTAGA 1501 + + * * + + і ^ 60 GTAAGTTAAACTTTATCTTCTCTAGAGATACGGGGGACAAGAACCAAAAGAGGGTACGAA 1561 + AACAACCAGT • j . ' Изобретение касается биологического материала, обладающего мужской стерильностью, который используется для разработки гибридных разновидностей культур сельскохозяйственного значения. 5 Оно касается, в частности, растения, принадлежащего к семейству крестоцветных, в которых цитоплазма клеток содержит органеллы, имеющие такую нуклеотидную последовательность, которая сооб- 10 щает мужскую стерильность и высокие агрономические характеристики. Разработка гибридных разновидностей может быть ускорена или возможна в результате использования цитоплазматичес- 15 кой системы мужской стерильности. Гибриды получаются путем перекрестного оплодотворения двух родственных популяций, одна их которых выполняет мужскую роль, а другая - женскую. Одним из 20 препятствий, которые имеют место, когда желательно получить гибридные разновидности одинакового качества при половом скрещивании самооплодотворяющихся видов, является способность растения к са- 25 моопылению. Системы мужской стерильности обеспечивают возможность получения женских растений, которые не способны к самооплодотворению, и от которых, после опыления, могут быть непос- 30 редственно взяты семена, которые все являются гибридами, без применения трудоемких приемов, таких, как кастрация цветов. Генетические детерминанты мужской 35 стерильности включают такие, которые несет цитоплазма. В каждой продуцируемой половым путем генерации они переносятся исключительно матерью. Таким образом, в каждом гене генерации получается 40 100% потомства мужской стерильности и системой цитоплазматической мужской стерильности (CMS). Эти генетические детерминанты переносятся геном митохондрии. Подходящая цитоплазматическая система мужской стерильности в крестоцветных определяется следующими характеристиками 1. Мужская стерильность должна быть полной, то есть не должно быть опыленного продукта независимо от условий культивации и независимо от линии, которая желательна для использования в качестве женского родителя. Когда этого условия нет, семена, собранные с этих женских растений, будут происходить частично от самооплодотворения, и, следовательно, они не будут семенами гибридного типа F1. 2. Получение этих семян следует осуществлять, используя преимущество естественных опыленных векторов, то есть в случае данных видов, опыляемых с помощью перепончатокрылых, двукрылых и оплодотворяемых пыльцой, переносимой ветром Пыльца должна переноситься от опылящих растений к стерильным мужским (женским) растениям. Практически в семействе крестоцветных такой перенос могут осуществлять лишь насекомые. Женские растения, таким образом, должны быть достаточно привлекательными для насекомых, которые прилетают к ним и собирают нектар. Морфология цветов должна быть такой, чтобы насекомые выполняли эту задачу через верхушку цветка так, чтобы их грудка контактировала с рыльцем пестика. Практически это приводит к такой ситуации, при которой основание лепестков должно образовывать определенный тип трубочки вокруг основания пестика. 3. Морфология женских органов (пестик) должна быть идентична морфологии фертильного растения, особенно растения с одним лепестком в цветке и быть прямолинейной по форме. Мужские стерильности очень часто приводят также к феминизации пыльника, которые транс 26445 формируются в псевдопестики, и даже в трансформации нектаринов в полные цветки. Иногда образуемые таким путем пестик или пестики, также деформируются. Все эти отклонения то нормы не позво- 5 ляют получать хорошие семена, и это может рассматриваться как эквивалент некоторой степени женской стерильности. 4. Для получения гибридных разновидностей F1 в тех видах, от которых 10 собираются семена, таких, как рапс или горчица, важно, чтобы мужской родитель гибрида полностью исключал эффект мужской стерильной цитоплазмы, так, чтобы гибридные растения легко опылялись. 15 Первый случай мужской стерильной цитоплазмы или CMS в семействе крестоцветных был описан Ogura (1968) в редьке, Raphanus sativus. Bannerot (1974, 1977) перенес цитоплазму Ogura в Brassicae, 20 получая таким образом растения, обладающие цитоплазматической мужской стерильностью. Эти же самые растения не обладают требуемыми агрономическими характеристиками {хлороз при понижении 25 температур, слабая женская фертильность), что приводит в результате к низкой урожайности, ввиду чего они непригодны для коммерческого использования. Для устранения хлороза в растениях 30 семейства крестоцветных ядерные и хлоропластовые геномы одного и того же рода должны быть объединены в одной и той же клетке. Так, растения рода Brassica, имеющие один из хлоропластовых гено- 35 мов Brassica, уже больше не проявляют хлороз. Если они имеют полный митохондриальный геном Ogura, то они проявляют полную цитоплазматическую мужскую стерильность, но, однако, цветы бу- 40 дут иметь отклоняющуюся от нормы морфологию, что делает невозможным для них опыление естественными векторами. Кроме того, для тех видов, к семенам которых проявляется интерес, очень важ- 45 но восстановить мужскую фертильность гибридных видов, которые маркетируются посредством ядерных генов, известных, как гены-восстановители. Трудно восстановить мужскую фер- 50 тильность растения, имеющего всю полноту митохондриапьного генома Ogura, поскольку необходимо одновременное участие нескольких генов восстановителей. 55 Авторы провели работу с целью получения подходящей системы мужской стерильности путем удаления генов, ответственных за нежелаемые характеристики цитоплазмы Ogura с сохранением мужской 8 стерильности, которая эффективна и легко восстанавливается. Таким образом, настоящее изобретение касается последовательности ДНК, которая далее будет рассматриваться как последовательность ДНК со стерильностью Ogura, которая отличается тем, что: а) ее переносит последовательность ДНК, связанная нуклеотидами 928 и 2273, как показано на фиг. 1, или б) она по меньшей мере на 50% гомологична указанной последовательности, упомянутой в а). И в случае, когда она присутствует в митохондриальном геноме растения, она придает цитоплазматическую мужскую стерильность указанному растению. В частности, объектом данного изобретения является последовательность ДНК со стерильностью Ogura, отличающаяся тем, что: с) последовательность между нуклеотидами 928 и 1569, как показано на фигуре 1, или д) по меньшей мере на 50% гомологична указанной последовательности в с), причем транскрибируется в РНК в митохондриях растений с мужской стерильностью. На фиг. 1 показана нуклеотидная последовательность митохондриального фрагмента ДНК редьки Ogura, несущая признак C...S; на фиг. 2: рестрикционная карта митохондриального фрагмента ДНК, описанного на фиг. 1; на фиг. 3 - электрофорез митохондриальной ДНК после расщепления Bglt (За) и Nrul (36). Обнаруженные полосы соответствуют гибридизации с пробой Coxl (Hiesel et al. 1987); на фиг. 4 - электрофорез митохондриальной ДНК после расщепления Sail обнаруженные полосы соответствуют гибридизации с пробой, содержащей последовательность между нуклеотидами №№ 389 и 1199 последовательности, описанной на фиг. 1; на фиг. 5 - плоды капустных растений, несущих различные цитоплазматические геномы; на фиг. 6 - электрофорез митохондриальной РНК (обнаруженные полосы соответствуют гибридизации с пробой, фрагментом EcoRIBamHI, включая участок последовательности, относящейся к OFR В). Последовательность ДНК со стерильностью Ogura определена в отношении последовательности, между номерами 1 и 2428, как показано на фиг. 1. Она переносится транскрибированной последовательностью, у которой З'и 5' концы связанны пунктирной линией на фиг. 2, и , *. ' 26445 которая наблюдается лишь у растений с мужской стерильностью. ORF В соответствует открытой рамке считывания; это обозначение дано на основе или наблюдаемой Гомологии с последовательностью, описанной Brennicke. На фиг. 2, последовательность, соответствующая одному из генов транспортной РНК, затемнена. Последовательность ДНК между нуклеотидами под номерами 928 и 2273, как показано на фиг. 6 соответствует транскрипту, который может визуализироваться путем молекулярной гибридизации (1, 4), как показано на фиг. 6. На этой фиг. 6 каждая ячейка соответствует фертильному растению (F) или растению с мужской стерильностью (S). Лишь растения с мужской стерильностью синтезируют транскрипт примерно из 1 400 оснований. Этот транскрипт начинается с положения 928 (± 10 оснований) последовательности, показанной на фиг. 6 и заканчивается в положений 2273 (± 5) {начало и завершение транскрипции может иметь место в различных положениях в растительной митохондрии). Настоящее изобретение касается предпочтительно цитоплазмы, содержащей последовательность ДНК, имеющую не менее, чем на 50% гомологии с последовательностью, между нуклеотидами 928 и 2273, на фиг, 1, сообщающей признаки CMS, или касается цитоплазмы, содержащей последовательность ДНК, имеющую не менее, чем на 50% гомологии с последовательностью, между нуклеотидами 928 и 1569, фиг. 1, и транскрибированную в РНК, сообщающей признак CMS, и отличающейся тем, что содержит хлоропласты тех же видов, что и ядерный геном или других видов, но которые совместимы с данным ядерным геномом, не содержит вовсе или часть одного или другого ( или обоих) фрагмента (фрагментов) митохондриального генома Ogura, определяемого ниже: * несущего один из двух формилметиониновых генов транспортной РНК, используемых для инициирования трансляции, * несущего ген Сохі, кодирующий субъединицу № 1 цитохромооксидазы. Отсутствие этих фрагментов, рассматриваемых как "нежелательные последовательности", необходимо для того, чтобы получить митохондриальные геномы, соответствующие мужской стерильности высокого качества, соответствующие четырем определяемым выше характеристикам. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение касается комбинантного растительного ядра или митохондриального генома, отличающегося тем, что содержит последовательность ДНК со стерильностью а) которую несет последовательность ДНК, между нуклеотидами 928 и 2273 последовательности, показанной на фиг. 1, или б) которая по меньшей мере на 50% гомологична указанной последовательности, упомянтой в а), и сообщает, в случае присутствия в цитоплазме растения, цитоплазматическую мужскую стерильность указанному растению. В частности одним из объектов данного изобретения является рекомбинантное растительное ядро или митохондриальный геном, отличающийся тем, что содержит последовательность ДНК со стерильностью Ogura с) которая представляет последовательность между нуклеотидами под номерами 928 и 1569, фиг. 1, или в) которая по меньшей мере на 50% гомологична указанной последовательности, упомянутой в с), и сообщает, в спучае присутствия в цитоплазме растения транскрибирования в РНК, цитоплазматическую мужскую стерильность указанному растению. Ядерный или миюхондриальный геном отличается тем, что этот рекомбинантный митохондриальный геном лишен всех или части геномных фрагментов Ogura: 1 - несущих один из двух генов формилметиониновой транспортной РНК, используемых для инициирования трансляции, - несущих ген Сохі, кодирующий субъединицу № 1 цитохромооксидазы, или в котором указанные фрагменты неактивны. В частности, рекомбинантный мито* хондриальный геном, отвечающий настоящему изобретению, может отличаться: 1) тем, что он лишен всего или части фрагмента примерно 10,7 kb после вываривания с Bgli, или фрагмента примерно 11 kb после вываривания с Nrui, которые (фрагменты) несут ген Сохі. Это иллюстрируется, в частности, как показано на фиг. 3, молекулярной гибридизацией с пробой, несущей последовательность Сохі, 2) тем, что он лишен всего или части фрагмента 5,1 kb после вываривания с Sali, или фрагмента примерно 15 kb пос 11 ле вываривания с Nrui, или фрагмента примерно 18 kb после вываривания с Bgli, которые (фрагменты) несут один из генов формилметиониновой транспортной РНК. Это продемонстрировано, в частности, как показано на фиг. 4, молекулярной гибридизации с пробой, связанной нукГенотипы 8. п 27 OGU 9, 17, 21, 24, 27С В. о 12 26445 леотидами №№ 389 и 1199 последовательности, описанной на фиг. 1. На фиг. 3 и 4 генотипы, обозначенные цифрами, соответствуют растениям, имеющим подходящую систему с мужской стерильностью. Хлоропласты В. napus В. napus R. sativus (OGU) В. oleracea В. oleracea Кроме того, присутствие признака CMS высокого качества вызывает необходимость присутствия последовательности ДНК, которая может быть идентифициро- 20 вана путем гибридизации ДНК/ДНК при обработке рестриктазами. Таким образом, настоящее изобретение касается последовательности ДНК, которая может быть определена и которая отличается тем, что 25 заключает в себе последовательность, дающую фрагмент 2,5 кб после расщепления Ncoi, дает фрагмент 6,8 кб после расщепления Nrul и дает фрагмент 4,4 кб после расщепления Sail 30 Эта последовательность может быть также идентифицирована путем гибридизации на полной РНК растений с мужской стерильностью. Проиллюстрирован транскрипт примерно на 1 400 оснований. Он 35 отсутствует в растениях, возвращающихся к фертильности. Определение "нежелательный" нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных последовательностей "существенно 40 важное" для стерильности согласно данному изобретению, позволяет выбрать растительный материал, несущий хлоропласты, которые совместимы с ядерным геномом и несут митохондрии высокого 45 качества. Путем ДНК гибридизации, способа хорошо известного для специалистов в данной области, не ожидая при этом взрослых растительных особей и появления цветов и плодов. 50 Таким образом, в распоряжении потребителя имеется высокоэффективное средство для выбора растений, имеющих цитоплазму с мужской стерильностью с высокими агрономическими характеристиками. 55 Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение касается митохондриона, отличающегося тем, что включает нуклеотидную последовательность, соответствующую ДНК, имеющую не менее, Митохондрия В. napus В. napus/Ogura R. sativus (OGU) В. oleracea/Ogura В. oleracea чем примерно 50% гомологии с последовательностью, между основаниями под номерами 928 и 2273, как показано на фиг. 1, и кодирующую цитоплазматическую мужскую последовательность ДНК, между нуклеотидами 928 и 1569, фиг. 1, или имеющую на 50% гомологию с данной последовательностью, и которая траснскрибируется в РНК в митохондриях растений с мужской стерильностью. Эта ДНК может обладать, кроме того, свойствами, которые определены выше, в частности, в ней могут отсутствовать нежелательные последовательности. Настоящее изобретение" касается также цитоплазмы крестоцветных, отличающейся тем, что включает последовательность ДНК со "стерильностью Ogura": та цитоплазма включает, кроме того, хлоропласты тех же или других видов, но которые совместимы с ядерным геномом. Последовательность со стерильностью Ogura отличается тем, что: а) содержится последовательность ДНК на 2428 основных пар, как показано на фиг. 1, б) находится между нуклеотидами 928 и 2273, показанными на фиг. 1 и соответствует транскрипту, который на фиг. 2 показан пунктирной линией, и визуализируется посредством молекулярной гибридизации (1,4), как показано на фиг. 6, в) имеет не менее, чем на 50% гомологию с указанной последовательностью в б) и в случае ее присутствия в митохондриальном геноме растения сообщает цитоплазмо вую мужскую стерильность указанному растению, или г) представляет последовательность, между нуклеотидами 928 и 1569, и она транскрибируется в РНК в митохондрии стерильных растений, или д) дает не менее, чем на 50% гомологию с последовательностью, описанной 13 26445 в г), и транскрибируется в РНК в митохондриях стерильных растений. Настоящее изобретение касается также растения из семейства крестоцветных, отличающегося тем, что содержит хлоропласты и ядра тех же видов или которые совместимы, и митохондрии, несущие геном, сообщающий признак CMS, как определено выше В частности, настоящее изобретение касается также растения, принадлежащего к семейству Brassica, и митохондрии, несущие геном, придающий признак CMS, как было определенно выше Эти митохондриальные геномы должны также нести определенное число генов растений семейства Brassica Это достигается путем рекомбинации между геномом Ogura и геномом Brassica Настоящее изобретение касается, в частности, растения, принадлежащего к разновидности Brassica napus, отличающегося тем, что содержит в себе ядро Brassica, и тем, что цитоплазма содержит в себе хлоропласты Brassica и стерильные мужские митохондрии, несущие ДНК, отвечающие данному изобретению, как было определено выше, эти митохондрии могут нести также наибольшую часть митохондриальных генов Brassica napus (18S, Atp9, Atp6, Coxll, ndht, cob) Brassica napus соответствует рапсу или каноле и брюкве. Настоящее изобретение касается растения разновидности Brassica oleracea, отличающегося тем, что оно содержит ядро Brassica и тем, что цитоплазма содержит хлоропласты Brassica и митохондрии, заключающие в себя последовательности ДНК, кодирующую признак CMS, который определен выше. Brassica oleracea охватывает различные типы капустных растений1 капусту с круглой формой кочана, Брюссельскую капусту, kohl-rabi, Брокколи, кормовую капусту и капусту цветную. Настоящее изобретение касается также растений разновидности капустных {Brassica campestns), отличающегося тем, что оно заключает в себе ядро Brassica и тем, что цитоплазма содержит хлоропласты Brassica, которые совместимы с ядерным геномом, и митохондрии, включающие последовательность ДНК, кодиГенотип г z(A) z(6) z(9) z(17) 5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 14 рующую признак CMS, который определен выше. Brassica campestns соответствует рапсу, турнепсу и Китайской, Пекинской и Японской капусте. Настоящее изобретение касается также растений, выбранных из группы, включающей разновидности В juncea, В. nigra, В. hirta и В cannata, отличающиеся тем, что содержат в себе ядро Brassica, и тем, что цитоплазма заключает в себе хлоропласты Brassica, которые совместимы с ядерным геномом, и митохондрии, содержащие последовательность ДНК, кодирующую признак CMS, который определен выше Согласно следующим аспектам, обьектом данного изобретения является растение, принадлежащее к семейству капустных (Brassica), у которого ядерный геном заключает в себе последовательность со стерильностью, которая определена выше, а также элементы, действующие на экспрессию и транспорт продукта трансляции в митохондрион Это растение, в частности, принадлежит к одному из следующих видов* В napus В, oleracea, В campestns, В ntgra, В juncea, В hirta, В cannata Присутствие "последовательности со стерильностью Ogura" необходимо и достаточно для того, чтобы индуцировать полное отсутствие пыльцы при отсутствии генов восстановителей Опыление этих растений является обычно результатом хорошего продуцирования нектара. Морфология женских органов обычная, и плоды (стручки), которые образуются, содержат нормальное число семян На фиг. 5 показана морфология, наблюдаемая у нормальных контрольных растений (г), растений, имеющих отклоняющуюся от нормы морфологию, имеющих полный геном Ogura (z{6)) и хлоропласты Brassica oleracea капустных растений, несущих хлоропласты Brassica napus и митохондрии с мужской стерильностью, имеющие гены Brassica napus (z(A)), и у растений, несущих хлоропласты Brassica oleracea и рекомбинантные митохондрии, уже более не содержащие нежелательных последовательностей (z(9)) и (z(17)). Эти растения имеют следующие характеристики: і Хлоропласты В. oleracea В. napus В. oleracea В. oleracea В. oleracea Митохондрии В. oleracea В. napus/Ogura Ogura В. oleracea/Ogura В. oleracea/Ogura 15 26445 Генотипы г(А) и z(6) уже более не имеют нужной цитоплазматической системы с мужской стерильностью. Такие растения могут быть получены, например, путем слияния протопластов или другими способами, при которых происходит хорошая рекомбинация между митохондриальным геномом данных рассматриваемых видов и митохон-дриальным геномом Ogura. У таких растений фертильность устанавливается посредством одного гена-восстановителя, который обозначается как Rf1, источником которого является редька, что не бывает у растений, которые несут полностью нежелательный митохондриальный геном. Такие растения могут быть получены также путем естественного или искусственного воспроизведения половым путем. Растения, имеющие митохондриальный геном, отвечающие данному изобретению, могут быть получены также путем генного переноса в митохондрион. Во всех случаях, эти растения имеют желательную систему CMS, а именно: - полную мужскую стерильность, - морфологию, допускающую хорошее опыление и хорошее продуцирование семян, как иллюстрировано в табл. 1 и в табл. 2. Таким образом, настоящее изобретение касается способа получения гибридных растений, отличающихся тем, что они имеют подходящий признак CMS, содержащих последовательность со стерильностью Ogura в их митохондриальном или ядерном геноме способны к скрещиванию с нормальным растением, в случае пищевых или кормовых культур, или с растением, дающим восстанавливающий фертильность ген, Rfl, в случае, когда должны быть собраны семена. Настоящее изобретение касается гибридного растения, получаемого данным путем. Вообще говоря, наилучшие агрономические качества достигаются в случае растений с мужской стерильностью, имеющих хлоропласты тех же видов, что и ядра или митохондрии с подходящей системой с мужской стерильностью. В табл. 1 показана продуктивность капустной линии с различными цитоплазмами (подходящими являются генотипы Z9 и Z17). В табл. 2 показана продуктивность рапсовой линии с различными цитоплазмами {подходящими ЯВЛЯЮТСЯ генотипы Fu 27, Fu 58 и Fu 85). Предметом данного изобретения является также проба, заключающая в себе последовательность не менее, чем из 10 рамок, предпочтительно из 10 рамок, ко 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 торая связана нуклеотидами под номерами 928 и 1569, показанными на фиг. 1; и эта проба может быть мечена, например, радиоактивным основанием, или другими средствами, например, посредством флуоресценции. Эта проба может быть использована для демонстрации мужской стерильности' и может быть использована, в частности, для отбора клонов. Некоторые отличные особенности • и преимущества данного изобретения станут более ясными из описания нижеследующих примеров. П р и м е р 1. Иллюстрация последовательности ДНК, ответственной за цитоплазматическую мужскую стерильность Ogura, 1. Растение. "Цибрид" (цибрид - имеется в виду гибрид - перевод) означает формы, полученные путем слияния изолированных протопластов с последующей регенерацией и всего растения. Этот способ продуцирования позволяет получить информацию о цитоплазме от обоих родителей, которые одновременно находятся в клетке. Цибрид № 13 получен из растений в количестве до 820, регенерированных слияниями протопластов Ogura-cms, стойкого к триазину цибрида В. napus (потомство от Цибрида 77, описанного в публикации Pelletier et al., 1983 и Chetrit et al., 1985 и чувствительной к триазину и фертильной разновидности Brutor. Испытание на стойкость к триазину (Ducruet and Gasquez, 1978) осуществлялось на образцах листьев каждого регенерата, дающего тип хлоропласта (стойкие к триазину хлоропласты от родителя 77 или чувствительные к триазину хлоропласты, происходящие от линии Brutor), который должен быть определен. Осуществляли культивацию данных растений, и наблюдались следующие стадии цветения. Растения, проявляющие неродительские комбинации (как чувствительные/с мужской стерильностью, так и стойкие/с мужской фертильностью) были выбраны в качестве цибридов (Cybrids). Цибрид № 13 был чувствительным/с мужской фертильностью цибридром.Цибрид 1 был стойким/ с мужской фертильностью цибритом. 2. Изоляция нуклеиновой кислоты. Полная ДНК была выделена из листьев от четырехнедельных растений согласно способу, описанному Dellaporta (1983). Митохондриальная ДНК была экстрагирована из листьев 8-недельных растений, как было описано Vedel и Mathie, 1982, со следующими возможными вариантами. 17 26445 Митохондрии не очищались на сахарозном градиенте перед лизисом, и лизис осуществлялся в 4% саркозиле с содержанием 0,5 мг/мл протеиназы к { Boehnnger Mannheim GmbH) в 50 ммоль. Трис. рН8, 20 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). После осаждения митохондрическая ДНК очищалась путем центрифугирования на градиенте этилиденбромид/хлорид цезия (метод 1 - Vedel и Mathie, 1982) в пробирках из полиалломера. Полная РНК была выделена из листьев или цветочных почек согласно способу Logemann et al., 1987. Митохондриальная РНК была экстрагирована из 8-недельной цветной капусты согласно способу Stern и Newton, 1986. 3. Рестрикционные анализы митохондриальной ДНК и электрофорез на агарозном геле. Данные процедуры осуществлялись как описано Pelletier et a!., 1983. Полная или митохондриальная РНК была введена в гели для электрофореза, содержащие формальдегид, как было описано Sambrook et al., 1989 . 4. Гибридизация. Осуществляли перенос ДНК и РНК на нейлоновые фильтры (Нуbond-N, Amersham) путем капиллярной абсорбции с использованием 6 х SSC или 10 х SSPE, соответственно, согласно инструкциям изготовления. Предварительная гибридизация и гибридизация осуществлялись согласно Amersham с использованием проб, меченых посредством системы мечения мультипраймерной ДНК {Amersham) после очистки в колонке с Sephadex G-50 (Sambrook et al., 1989). 5. Клонирование митохондриальной ДНК. Были построены две геномные библиотеки цибридных линий с мужской стерильностью (13-7) и ревертанта (13-6) в фаговом векторе EMBL3, культивированном в рестрикционном штамме Nm 539 (Frischauf et at., 1983). Получалось примерно 2,5 х 10* клонов на мкг митохондриальной ДНК. Митохондриальные библиотеки ДНК анализировались и высевались с целью изоляции колоний, которые переносились на нейлоновые фильтры, как описано в работе Sambrook et al., 1989. Гибридизационная проба, используемая для отсева двух библиотек митохондриальной ДНК, приготавливалась следующим образом. Фрагмент митохондриальной ДНК, специфический для cms, элюировался с ис 18 пользованием процедуры генной очистки ТМ (В!О 101 INC) из продукта расщепления митохондриальной ДНК на препаративном агарозном геле. Элюированная ДНК 5 затем метилась, как уже было описано. Экстракция лямбда ДНК, субклонирование фрагмента 2,5 Ncoi в Ncoi сайт pTrc99A (Ammann et al., 1988) и экстракции ДНК. Плазмиды осуществлялись сог10 ласно процедуре Sambrook et al., 1989. Рекомбинантные плазмиды вводились в штамм № NM522 (Gough и Murray, 1983). 6. Генетическое исследование цибри15 да 13 и его потомства. В первой генерации потомства, полученного путем опыления цибрида 13 посредством Brutor, которая включала 13 растений, 5 растений были полностью с мужс20 кой стерильностью (включая растения 132 и 13-7), одно было с мужской фертильностью (№ 13-6) и 7 растений были полностью стерильны с несколькими цветками с мужской фертильностью. 25 Фертильное растение 13-6 было самоопыленным и было скрещенным с Brutor. В обоих случаях получались лишь фертильные растения {соответственно 42 и 43) 30 При скрещиваниях растения с мужской стерильностью № 13-7 и Brutor, 24 потомства были полностью стерильными и 6 растений имели несколько фертильных листочков, результат, аналогичный то35 му, который наблюдается у самого цибрида. Растение 13-2 скрещивалось с линией восстановителя RF, которая являлась гетерозиготной для специфических генов восстановителей для мужской стерильнос40 ти (Chetnt et al., 1985). Потомство от данного скрещивания включало 53 растения с мужской стерильностью, 37 растений с мужской фертильностью и 9 растений, которые были почти полностью стерильны, 45 хотя они имели несколько фертильных цветочков. Эти результаты подтверждают, что растения с мужской стерильностью из семейства цибрида 13 заключают в себе детерминанту Ogura, как и другие цибри50 ды, изучаемые ранее с более простым восстановительным профилем {Chetnt et al., 1985). На этом этапе исследования могут быть рассмотрены две возможности: или 55 цибрид 13 содержит смесь митохондриальных геномов как "мужской стерильности", так и "мужской фертильности" и в дальнейшем возможна селекция на оба фенотипа, или же цибрид 13 содержит рекомбинантный геном, нестабильная структура 19 26445 которого ревертирует к стабильной "фертильной" конфигурации, при этом поддержание гомогенного фенотипа мужской стерильности в последующих поколениях невозможно. Растения с мужской стерильностью, выявленные в потомстве сходного растения 13-7, были размножены черенкованием и скрещиванием с Brutor. Через некоторое число генераций (от 1 до 5), полученных обоими методами, все семьи дают фертильные растения. Напротив, обнаруженные при этом полностью фертильные растения никогда не дают начало стерильным растениям. В свете этих результатов можно заключить, что верным является второе из предложенных выше объяснений, то есть цибрид 13 содержит нестабильный митохондриальный геном, теряющий Ogura-cms детерминанту в ходе процесса, ведущего к образованию "фертильной" конфигурации, без возможности возврата к стериль ному фенотипу. 7. Сравнение митохондриальной ДНК у потомков растений с мужской стерильностью и фертильных ревертантов. Выделение фрагмента, специфичного для растений с мужской стерильностью. Митохондриальную ДНК выделяли из листьев потомков растения с мужской стерильностью 13-7 и фертильных ревертантов (потомки растений 13-6 и 13-7) и переваривали несколькими рестрикционными ферментами с целью сравнения их рестрикционных профилей. Митохондриальные геномы этих двух типов очень сходны, т. к. между рестрикционными профилями митохондрий из растений с мужской стерильностью и фертильных ревертантов нельзя обнаружить различия при использовании разнообразных ферментов. Тем не менее, рестрикционный фрагмент в 6,8 ко был зарегистрирован в рестрикционном профиле митохондриальной ДНК растений с мужской стерильностью, обработанных Nrut, и он никогда не наблюдался в соответствующих профилях фертильных ревертантов. Данный фрагмент (рассматриваемый как N6 8) был элюирован из агарозного геля, он метился и использовался как проба на рестрикционных профилях митохондриальной ДНК Nrut: широкий сигнал, соответствующий 6,8 kb, наблюдался в потомстве с полностью мужской стерильностью цибрида 13, в то время как никакой фрагмент данного размера не гибридизировался с данной пробой в геномах митохондрии фертильных ревертантов. Кро 20 ме того, проба N 6.8 гибридизируется с фрагментом 6,8 kb в митохондриальной ДНК Ogura, вываренной с Nrul, но не в В. napus cv Brutor, что показывает проис5 хождение данного фрагмента из Ogura. Библиотека лямбда, включающая экстракты митохондриальной ДНК, происходящий от растений с мужской стерильностью (13-7) испытывалась с элюированным 10 меченым фрагментом, и из 8 гибридизирующихся клонов были изолированы 2 рекомбинантных фага, содержащих полный фрагмент N6.8 и соседние последовательности. Была получена подробная рестрик15 ционная карта этой зоны. Гибридизация рестристиционных профилей митохондриальной ДНК, происходящей от фертильного и стерильного потомства цибрида 13 с N6 8 как пробы, подходящей для зоны 20 специфической для генотипа с мужской стерильностью, должна быть ограничена фрагментом 2,5 kb. Фрагмент 2,5 kb Ncol метился и использовался как проба в отношении ми25 тохондриальной ДНК, происходящей от потомства 13-7 и 13-6, вываренного с Ncol. Не считая сигнала, соответствующего 2,5 kb, который является специфическим для профиля с мужской стерильностью, неко30 торые фрагменты Ncoi гибридизируются как в фертильном ревертанте, так и в профилях с мужской стерильностью; этими фрагментами являются фрагменты 2,2, 10 и 14 kb. Фрагменты 2,7 kb Ncol сильно 35 гибридизируются в митохондриальном геноме фертильного потомства, а не в геноме стерильного потомства. Анализ данного профиля гибридизации позволил сделать заключение, что фрагмент 2,7 kb Ncol, 40 хотя и специфический для митохондриальной ДНК с мужской стерильностью, но заключает в себе последовательности, которые повторяются в другом месте в митохондриальном геноме (на 2,2-10 и 1445 kb фрагментах после Ncol) и эти повторяемые последовательности присутствуют также в митохондриальной ДНК фертильных ревертантов, не считая специфического фрагмента 2,7 kb. 50 Полная РНК экстрагируется из листьев или почек потомства цибридов 13, или цибридов с мужской стерильностью или с фертильностью (полученных в других экспериментах по слиянию), и линии 55 Brutor. Осуществляли Нозерн-блотингом и реплики гибридизировались с пробой, соответствующей вставке лямбда клона, включающего N6.8, описанный в примере 3. Основной транскрипт 1,4 kb был обнаружен во всех цибридах с мужской 21 26445 стерильностью, включая цибрид 13-7, в то время как никакого транскрипта данного размера не обнаруживалось в линии Brutor или в двух фертильных цибридах {отличных от 13). Более того, фертильные растения имеют транскрипт 1,1 kb, который гибридизируется с данной пробой, которая отсутствует или присутствует в очень низких концентрациях во всех испытанных гибридах с мужской стерильностью. Некоторые транскрипты общие для всех образцов гибридизируются слабо с данной пробой ввиду большого размера меченой вставки. Это подтверждает, что митохондриальные транскрипты могут быть обнаружены в образцах полной РНК путем Нозерн-гибридизации той же реплики с фрагментов ДНК, включающим генную последовательность atpa. Тот же специфический транскрипт 1,4 был найден в митохондриальной РНК Ogura, экстрагированной из цветной капусты, с использованием в качестве пробы фрагмента 2,5 Ncol. Экстракционные пределы данного транскрипта были определены с использованием в качестве пробы субклонов фрагмента 2,5 Ncol. 8. Изучение цибрида 1 и его потомства. Цибрид 1 был с мужской фертильностью. В этом потомстве растение 1.12 было фертильным, и растение 1.18 было стерильным. Растение 1.12 давало в своем потомстве стерильные растения (S3) и фертильные растения (FR3). Растение U8 давало стерильные растения (S2) и фертильную ветвь (FR2). Растения S2 и S3 восстанавливались тем же ядерным геном, что восстанавливает достигаемую опылением фертильность как и стерильный цибрид 13. При гибридизации с меченым фрагментом 2,5 Ncol, митохондриальная ДНК растений S 2 n S3 не давала сигнала фрагмента 2,5 kb при вываривании с Ncot или сигнала фрагмента 6,8 kb при вываривании с Nrul. Аналогично гибридизации с полной РНК и (Нозерн-блоттинг) с пробой, соответствующей последовательности ORFB, не давала сигнала, соответствующего 1,4 kb, как это происходило со стерильным цибридом 13. В противоположность этому, проба, соответствующая последовательности, между нуклеотидами 928 и 1569, показанным на фиг. 1 давала сигнал при Нозерн-блоттинге, соответствующий примерно 1,3 kb. Этот сигнал отсутствует в РНК растений RF,, RF2, RF3 или Brutor. Аналогично, можно использовать эту последовательность (928-1569) как пробу в 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 22 дотблоттинге полной РНК, и в данном случае будут давать сигнал лишь растения с мужской стерильностью и каждое из них. Эти результаты показывают, что растения S2 и S3, хотя они и с мужской стерильностью, но не сохраняются в нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1, в исходной конформации, и они показывают, что в данной последовательности участок, связанный нуклеотидами 928 и 1569, являетсятаким участком, который несет "специфическую детерминанту" стерильности Ogura, которая дает растениям мужскую стерильность, при транскрибировании данной последовательности. Данная последовательность не имеет значительной гомопогии с последовательностью, присутствующей в банке данных. П р и м е р 2 Иллюстрация нежелательных источников в митохондриальном геноме. Была получена коллекция гибрида семейства В napus путем протопластового слияния между рапсом, несущим цитоплазму Ogura, и обычным рапсом. Первый является растением с мужской стерильностью и дефицитом хлорофилла при низкой температуре, в то время как последний - обычно зеленый и фертильный. Цибриды отбирались из числа регенерированных растений и те, которые имели мужскую стерильность и обычно были зелеными, были приняты. В том же случае получали коллекцию цибридов в семействе В. oleracea путем протопластового слияния между капустой, несущей цитоплазму Ogura, и обычной капустой. Цибриды, которые имели мужскую стерильность и обычно были зелеными, отбирались из числа регенерированных растений. Эти цибриды скрещивались с различными видами рапса в первом случае и капусты во втором случае. Скрещивания повторялись для каждой генерации с теми же видами, так, чтобы получился определенный генотип, близкий к генотипу повторяющегося вида. Эти различные виды, таким путем трансформированные цитоплазмами различных цибридов, подвергались агрономическим испытаниям для определения продуктивности по семенам, которая зависит от ряда факторов: достаточной степени продуцирования нектара для осуществления опыливания насекомыми, и нормальной цветочной морфологии с тем, чтобы это опыливание было эффективным и плоды развивались нормально. 23 26445 Коллекция цибридов, таким образом, может быть разделена на две партии: - партия цибридов, имеющих мужскую стерильность, пригодная для коммерческого получения семян; - партия цибридов, не обладающих всеми благоприятными характеристиками для должного коммерческого полумения семян. Так, например, рапсовые цибриды №№ 27, 58 и 85 и капустные цибриды №№ 9, 17, 21, 24 и 27с принадлежат к первой партии. Рапсовые цибриды №№ 23s, 77 и 118 и капустные цибриды №№ 1, 6 и 14, например, принадлежат к второй партии. Полная ДНК этих цибридов подвергалась обработке с Sail, Ncol, Nrul, Bgll, Pstl и Kpnl. Полученные реплики Southern гибридизировали с различными митохондриальными пробами Atpa, Cob, Cox1, Atp6, 26S и 18S и двумя фрагментами генома Ogura на 2,5 kb, полученного расщеплением Nrul. Обе партии цибридов отличаются тем, что: а) №№ 23S, 77 и 11S в рапсах и 1, 16 и 11 в капусте включают зону генома Ogura, которая окружает ген Сох1, распознаваемый фрагментами 10,7 kb Bgli или 11 kb Nrul и зону генома Ogura, которая окружает один из формилметиониновых транспортных генов РНК, распознаваемых фрагментами 5,1 kb Salt или 15 kb Nrul. б) №№ 27, 58 и 85 в рапсе и 9, 17, 21, 24 и 27с в капусте не содержат соответствующих зон, которые были заменены в результате рекомбинаций между геномами двух родителей, которые были слиты, аналогичными зонами митохондриального генома рапса в №№ 27, 58 и 85 и капусты в №№ 9, 17, 21, 24 и 27с. Из этого можно сделать заключение, что обе рассматриваемые зоны генома Ogura нежелательны, если желательно иметь систему с мужской стерильностью для коммерческого получения семян. П р и м е р 3. Данный пример иллюстрирует важность знания последовательностей "мужской стерильности Ogura" и нежелательных последовательностей для осуществления непосредственного отбора цибридов, без ожидания в течение нескольких лет обратного скрещивания и без агрономических испытаний. Протопласты растений Brassica, несущие цитоплазму Ogura, сливались с протопластами рассматриваемых видов 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 24 Brassica. Колонии от слияния культивировались в условиях "ин витро" и регенерировались на среде, которая ускоряла образование стручков (см. Pelletier et. al., 1983). Из одного грамма свежего материала, либо каллуса, либо фрагмента регенерированного проростка, путем описанных выше приемов можно выделять всю ДНК. После обработки Sail гибридизации по Саузерну с пробой, представляющей последовательность между нуклеотидами №№ 389 и 1199 (см. фиг. 1) будет давать сигнал лишь для фрагмента 4,4 kb (не будет давать сигнал для 5,1 kb). Аналогичным образом после расщепления Nrul и гибридизации с пробой, несущей ген Сох1 должен быть получен сигнал для фрагмента отличного от 11 kb. Эти данные позволяют предсказать, что растение, которое было получено, является действительно стерильным и пригодным для коммерческого получения семян. П р и м е р 4. Данный пример является вариантом примера 1, основанного на идее полового скрещивания двух родителей в специальных условиях или с определенными генотипами вместо осуществления протопластовых слияний. Результатом является то, что в отличие от известных способов оплодотворения происходит смешивание протоплазм оосфер и пыльцевой трубки или мужской гаметы. Если бы такие способы были описаны, то мог бы быть осуществлен ранее отсев уже известным образом на молодых растениях, происходящих от этих искусственных оплодотворений с использованием указанных проб и тех же критериев, что в примере 3. П р и м е р 5. Данный пример иллюстрирует важность знания последовательности стерильности Ogura в типе генетической манипуляции, который уже был описан для дрожжей (Johnston et. al., 1988). Используя обычно (нормальное) растение Brassica, меристемы или альтернативно клетки "ин витро" бомбардировали микрочастицами, покрытыми ДНК, несущей последовательность стерильности Ogura. Растения, полученные в потомстве таких обработанных меристем или регенерированные проростки будут с цитоплазматической мужской стерильностью, если ДНК будет в состоянии вводиться в митохондрии и становиться интегрированной в геноме данных органелл. Данная процедура исключает проблемы, создаваемые нежелательными последователь 25 26 ?6445 ностями, когда имеются хлоропласты Ogura редьки или определяемые таким путем последовательности митохондриального генома. леотидами 928 и 1569, может быть построен химерный ген, который будет транскрибироваться после генетической трансформации клеток Brassica или другого гена, в ядре клеток получаемых трансформированных растений. Если химерный П р и м е р 6 Данный пример ген включает предварительную последоиллюстрирует важность знания последовательность, которая позволяет ее провательности "стерильности Ogura" в посттеиновому продукту трансляции вводиться роении ядерной, а не цитоплазматической стерильности согласно теории Мен- 10 в митокондрион, то эти трансформанты будут иметь мужскую стерильность, и этот деля. признак будет проявляться как доминантПри использовании в качестве источный Менделевский признак. ника последовательности ДНК между нук1 Т а б л и ц а Продуктивность линии Z (капуста) с различными цитоплазмами Цитоплазма Генотипы Сбор семян (z) г/растения 53,1 (zC) (zA) (z6) (zO) (z9 или z17) 0 22,7 9,3 20,1 91,8 Хромопласты Митохондрии В. oleracea В oleracea (контроль фертильности) В. napus В. napus В. oferacea Ogura B. oleracea Ogura Ogura/napus Ogura Ogura Ogura/oleracea " Т а б л и ц а Продуктивность линии Dormer (зимний рапс) с различными цитоплазмами * Урожай j * Зимний рапс с мужской и женской стерильностью Урожай (% DARMOR) DARMOR Fu 27 Fu 58 Fr77 Fu 85 Fu 118 BIENVENUE JET NEUF 100 , 6 --+ 1 -t * ЩО • TTTCTCCCCTTTCCCCTTTATCTCCCCTTTCTCCTTTTTTTTCTCCACCTTTTAACTGGC 14 4 1 + + + • + + + 1500 TCTTTTATTACGAAACACTTGGGTTAACGAAACTGTTTTTATTTCTTTCTTCGTTTTAGA 1501 1561 -f * * * + < 1560 • GTAAGTTAAACTTTATCTTCTCTAGAGATACGGGGGACAAGAACCAAAAGAGGGTACT3AA + AACAACCAGT Изобретение касается биологического материала, обладающего мужской стерильностью, который используется для разработки гибридных разновидностей культур сельскохозяйственного значения. Оно касается, в частности, растения, принадлежащего к семейству крестоцветных, в которых цитоплазма клеток содержит органеллы, имеющие такую нуклеотидную последовательность, которая сообщает мужскую стерильность и высокие агрономические характеристики. Разработка гибридных разновидностей может быть ускорена или возможна в результате использования цитоплазматической системы мужской стерильности. Гибриды получаются путем перекрестного оплодотворения двух родственных популяций, одна их которых выполняет мужскую роль, а другая - женскую. Одним из препятствий, которые имеют место, когда желательно получить гибридные разновидности одинакового качества при половом скрещивании самооплодотворяющихся видов, является способность растения к самоопылению. Системы мужской стерильности обеспечивают возможность получения женских растений, которые не способны к самооплодотворению, и от которых, после опыления, могут быть непосредственно взяты семена, которые все являются гибридами, без применения трудоемких приемов, таких, как кастрация цветов. Генетические детерминанты мужской стерильности включают такие, которые несет цитоплазма. В каждой продуцируемой половым путем генерации они переносятся исключительно матерью. Таким образом, в каждом гене генерации получается 100% потомства мужской стерильности и системой цитоплазматической мужской стерильности (CMS). Эти генетические детерминанты переносятся геном митохондрии. 5 10 15 20 25 30 35 40 Подходящая цитоплазматическая система мужской стерильности в крестоцветных определяется следующими характеристиками: 1. Мужская стерильность должна быть полной, то есть не должно быть опыленного продукта независимо от условий культивации и независимо от линии, которая желательна для использования в качестве женского родителя. Когда этого условия нет, семена, собранные с этих женских растений, будут происходить частично от самооплодотворения, и, следовательно, они не будут семенами гибридного типа F1. 2. Получение этих семян следует осуществлять, используя преимущество естественных опыленных векторов, то есть в случае данных видов, опыляемых с помощью перепончатокрылых, двукрылых и оплодотворяемых пыльцой, переносимой ветром. Пыльца должна переноситься от опылящих растений к стерильным мужским (женским) растениям. Практически в семействе крестоцветных такой перенос могут осуществлять лишь насекомые. Женские растения, таким образом, должны быть достаточно привлекательными для насекомых, которые прилетают к ним и собирают нектар. Морфология цветов должна быть такой, чтобы насекомые выполняли эту задачу через верхушку цветка так, чтобы их грудка контактировала с рыльцем пестика. Практически это приводит к такой ситуации, при которой основание лепестков должно образовывать определенный тип трубочки вокруг основания пестика. 3. Морфология женских органов (пестик) должна быть идентична морфологии фертильного растения, особенно растения с одним лепестком в цветке и быть прямолинейной по форме. Мужские стерильности очень часто приводят также к феминизации пыльника, которые транс 26445 формируются в псевдопестики, и даже в трансформации нектаринов в полные цветки. Иногда образуемые таким путем пестик или пестики, также деформируются Все эти отклонения то нормы не позволяют получать хорошие семена, и это может рассматриваться как эквивалент некоторой степени женской стерильности. 4 Для получения гибридных разновидностей F1 в тех видах, от которых собираются семена, таких, как рапс или горчица, важно, чтобы мужской родитель гибрида полностью исключал эффект мужской стерильной цитоплазмы, так, чтобы гибридные растения легко опылялись. Первый случай мужской стерильной цитоплазмы или CMS в семействе крестоцветных был описан Ogura (1968) в редьке, Raphanus sativus. Bannerol (1974, 1977) перенес цитоплазму Ogura в Brassicae, получая таким образом растения, обладающие цитоплазматической мужской стерильностью. Эти же самые растения не обладают требуемыми агрономическими характеристиками (хлороз при понижении температур, слабая женская фертильность), что приводит в результате к низкой урожайности, ввиду чего они непригодны для коммерческого использования. Для устранения хлороза в растениях семейства крестоцветных ядерные и хлоропластовые геномы одного и того же рода должны быть объединены в одной и той же клетке. Так, растения рода Brassica, имеющие один из хлоропластовых геномов Brassica, уже больше не проявляют хлороз. Если они имеют полный митохондриальный геном Ogura, то они проявляют полную цитоплазматическую мужскую стерильность, но, однако, цветы будут иметь отклоняющуюся от нормы морфологию, что делает невозможным для них опыление естественными векторами. Кроме того, для тех видов, к семенам которых проявляется интерес, очень важно восстановить мужскую фертильность гибридных видов, которые маркетируются посредством ядерных генов, известных, как гены-восстановители. Трудно восстановить мужскую фертильность растения, имеющего всю полноту митохондриального генома Ogura, поскольку необходимо одновременное участие нескольких генов восстановителей Авторы провели работу с целью получения подходящей системы мужской стерильности путем удаления генов, ответственных за нежелаемые характеристики цитоплазмы Ogura с сохранением мужской 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 стерильности, которая эффективна и легко восстанавливается. Таким образом, настоящее изобретение касается последовательности ДНК, которая далее будет рассматриваться как последовательность ДНК со стерильностью Ogura, которая отличается тем, что: а) ее переносит последовательность ДНК, связанная нуклеотидами 928 и 2273, как показано на фиг. 1, или б) она по меньшей мере на 50% гомологична указанной последовательности, упомянутой в а). И в случае, когда она присутствует в митохондриальном геноме растения, она придает цитоплазматическую мужскую стерильность указанному растению. В частности, объектом данного изобретения является последовательность ДНК со стерильностью Ogura, отличающаяся тем, что: с) последовательность между нуклеотидами 928 и 1569, как показано на фигуре 1, или д) по меньшей мере на 50% гомологична указанной последовательности в с), причем транскрибируется в РНК в митохондриях растений с мужской стерильностью. На фиг. 1 показана нуклеотидная последовательность митохондриального фрагмента ДНК редьки Ogura, несущая признак C...S; на фиг. 2: рестрикциейная карта митохондриального фрагмента ДНК, описанного на фиг. 1; на фиг. 3 - электрофорез митохондриальной ДНК после расщепления Bgtl (За) и Nrul (36). Обнаруженные полосы соответствуют гибридизации с пробой Coxl (Hiesel et al. 1987); на фиг. 4 - электрофорез митохондриальной ДНК после расщепления Sail обнаруженные полосы соответствуют гибридизации с пробой, содержащей последовательность между нуклеотидами №№ 389 и 1199 последовательности, описанной на фиг. 1; на фиг. 5 - плоды капустных растений, несущих различные цитоплазматические геномы; на фиг. 6 - электрофорез митохондриальной РНК (обнаруженные полосы соответствуют гибридизации с пробой, фрагментом EcoRIBamHI, включая участок последовательности, относящейся к OFR В). Последовательность ДНК со стерильностью Ogura определена в отношении последовательности, между номерами 1 и 2428, как показано на фиг 1. Она переносится транскрибированной последовательностью, у которой З'и 5' концы связанны пунктирной линией на фиг. 2, и 26445 которая наблюдается лишь у растений с мужской стерильностью ORF В соответствует открытой рамке считывания; это обозначение дано на основе или наблюдаемой Гомологии с последовательностью, описанной Brennicke. На фиг. 2, последовательность, соответствующая одному из генов транспортной РНК, затемнена. Последовательность ДНК между нуклеотидами под номерами 928 и 2273, как показано на фиг 6 соответствует транскрипту, который может визуализироваться путем молекулярной гибридизации (1. 4), как показано на фиг. 6. На этой фиг. 6 каждая ячейка соответствует фертильному растению (F) или растению с мужской стерильностью (S). Лишь растения с мужской стерильностью синтезируют транскрипт примерно из 1 400 оснований. Этот транскрипт начинается с положения 928 (± 10 оснований) последовательности, показанной на фиг. 6 и заканчивается в положении 2273 (± 5) (начало и завершение транскрипции может иметь место в различных положениях в растительной митохондрии). Настоящее изобретение касается предпочтительно цитоплазмы, содержащей последовательность ДНК, имеющую не менее, чем на 50% гомологии с последовательностью, между нуклеотидами 928 и 2273, на фиг. 1, сообщающей признаки CMS, или касается цитоплазмы, содержащей последовательность ДНК, имеющую не менее, чем на 50% гомологии с последовательностыо, между нуклеотидами 928 и 1569, фиг. 1, и транскрибированную в РНК, сообщающей признак CMS, и отличающейся тем, что содержит хлоропласты тех же видов, что и ядерный геном или других видов, но которые совместимы с данным ядерным геномом, не содержит вовсе или часть одного или другого ( или обоих) фрагмента (фрагментов) митохондриального генома Ogura, определяемого ниже: * несущего один из двух формилметиониновых генов транспортной РНК, используемых для инициирования трансляции, * несущего ген Сохі, кодирующий субъединицу № 1 цитохромооксидазы. Отсутствие этих фрагментов, рассматриваемых как "нежелательные последовательности", необходимо для того, чтобы получить митохондриальные геномы, соответствующие мужской стерильности высокого качества, соответствующие четырем определяемым выше характеристикам. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение касается комбинантного растительного ядра или митохондриального генома, отличающегося тем, что содержит последовательность ДНК со стерильностью а) которую несет последовательность ДНК, между нуклеотидами 928 и 2273 последовательности, показанной на фиг. 1, или б) которая по меньшей мере на 50% гомологична указанной последовательности, упомянтой в а), и сообщает, в случае присутствия в цитоплазме растения, цитоплазматическую мужскую стерильность указанному растению. В частности одним из объектов данного изобретения является рекомбинантное растительное ядро или митохоидриальный геном, отличающийся тем, что содержит последовательность ДНК со стерильностью Ogura с) которая представляет последовательность между нуклеотидами под номерами 928 и 1569, фиг. 1, или в) которая по меньшей мере на 50% гомологична указанной последовательности, упомянутой в с), и сообщает, в случае присутствия в цитоплазме растения транскрибирования в РНК, цитоплазматическую мужскую стерильность указанному растению. Ядерный или митохондриальный геном отличается тем, что этот рекомбинантный митохондриальный геном лишен всех или части геномных фрагментов Ogura: • - несущих один из двух генов формилметиониноеой транспортной РНК, используемых для инициирования трансляции, - несущих ген Сохі, кодирующий субъединицу № 1 цитохромооксидазы, или в котором указанные фрагменты неактивны. В частности, рекомбинантный митохондриальный геном, отвечающий настоящему изобретению, может отличаться: 1) тем, что он лишен всего или части фрагмента примерно 10,7 kb после вываривания с Bgli, или фрагмента примерно 11 kb после вываривания с Nrui, которые (фрагменты) несут ген Coxi. Это иллюстрируется, в частности, как показано на фиг. 3, молекулярной гибридизацией с пробой, несущей последовательность Сохі, 2) тем, что он лишен всего или части фрагмента 5,1 kb после вываривания с Sail, или фрагмента примерно 15 kb пос 11 ле вываривания с Nrui, или фрагмента примерно 18 kb после вываривания с Bgli, которые (фрагменты) несут один из генов формилметиониновой транспортной РНК. Это продемонстрировано, в частности, как показано на фиг 4, молекулярной гибридизации с пробой, связанной нукГенотипы 8. п 27 OGU 9, 17, 21, 24, 27С В. о 12 26445 леотидами №№ 389 и 1199 последовательности, описанной на фиг. 1. На фиг. 3 и 4 генотипы, обозначенные цифрами, соответствуют растениям, имеющим подходящую систему с мужской стерильностью. Хлоропласты В. napus В. napus R. sativus (OGU) В. oleracea В. oleracea Кроме того, присутствие признака CMS высокого качества вызывает необходимость присутствия последовательности ДНК, которая может быть идентифициро- 20 вана путем гибридизации ДНК/ДНК при обработке рестриктазами. Таким образом, настоящее изобретение касается последовательности ДНК, которая может быть определена и которая отличается тем, что 25 заключает в себе последовательность, дающую фрагмент 2,5 кб после расщепления Ncoi, дает фрагмент 6,8 кб после расщепления Nrul и дает фрагмент 4,4 кб после расщепления Sali. 30 Эта последовательность может быть также идентифицирована путем гибридизации на полной РНК растений с мужской стерильностью. Проиллюстрирован транскрипт примерно на 1 400 оснований. Он 35 отсутствует в растениях, возвращающихся к фертильности. Определение "нежелательный" нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных последовательностей "существенно 40 важное" для стерильности согласно данному изобретению, позволяет выбрать растительный материал, несущий хлоропласты, которые совместимы с ядерным геномом и несут митохондрии высокого 45 качества. Путем ДНК гибридизации, способа хорошо известного для специалистов в данной области, не ожидая при этом взрослых растительных особей и появления цветов и плодов. 50 Таким образом, в распоряжении потребителя имеется высокоэффективное средство для выбора растений, имеющих цитоплазму с мужской стерильностью с высокими агрономическими характеристиками. 55 Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение касается митохондриона, отличающегося тем, что включает нуклеотидную последовательность, соответствующую ДНК, имеющую не менее, Митохондрия В. napus В. napus/Ogura R. sativus (OGU) В. oleracea/Ogura В. oleracea чем примерно 50% гомологии с последовательностью, между основаниями под номерами 928 и 2273, как показано на фиг. 1, и кодирующую цитоплазматическую мужскую последовательность ДНК, между нуклеотидами 928 и 1569, фиг. 1, или имеющую на 50% гомологию с данной последовательностью, и которая траснскрибируется 8 РНК в митохондриях растений с мужской стерильностью. Эта ДНК может обладать, кроме того, свойствами, которые определены выше, в частности, в ней могут отсутствовать нежелательные последовательности. Настоящее изобретение'касается также цитоплазмы крестоцветных, отличающейся тем, что включает последовательность ДНК со "стерильностью Ogura": та цитоплазма включает, кроме того, хлоропласты тех же или других видов, но которые совместимы с ядерным геномом. Последовательность со стерильностью Ogura отличается тем, что: а) содержится последовательность ДНК на 2428 основных пар, как показано на фиг. 1, б) находится между нуклеотидами 928 и 2273, показанными на фиг. 1 и соответствует транскрипту, который на фиг. 2 показан пунктирной линией, и визуализируется посредством молекулярной гибридизации (1,4), как показано на фиг, 6, в) имеет не менее, чем на 50% гомологию с указанной последовательностью в б) и в случае ее присутствия в митохондриальном геноме растения сообщает цитоплазмовую мужскую стерильность указанному растению, или г) представляет последовательность, между нуклеотидами 928 и 1569, и она транскрибируется в РНК в митохондрии стерильных растений, или д) дает не менее, чем на 50% гомологию с последовательностью, описанной