Спосіб забезпечення принаймні часткової резистентності чи підвищення резистентності у рослини проти ооміцетної інфекції

Реферат: Даний винахід належить до способу забезпечення принаймні часткової резистентності чи підвищення резистентності у рослини проти ооміцетної інфекції, де вказані ооміцети включають Phytophthora infestans (збудники фітофтори). Винахід розкриває ген резистентності та його UA 110021 C2 (12) UA 110021 C2 функціональні гомологи чи фрагменти, виділені з S. chacoense, S. berthaultii, S. sucrense або S. tarijense. Додатково, даний винахід належить до застосування зазначеного гена резистентності для підвищення чи надання принаймні часткової резистентності рослині проти ооміцетної інфекції шляхом забезпечення рослини чи її частини нуклеїновою кислотою, що кодує амінокислотну послідовність Rpi-chc1. UA 110021 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід відноситься до резистентного гену, виділеного з S. chacoense. Додатково, даний винахід відноситься до застосування зазначеного резистентного гена, наприклад, для клонування функціональних гомологів, а також застосування зазначеного гену(генів) резистентності у способі підвищення або надавання щонайменше, часткової резистентності до ооміцетної інфекції в рослинах. Більш конкретно, даний винахід представляє резистентний ген, здатний збільшувати або надавати щонайменше, часткову резистентність до Phytophthora sp. (наприклад, Phytophthora infestans) за допомогою способів генної інженерії або способів маркерної селекції. Передумови створення винаходу Фітофтороз, викликаний ооміцетом Phytophthora infestans, є одним з найбільш серйозних захворювань у світовому виробництві картоплі. Він був відповідальним за ірландський картопляний голод в середині 19-го століття, що призвів до смерті одного мільйона людей. Хоча багато зусиль було вкладено в боротьбі з патогеном, хімічний контроль P. Infestans, як і раніше є основною стратегією контролю культури, але екологічна безпека стає все більш важливою та патоген іноді в змозі розвивати до обробки фунгіцидами. Таким чином, введення резистентності в сучасні види картоплі є найбільш міцною стратегією по боротьбі з хворобою. У минулому столітті, Solanum demissum, що гексаплоїдним мексиканським видом, широко використовували в селекції для пізнього занепаду резистентності в картоплі. Спочатку було описано серію 11 R генів, отриманих від S. demissum. Серед них, R1, R2, R3a/b, R6, та R7 були локалізовані на генетичних картах картоплі (Solanum tuberosum). Тим не менш, ці гени R надають патовар-специфічну резистентність та такі, що були в інтрогесивних сортах картоплі, в основному, R1, R2, R3, R4 і R10, були швидко подолані патогеном. Таким чином, існує потреба в нових джерелах резистентності не потрібно, і в даний час, повідомлялося про ряд інших диких видів Solanum як потенційних джерел резистентності, багато з яких були генетично охарактеризовані (Таблиця 6). Нещодавні зусилля з виявлення резистентності до хвороб рослин були зосереджені на основних генах R, що надають широкий спектр резистентності, отриманої з різних дикорослих видів Solanum. Крім S. demissum, повідомляли про інші дикорослі видів Solanum, такі, як S. acaule, S. chacoense, S. berthaultii, S. brevidens, S. bulbocastanum, S. microdontum, S. sparsipilum, S. spegazzinii, S., stoloniferum, S. sucrense, S. toralapanum, S. vernei та S. Verrucosum, які були представлені як нові джерела резистентності до фітофторозу (огляд (Jansky, 2000). S. chacoense, є само-несумісним диплоїдним видом з Південної Америки, і, як вважають, є джерелом резистентності проти фітофтори. Останні таксономічні перегрупування розділу Petota показали його зв'язок з такими видами, як S. berthaultii та S. tarijense.. Кілька зразків S. chacoense (CHC543-1), S. berthaultii (BER481-3, BER94-2031) та S. tarijense (TAR852-5) були випробувані в тестах відділеного листя (DLA) з множиною ізолятів (Таблиця 5) і при повторних польових випробуваннях ізоляту IPO-C. У всіх тестах CHC543-5, BER94-2031, BER481-3 та TAR852-2 залишається непошкодженими, що підкреслює релевантність експресованих R генів для резистентних селекції. Молекулярне клонування генів, відповідальних за резистентність і подальше введення генів у види картоплі є третім способом, який дозволяє обійти багато проблем, що виникають в попередніх двох стратегій. На сьогоднішній день було клоновано множину R-генів проти фітофтори, як алельні гени RB та Rpi-blb1 на хромосомі 8 і Rpi-blb1 на хромосомі 6 (Таблиця 6). Останнім часом був також виділений Rpi-blb 3 резистентний ген (WO 2008/091153). Хоча початкові результати, отримані для RB та Rpi-blb1, -2 та -3 є обіцяючими, існує необхідність у додаткових R-генах. Стислий опис винаходу Даний винахід на даний час відноситься до способу одержання принаймні часткової резистентності або збільшення резистентності у рослини проти ооміцетної інфекції, що включає надання рослині або її частини нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність Rpichc1 на Фігурі 4, або її функціональний фрагмент або функціональний гомолог, переважно де зазначена рослина є рослиною з родини пасльонових, більш переважно Solanum tuberosum. Переважно, вказаний ооміцет включає Phytophthora, більш переважно Phytophthora infestans. У конкретному втіленні, вказаний вище функціональний гомолог вибраний з групи амінокислотних послідовностей, що складається з 493-7_G12, 543-5_C2, 849-1_M8_M18_M20, 487-1_I4_I6_I8, 94-2031_L4_L7_l8, 561-2_K4_K14_K22, 324-2_J1_J3_J8, 852-5_E14_E23, 852-5_E28, 4939_H5_H30, 493-7_G14_G22, 561-2_K6_K30_K31 та 493-7_G21. У додатковому конкретному втіленні послідовність нуклеїнових кислот, як визначено вище, включає нуклеїнову кислоту, як показано на Фігурі 7 або послідовність нуклеїнових кислот, що кодує амінокислотні 1 UA 110021 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності 493-7_G12, 543-5_C2, 849-1_M8_M18_M20, 487-1_I4_I6_I8, 94 - 2031_L4_L7_l8, 561-2_K4_K14_K22, 324-2_J1_J3_J8, 852-5_E14_E23, 852-5_E28, 493-9_H5_H30, 4937_G14_G22, 561-2_K6_K30_K31 та 493-7_G21, як показано на Фігурі 13. Даний винахід додатково включає спосіб для селекції ооміцету, переважно резистентної до Phytopthora тетраплоїдної рослини, включаючи а. підвищення рівня плоїдності гамет диплоїдної рослини, яка вже містить послідовність нуклеїнових кислот, як визначено вище; б. застосування вказаних гамет у схрещенні з гаметами тетраплоїдної рослини; та в. вибір нащадків зазначеного схрещення на наявність зазначеної послідовності нуклеїнової кислоти. Переважно в такому способі диплоїдна рослина стадії а) є рослиною з роду S. chocaense, S. berthaultii, S. sucrense, або S. tarijense. Даний винахід також відноситься до способу вибору рослин або рослинного матеріалу або їх потомства у відношенні чутливості або резистентності до ооміцетної інфекції, де зазначений спосіб включає стадії тестування принаймні частини зазначеної рослини або рослинного матеріалу або їх потомства на наявність або відсутність нуклеїнової кислоти, як визначено вище. Конкретно у такому способі тестування включає виявлення наявності одного або декількох маркерів, наведених у Таблиці 2 та 8, і воно здійснюється з праймером або зондом, який специфічно зв'язує зазначену нуклеїнову кислоту. Таким чином, даний винахід також відноситься до маркера для селекції за допомогою маркерів в рослинництві, щоб одержати резистентність проти ооміцетів, де зазначений маркер вибирають з маркерів, представлених у Таблиці 2 та 8. В іншому втіленні, даний винахід також відноситься до виділеної або рекомбінантної послідовності нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнових кислот, що кодує амінокислотну послідовність Rpi-chc1, наведену на Фігурі 4, або її функціональний фрагмент, або нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність 493 - 7_G12, 543-5_C2, 8491_M8_M18_M20, 487-1_I4_I6_I8, 94-2031_L4_L7_l8, 561-2_K4_K14_K22, 324-2_J1_J3_J8, 8525_E14_E23, 852-5_E28, 493-9_H5_H30, 493-7_G14_G22, 561-2_K6_K30_K31 та 493-7_G21 або її функціональний фрагмент. Переважно, зазначений фрагмент містить принаймні LRR домен амінокислотної послідовності. Це являє собою додаткове переважне втілення, де виділена або рекомбінантна послідовність нуклеїнових кислот за п.10 містить послідовність нуклеїнових кислот, як показано на Фігурі 7 і на Фігурі 13. Додатково, даний винахід відноситься до трансгенної або тетраплоїдної клітини, що містить нуклеїнову кислоту відповідно до даного винаходу. Додатково, частина даного винаходу є вектором, що містить послідовність нуклеїнових кислот за даним винаходом. Переважно, зазначений вектор додатково містить промотор та/або термінатор, з якими природно пов'язаний ген, більш переважно усічений промотор, що мають менш, ніж 1000 нуклеотидів перед послідовністю генів. Даний винахід також відноситься до трансгенної або тетраплоїдної клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту за даним винаходом, або вектор за даним винаходом, переважно, де така клітина-хазяїн є клітиною або рослинною клітиною Agrobacterium. Даний винахід також відноситься до трансгенної або тетраплоїдної рослинної клітини, що містить нуклеїнову кислоту за даним винаходом або вектор за даним винаходом, де переважно зазначена рослинна клітина є клітиною пасльонових, більш переважно, Solanum tuberosum, більш переважно тетраплоїдних Solanum tuberosum . В іншому втіленні даний винахід є трансгенною або тетраплоїдною рослиною, що містять таку клітину, а також частину, одержану з такої рослини, переважно де така частина є бульбою. Додатково, даний винахід включає білок, який кодується виділеною або рекомбінантною нуклеїновою кислотою за даним винаходом або її функціональним фрагментом, переважно де зазначений білок має амінокислотну послідовність Rpi-chc1, як показано на Фігурі 4. Даний винахід також відноситься до антитіла, яке (специфічно), зв'язується з білком за п. 20. Підписи до фігур Фігура 1. Генетичні та фізичні карти Rpi-chc1 (A) та Rpi-ber (B) локусів (7650 і 06-882 популяції відповідно). Зазначені відносні позиції маркерів, кількість рекомбінантів, ідентифікованих між маркерами, перекриття BAC клонів, які охоплюють R-локуси, і відносні положення RGAs в CHC543-5 і RH89-039-16 фізичних картах. Фігура 2. Анонатція послідовності Chr10 BAC. Два коміркові маршрути, що складаються з 3 і 4 ВАС, що перекриваються, з RH89-039-16 (RH106G038, RH137D014, RH009D021 та RH122B15, RH77O23, RH04G12, RH199E15) і двох ВАС, що перекриваються, з CHC543-5, були секвеновані та анотовані. Позиції маркерів і ВАС кінцевих послідовностей від ВАС, що перекриваються, позначені стрілками. Позиції контігів 2 UA 110021 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності позначені горизонтальними стрілками. Позиції генів, як і передбачені FGENESH алгоритм, позначені кольоровими квадратами. Гомологія протеїнових послідовностей, як було встановлено BlastP пошуку по базі даних NR, вказується вертикальними стрілками. RGAs нумеруються підкресленими фігурами та їх генна структура пронумерована, відповідно, А: RH106G03, B: RH137D14, C: RH97D21, D: RH122B15, E: RH77023, F: CHC B1 (B07-1-05), G: CHC B2 (2-D06_3-D21). Фігура 3. Перехідна комплементація чутливості до Phytophthora листя Nicotiana benthamiana. Через два дні після агро-інфільтрації листя були піддані щепленню шляхом інокуляції зооспоровою суспензією P. infestans ізолятом 90128 (авірулентний на CHC543-5) в аналізі відділеного листя. Типові фенотипи захворювання розвилися через 6 днів після інокуляції контрольних рослин, які були агро-інфільтровані pBINplus без вставки. Повна резистентність спостерігалася в контрольних рослинах, агро-інфільтрованих pBINplus: RPI-blb1. Агроінфільтрація pBINplus: CHCB2-3, одного з трьох RGAs від Rpi-chc1 інтервалу картування, а також надано повну резистентність до інфекції P. infestans, тоді як pBINplus: CHCB2-1 і pBINplus: CHCB2-2 інфільтроване листя залишається уразливим. Фігура 4. Вирівнювання амінокислотних послідовностей RGAs з S. chacoense (CHC B1-1, CHC B1-2, CHC B2-1, CHC В2-2, та CHC B2-3 = RPI-chc1) та родинних послідовностей, одержаних з S. tuberosum зразок RH89-039-16 (77O23c5794, 77O23c5795, 77O23c671, 77O23c7063, 77O23c7064, 122B15C88, 122B15C247, 137D14c131 і 137D14c132). Білок з невідомою функцією, ABF81421, кодується геном від Populus trichocarpa. Фігура 5. Організація Rpi-chc1 білкового домену. N-кінцевий CC-домен складається з амінокислот 1-231. Амінокислоти, зображені затемненими, як прогнозують, згорнуті у виту структури за допомогою "COIL" алгоритму з розміром вікна 14. Домен центрального домену NB-ARC складається з амінокислот, 232-557. Домени, зображені затемненими, проявляють подібність до описаної раніше кінази 1а, кінази 2, кінази 3а, GLPL, RNBS-D і MHD доменів, відповідно. С-кінцевий LRR домен складається з 29 недосконалих збагачених лейцином повторами. Консервовані гідрофобні амінокислоти (A, V, L і F), у цій заявці позначені затемненням. Консенсус показано в нижній частині. Фігура 6. Карта позицій Rpi-chc1 родинних послідовностей та резистентних генів фітофтороз на хромосомі 10. UHD карти SH і RH хромосом показані зліва (van Os et al., 2006). 06-882 і 7677, відповідно до даного дослідження, представлені у середині. Позиції Rpi числа Rpi-ber (Rauscher et al., 2006), Rpi-ber1 та Rpi-ber2 (Park et al., 2008) показані справа. Червоні лінії показують розташування Rpi-chc1 родинних послідовностей. Зелені лінії показують розташування резистентних генів до фітофтори. Фігура 7. Нуклеотидні послідовність клонів CHC B2-3 (7907 bp), що містить Rpi-chc1 кодуючі і регуляторні послідовності. Rpi-chc1 кодуючу ділянку 4550 bp виділено затемненням (3358-7266). Верхні 3357 нуклеотиди (1-3357) і нижні 641 нуклеотиди (7267-7907) містять регуляторні послідовності. Фігура 8. Функціональна комплементація чутливості Phytophthora infestans (Pi) в трансгенних рослинах Desiree. Cv Desiree, трансформовані Rpi-chc1кандидатними генами (RGC-1, -2 і -3) були щеплені Pi ізолятом 90128 в аналізі відділеного листя. Фотографії були зроблені через 6 днів після інокуляції. Резистентність спостерігали тільки в трансгенах, що містять RGC-3. Фігура 9. Скринінг PEX набору за допомогою спільної інфільтрації. PEX клони інфільтрували у листя N. benthamiana окремо або спільно інфільтрували з Rpi-chc1. Через тиждень після інфільтрації були зроблені фотографії. Лист А, PEX1 = RD31, PEX2 =RD36. Лист В PEX1 = RD12-1, PEX2 = RD12-2. Лист C PEX1 = INF1, PEX2 = pGR106. У кожному листі внизу зліва пляму інфільтрували R3A + avr3a. Нижню праву пляму інфільтрували Rpi-chc1. Лист A не показує ідентифікації відповіді ефектора. B показує некроз для взаємодії Rpi-chc1 і RD12. С показує аутонекроз для INF1. Фігура 10. Регуляторні елементи запуску Rpi-chc1 експресії. Rpi-chc1 ORF клонували між однією з чотирьох промоторних/термінаторних послідовностей; її 3kb промотор та термінатор 0,5 kb (p-chc1-завдовжки), 0,9 kb власного промотор та термінатор 0,5 kb (p-chc1-завдовжки) , подвійний промотор 35S в pMDC32 або Rpi-blb3 промотор/термінатор комбінації (Lokossou et al., 2009). Спільну агро-інфільтрацію з PEX-RD12 проводили в п'яти серійних розведеннях (OD600 = 2,0, 1,0, 0,5, 0,2, 0,1), як зазначено. R3а змішували з Avr3a та використовували в якості позитивного контролю (+) і Rpi-chc1 був використаний як негативний контроль (-). Фотографії були зроблені через 6 днів після проникнення. Фігура 11. Вибір Rpi-chc1 специфічних пар праймерів, за допомогою скринінгу зародкової 3 UA 110021 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 плазми. А. Вибір Rpi-chc1 специфічних пар праймерів. Праймерні комбінації а: 581 + 582, б: 585 + 587, в: 585 + 589 г: 586 + 587, д: 586 + 589,е: 588 + 589 відносяться до Таблиці 8. Були використані темплати 1: chc543-5 (донорна рослина для Rpi-chc1 ), 2: chc544-5 (чутлива батьківська картування популяції, 3: RH89-39-16 (чутлива рослина, донор Rpi-chc1 гомологічних послідовностей, 4: CHC BAC-1 (BAC клона що містить три неактивних RGA), 5: CHC BAC-2 (BAC клон, що містить Rpi-chc1 ), 6: MQ. B. 225 генотипів з таксономічними групами 10-12 - 10-17, перераховані в Таблиці 7 були піддані скринінгу з комбінацією праймерів Д. Білі стрілки вказують на фрагменти очікуваного розміру у 6 генотипів. Фігура 12. Філогенетичний аналіз Rpi-chc1 гомологів. зелений: Послідовності, виділені Rpi-chc1 гомологом ПЛР (Приклад 2) чорний: Rpi-chc1 гомологи, виявлені в ході клонування на основі картування (Приклад 1) Фігура 13. Послідовності нуклеїнової кислоти, 21 розроблених Rpi-chc1 гомологів. Фігура 14. Кластерні W вирівнювання послідовностей білків, кодованих Rpi-chc1 гомологів за Фігурою 11 та Rpi-chc1 гомологічних послідовностей, описаних в Прикладі 1 Детальний опис Як використовують у цій заявці, термін "рослина або її частина" означає будь-яку повну або часткову рослину, окремі клітини та клітинні тканини, такі, як рослинні клітини, які є інтактними в рослині, клітинних скупченнях та тканинних культурах, з яких рослини картоплі можуть бути відновлені. Приклади частин рослин включають, але не обмежуючись цим, окремі клітини і тканини від пилку, яйцеклітин, листя, ембріонів, коріння, кінчиків коренів, пильовиків, квітів, плодів, пагонів стебла, бульб, в тому числі бульб картоплі для споживання або «насіння бульб» для культивування або клонального розмноження, та насіння, а також пилок, яйцеклітини, листя, ембріони, коріння, кінчики коренів, пильовики, квіти, плоди, стебла, пагони, живці, кореневища, насіння, протопласти, каллуси, тощо. Як використовують у цій заявці, термін "популяція" означає генетично гетерогенну колекцію рослин, що мають спільне генетичне походження. Як використовують у цій заявці термін "різноманітність" є таким, як визначено в договорі UPOV та відноситься до будь-якого угруповання рослин у межах одного ботанічного таксона нижчого з відомих рангів, де угруповання може бути: (а) визначеним експресією характеристик від даного генотипу або комбінації генотипів, (б) відрізняється від будь-якої іншої групи рослин експресією, принаймні однієї із зазначених ознак, і (с) розглядається як ланка з точки зору її придатності для поширення без змін. Термін "культивар" (для культивованого виду), який використовують у цій заявці, визначається як вид, що зазвичай не зустрічається в природі, але був культивований людьми, тобто має біологічний стан, відмінний від "дикого" статусу, де "дикий" статус вказує на оригінальний неокультурений, або природний стан рослини або приросту. Термін "культивар" конкретно відноситься до рослини картоплі, що має плоїдність, яка не тетраплоїдна. Термін "культивар" додатково включає, але не обмежуючись наведеним, напів-природний, напівдикий, засмічений, традиційний культивар, ландрас, селекційний матеріал, науково-дослідний матеріал, селекційну лінію, синтетичну популяцію, гібрид, основну популяцію, інбредну лінію (батьківський гібридний сорт), сегрегуючу популяцію, мутантну/генетичну родину, а також розвинений/поліпшений культивар. Як використовують у цій заявці, "схрещування" означає запліднення жіночих рослин (або гамет) чоловічими рослинами (або гаметами). Термін "гамет" відноситься до гаплоїдних і диплоїдних репродуктивних клітин (яйцеклітин або сперми), вироблених рослинами шляхом мейозу, або перше або друге відновлення, або подвійне скорочення від гаметофита, що бере участь в статевому розмноженні, при якому дві гамети протилежної статі зливаються, утворюючи диплоїдні чи поліплоїдні зиготи. Цей термін зазвичай включає посилання на пилок (у тому числі сперматозоїд) та яйцеклітини (у тому числі жіночі зародкові клітини). "Схрещування", тому загалом відноситься до запліднення яйцеклітини з однієї особи пилком іншої особи, тоді як "самозапилення" відноситься до запліднення яйцеклітин особи пилком з генетично тієї ж особи. Термін "зворотне схрещування", який використовують у цій заявці, означає процес, в якому рослина в результаті схрещування двох батьківських ліній схрещується з однією з батьківських ліній, де батьківські лінії, що використовуються в зворотному схрещуванні мають назву рекурентних батьків. Повторні зворотні схрещування призводять до геному, що стає все більш і більш подібним на рекурентного батьківського, наскільки це може бути досягнуто з урахуванням рівня гомо-і гетерозиготності зазначеного батьківського геному. Як використовують у цій заявці, "самозапилення" визначається як ставиться до процесу 4 UA 110021 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 самозапліднення, де осіб запилюється або запліднюється власним пилком. Термін "маркер", який використовують у цій заявці, означає будь-який показник, який використовують в способах встановлення відмінностей в характеристиках геномних послідовностей. Прикладами таких показників є маркери поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (RFLP), маркери поліморфізму довжини фрагмента (AFLP), одиночні нуклеотидні поліморфізми (SNP), введення мутацій, мікросателітні маркери (SSRs), ампліфіковані ділянки, що характеризуються послідовностями (SCARs), маркери розщеплених ампліфікованих поліморфних послідовностей (CAPS) або ізоферментні маркери, або комбінації маркерів, описаних у цій заявці, що визначає конкретні генетичні та хромосомні розташування. Як використовують у цій заявці, "локус" визначається як генетична або фізична позиція, де даний ген займає на хромосому рослини. Термін "алель(і)", який використовують у цій заявці, означає будь-яку з одного або більше альтернативних форм гена, де усі алелі відносяться до наявності або відсутності певної фенотипічні риси чи характеристики рослини. У диплоїдних клітин або організмів, два алелі даного гена займають відповідні локуси на парі гомологічних хромосом. Тому в деяких випадках більш точним є посилатися на «гаплотипи" (тобто алель хромосомного сегменту) замість "алелю", проте, в таких випадках термін "алель" слід розуміти як такий, що включає термін "гаплотип" . Термін "гетерозиготний", що використовують у цій заявці, та що обмежується діплоідами, означає генетичний стан, коли ідентичні алелі знаходяться у відповідних локусах на гомологічних хромосомах. Як використовують у цій заявці, і обмежується діплоід "гомозиготних" визначається як спадкове захворювання, при існуючих ідентичних алелів знаходяться у відповідних локусах на гомологічних хромосом. Як використовують у цій заявці, і обмежуючись тетраплоїдами, термін "нулліплекс", "сімплекс", "дуплекс", "триплекс" та "квадруплекс" визначають як спадкове захворювання, коли існуючі конкретні алелі у відповідному локусі на відповідних гомологічних хромосомах присутні 0, 1, 2, 3 або 4 рази, відповідно. На тетраплоїдному рівні фенотипичний ефект, пов'язаний з рецесивним алелем, спостерігають тільки, коли алель присутній в квадруплексному стані, в той час як фенотипичний ефект, пов'язаний з домінантним алелем, вже спостерігали, коли алель присутній в симплексному чи вищому стані. Терміни «гаплоїдни й», «диплоїдний» та «тетраплоїдний", що використовують у цій заявці, визначають як такі, що мають одну, дві і чотири пари кожної хромосоми в кожній клітині (за винятком статевих клітин). Термін «гаплотип», як використовують у цій заявці, означає комбінацію алелей декількох локусів, які передаються разом на одній хромосомі. Це включає в себе гаплотипи, маючи на увазі всього лише два локуси. та гаплотип, посилаючись на всю хромосому в залежності від кількості рекомбінаційних подій, які відбулися між заданим набором локусів. Як використовують у цій заявці, термін «визначати» або «визначення», коли використовують по відношенню до оцінки наявності резистентності до грибків, у зв'язку з експресією Rpi-chc1 гену, означає висновок про наявність зазначеного гена в рослині або її частині за допомогою процесу, де аналізують окремо або в комбінації нуклеотидних наявності у зазначеному гені у пробі нуклеїнових кислот рослини або її частини. Як зазначено в цій заявці, наявність нуклеотиду може бути визначена безпосередньо шляхом вивчення якісних відмінностей і кількісних відмінностей в рівнях експресії молекули нуклеїнової кислоти, або побічно, шляхом вивчення (рівня експресії) Rpi-chc1 білка. Термін "праймер", який використовують у цій заявці, відноситься до олигонуклеотида, який здатний гібридизувати для ампліфікації мішені, що дозволяє приєднання ДНК-полімерази, виступаючи в якості точки ініціації синтезу ДНК, в умовах, в яких індукується синтез праймерного продукту розширення, комплементарного до ниті нуклеїнової кислоти, тобто в присутності нуклеотидів і агента полімеризації, такого, як ДНК-полімераза і при відповідній температурі і рН. Праймер (ампліфікації) переважно є одноланцюговим для досягнення максимальної ефективності ампліфікації. Переважно, праймер є олігодезоксирибонуклеотидом. Праймер повинен бути досить великим для запуску синтезу продуктів подовження в присутності агента полімеризації. Точна довжина праймерів буде залежати від багатьох факторів, включаючи температуру та джерело праймера. "Пара бі-направлених праймерів", як використовують у цій заявці, відноситься до одного прямого та одного зворотного праймера, як широко використовується у галузі ампліфікації ДНК, наприклад, в ПЛР ампліфікації. Як використовують у цій заявці термін "зонд" означає одноланцюгову олігонуклеотидну послідовність, що буде розпізнавати та утворювати зв’язаний водневими зв'язками дуплекс з 5 UA 110021 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комплементарною послідовністю в цільовому аналіті послідовності нуклеїнових кислота бо її кДНК похідних. Термін "жорсткість" або "жорсткі умови гібридизації" відноситься до умов гібридизації, які впливають на стабільність гібридів, наприклад, до температури, концентрації солей, рН, концентрації формаміду тощо. Ці умови емпірично оптимізовані для максимального специфічного зв'язування і зводять до мінімуму неспецифічне зв'язування праймера або зонда цільової послідовності нуклеїнової кислоти. Терміни, що використовують. включають посилання на умови, за яких зонд або праймер гібридизують до цільової послідовності, до детектовно більшою міри, ніж інші послідовності (наприклад, щонайменше в 2 рази в порівнянні з фоновими). Жорсткі умови послідовність-залежні і будуть відрізнятися за різних обставин. Довші послідовності гібридизують специфічно при високих температурах. Як правило, жорсткі умови вибрані так, щоб бути приблизно на 5° C нижчими, ніж теплова температура плавлення (Tm) певної послідовності при певній іонній силі та рН. Tm є температурою (при певних іонній силі та рН), при якій 50% комплементарна послідовність-мішень гибрідизує до ідеально придатного зонда або праймера. Як правило, жорсткі умови будуть такими, в яких концентрація солей становить менше 1,0 М Na + іон, як правило, приблизно від 0,01 до 1,0 М Na + концентрація іонів (або інших солей) при рН 7,0 - 8,3 і температурі, принаймні приблизно 30° C для коротких зондів або праймерів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60° С для довгих зондів або праймерів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть бути досягнуті з додаванням дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Ілюстративні умови малої жорсткості або "умови зниженої жорсткості" включають гібридизацію з буферним розчином 30% формаміду, 1 М NaCl, 1% SDS при 37° С і промивання в 2х SSC при 40° C. Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію в 50% формаміді, 1 М NaCl, 1% SDS при 37° С, та промивання в 0,1x SSC при 60° C. Гібридизаційні процедури добре відомі і описані, наприклад, в Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D.,Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. eds. (1998) Current protocols in molecular biology. V.B. Chanda, series ed. New York: John Wiley & Sons. Даний винахід описує клонування Rpi-chc1 гену. Rpi-chc1 був картований на новий ген R локусу на хромосомі 10, використовуючи картування S. chacoense популяція. Маркери, дуже пов'язані з Rpi-chc1, були використані для створення фізичної карти локусу R. Три гена R аналогів (RGA) були присутні на одному з двох клонів BAC, що охоплює Rpi-chc1 локус, та були направлені для аналізу доповнення, один з яких виявився функціональним Rpi-chc1 геном. Поза R-генних кластерів, описаних в даному винаході, Rpi-chc1 має найвищу амінокислотну ідентичність послідовності кислот (40%) і білків, що кодуються геном з невідомою функцією, позначеним ABF81421, з тополі (Populus trichocarpa). Нижній відсоток гомології (