Спосіб надання рослині цукрового буряка резистентності до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка (bnyvv) та рослини, одержані цим способом

1. Спосіб надання рослині цукрового буряка резистентності до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV), що включає наступні стадії: (a) одержання ДНК-фрагмента, який складається принаймні з 15 послідовно розташованих нуклеотидів, і який принаймні на 70% гомологічний відповідній нуклеотидній послідовності геномної РНК 1 вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV), (b) введення вказаного ДНК-фрагмента, функціонально пов'язаного з промотором, який є активним в рослинах цукрового буряка, в клітину рослини цукрового буряка з одержанням трансформованої клітини цукрового буряка; і (с) регенерації трансгенної рослини цукрового буряка з трансформованої клітини рослини цукрового буряка. 2. Спосіб за п. 1, де вказаний ДНК-фрагмент принаймні на 80%, переважно принаймні на 90%, а більш переважно принаймні на 95%, гомологічний відповідній нуклеотидній послідовності геномної РНК 1 вказаного вірусу. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що довжина фрагмента ДНК складає щонайменше 35 основ. 4. Спосіб за п. 1 або 3, який відрізняється тим, що в ньому вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в 2 (19) 1 3 79731 4 13. Вектор за п. 11 або 12, який відрізняється тим, що довжина фрагмента складає щонайменше 35 основ. 14. Вектор за будь-яким з пп. 11-13, який відрізняється тим, що в ньому вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в пп. 11 і 12, з нуклеотидами 1533258 РНК 1 вказаного вірусу. 15. Вектор за будь-яким з пп. 11-13, який відрізняється тим, що довжина фрагмента знаходиться у межах від 100 до 1000 основ. 16. Вектор за п. 15, який відрізняється тим, що в ньому вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в пп. 11 і 12, з нуклеотидами 169-539 РНК 1 вказаного вірусу. 17. Вектор за п. 15, який відрізняється тим, що в ньому вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в пп. 11 і 12, з нуклеотидами 1226-1683 РНК 1 вказаного вірусу. 18. Вектор за п. 15, який відрізняється тим, що в ньому вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в пп. 11 і 12, з нуклеотидами 2754-3192 РНК 1 вказаного вірусу. 19. Вектор за будь-яким з пп. 11-13, який відрізняється тим, що в ньому вказаний фрагмент складається з 6746 нуклеотидів. 20. Застосування вектора за пп. 11-19 для трансформації клітини рослини. 21. Клітина рослини, яка має резистентність до BNYVV і містить в своєму геномі ДНК-фрагмент, який складається принаймні з 15 послідовно розташо ваних н уклеотидів і принаймні на 70 % гомологічний відповідній нуклеотидній послідовності геномної РНК 1 вказаного вірусу. 22. Клітина рослини за п. 21, де вказаний фрагмент принаймні на 80%, переважно принаймні на 90%, а більш переважно принаймні на 95%, гомологічний відповідній нуклеотидній послідовності геномної РНК 1 вказаного вірусу. 23. Клітина рослини за п. 21 або 22, яка відрізняється тим, що довжина фрагмента складає щонайменше від 35 основ. 24. Клітина рослини за будь-яким з пп. 21-23, яка відрізняє ться тим, що в ній вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в пп. 21 і 22, з н уклеотидами 153-3258 РНК 1 вказаного вірусу. 25. Клітина рослини за будь-яким з пп. 21-23, яка відрізняє ться тим, що довжина фрагмента знаходиться у межах від 100 до 1000 основ. 26. Клітина рослини за п. 25, яка відрізняється тим, що в ній вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в пп. 21 і 22, з нуклеотидами 169-539 РНК 1 вказаного вірусу. 27. Клітина рослини за п. 25, яка відрізняється тим, що в ній вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в пп. 21 і 22, з нуклеотидами 1226-1683 РНК 1 вказаного вірусу. 28. Клітина рослини за п. 25, яка відрізняється тим, що в ній вказаний фрагмент має послідовність нуклеїнової кислоти, яка має гомологію, вказану в пп. 21 і 22, з нуклеотидами 2754-3192 РНК 1 вказаного вірусу. 29. Клітина рослини за будь-яким з пп. 21-23, яка відрізняє ться тим, що в ній вказаний фрагмент складається з 6746 нуклеотидів. 30. Клітина рослини за пп. 21-29, що є частиною рослини цукрового буряка, яка має резистентність проти BNYVV. 31. Застосування клітини рослини за пп. 21-29 для регенерації з неї рослини цукрового буряка, яка має резистентність проти BNYVV. 32. Рослина цукрового буряка, яка має резистентність проти BNYVV і містить принаймні, частково, клітини рослини за пп. 21-29. 33. Потомство рослини цукрового буряка, яке має резистентність проти BNYVV, за п. 32, яке містить принаймні частково клітини рослини за пп. 21-29. 34. Насіння рослини цукрового буряка зап. 32 або потомство за п.33, з якого може бути відтворено рослину, яка має резистентність проти BNYVV за п. 32. 35. Структури, що вегета тивно репродукуються, такі як калюс, бруньки, зародки, що походять від рослини за п. 32 або від потомства за п. 33, з яких може бути відтворено рослину, яка має резистентність проти BNYVV за п. 32. Даний винахід відноситься до способу надання рослинам цукрового буряка резистентності до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV - beet necrotic yellow vein virus). Крім того, даний винахід відноситься до вірусорезистентних рослин, отриманим вказаним способом, а також до сім'я і потомства, продукованих від цих рослин. Віруси рослин являють собою серйозну загрозу для багатьох основних сільськогосподарських культур. Так, наприклад, вірус BNYVV, який передається ґрунтовими грибками плазмодіофороміцетамми Polvmuxa betae. є збуджувачем хвороби, відомої як ризоманія, яка вражає економічно цінну культур у цукрового буряка (Beta vulgaris). Це захворювання було уперше виявлене в Італії в 1950х роках, і відтоді, воно стало представляти серйозну загрозу для культур цукрового буряка в більшості регіонів світу, де обробляється ця культура. У польових умовах, поразка вірусом BNYVV, звичайно, обмежується підземними частинами рослини. Інфікування коріння цукрового буряка виявляється в підвищеній проліферації і некрозі бічного коріння, в зниженні загальної маси головного кореня, і в подальшому зниженні виходу цукру. Загибель рослини може бути також викликана інфекцією, особливо, якщо ця культура інфі 5 79731 кована на початку сільськогосподарського сезону. У деяких випадках, цей вірус вражає листя рослини, де він може викликати інвазивні жилкоасоційовані хлоротичні і некротичні поразки. BNYVV є типовим членом сімейства бенівірусів, які являють собою палочкоподібні віруси, що передаються грибками, що володіють складовим геномом, що складається з двох або більше компонент одноланцюгової (ол) РНК. Були ідентифіковані чотири молекули плюс-олРНК вірусу BNYVV, які були позначені в порядку зменшення їх розміру (РНК 1 - 6,8 т.п.н.; РНК 2 - 4,7 т.п.н.; РНК 31,8 т.п.н.; РНК 4-1,5 т.п.н.). Деякі ізоляти, отримані в Японії, також містять п'ятий РНК-компонент (РНК 5 - 1,45 т.п.н.). Всі РНК були клоновані і секвеновані. Генетична карта вірусних РНК подана на Фіг.1. Всі п'ять РНК мають послідовність з поліаденілової кислоти, а РНК 1-4 на 3'-кінці мають кепструктури на своїх 5'-кінцях. РНК 1 і 2 кодують основні незалежні від господаря функції "домашнього господарства", а більш дрібні РНК конкретно беруть участь в природних процесах інфікування, включаючи опосередковане вектором інфікування коріння цукрового буряка, проліферацію в кореневій системі і індукування симптомів ризоманії. Так, наприклад, було показано, що РНК 1 кодує вірусну РНК-полімеразну активність, а РНК 2 кодує 21 кДабілок вірусного покриву. 3'-проксимальна половина РНК 2 несе групу з трьох слідуючи х один за одним вірусних генів, що тро хи перекриваються, відомих як потрійний блок генів (TGB3), який має близьку схожість з кластером з трьох генів в інших палочкоподібних віруса х рослин, і який бере участь в перенесенні вірусу від клітини до клітини. РНК 3 асоціюється з масивною проліферацією дрібних корінців цукрового буряка і полегшує поширення вірусу в тканині коріння, а РНК 4 підвищує ефективність передачі вірусу грибами. Віруси, що передаються грибами, такі як BNYVV, можуть зберігатися в спорах, що знаходяться в стані спокою, присутніх в ґрунті, протягом декількох років після зараження земель. Оскільки в цей час не існує ефективних хімічних або фізичних методів елімінації вірусу як в рослинах, так і в ґрунті, то єдиною можливістю для кожного фермера, що культивує цукровий буряк, є використання генетично резистентних сортів. Деякі компанії отримують ряд резистентних, і навіть частково резистентних сортів завдяки перенесенню генів стійкості дикого типу в комерційно цінні сорти за допомогою селекції. Однак, цей процес є дуже тривалим і трудомістким, і для того, щоб отримати корисні резистентні рослини, звичайно, потрібно дуже багато часу. Крім того, у толерантних або частково резистентних рослин при високому тиску хвороби, будуть розвиватися симптоми хвороби, оскільки рівень резистентності є дуже низьким. Інша проблема, пов'язана з толерантністю або лише з частковою резистентністю рослин, полягає в тому, що популяції вірусу продовжують рости, що приводить до можливого виникнення штаму BNYVV, який може руйнувати гени резистентності/толерантності. 6 Швидкий прогрес в області генної інженерії рослин привів до розробки нових стратегій надання рослинам генетичної резистентності до вірусів. Резистентність до вірусних хвороб, що надається за допомогою введення фрагментів послідовностей вірусного геному, є новою відправною точкою для досягнення резистентності. Вірусну послідовність (конструкцію) вводять в рослину шляхом використання комбінованих методів із застосуванням відповідних клітинних або тканинних культур і системи доставки ДНК, такої як добре відома система трансформації Agrobacterium tumefaciens або шляхом прямого перенесення ДНК, опосередкованого хімічними сполуками, такими як полі етиленгліколь (ПЕГ). Відомі методи індукування механізмів захисту рослин від патогенів описані, наприклад, в [ЕР 96871060], який відноситься до способу індукування резистентності до вірусу, що містить послідовність TGB3. У цій публікації описано, що резистентність до BNYVV може бути індукована методом, що передбачає трансформацію клітин рослини ДНК-конструкцією, відповідною фрагменту послідовності геномної або субгеномної РНК 2 BNYVV. Однак, недолік цього методу полягає в тому, що в цьому випадку досягається лише толерантність, а не резистентність. У толерантних рослингосподарів ще може відбуватися реплікація вірусу рослин на нормальному рівні, і ці рослини виявляють невеликі видимі ознаки інфікування або ці ознаки відсутні, тоді як у резистентних господарів, реплікація відбувається на низькому рівні або взагалі відсутня. У заявці [WO 93/25068] резистентність до вірусу у рослин індукують шляхом трансформації рослини репліказною частиною (РНК 1) геному рослинного вірусу. Ця п ублікація не відноситься ні до цукрового буряка, ні до BNYVV. Відомо, що цукровий буряк є важким об'єктом для генної інженерії, що ускладнює успішне індукування у нього резистентності до BNYVV. Однак, якщо врахувати ступінь і наслідки вірусної хвороби, що викликається BNYVV, то особливий інтерес представляє поліпшення джерел генетичної резистентності рослин цукрового буряка. Тому, метою даного винаходу є забезпечення засобів для отримання рослин цукрового буряка, які володіють резистентністю до BNYVV. Переважно, якщо вони володіють повною резистентністю або імунітетом, що надається шляхом комбінування різних методів і шляхом використання методів, які не дозволяють вірусам реп лікуватися. Ця мета досягається завдяки даному винаходу шляхом розробки способу надання рослині цукрового буряка резистентності до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV), що включає наступні стадії: (a) отримання ДНК-фрагменту, який складається, принаймні, з 15 слідуючих підряд один за іншим нуклеотидів, і який, в основному, гомологічний відповідній нуклеотидній послідовності геномної РНК 1 вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV), (b) введення вказаного ДНК-фрагменту, функціонально пов'язаного з промотором, що є актив 7 79731 ним в рослинах цукрового буряка, в клітину рослини цукрового буряка з отриманням трансформованої клітини цукрового буряка; і (c) регенерації трансгенної рослини цукрового буряка з трансформованої клітини рослини цукрового буряка. Таким чином, отримують рослини цукрового буряка, які володіють стабільною резистентністю, і в яких вказаний вірус не реплікується. Такий трансформант є унікальним аспектом даного винаходу і ніде раніше не був описаний. Відповідно до даного винаходу, істотна гомологія послідовності даного фрагмента являє собою гомологію, принаймні, на 70%, переважно, принаймні, на 80%, більш переважно, принаймні, на 90%, а найбільш переважно, принаймні, на 95%. Терміни "гомологія" або "ступінь схожості" використовуються для позначення нуклеотидних послідовностей, які при їх зіставленні мають аналогічні (ідентичні або консервативно замінені) нуклеотиди в аналогічних положеннях або областях. Так, наприклад, дві нуклеотидні послідовності, принаймні, з 85%-ною гомологією мають, принаймні, на 85% гомологичні (ідентичні або консервативно замінені) нуклеотиди в аналогічних положеннях, що виявляється при їх зіставленні з введенням оптимальної поправки до 3 "проломів", за умови, що вказані "проломи" зачіпають не більш, ніж 15 амінокислотних залишків. Ступінь схожості може бути визначена методами, добре відомими фахівцям [див., наприклад, Wilbur W.J.& Lipman, DJ. "Rapid Similarity Searches of Nucleic Acid and Protein Data Banks". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983) & Myers E.& Miller W. "Optimal Alignments in Linear Space". Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)]. Однією з програм, яка може бути використана для визначення міри схожості, є метод однієї пари MegAlign Lipman-Pearson (з використанням параметрів за умовчанням), який може бути отриманий з DNAstar Inc, 1228, Selfpark Street, Madison,Wisconsin, 53715, USA як частина системи Lasergene. Тест на гомологію послідовності заснований на визначенні процента ідентичності, який обчислюється методом Fast DB виходячи з наступних параметрів: "штраф" на розходження - 1,0, штраф на "пролом" (1,00), штраф на розмір "пролому" - 0,33 і штраф на приєднання - 30,0. У своєму переважному варіанті, даний винахід відноситься до використання різних фрагментів, що мають нуклеїновокислотні послідовності, відповідні вказаній гомології або повністю гомологічні нуклеотидам 153-3258, 169-539, 1226-1683, 27543192 або всім з 6746 нуклеотидів РНК 1. Даний винахід також відноситься до ДНК, яка гібридизується з ДНК даного винаходу і яка кодує РНК 1. Така гібридизація, переважно, відбувається в умовах низької або високої жорсткості або в проміжних умовах. У загальних рисах, умови низької жорсткості можуть бути визначені як: 3 х SSC в інтервалі приблизно від кімнатної температури до температури приблизно 65°С, а умови високої жорсткості можуть бути визначені як: 0,1 х SSC при температурі приблизно 65°С. SSC означає буфер, 8 що складається з 0,15 М NaCl, 0,15 цитрату натрію. "З х SSC" означає в три рази більш високу концентрацію, ніж SSC, і т.п. Даний фрагмент може бути введений в клітину рослини, що регенерується за допомогою ДНКвектору, що містить даний фрагмент і транскрипційну і трансляційну регуляторну послідовності, функціонально приєднані до цього фрагмента, стандартними методами трансформації рослин, такими як Agrobacterium-опосередкована трансформація клітин, введених в тканини рослини, такі як сім'ядолі (Krens et al.. Plant Science 116: 97-106; 1996), або опосередковане поліетиленгліколем включення ДНК в одиночні клітини, такі як замикаючі клітини-протопласти [Hall et al.. Nature Biotechnology 14: 1133-1138; 1996]. ДНК-вектор, що містить даний фрагмент, також є частиною даного винаходу. Цілі використання конструкцій, отриманих так, щоб дана послідовність гена інгібувала або стимулювала експресію гена, абсолютно очевидні. Повна послідовність гена, що знаходиться під контролем промотору, який ефективно функціонує в даній рослині, буде, в основному, експресувати підвищену кількість генного продукту, що буде приводити до посилення дії продукованого таким чином білка. Іноді кількість генного продукту знижується, і цей феномен називають "ко-супресією". Негативна регуляція цього гена може бути здійснена декількома методами. Це може бути досягнуте з використанням "домінантно-негативних" конструкцій. Ці конструкції містять специфічний ДНКзв'язуючий домен, а також можливі домени димеризації, які, однак, є транскрипційно неактивними. Вони "сидять" на промоторах цільових генів, і тим самим перешкоджають скріпленню ендогенного білка. Крім того, зниження кількості генного продукту може бути також досягнуте з використанням домінантно-негативної мутації, або шляхом зміни на зворотну орієнтації генної послідовності по відношенню до промотору так, щоб він продукував тип генного продукту, який називається "антисмисловою" матричною РНК. ДНК-конструкція даного винаходу може бути "антисмисловою" конструкцією, що генерує "антисмислову" РНК, або "смисловою" конструкцією (що кодує, принаймні, частину функціонального білка), що генерує "смислову" РНК. "Антисмислова РНК" являє собою РНКпослідовність, яка комплементарна послідовності основ у відповідній мРНК: тобто, комплементарна в тому значенні, що кожна основа (або множина основ) в даній антисмисловій послідовності (при читанні в напрямі 3' —> 5') може спарюватися з відповідною основою (G з С, А з U) в послідовності мРНК, що читається в напрямі 5' —> 3'. Така антисмислова РНК може бути продукована в клітині при її трансформації відповідною ДНКконструкцією, розташованою так, щоб в результаті генерувався транскрипт, в якого, принаймні, частина послідовності комплементарна, щонайменше, частині кодуючого ланцюга релевантного гена (або ДНК-послідовності, в основному, гомологічною цьому гену). 9 79731 "Смислова РНК" являє собою РНКпослідовність, яка, в основному, гомологічна, принаймні, частині відповідної мРНК-послідовності. Така смислова РНК може бути продукованою в клітині при її трансформації відповідною ДНКконструкцією, розташованою в нормальній орієнтації, так, щоб генерувався транскрипт, що має послідовність, ідентичну, принаймні, частині кодуючого ланцюга релевантного гена (або ДНКпослідовності, в основному, гомологічною цьому гену). Відповідні смислові конструкції можуть бути використані для інгібування експресії гена [як описано в Міжнародній патентній заявці W091/08299]. ДНК-конструкції даного винаходу можуть містити нуклеотидну послідовність довжиною, принаймні, в 10 основ (переважно, принаймні, 35 основ) для транскрипції в РНК. Дана нуклеотидна послідовність не має теоретичної верхньої межі вона може мати і довжину, рівну довжині релевантно мРНК, що продукується клітиною - але в основному, переважно, використовувати послідовності довжиною від 100 до 1000 ослов. Отримання таких конструкцій більш детально описане нижче. Як джерело нуклеотидної ДНК-послідовності для транскрипції можуть бути використані відповідні кДНК або геномна ДНК, РНК або синтетичний полінуклеотид. Областю ініціації транскрипції (або промотором), що функціонує в рослинах, може бути конститутивний промотор (такий як промотор 353 вірусу мозаїки цвітної капусти), або індуцибельний або стадіє-специфічний регульований промотор, якщо це необхідне. Відповідні ДНКпослідовності, регулюючі експресію генів, що експресуються в рослинах (включаючи маркерні гени), таких як області ініціації транскрипції, енхансери, лідерні послідовності, що не транслюються лідерні послідовності і т.п., можуть бути отримані від будь-якого гена, який експрессується в рослинній клітині. Можуть бути також використані і гібридні промотори, що об'єднують функціональні частини різних промоторів, або їх синтетичні еквіваленти. Крім конститутивни х промоторів, регулюючих експресію генів даного винаходу, що експресуються, можуть бути використані індуцибельні промотори або промотори, що здійснюють регуляцію відповідного типу експресії, наприклад, стадієспецифічну або клітинноспецифічну експресію. Так, наприклад, може виявитися бажаним модифікувати активність білка на певній стадії розвитку рослини. Використання конститутивного промотору має за свою мету впливати на рівні і функції білка у всі х органах даної рослини, тоді як використання тканинноспецифічного промотору дозволяє здійснювати більш ефективну регуляцію експресії гена і функцій, що піддаються впливу. В іншому своєму варіанті, даний винахід відноситься до застосування індуцибельних промоторів. Відомі промотори, які індукуються патогенами стресом, хімічними сполуками і впливами навколишнього середовища. Індукування активності гена внутрішніми або зовнішніми чинниками входить в об'єм даного винаходу. Промотори цього типу дозволяють індукувати активність гена регульованим образом, і тим самим дозволяють рослині нормально розвиватися без надмірного 10 впливу на них трансгенного гена. Індуцибельними промоторами є промотори, описані в [DE 4446342] (промотор PRP-1, що індукується грибами і ауксином), в [WO 96/28561] (промотор PRP-1, що індукується грибами), в [ЕР 0-712273] (промотор, що індукується нематодами), в [ЕР 0330479 і патенті США 5510474] (промотор, що індукується стресом), в [WO/96/12814] (що індукується холодом) і промотор^ що індукується спиртом Zeneca. Інші індуцибельні промотори описані в [ЕР 0494724, ЕР 0619844, WO 92/19724]. Таким чином, цей генний продукт, незалежно від того, чи є він антисмисловою або смисловою РНК або пептидом, продукується в тканині лише в той час, коли необхідна його дія. Як згадувалося вище, термін "індуцибельний промотор" включає промотори, які можуть бути індуковані хімічно. Використання промоторної послідовності, яка регулюється із застосуванням зовнішніх хімічних стимуляторів, є найбільш переважним. Зовнішніми хімічними стимуляторами є, переважно, агрономічно прийнятні хімічні сполуки, використання яких сумісно з сільськогосподарською практикою і не надає негативного впливу на рослини або ссавців. Найбільш переважна індуцибельна промоторна область включає систему індуцибельних промоторів-перемикачів, таку як, наприклад, двокомпонентна система, така як система промоторів-перемикачів генів alcA/alcR, описана в [міжнародній заявці WO 93/21334], система промоторів-перемикачів гена екдизону, описана в [міжнародній заявці WO 96/37609], або промотор GST, описаний в [міжнародних заявках WO 90/08826 і WO 93/031294], зміст яких вводиться в даний опис за допомогою посилання. Такі промоторні системи називаються "промоторамиперемикачами". Хімічними сполукамиперемикачами, що використовуються в поєднанні з промоторами-перемикачами, є агрономічно прийнятні хімічні сполуки, що роблять цю систему особливо ефективною в способі даного винаходу. Кожний фахівець може самостійно вибрати ДНК-вектор для використання в даних способах. Прикладом вектора, придатного для Agrobacterium-опосередкованої трансформації, є pBIN19. Векторами, придатними для ПЕГ-опосередкованої трансформації, € вектор pBluescript або pIGPD7 [Hall et al., Nature Biotechnology 14: 1133-1138, 1996]. Введення даного фрагмента в ці вектори може бути здійснене стандартними методами молекулярної біології, описаними, наприклад, [Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989]. Трансформовані рослини, отримані даним способом даного винаходу, виявляють абсолютну резистентність, або імунітет, до BN YVV. У протилежність цьому, попередні спроби надання рослинам резистентності до BNYVV [Kallerhof et al.. Plant Cell Reports 9:224-228, 1990; і Mannenrlof et al., Euphytica 90:293-299, 1996], або до інших вірусів, таких як вірус тютюнової мозаїки (TMV) [Donson et al., Мої. Plant-Microbe Interact. 6:635-642; 1993] шляхом трансформації рослин фрагментами вірусного гена, виявилися менш успішними. Інокульоване листя ще виявляло симптоми інфекції, що 11 79731 свідчить про те, що дана резистентність не є абсолютною. А тому той факт, що спосіб даного винаходу дозволяє надавати рослинам цукрового буряка абсолютну резистентність до BNYVV, виявився несподіванкою. Крім того, даний винахід відноситься до трансформованої клітини рослини і до трансгенної рослини, резистентної до BNYVV, а також до структур, що репродукуються, таких як сім'я, калюси, бруньки, зародки, отримані від трансгенних рослин, і до їх потомства. У переважному варіанті здійснення винаходу, описана тут резистентність може бути об'єднана з резистентністю інших типів або з толерантністю до BNYVV. Даний винахід може бути, крім того, проілюстрований нижченаведеними прикладами або графічним матеріалом, але вони не повинні розглядатися як обмеження винаходу. На Фіг.1 схематично представлена характерна геномна організація вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка на основі роботи [Jupin et al, Seminars in Virology vol. 2.2: 112-129; 1991]. На Фіг.2 показані фізичні карти pVDH239 і pVDH240. LB = лівий край, RB = правий край, P35S = промотор 353 CaMV, NPTII = неоміцинфосфо трансфераза II, T35S = сигнал поліаденілювання 353 CaMV, GUSINT = генів бетаглюкуронідази, BNYVVpolTRUNC= фрагмент кДНКІ BNYVV, Tnos = виникаючий від гена нопалінсинтази сигнал поліаденілювання. Вказані положення сайтів розпізнавання головних рестриктуючих ферментів. На Фіг.3 проілюстрований блот-аналіз за Саузерном, за допомогою якого було визначене число Т-ДНК-вставок, інтегрованих в геном первинного трансформанту ТІ 57-01 цукрового буряка. У верхній частині схематично показана Т-ДНК-структура бінарного вектора pVDH239. На Фіг.4 показані діаграми окремих ELISAвеличин для екстрактів з коріння рослин цукрового буряка від популяцій Cadyx (сприйнятливий контроль). Rifle (сорт, толерантний до ризоманії), Rhizor (сорт, толерантний до ризоманії) і ТІ57-01 (GUS-позитивні F1-рослини) після інокуляції BNYVV-інфікованим ґрунтом. Кожне число на горизонтальній осі представляє окрему рослину. На Фіг.5В проілюстрований блот-аналіз за Саузерноим, за допомогою якого було визначене число Т-ДНК-вставок, інтегрованих в геном F1потомства рослин ТІ57-01, а також представлена діаграма окремих ELISA-величин для екстрактів з коріння F1-потомства рослин ТІ 57-01 після інокуляції BNYVV-інфікованим ґрунтом (Фіг.5А). Числа у верхній частині Саузерн-блотів представляють лабораторні коди окремих рослин потомства F1. ELISA-величини, позначені "Генотипом 1" в нижній панелі, відповідають окремим рослинам, що виявляють одну смугу в Саузерн-блоті (2012, 2019, 2021, 2029, 2030, 2031, 2034, 2035, 2038, 2042, 2044, 2046, 2051, 2052, 2061, 2066, 2068, 2069), тоді як ELISA-величини, позначені "Генотипом 2+3" в нижній панелі, відповідають окремим рослинам, що виявляють 2 або 3 смуги в Саузернблоті (1999, 2000, 2001, 2007, 2008, 2011, 2013, 12 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2020, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2032, 2033, 2036, 2037, 2039, 2040, 2041, 2043, 2045, 2047, 2048, 2049, 2050, 2053, 2054, 2055, 2056, 2057, 2058, 2059, 2060, 2062, 2063, 2064, 2065, 2067, 2070). ELISA-величини, що позначаються "сегрегантами GUS(-)" в нижній панелі, відповідають окремим рослинам потомства F1, які є GUS-негативними (1997, 1998, 2002, 2004, 2005, 2006, 2009, інші не показані). Приклади Приклад 1 Створення конструкції з усіченою послідовністю реплікази BNYVV Для отримання кДНК-клонів BNYVV використали комбінації з двох праймерів для клонування в трансформуючому векторі (Bouzoubaa et al., J. Gen. Virol. 68: 615-626; 1987). Для 5'-кінця були використані праймери: PI: 5'CGCGGATCCACCATGGC AGATTCGTTC-3' (утримуючий рестрикційні ВатНІ- і Ncol-сайти і нуклеотиди, ідентичні нуклеотидам 153-168), і Р2: 5'- GACGAATTCAAGTCGTCTTTC-3' (рестрикційний EcoRI-сайт і нуклеотиди, комплементарні нуклеотидам 288-301), Для 3'-кінця були використані праймери: РЗ: 5'GACGAATTCGAAGATGAGTCTA-3' (EcoRI-сайт і нуклеотиди, ідентичні нуклеотидам 2799-2812) і Р4: 5'- CGC AGATCTTTAACTGCTC ATC ACCAAC-3' (BglII-сайт і нуклеотиди, комплементарні нуклеотидам 3244-3258 і стоп-кодон). . Перед клонуванням фрагментів у вектор pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, USA), Sall/HincIII/Accl-сайт замінювали на BglII-сайт. Після ампліфікації кДНК BNYVV з використанням Р1 і Р2 отримували ДНК-фрагмент, який гідролізували ферментами ВаіпНІ і EcoRI і вбудовували в модифікований BamHI/EcoRI-розщеплений вектор pBluescript, внаслідок чого отримували pRSNBPoll. Потім кДНКІ BNYVV ампліфікували з використанням РЗ і Р4. Отриманий ДНК-фрагмент розщеплювали EcoRI і BgUI і вбудовували в плазміду pRSNBPoll, розщеплену EcoRI і BgUI, внаслідок чого отримували плазміду pRSNBPol2. Потім Accl-фрагмент кДНКІ BNYVV, ідентичний нуклеотидам 250-2815, клонували в Асе 1розщеплений pRSNBPol2. Таким чином отримували pRSNBPoltrunc, який включав фрагмент кДНКІ BNYVV (poltrunc), ідентичний нукеотидами 1533258, фланкований ВатНІ-сайтом у 5'-кінця і BgIIIфрагментом у З'-кінця. Фрагмент poltrunc клонували у вигляді BamHI-BgIII-фрагмента в ВатНІ-сайті pVDH4 так, що функціональний смисловий фрагмент poltrunc знаходився за промотором 35S CaMV і перед термінаторною послідовністю гена нопаліну. Повну конструкцію, несучу промотор 35S CaMV, фрагмент poltrunc і термінаторну послідовність нопаліну, вирізали з плазміди ферментом СіаІ і клонували в бінарний трансформуючий вектор pVDH212, в якому BamHI-сайт був перетворений в Clal-сайт шляхом вбудовування молекулярного лінкера. 13 79731 pVDH212 являє собою виникаючий від pBIN19 бінарний трансформуючий вектор, який містить 35S-NPTII (ген неоміцинфосфотрансферази, що знаходиться під контролем промотору 35S CaMV і що використовується як селективний маркерний ген, що надає резистентність до канаміцину), а також 35S-GUS1 (ген, що кодує бетаглюкуронідазу [Vancanneyt et al., Mol.Gen.Genet. 220:245-250; 1990]. Таким чином, були отримані два різних трансформуючих вектора, що містять вказану конструкцію poltrunc: один, з яких, pVDH239, містив конструкцію poltrunc в тому ж самому напрямі транскрипції, що і гени NPTII і GUS, а інший, pVDH240, містив конструкцію poltrunc, що має протилежний напрям транскрипції. Бінарні трансформуючі вектори pVDH239 і 240 (Фіг.2) кон'югували і переносили в Agrobacterium tumefaciens LBA4403 [Phabagen Collection, Utrecht, the Netherlands], внаслідок чого отримували штами НАТ1239 (для pVDH239) і НАТ1240 (для pVDH240). HAT1239 і НАТ1240 були використані для трансформації цукрового буряка. Приклад 2 Трансформація цукрового буряка Методи Agrobacterium-опосередкованої трансформації з використанням бінарних векторів добре розроблені і відомі кожному фа хівцеві. Для отримання трансформованих рослин цукрового буряка, були трансформовані рослини В8М5.9 0-типу методом Klens et al. [Plant Science 116; 97-106; 1996]. В результаті трансформації Agrobacterium HAT 1239 отримували 8 трансформантів: ТІ56-03, Т 156-06, Т156-09, Т156-10, Т15613, Т156-20, Т150-30 і Т157-01, а в результаті трансформації Agrobacterium НАТ1240 отримували 12 трансформантів: Т183-01, Т183-02, Т183-06, Т183-10, Т183-16, Т183-19, Т183-21, Т183-23, Т183-26, Т184-26, Т184-02, Т184-03 і Т184-04. У цих трансформантів індукували цвітіння шляхом яровізації, і вони були використані для отримання сім'я або за допомогою самозапилення (сім'я, отримане самозапиленням, або сім'я S1) або шляхом перехресного запилення з рослинами з чоловічою стерильністю (гібридне сім'я або сім'я F1). Для попередження запилення пилком цукрового буряка від іншого джерела, запилення здійснювали в закритих камерах, що містять пилок. Сім'я F1 використовували як початковий матеріал для проведення біологічного аналізу на резистентність до BNYVV. Проростки заздалегідь скринували на GUS активність, що вказувало на присутність Т-ДНК. GUS-негативні сегреганти були використані як негативний контроль в даному біологічному аналізі. У залежності від повного числа вставок Т-ДНК, резистентність, якщо вона існує, може зазнавати сегрегації в GUS-позитивній популяції. І лише потомство, що походить від ТІ 57-01, виявляло резистентність до BNYVV. Потім, первинний трансформант Т157-01 аналізували більш ретельно на блотах за Саузерном. Геномну ДНК виділяли з листя, розщеплювали окремо ферментами EcoRI, BamHI і Sad, і використовували для отримання блота за Саузерном, який потім зондували GUS. Виходячи з цього екс 14 перименту був зроблений висновок, що первинний трансформант містив три вставки Т-ДНК (Фіг.3). Приклад 3 Біологічний аналіз Біологічний аналіз бічного коріння був розроблений як тест однієї рослини для відбору резистентних до ризоманії рослин цукрового буряка. Однотижневі проростки пересаджували в стандартну суміш з 10% інфікованого ризоманією ґрунту, а потім інкубували протягом 4 тижнів. Умови інфікування оптимізували і стандартизували по рівню тиску інфекції і зростання корінців (тільки утворення волосистого коріння). Використали наступні умови інкубування: 18,9-19°С день/ніч, відносна вологість 70%, освітленість денним світлом 10,000 люкс, вегетаційні судини знаходилися на відстані 32,5см від ламп. Кількість вірусу в проростках, яка безпосередньо корелювала з механізмом резистентності у рослин, вимірювали ELISA-методом. Величину відсічки для резистентних рослин встановлювали при значенні ОП 0,2 [dark et al., J.Virol.Meth. 15:213-222; 1987]. Через чотири тижні після пересадки, нижні частини коріння використали для ELISA. Шматочки коріння сушили на фільтрувальному папері і переносили в ступку. Потім додавали буфер для екстракції при відношенні 10 об'ємних еквівалентів маси коріння (розведення 1/10). Сік з коріння екстрагували за допомогою ручної вижимки. Цей сік переносили в 1,5 мл-пробірки і центрифугували (300об/хв., 10 хвилин), і супернатанти витримували на льоду і аналізували. Були протестовані наступні популяції: Т157-01(F1) Число рослин 73 Cadyx F 052 26 Rhizor F 202 27 Rifle 28 Популяція Примітки Ои8(+)-рослини сприйнятливий контроль толерантний контроль толерантний контроль У групі Т157-01, можуть спостерігатися дві категорії GUS(+)-poслин (Фіг.4). Одна категорія виявляє імунітет проти BNYVV (ELISA-відсічка 0,2) із середньою ELISAвеличиною 0,006, яке являє собою фоновий рівень експериментальної системи. Інша категорія виявляє нормальну сприйнятливість із середньою ELISA-величиною в межах сприйнятливого контролю. Тиск інфекції в даному біоаналізі був високим внаслідок підвищення температури протягом певного відрізка часу інфекційного періоду. Тому, явної відмінності між Ca,dy& І Rhizor/Rifle не спостерігалося (Фіг.4). З іншого боку, резистентні рослини, вибрані в Fl-потомстві ТІ57-01, можуть розглядатися як абсолютно резистентні незалежно від тиску інфекційної ризоманії (Фіг.4). Виходячи з цього можна зробити висновок, що введена конструкція, що містить фрагмент кДНКІ BNYVV, приводила до сильного негативного впливу на розмноження BNYVV в бічному корінні інокульованих 15 79731 трансгенних рослин цукрового буряка, що дозволяло ефективно забезпечувати повну резистентність цих рослин до ризоманії. Для пояснення сегрегації Ои8(+)-популяції на категорії резистентних і сприйнятливих рослин, окремі рослини були проаналізовані в незалежному експерименті на резистентність до BNYVV і одночасно на присутність Т-ДНК за допомогою блот-аналізу за Саузерном з використанням Sad в якості рестриктуючого ферменту і GUS як зонду. Результати, представлені на Фіг.5А і 5В, свідчили про те, що всі GUS (+)-рослини в тій популяції, яка містила одну смугу на блоті за Саузерном, були сприйнятливими (середня ELISA-величина - 0,63), тоді як всі GUS(+)-poanHHH, які містили 2 або 3 смуги на блоті за Саузерном, були резистентними (середня ELISA-величина -0,21). Всі GUS(-)сегреганти виявилися сприйнятливими (середня ELISA-величина - 0,80). Очевидно, що резистентний фенотип асоційований з присутністю- верхньої і нижньої смуги цієї конкретної картини смуг, отриманої на блотах за Саузерном, тоді як присутність середньої смуги не асоційована з резистентним фенотипом. Виходячи з цього можна зробити висновок, що розщеплення ОШ(+)-популяції на сприйнятливу і резистентну категорію може бути пояснене тим фактом, що одна з Т-ДНК, яка приводить до GUS(+)-фенотипу, не надає резистеності до BNYVV. Список послідовностей SES Europe N.V./S.A. Спосіб надання резистентності рослинам цукрового буряка до BNYVV seseurope4seqlist РСТ/ЕРОО/00609 2000-01-26 ЕР 992002360 1999-01-27 16 4 PatentinVer.2.1 1 27 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: Р1 1 cgcggatcca ccatggcaga ttcgttc 2 21 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: Р2 2 gacgaattca agtcgtcttt с 3 23 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: РЗ 3 gacgaattcg aaagatgagt eta 4 28 ДНК Штучна послідовність Опис штучної послідовності: Р4 4 egcagatett taactgetea tcaccaac праймер праймер праймер праймер 17 79731 18 19 79731 20 21 Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 79731 Підписне 22 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601