Вакцинна композиція для імунізації собак проти leptospira bratislava

1. Вакцинна композиція для імунізації собак проти Leptospira bratislava, що включає клітинний препарат Leptospira з Leptospira bratislava, Leptospira canіcola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona і додатково містить атенуйований штам вірусу собачої чуми (СD), атенуйований штам собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2), атенуйований штам вірусу собачого парагрипу (СРІ), атенуйований штам собачого парвовірусу (CPV) і носій, де кількість кожного штаму Leptospira у вакцинній композиції знаходиться в діапазоні приблизно 1003500 нефелометричних одиниць на дозу вакцини. 2. Вакцинна композиція за пунктом 1, в якій кількість кожного штаму Leptospira у вакцині знаходиться в діапазоні приблизно 200-2000 нефелометричних одиниць на дозу. 3. Вакцинна композиція за пунктом 1, в якій носій включає сапонін і сурфактант. 4. Вакцинна композиція за пунктом 3, в якій сапоніном є Quil А і сурфактантом є холестерин. 5. Вакцинна композиція за пунктом 4, в якій кількість Quil А знаходиться в діапазоні 1-1000 мкг/доза, і кількість холестерину знаходиться в діапазоні 1-1000 мкг/доза. 6. Вакцинна композиція за пунктом 1, в якій носій містить гідроксид алюмінію. 7. Вакцинна композиція за п. 1, в якій носій включає Quil A і холестерин, і де Leptospira bratislava й носій перебувають у кількості, 2 (19) 1 3 91197 4 підшкірно. 19. Спосіб за пунктом 17, в якому згадувана собака одержує згадану вакцинну композицію два або три рази з інтервалом приблизно 2-4 тижні між введеннями. 20. Спосіб захисту собак проти Leptospira bratislava, що полягає у введенні собаці вакцинної композиції за пунктом 9 у терапевтично ефективній кількості. 21. Спосіб за пунктом 20, в якому згадану вакцинну композицію вводять внутрішньовенно, інтраназально, орально, внутрішньом'язово або підшкірно. 22. Спосіб за пунктом 20, в якому собака одержує згадану вакцинну композицію два або три рази з інтервалом приблизно 2-4 тижні між введеннями. 23. Спосіб імунізації собак проти Leptospira bratislava, що полягає у введенні собаці вакцинної композиції за пунктом 9. 24. Спосіб за пунктом 23, в якому згадану вакцинну композицію вводять внутрішньовенно, інтраназально, орально, внутрішньом'язово або підшкірно. 24. Спосіб за пунктом 23, в якому собака одержує згадану вакцинну композицію два або три рази з інтервалом приблизно 2-3 тижні між введеннями. Цей винахід стосується вакцин, що містять р68 антиген Bordetella bronchiseptica, і які використовують для захисту собак проти інфекційного трахеобронхіту ("собачий кашель"), викликаний Bordetella bronchiseptica. Цей винахід також стосується комбінованих вакцин, що містять р68 антиген Bordetella bronchiseptica і один або більше антигенів інших собачих патогенів, таких як вірус собачої чуми (CD), собачий аденовірус тип 2 (CAV-2), вірус собачого парагрипу (СРІ), собачий коронавірус (CCV), собачий парвовірус (CPV), Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae або Leptospira pomona. Винахід також охоплює способи захисту собак від захворювань, викликаних собачими патогенами, шляхом застосування комбінованих вакцин. Цей винахід стосується вакцин, що містять Leptospira bratislava і їх використання для захисту собак від інфекцій, викликаних Leptospira bratislava. Цей винахід також стосується комбінованих вакцин, що містять Leptospira bratislava й один або більше антигенів інших собачих патогенів, таких як вірус собачої чуми (собача чума (CD)), собачий аденовірус тип 2 (CAV-2), вірус собачого парагрипу (СРІ), собачий коронавірус (CCV), собачий парвовірус (CPV), Leptospira canicola, Leptospira gnppotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae або Leptospira pomona. Цей винахід далі стосується комбінованих вакцин згаданих антигенів без Leptospira bratislava. Винахід також охоплює способи захисту собак від захворювань, викликаних собачими патогенами, шляхом використання комбінованих вакцин. Представлена комерційно доступна собача вакцина Bordetella bronchiseptica, що складається з інактивованої, неад'ювантної цілої клітини Bordetella bronchiseptica. Такі цілі клітини бактерій у вакцинах можуть приводити до поствакцинальних реакцій, пов'язаних з целюлярним протеїном. Протеїн р68 В. bronchiseptica подібний за антигенною структурою до протеїну зовнішньої мембрани (ПЗМ.ОМР) В.pertussis і ПЗМ B.parapertussis (Shahin та інші, "Characterization of the Protective Capacity and Immunogenicity of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis", J. Exp. Мed.. 171: 63-73,1990). Захисна роль цього ПЗМ була продемонстрована для мишей (Shahin та інші, supra; Novotny та інші, "Biologic and Protective Properties of the 69-kD Outer Membrane Protein of Bordetella pertussis: A Novel Formulation for a Acellular Pertussis Vaccine", J. Infect. Pis. 164: 114-22,1991), людей (Не та інші, "Protective Role of Immunoglobulin G Antibodies to Filamentous Hemagglutinin and Pertactin of Bordetella pertussis in Bordetella parapenussis Infection", Eur. J. Clin Microbiol Infect Pis. 10: 793798,40 1996) і свиней (Kobisch та інші," Identification of a 68-Kilodalton Outer Membrane Protein as the Major Protective Antigen of Bordetella bronchiseptica by Using Specific-Pathogen-Free Piglets". Infect. Immun. 58(21: 352-357.1990). До представленого винаходу не було показано, що р68 антиген Bordetella bronchiseptica може бути безпечною й ефективною вакциною для собак. Тому, є потреба розробляти вакцину Bordetella bronchiseptica, що містить р68 антиген, яка є прийнятною для використання у собак. Було б ще більш корисно, якщо така вакцина Bordetella bronchiseptica р68 була б безпечною для призначення щенятам і забезпечувала б довгостроковий захист. Собача чума (CD) - широкорозповсюджене, з високою летальністю вірусне захворювання з різноманітними проявами. Приблизно у 50% невакцинованих неімунізованих собак, інфікованих вірусом собачої чуми (CD), розвиваються клінічні симптоми, і приблизно 90% таких собак вмирають. Інфекційний собачий гепатит (ІСГ) або ІСН, викликаний собачим аденовірусом типу 1 (CAV-1), є розповсюдженим, іноді фатальним вірусним захворюванням собак, що характеризуються печінковими і генералізованими ендотеліальними ураженнями. CAV-2 спричиняє респіраторне захворювання, що у важких випадках, може включати пневмонію й бронхопневмонію. СРІ - загальне вірусне захворювання верхнього респіраторного тракту. Неускладнений СРІ може бути помірним або субклінічним, із симптомами, що стають більше серйозними, якщо існує конкурентна інфекція з іншими респіраторними патогенами. CPV інфекція приводить до кишкового захворювання, що характеризується раптовим початком блювоти й діареї, часто геморагічного. Зазвичай клінічні симптоми супроводжує лейкопенія. Інфікованимим можуть бути собаки будь-якого віку, але летальність є найбільш великою серед 5 щенят. У щенят віком 4-12 тижнів CPV може іноді викликати міокардит, що може призвести до гострої серцевої недостатності після короткого й латентного захворювання. Після інфекції багато собак є рефрактерними до захворювання протягом року або більше. Так само ж, серопозитивні суки можуть передати своїм щенятам CPV антитіла, які можуть перешкоджати активній імунізації щенят протягом 16-тижневого віку. CCV також викликає кишкове захворювання у сприйнятливих собаках всіх вікових категорій в усьому світі. Висококонтагіозний вірус передається насамперед через прямий контакт із інфікованими екскрементами і може викликати клінічний ентерит протягом 1-4 днів після експозиції. Серйозність захворювання може бути посилена конкурентною інфекцією іншими агентами. Первинні симптоми CCV інфекції включають анорексію, блювоту і понос. Частота блювоти звичайно зменшується протягом дня або на 2-й день після початку діареї, але діарея може затриматися через перебіг інфекції, і екскременти іноді можуть містити смуги крові. З CCV інфекцією більшість собак залишається афебрильними і в нескладних випадках лейкопенія не спостерігається. Лептоспіроз зустрічається у собак усіх вікових категорій у різноманітності клінічних симптомів і хронічних нефритів взагалі під час гострої інфекції. Були розроблені деякі комбіновані вакцини, включаючи такі, що продавалися під торговельною ® маркою Vanguard . Однак, до представленого винаходу не було ніяких ефективних комбінованих вакцин, які б захищали собак від Bordetella bronchiseptica і однієї або більшої кількості інших собачих патогенів, таких як вірус собачої чуми (CD), CAV-2, вірус СРІ, CPV, CCV і видів Leptospira, таких як L. bratislava, L. canicola, L. gnppotyphosa, L icterohaemorrhagiae і L. роmоnа. Також не було ніяких ефективних комбінованих вакцин, що включають L. bratislava проти інших собачих патогенів, але без Bordetella bronchiseptica. Проблема в розвитку комбінованих вакцин включає інтерференцію ефективності, а саме неспроможність одного або більше антигенів у комбінованій композиції підтримувати або досягати ефективності через присутність інших антигенів у композиції. Це, як вважають, є результатом інтерференції з антигеном у композиції, що призначається хазяїну, наприклад, собаці, такий антиген індукує у хазяїні через присутність інших антигенів у композиції імунологічну, антигенну, антитільну або захисну реакції. Однак, для інших хазяїв, таких як коти, комбіновані вакцини відомі. Вважається, що інтерференція ефективності в організмі собак обумовлена деякою особливістю собаки, як біологічної системи, або внаслідок реакції антигенів із біологічною системою собаки. Тому, є потреба розробляти комбіновану вакцину, прийнятну для призначення собаці проти Bordetella bronchiseptica і одного або більше інших собачих патогенів, що не проявляє інтерференцію ефективності у собак. Є також потреба розробляти такі комбіновані вакцини без Bordetella 91197 6 bronchiseptica. Було б ще більш вигідно, якби такі комбіновані вакцини були безпечними для призначення щенятам і забезпечували довгостроковий захист. Даний винахід охоплює вакцини й способи захисту собак від захворювань, викликаних собачими патогенами. В одному варіанті реалізації даний винахід стосується р68 вакцин, прийнятних для введення собакам і здатних захистити собак від захворювання, викликаного Bordetella bronchiseptica. Такі вакцини представленого винаходу включають р68 антиген Bordetella bronchiseptica і прийнятний у ветеринарії носій, такий як ад'ювант. В іншому варіанті реалізації даний винахід забезпечує способи захисту собак від захворювання, викликаного Bordetella bronchiseptica, шляхом введення собаці вакцини, що включає р68 антиген Bordetella bronchiseptica і прийнятний у ветеринарії носій, такий як ад'ювант. В іншому варіанті реалізації даний винахід забезпечує вакцини Leptospira bratislava, прийнятні для введення собакам і здатні захистити собак від захворювання, викликаного Leptospira bratislava. Такі вакцини представленого винаходу включають клітинний препарат Leptospira bratislava й прийнятний у ветеринарії носій, такий як ад'ювант. В іншому варіанті реалізації даний винахід забезпечує способи захисту собак від захворювання, викликаного Leptospira bratislava, шляхом призначення собаці вакцини, що включає клітинний препарат Leptospira bratislava й прийнятний у ветеринарії носій, такий як ад'ювант. Ще в одному іншому варіанті реалізації даний винахід забезпечує комбіновані вакцини, прийнятні для введення собакам. Комбіновані вакцини представленого винаходу включають р68 антиген Bordetella bronchiseptica у комбінації з принаймні одним іншим антигеном від інших собачих патогенів, здатних до стимулювання захисної імунної реакції у собак від захворювання, викликаного таким іншим патогеном(ами). Такі інші патогени можуть бути вибрані із вірусу собачої чуми (CD), собачого аденовірусу тип 2 (CAV-2), вірусу собачого парагрипу (СРІ), собачого парвовірусу (CPV), собачого коронавірусу (CCV), вірусу герпеса собак, вірусу сказу, Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Leishmania spp., Borrelia spp., Ehrlichia spp., Mycoplazma spp.. і Microsporum canis. Переважна комбінація представленого винаходу включає два або більше антигенів від собачих патогенів, здатних до стимулювання захисної імунної реакції у собаки від захворювання, викликаного таким патогеном(ами). Такі патогени можуть бути вибрані з наступних: вірус собачої чуми (CD), собачий аденовірус типу 2 (CAV-2), вірус собачого парагрипу (СРІ), собачий парвовірус (CPV), собачий коронавірус (CCV), вірус собачого герпеса, вірус сказу, Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira 7 grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Leishmania spp., Borrelia spp., Ehrlichia spp., Mycoplazma spp.. і Microsporum canis. Переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2), вірусу собачого парагрипу (СРІ) і собачого парвовірусу (CPV); препарат інактивованого штаму собачого коронаровірусу (CCV); і р68 антиген Bordetella bronchiseptica. Переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2), вірусу собачого парагрипу (СРІ) і собачого парвовірусу (CPV); і препарат інактивованого штаму собачого коронаровірусу (CCV). Інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми(СО), собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2), вірусу собачого парагрипу (СРІ) і собачого парвовірусу (CPV); препарат інактивованого штаму собачого коронаровірусу (CCV); протеїн р68 Bordetella bronchiseptica, і препарат інактивованих клітин п'яти сероварів Leptospira (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2), вірусу собачого парагрипу (СРІ), і собачого парвовірусу (CPV); і препарат інактивованого штаму собачого коронаровірусу (CCV); і препарат п'яти сероварів Leptospira (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2), вірусу собачого парагрипу (СРІ), і собачого парвовірусу (CPV); препарат інактивованого штаму собачого коронаровірусу (CCV); і препарат інактивованих клітин чотирьох сероварів Leptospira (Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Ще одна інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV; і р68 антиген.Bordetella bronchiseptica. Ще одна інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV. Інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV; р68 антиген Bordetella 91197 8 bronchiseptica; і препарат інактивованих клітин Leptospira canicola і Leptospira icterohaemorrhagiae. Інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV; і препарат інактивованих клітин Leptospira canicola і Leptospira icterohaemorrhagiae. Ще одна інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV, р68 антиген Bordetella bronchiseptica і препарат інактивованих клітин п'яти Leptospira сероварів (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Ще одна інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV, і препарат інактивованих клітин п'яти сероварів Leptospira (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Ще одна інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV, і препарат інактивованих клітин чотирьох сероварів Leptospira (Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa,Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Інша переважна комбінована вакцина включає р68 антиген Bordetella bronchiseptica і атенуйований вірус СРІ. Ще одна інша переважна комбінована вакцина включає р68 антиген Bordetella bronchiseptica, атенуйований штам вірусу СРІ і препарат інактивованих клітин Leptospira canicola і Leptospira icterohaemorrhagiae. Даний винахід також стосується способів захисту собак від захворювання, викликаного собачим патогеном, шляхом введення собаці комбінованої вакцини даного винаходу. Фіг.1. Сумарне середнє геометричне значення р68 кінцевої точки титрів ELISA в невакцинованих і вакцинованих з Bordetella р68 (15мкг/доза) після інгаляційної провокації з Bordetella bronchiseptica. Фіг.2. Сумарні титри амілоїду сироватки собак після інгаляційної провокації з Bordetella bronchiseptica. Фіг.3. Сумарне середнє геометричне значення р68 кінцевої точки титрів ELISA у невакцинованих і вакцинованих Bordetella р68 собак після вакцинації і після інгаляційної провокації з Bordetella bronchiseptica. Фіг.4. Сумарні титри амілоїду А сироватки у собак після інгаляційної провокації з Bordetella bronchiseptica. Фіг.5. Вестерн-блоттинг, що демонструє реакційну здатність рб8 моноклонального антитіла Bord 2-7 щодо р68 цілого лізату клітин. В одному з варіантів реалізації даний винахід забезпечує моновалентні вакцини, прийнятні для введення собакам, які здатні захистити собак від захворювання, викликаного Bordetella 9 bronchiseptica. Моновалентні вакцини представленого винаходу включають рекомбінантний р68 антиген Bordetella bronchiseptica і прийнятний у ветеринарії носій, такий як ад'ювант. В іншому варіанті реалізації, даний винахід забезпечує способи захисту собак від захворювання, викликаного Bordetella bronchiseptica, шляхом введення собаці моновалентної вакцини, що включає рекомбінантний р68 антиген Bordetella bronchiseptica і прийнятний у ветеринарії носій, такий як ад'ювант. Ще в одному іншому варіанті реалізації даний винахід забезпечує комбіновані вакцини, прийнятні для введення собакам. Комбіновані вакцини представленого винаходу включають рекомбінантний р68 антиген Bordetella bronchiseptica у комбінації принаймні з одним з інших антигенів, здатних до стимулювання захисної імунної реакції в організмі собак від захворювання, викликаного таким іншим антигеном. Інше втілення представленого винаходу включає два або більше антигени від собачих патогенів, здатних до стимулювання захисної імунної реакції в організмі собак від захворювання, викликаного таким патогеном(ами). Переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми(СО), собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2), вірусу собачого парагрипу (СРІ) і собачого парвовірусу (CPV); препарат інактивованого штаму собачого коронаровірусу (CCV); і препарат чотирьох сероварів Leptospira (Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, і Leptospira pomona). Інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), собачого аденовірусу типу 2 (CAV-2), вірусу собачого парагрипу (СРІ) собачого парвовірусу (CPV); препарат інактивованого штаму собачого коронаровірусу (CCV); і препарат п'яти сероварів Leptospira (Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Ще одна інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV; і препарат чотирьох сероварів Leptospira (Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV, штам CCV; і препарат Leptospira canicola і Leptospira icterohaemorrhagiae. Ще одна інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйовані штами вірусу собачої чуми (CD), CAV-2, вірусу СРІ, штам CPV й препарат п'яти сероварів Leptospira (Leptospira bratislava, Leptospira 91197 10 canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona). Даний винахід також забезпечує способи захисту собак від захворювання, викликаного собачим патогеном, шляхом введення собаці комбінованої вакцини даного винаходу. Для ясності розкриття, а не з ціллю обмеження, детальний опис винаходу розділений на наступні підрозділи, які описують або ілюструють деякі особливості, втілення або додатки винаходу. Визначення і Абревіатура Термін "захист собаки від захворювання, викликаного собачим патогеном", як використовується тут, означає зменшення або виключення ризику інфекції, спричиненої патогеном, поліпшення стану або полегшення симптомів інфекції, або прискорення реконвалесценції. Захист досягнутий, якщо є зменшення вірусного або бактеріального навантаження, зменшення вірусного або бактеріального розповсюдження, зменшення інцидентів або тривалості інфекцій, зменшення гострофазних серологічних змістів протеїну, зниження ректальної температури, та/або збільшення ваги та/або росту, наприклад. Термін "р68 антиген" відноситься до протеїну з молекулярною масою 68kDa, як визначено електрофорезом в гелі поліакриламіду SDS, розпізнаного р68-специфічним моноклональним антитілом Bord 2-7 (АТСС #), і має амінокислотну послідовність, як наведено в SEQ ID NO:1, або амінокислотну послідовність, що є по суті ідентичною SEQ ID NO:1. Під терміном "в основному ідентична" розуміють ступінь ідентичності послідовності принаймні приблизно на 90%, переважно принаймні приблизно на 95%, або більш переважно, принаймні приблизно на 98%. Термін "моновалентна вакцина", як використовується тут, відноситься до вакцини, що має один основний антигенний компонент. Наприклад, р68 моновалентна вакцина включає р68 антиген Bordetella bronchiseptica як основний антигенний компонент вакцини й здатна захистити тварину, якій вакцина вводиться від захворювань, викликаних Bordetella bronchiseptica. Інший приклад моновалентної вакцини включає клітинний препарат Leptospira bratislava як основний антигенний компонент вакцини й здатна до захисту тварини, до якої вакцина вводиться від захворювань, викликаних Leptospira bratislava. Термін "комбінована вакцина" означає бівалентну або полівалентну комбінацію антигенів, яка здатна до стимулювання захисної імунної реакції у собак. Захисні ефекти комбінованої вакцини проти патогену або патогенів звичайно досягаються індукуванням у тварини імунної реакції або клітинно-опосередкованої або гуморальної імунної реакції або їх комбінацій. "Імуногенний" означає здатність композиції викликати імунну реакцію у собак на специфічний патоген або патогени. Імунна реакція може бути клітинною імунною реакцією, опосередкованою насамперед цитотоксичними Т-лімфоцитами й 11 цитокін-продукуючими Т-лімфоцитами або гуморальною імунною реакцією, опосередкованою насамперед хелперними Т-лімфоцитами, що у свою чергу активізує В-лімфоцити, що ведуть до продукції антитіл. Термін "терапевтично ефективна кількість" або "ефективна кількість" відноситься до кількості моновалентної або комбінованої вакцини, достатньої виявляти захисну імунну реакцію у організмі собаки, якій це вводиться. Імунна реакція може включати, без обмеження, індукцію клітинного й/або гуморального імунітету. Кількість вакцини, що є терапевтично ефективною, може змінюватися залежно від специфічного антигену, використовуваного у вакцині, віку й стану організму собаки, та/або ступеня інфекції, і може бути визначена ветеринарним лікарем. р68 Вакцини Даний винахід вперше продемонстрував, що композиція вакцини, що містить р68 антиген Bordetella bronchiseptica, ефективно захищає собак від захворювання, викликаного Bordetella bronchiseptica. Композиція вакцини представленого винаходу не викликає суттєвих пост-вакцинальних реакцій, безпечна для введення щенятам, і індукує захисний імунітет у організмі собак, що триває протягом продовженого періоду часу. Відповідно, одне з втілень представленого винаходу спрямовано до вакцинної композиції, що містить р68 антиген Bordetella bronchiseptica (або "р68 вакцина"), яка прийнятна для введення собакам і здатна захистити собак від захворювання, викликаного Bordetella bronchiseptica, наприклад, інфекційного трахеобронхіту ("собачий кашель"). Для цілей представленого винаходу, термін "р68 антиген" відноситься до протеїну (див. Фіг.5) з молекулярною масою 68kD, як визначено електрофорезом у гелі поліакриламіду SDS, розпізнаного р68-специфічним моноклональним антитілом Bord 2-7 (АТСС #), який має амінокислотну послідовність, як наведено в SEQ ID NO:1 або амінокислотну послідовність, що по суті ідентична SEQ ID NO:1. Термін "по суті ідентична" означає ступінь ідентичності послідовності принаймні приблизно 90%, переважно принаймні приблизно 95%, або більш переважно, принаймні приблизно 98%. Прикладом р68 антигену, що має амінокислотну послідовність, по суті ідентичну SEQ ID NO:1, є р68 антиген, описаний в WO 92/17587, що наведений в SEQ ID NO:3. р68 специфічне моноклональное антитіло представленого винаходу розпізнає нативні р68 протеїни, рекомбінантнні р68 протеїни й р68 протеїни на поверхні бактерій, наприклад. Згідно з даним винаходом, р68 антигени, прийнятні для використання в представленому винаході включають обидва нативні р68 протеїни (тобто, що зустрічаються у природі (нативні) р68 протеїни, очищені від Bordetella bronchiseptica) і рекомбінантні р68 протеїни. Очищення нативного р68 від Bordetella bronchiseptica описано, наприклад, в Montaraz та інші., Infection and Immunity, 47: 744-751 (1985), і 91197 12 також проілюстровано в нижченаведених прикладах. Одержання рекомбінантного р68 досягається використанням будь-якого молекулярного клонування й способів рекомбінантної експресії, відомих фахівцям у даній галузі. Наприклад, кодована молекула нуклеїнової кислоти р68 може бути введена в прийнятну клітину хазяїна, таку як бактерія, дріжджова клітина (наприклад, клітина Pichia), клітина комахи або клітина ссавця (наприклад, СНО клітина). Молекула кодованої нуклеїнової кислоти може бути поміщена до функціонально зв'язаного промотора, здатного активувати здійснення експресії р68 антигену в клітині хазяїна. р68, що експресований клітиною хазяїна, може бути очищений, використовуючи звичайні способи очищення протеїну. У переважному втіленні представленого винаходу, нуклеотидну послідовність, як наведено в SEQ ID NO:2, що кодує р68 антиген, який має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1, клонують у векторі експресії й поміщають до функціонально зв'язаного термолабільного промотора. Вектор експресії вводили в Escherichia coli і р68 антиген був експресований під індукцією високої температури. Клітини піддавали лізису й тільця включення, де накопичується р68 антиген, відділяли центрифугуванням. Рекомбінантний р68 у тільцях включення солюбілізували, використовуючи SDS або інші солюбілізатори, відомі в даній галузі, такі як сечовина, хлоргідрат гуанідину, холат натрію, таурохолат, і натрію деоксихолат. Згідно з даним винаходом, очищений нативний або рекомбінантний р68 протеїн комбінували із прийнятним для ветеринарних цілей носієм, щоб утворити композицію р68 вакцини. Термін "прийнятний у ветеринарії носій" включає будь-який і усі розчинники, дисперсійне середовище, покриття, ад'юванти, стабілізатори; розріджувачі, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, пролонгатори абсорбції, і т.п. Розріджувачі можуть включати воду, сольові розчини, декстрозу, етиловий спирт, гліцерин, і т.п. Ізотонічні агенти можуть включати хлорид натрію, декстрозу, манніт, сорбіт і лактозу, серед інших. Стабілізатори серед інших включають альбумін. Ад'юванти, прийнятні для використання згідно з даним винаходом включають, але не обмежуються декількома класами ад'ювантів, таких як: мінеральні солі, наприклад, галуни, гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію й фосфат кальцію; поверхнево-активні агенти і мікрочастинки, наприклад, неіонні блок-полімерні сурфактанти (наприклад, холестерин), віросоми, сапоніни (наприклад, Quil A, QS-21 і GPI-0100), протеосоми, комплекси, що стимулюють імунітет, кохлеати, четвертинні аміни (диметилдіокатадециламмонію бромід (DDA)), аврідин, вітамін А, вітамін Е; бактеріальні продукти, такі як RIBI ад'ювантна система (Ribi Inc), остов клітинної оболонки Mycobacterum phlei (Detox®), мурамілдипептиди дипептиди (MDP) і трипептиди (МТР), монофосфорилліпід А, бацила 13 Calmete-Guerin, термолабільний ентеротоксин Е.соlі, токсин холери, диміколат тригалози, CpG олігодеокснуклеотиди; цитокіни й гормони, наприклад, інтерлейкіни (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL15, IL-18), гранулоцитарно-макрофагальний колоніє-стимулювальний фактор, дегідроепіандростерон, 1,25-дигідроксивітамін D3; поліаніони, наприклад, декстран; поліакрилати (наприклад, поліметилметакрилат, Carbopol 934P); носії, наприклад, правцевий анатоксин, дифтерийний анатоксин, токсин холери В, мутант лабільного ентеротоксину Е.соlі (rmLT), термошокові протеїни; емульсії типу "масло-у-воді", наприклад, AMPHIGEN® (Hydronics, США); і емульсії типу "вода-в-маслі" такі як, наприклад, повні й неповні ад'юванти Фреунда. Переважні ад'юванти для використання у вакцинах представленого винаходу включають Quil А і холестерин. р68 Антиген і прийнятний у ветеринарії носій можуть бути скомбіновані будь-яким зручним й практичним способом, щоб утворити комбіновані вакцинні композиції, як, наприклад, змішування, розчинення, суспендування, емульгування, капсулювання, абсорбція й т.п., і можуть бути виготовлені у формах, таких як таблетки, капсули, порошки, сиропи, суспензії, які є прийнятними для ін'єкцій, імплантацій, інгаляцій, внутрішнього прийому або подібних способів введення. Переважно, вакцина утворена так, що вона може вводитися собакам ін'єкцією в дозі від приблизно 0,1 до 5мл, або переважно від приблизно 0,5 до 2,5мл, або ще більш переважно, у дозі приблизно 1мл. Коли прийнятно, фармацевтичні композиції представленого винаходу повинні бути одержані як стерильні відповідно до відомих процедур. Кількість р68 у вакцинах повинна бути імунізаційно ефективною й перебуває взагалі в діапазоні 0,5-1000мкг/доза. Переважно, кількість р68 перебуває в діапазоні 1-260мкг/доза. Більш переважно, кількість р68 перебуває в діапазоні 10100мкг/доза. Ще більш переважно, кількість р68 приблизно 15-25мкг/доза. Кількість ад'ювантів, прийнятних для використання у вакцинах, залежить від природи використовуваного ад'юванта. Наприклад, коли Quil А і холестерин використовуються як ад'ювант, Quil А використовують в кількості приблизно 11000мкг/доза, переважно 30-100мкг/доза, і більш переважно, приблизно 50-75мкг/доза; і холестерин використовують взагалі в кількості приблизно 11000мкг/доза, переважно приблизно 30100мкг/доза, і більш переважно, приблизно 5075мкг/доза. В іншому варіанті реалізації даний винахід забезпечує способи захисту собак від захворювання, викликаного Bordetella bronchiseptica, шляхом введення собаці композиції вакцини рб8, як описано вище. Згідно з даним винаходом, композиція вакцини р68 забезпечує собак імунітетом тривалого строку протягом принаймні приблизно 4 місяців, переважно протягом принаймні приблизно 6 місяців, або ще більш переважно, протягом приблизно одного року. 91197 14 Згідно з даним винаходом, р68 вакцина може вводитися собакам будь-якими відомими шляхами, включаючи оральний, інтраназальний, мукозальний, місцевий, трансдермальний, і парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, інтраперитонеальний, внутрішньошкірний, підшкірний або внутрішньом'язовий). Введення може також бути досягнуто, використовуючи безголкові ін'єктори. Введення може бути досягнуто, використовуючи комбінацію шляхів введення, наприклад, перше введення парентерально, наступне - мукозально. Переважні шляхи введення включають підшкірний і внутрішньом'язовий. Композиція вакцини р68 представленого винаходу може вводитися собакам віком принаймні 6 тижнів, переважно принаймні 7 тижнів, і більш переважно, принаймні 8 або 9 тижнів. Собаки можуть бути вакциновані однією дозою або більше, ніж однією дозою р68 вакцини. Переважно, дві дози р68 вакцини вводяться собакам з інтервалом приблизно 2-4 тижні, переважно приблизно 3 тижні, між цими двома введеннями. Якщо собаки вакциновані до віку 4 місяці, рекомендується, щоб вони були повторно вакциновані однократною дозою після досягнення 4 місячного віку, тому що материнські антитіла можуть інтерферувати з розвитком адекватної імунної реакції у щенят віком менше, ніж 4 місяці. Собаки можуть також бути ревакциновані щорічно однократною дозою. У випадку, якщо імовірний контакт з В. bronchiseptica та/або собачим вірусом, при таких умовах як розмноження, харчування, і виставкові ситуації, додатковий стимулятор може бути наданий у межах 1-року, або переважно 6 місяців від здійснення цих подій. Комбіновані вакцини В іншому варіанті реалізації, даний винахід забезпечує комбіновані вакцини й способи захисту собак щодо Bordetella bronchiseptica і/або одного або більше інших собачих патогенів, застосовуючи такі комбіновані вакцини. Комбіновані вакцинні композиції представленого винаходу не показують інтерференції ефективності й безпечні для введення щенятам. Комбіновані вакцини представленого винаходу включають р68 антиген Bordetella bronchiseptica, що може бути одержаний як описано вище, у комбінації з принаймні одним антигеном інших собачих патогенів, здатних до стимулювання захисної імунної реакції організмі собак від захворювання, викликаного такими іншими патогенами. Такі комбіновані вакцини також включають комбінації двох або більше таких інших собачих патогенів без р68 антигену. Такі інші патогени включають, але не обмежуються ними, вірус собачої чуми (собача чума (CD)), собачий аденовірус тип 2 (CAV-2), вірус собачого парагрипу (СРІ), собачий парвовірус (CPV), собачий коронавірус (CCV), вірус собачого герпеса і вірус сказу. Антигени від цих собачих патогенів для використання у вакцинних композиціях представленого винаходу можуть бути у формі модифікованого живого вірусного препарату або інактивованого вірусного 15 препарату. Способи атенуації вірулентних штамів цих вірусів і способи одержання інактивованого вірусного препарату відомі в даній галузі і описані в, наприклад, патентах США 4 567 042 і 4 567 043. Інші патогени також включають Leptospira Bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bactenodes spp., Leishmania spp., Borrelia spp., Ehrlichia spp., Mycoplasma ssp. і Microsporum canis. Антигени від цих собачих патогенів для використання у вакцинних композиціях представленого винаходу можуть бути у формі інактивованого препарату цілої клітини або частини клітини, використовуючи способи, відомі в даній галузі. Наприклад, способи одержання інактивованого препарату цілої клітини або частини клітини Leptospira відомі в даній галузі і описані в, наприклад, Yan, K-T, "Aspects of Immunity to Leptospira borgpetersenii serovar hardjo', PhD Thesis, Appendix 1,1996. Faculty of Agriculture and Food Science, The Queen's University of Belfast; Mackintosh та інші, "The use of a hardjo-pomona vaccine to prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challenge with Leptospia interrogans serovar hardjo", New Zealand Vet. J. 28: 174-177,1980; Bolin та інші, "Effect of vaccination with a pentavalent leptopsiral vaccine on Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-boivs infection of pregnant cattle". Am. J. Vet. Res. 50: 161-165.1989. Згідно з даним винаходом комбіновані вакцини взагалі включають прийнятний у ветеринарії носій. Як описано вище, прийнятний у ветеринарії носій включає будь-які розчинники, дисперсійне середовище, покриття, ад'юванти, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні й протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, пролонгатори абсорбції, і т.п. Розріджувачі можуть включати воду, сольові розчини, декстрозу, етиловий спирт, гліцерин, і т.п.. Ізотонічні агенти можуть включати хлористий натрій, декстрозу, манніт, сорбіт, і лактозу, серед інших. Стабілізатори серед інших включають альбумін. Ад'юванти, прийнятні для використання згідно з даним винаходом включають, але не обмежуються декількома класами ад'ювантів, таких як; мінеральні солі, наприклад, галуни, гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію й фосфат кальцію; поверхнево-активні агенти і мікрочастинки, наприклад, неіонні блок-полімерні сурфактанти (наприклад, холестерин), виросоми, сапоніни (наприклад, Quil A, QS-21 і GPI-0100), протеосоми, стимулювальні імунітет комплекси, кохлеати, четвертинні аміни (диметилдіокатадециламмонію бромід (DDA)), аврідин, вітамін А, вітамін Е; бактеріальні продукти, такі як RIBI ад'ювантна система (Ribi Inc), остов клітинної оболонки Mycobacterum phlei (Detox®), мурамілдипептиди дипептиди (MDP) і трипептиди (МТР), монофосфорилліпід А, бацила Calmete-Guerin, термолабільний ентеротоксин Е.соlі, токсин холери, диміколат тригалози, CpG олігодеокснуклеотиди; цитокіни й гормони, наприклад, інтерлейкіни (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL15, IL-18), гранулоцитарно-макрофагальний 91197 16 колоніє-стимулювальний фактор, дегідроепіандростерон, 1,25-дигідрокси вітамін Д3; поліаніони, наприклад, декстран; поліакрилати (наприклад, поліметилметакрилат, Carbopol 934P); носії, наприклад, правцевий анатоксин, дифтерийний анатоксин, токсин холери В, мутант лабільного ентеротоксину Е.соіі (rmLT), термошокові протеїни; емульсії типу "масло-у-воді" наприклад, AMPHIGEN® (Hydronics, США); і емульсії типу "вода-в-маслі" такі як, наприклад, повні й неповні ад'юванти Фреунда. Переважні ад'юванти для використання в комбінованих вакцинах відповідно до представленого винаходу включають Quil А і холестерин; 2) гідроксид алюмінію. Кількість ад'ювантів, прийнятних для використання у вакцинах залежить від природи використовуваного ад'юванта. Наприклад, коли Quil А і холестерин використовуються як ад'юванти, Quil А використовують взагалі в кількості приблизно 1-1000мкг/доза, переважно 30100мкг/доза, і більш переважно, приблизно 5075мкг/доза; і холестерин використовують взагалі в кількості приблизно 1-1000мкг/доза, переважно приблизно 30-100мкг/доза, і більш переважно, приблизно 50-75мкг/доза. Коли гідроксид алюмінію використовують як ад'ювант, він міститься взагалі в кількості приблизно 0,5-20%, переважно приблизно 0,5-10%, і більш переважно приблизно 1-2%. р68 Антиген, один або більше антигенів від інших собачих патогенів, і/або прийнятний у ветеринарії носій може бути скомбінований будьяким зручним й практичним способом, щоб утворити комбіновані вакцинні композиції, як, наприклад, змішування, розчинення, суспендування, емульгування, капсулювання, абсорбція й т.п., і можуть бути виготовлені у формах, таких як таблетки, капсули, порошки, сиропи, суспензії, які є прийнятними для ін'єкцій, імплантацій, інгаляцій, внутрішнього застосування або подібними. Переважно, вакцина утворена так, що може вводитися собакам ін'єкцією в дозі приблизно 0,1-5мл, або переважно приблизно від 0,5 до 2,5мл, або ще більш переважно, у дозі приблизно 1мл. Комбіновані вакцини можуть бути одержані, шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів (або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) і вірусного препарату з рідким препаратом, який скомбінований з антигенами Leptospira, розчиненими в стерильному фізіологічному розчині і поєднаний з Quil А і холестерином. Така комбінована вакцина може також бути одержана шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів і препарату Leptospira (або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) з стерильним розчином або шляхом регідратації згадуваного ліофільно-висушеного препарату з CCV і розріджувачем. 17 Згідно з даним винаходом комбіновані вакцини можуть вводитися собаці віком принаймні 6 тижнів, переважно принаймні 7 тижнів, і більш переважно, принаймні 8 або 9 тижнів. Комбіновані вакцини можуть вводитися собаці в 2-4 дозах, переважно в 2-3 дозах. Дози можуть вводитися собаці з 2-6 тижнями перерви між кожною дозою, переважно з 2-4 тижнями між кожною дозою. Введення може бути здійснено будь-якими відомими шляхами, включаючи оральний, інтраназальний, мукозальний, місцевий, трансдермальний і парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, інтраперитонеальний, внутрішньошкірний, підшкірний або внутрішньом'язовий). Введення може також бути досягнуто, використовуючи безголкові ін'єктори. Введення може також бути досягнуто, використовуючи комбінацію шляхів введення, наприклад, перше введення - парентерально і наступне ведення - мукозально. Переважні шляхи введення включають підшкірні й внутрішньом'язові введення. Переважні комбіновані вакцини й способи вакцинації Переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйований штам вірусу собачої чуми (CD), атенуйований штам CAV-2, атенуйований штам вірусу СРІ, атенуйований штам CPV, інактивований препарат штаму CCV, і р68 антиген Bordetella bronchi'septica. Особливо переважна комбінована вакцина включає атенуйований штам вірусу собачої чуми (CD), позначену як штам "Snyder Hill" (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), атенуйований штам CAV-2, позначений як штам "Манхеттен" (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), атенуйований штам вірусу СРІ, що має позначення "NL-CPI-5" (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), атенуйований штам CPV, що має позначення "NL35-D" (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), інактивований препарат CCV, що має позначення «NL-18» (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), і рекомбінантний р68 антиген Bordetella bronchiseptica, що має послідовність SEQ ID NO:1. Така комбінована вакцина, також згадувана тут як "p68/5CV комбінована вакцина", переважно одержана шляхом регідратації ліофільно висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів і вірусного препарату з рідким препаратом, що скомпонований з р68 антигеном, розчиненим в стерильному фізіологічному розчині й поєднаний із Quil А і холестерином. Така комбінація без р68 антигену згадувана тут як 5CV комбінація. Така комбінована вакцина переважно одержана шляхом регідратації ліофільно висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів і вірусного препарату з рідким препаратом, що скомпонований із стерильного фізіологічного розчину й поєднаний із Quil А і холестерином. Інша особливо переважна комбінована вакцина включає антигенні компоненти p68/5CV комбінованої вакцини, так само як інактивовані 91197 18 препарати цілих клітин п'яти видів Leptospira: Leptospira bratislava (наприклад, штам Leptospira bratislava, що може бути отримана від Національної Сервісної Ветеринарної Лабораторії, Ames, ΙΑ), Leptospira canicola (наприклад, штам С5, Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), Leptospira grippotyphosa (наприклад, штам MAL 1540, Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ.), Leptospira icterohaemorrhagiae (наприклад, штам NADL 11403, Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ) і Leptospira pomona (наприклад, штам Т262, Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ). Така комбінована вакцина, також згадувана тут як "p68/5CV-Leptospira комбінована вакцина", переважно одержана шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів (або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) і вірусного препарату з рідким препаратом, що скомпонований з р68 антигену й антигенами Leptospira, розчиненими в стерильному фізіологічному розчині й поєднані з Quil А і холестерином. Ця комбінація без р68 антигену згадувана тут як 5CV-5Leptospira комбінація. Ця комбінація без р68 антигену та без Leptospira bratislava згадувана тут як 5CV-4Leptospira комбінація. 5CV комбінація без р68 антигену та з Leptospira canicola і Leptospira icterohaemorrhagiae згадувана тут як 5CV-2 Leptospira комбінація. Такі комбіновані вакцини переважно одержані шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів (або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) і вірусного препарату з рідким препаратом, що скомпонований з антигенами Leptospira, розчиненими в стерильному фізіологічному розчині й поєднаними з Quil А і холестерином. Такі комбіновані вакцини також переважно одержані шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів і препарату Leptospira (або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) з стерильним розчином, або шляхом регідратації згадуваного ліофільно-висушеного препарату з CCV і розріджувачем. Згідно з даним винаходом, p68/5CV, p68/5CVLeptospira, 5CV, 5CV-5Leptospira, 5CV-4Leptospira, i 5CV-2Leptospira комбіновані вакцини можуть вводитися здоровим собакам віком 4 тижні або старшим, переважно віком 6 тижнів або старшим, і переважно в 3 дозах, з інтервалом приблизно 3 тижні. Собаки можуть бути ревакциновані щорічно однократною дозою. У випадку імовірного контакту з В. bronchiseptica та/або собачим вірусом, при таких умовах як розмноження, харчування, і виставкові ситуації, додатковий стимулятор може бути наданий у межах 1- року або переважно 6 місяців від здійснення цих подій. Усе ще інша переважна комбінована вакцина представленого винаходу включає атенуйований 19 штам вірусу собачої чуми (CD), атенуйований штам CAV-2, атенуйований штам вірусу СРІ, атенуйований штам CPV і рекомбінантний рб8 антиген Bordetella bronchiseptica. Особливо переважна комбінована вакцина включає атенуйований штам вірусу собачої чуми (CD), позначений як штам «Synder Hill» (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), атенуйований штам CAV-2, позначений як штам "Manhattan" (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), атенуйований штам вірусу СРІ, що має позначення "NL-CPI-5" (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), атенуйований штам CPV, позначений як "NL-35-D" (Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), і рекомбінантнийний р68 антиген Bordetella bronchiseptica, що має послідовність SEQ ID NO:1. Така комбінована вакцина, також згадувана тут як "p68/DA2PP комбінована вакцина", переважно одержана шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів (або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) з рідким препаратом, що скомпонований з р68 антигену, розчиненого в стерильному сольовому розчині і поєднаний з Quil А і холестерином. Ця комбінована вакцина без рб8 антигену згадується як DA2PP комбінована вакцина. Така комбінована вакцина переважно одержана шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів(або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) з рідким препаратом, що скомпонований із стерильного фізіологічного розчину й поєднаний з Quil А і холестерином. Інша особливо переважна комбінована вакцина включає компоненти p68/DA2PP комбінованих вакцин, так само як інактивовані препарати цілих клітин двох видів Leptospira: Leptospira canicola (наприклад, штам С-51, Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), і Leptospira icterohaemorrhagiae (наприклад, штам NADL 11403,20 Національної Сервісної Ветеринарної Лабораторії, Ames, ΙΑ). Альтернативно, переважна комбінована вакцина може включати антигенні компоненти p68/DA2PP комбінованої вакцини, так само як інактивовані препарати цілих клітин п'яти видів Leptospira: Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira ghppotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona. Ці комбіновані вакцини, також згадувані тут як "p68/DA2PP-Leptospira комбіновані вакцини", переважно одержані шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів (або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) і вірусного препарату з рідким препаратом, що скомпонований з р68 антигену та антигенів Leptospira, розчинених в стерильному фізіологічному розчині й поєднаних з Quil А і холестерином. 91197 20 Альтернативно, інша переважна комбінована вакцина включає антигенні компоненти DA2PP комбінованих вакцин, так само як і інактивовані препарати цілих клітин п'яти видів Leptospira: Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona. Ще одна інша переважна комбінована вакцина включає компоненти DA2PP комбінованих вакцин, так само як і інактивовані препарати цілих клітин чотирьох видів Leptospira: Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae і Leptospira pomona. Ці комбіновані вакцини, також згадувані тут як "DAzPP-Leptospira комбіновані вакцини", переважно одержані шляхом регідратації ліофільно-висушеного препарату атенуйованих вірусних штамів(або препарату, одержаного іншими способами, такими як сушіння розпиленням або висушування) і вірусного препарату з рідким препаратом, що скомпонований з антигенів Leptospira, розчинених в стерильному фізіологічному розчині й поєднаний з Quil А і холестерином. Згідно з даним винаходом, p68/DA2PP, p68/DA2PP-Leptospira, DA2PP, і DA2PP. Leptospira комбіновані вакцини можуть вводитися здоровим собакам віком тижнів або старше, або переважно віком 8 тижнів або старше, і переважно в 2 дозах з інтервалом 3 тижні. Однократна доза може бути достатня, якщо введена собаці принаймні 12 тижневого віку. Собаки можуть бути ревакциновані щорічно однократною дозою. У разі імовірного контакту з В. bronchiseptica та/або собачим вірусом, при таких умовах як розмноження, харчування, і виставкові ситуації, додатковий стимулятор може бути наданий у межах 1-року або переважно 6 місяців від здійснення цих подій, інша переважна комбінована вакцина включає р68 антиген, переважно рекомбінантний р68 антиген, що має SEQ ID NO:1 у комбінації з атенуйованим штамом СРІ. Ще одна інша переважна комбінована вакцина включає р68 антиген, переважно рекомбінантний р68 антиген, що має SEQ ID NO:1, атенуйований штам СРІ і принаймні два види Leptospira, таких як Leptospira canicola (наприклад, штам С-51, Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ), і Leptospira icterohaemorrhagiae (наприклад, штам NADL 11403, Національна Сервісна Ветеринарна Лабораторія, Ames, ΙΑ). Кількість р68 антигену й антигену(ів) одного або більше собачих патогенів у комбінованих вакцинах представленого винаходу повинна бути імунізаційно ефективною. Взагалі, р68 антиген у комбінованій вакцині повинен бути в кількості принаймні приблизно 0,5мкг/доза. Атенуойований вірус собачої чуми (CD) повинен бути в кількості принаймні від приблизно 102 до приблизно 109 TCID50 на дозу TCID50 (цитопатичний ефект 50% дози інфекційної культури тканин) на дозу, і переважно в діапазоні від приблизно 104 до приблизно 106 TCID50 на дозу. Атенуойваний CAV2 повинен бути в кількості принаймні від приблизно 102 TCID50 до приблизно 109 TCID50 на дозу, переважно у діапазоні від приблизно 104 до 21 приблизно 106 TCID50 на дозу. Атенуойований вірус СРІ повинен бути в кількості принаймні від 102TCID50 до приблизно 109 TCID50 на дозу і переважно в діапазоні від 106 до приблизно 108 TCID50 на дозу. Атенуойваний CPV повинен бути в кількості принаймні від 102 TCID50 до приблизно 109 TCID50 на дозу, переважно, кількість у діапазоні від 107 до 109 TCID50 на дозу. Кількість CCV в інактивованому вірусному препараті повинен бути принаймні приблизно 100 відносних одиниць на дозу, і переважно в діапазоні 10004500 відносних одиниць на дозу. Кожний різновид Leptospira у вакцині повинен бути в діапазоні приблизно 100-3500 НО (нефелометричних одиниць) на дозу вакцини, і переважно в діапазоні 200-2000 НО на дозу. Комбіновані вакцини утворені так, що вакцини можуть вводитися собакам ін'єкцією в дозі 0,1мл5мл, переважно від 0,5мл до 2,5мл, і більш переважно, приблизно 1мл. Представлений винахід надалі ілюструється наступними прикладами, але не обмежується ними. Даний винахід далі ілюстрований під час необмежуючими прикладами. Приклад 1 Дослідження титрування дози рекомбінантного р68 антигену Bordetella Вакцина: Група Т01 Т02 Т03 Т04 Т05 Т06 1 Рівень дози Контроль (0,9% фізіологічний розчин 1 1мкгр68 4мкг р68 16мкгр68 64мкг р68 256мкг р68 91197 22 Експериментальний вакцинний антиген був рекомбінантним р68 протеїном зовнішньої мембрани (SEQ ID NO:1) В. Bronchiseptica, продукованим штамом E.coli LW68. Вакцина містила перемінні рівні SDS (додецилсульфат натрію) солюбілізованого р68, поєднаного з 50мкг QAC (Quil А/50мкг холестерин) на 1мл дози. Сенсибілізувальний матеріал: Аерозоль Bordetella bronchiseptica, собачий ізолят #85В, пасаж #3, лот #051597, використовували як сенсибілізувальний матеріал. Середнє значення кількості на планшеті було 1,59 X 108 CFU/мл. Тварини: Шістдесят собачих щенят різної статі були рандомізовано розподілені в одну із шести груп обробки (10 щенят на групу). Щенят піддавали впливу парової інгаляції і трахеальні змиви збирали за 41 день до першої вакцинації знову за 28 днів до першої вакцинації й будь-які серопозитивні або культурально позитивні тварини були вилучені з дослідження. Тварини були рандомізовано визначені на оброблювані і необроблювані згідно з рандомізованим повним дизайном блоку. Поствакцинальні спостереження були здійснені без знання груп призначення вакцини. Шлях введення 1: SC SC SC SC SC SC Кількість тварин 9 8 8 9 9 9 sc= підшкірно Процедура IVP Введення: Тварини були вакциновані в 0 день (на початку дослідження) плацебо або експериментальною вакциною. Друга вакцинація проводилася на 21-й день. Перша вакцинація проводилася підшкірно в праву сторону шиї і друга вакцинації проводилася підшкірно в лівосторонню шийну область. Введення сенсибілізувального матеріалу: Всі тварини були сенсибілізовані через 28 днів після другої вакцинації аерозолем Bordetella bronchispetica. Тварини були піддавалися моніторингу на кашльовий рефлекс протягом 30 хвилин двічі на день (один раз уранці й один раз пополудні) з другого по чотирнадцятий день після сенсибілізації (дні 51-63). Спостереження й колекція зразків: Всі місця ін'єкції пальпірували і вимірювалися за трьома вимірами протягом семи днів під час кожної вакцинації (дні 0-7 і 21-28) і на 14-й день після кожної вакцинації (дні 14 і 35). Ректальні температури реєстрували в день вакцинації й протягом трьох днів під час кожної вакцинації (дні 0-3 і 21-24). Кров збирали в дні вакцинації (дні 0 і 21) і в дні 42, 50, і 63 і досліджували ELISA для специфічних антитіл щодо р68 протеїну, очищеного від B. bronchispetica. Кров також збирали в дні 42, 49, 50, 52, 54, 56 і 58 і аналізували на амілоїд сироватки (SAA). В усіх тварин брали трахеальні змиви для виділення В. bronchispetica і кров збирали для титрів аглютинації В. bronchispetica до вакцинації (при поставці на 41 і 28 день) і в 49 день. DAB ELISA титрування собачих і мишиних антитіл до Bordetella P68 Очищений нативний р68 розводили до 600нг/мл у 0,01Μ боратному буфері і додавали до кожної лунки - 100мкл/лунка. Планшети інкубували протягом ночі при 4°С. Планшети потім промивали однократно із надлишком PBS-Tween 20. Додавали до планшетів 1%-е знежирене висушене молоко в PBS - 200мкл/лунка. Планшети потім інкубували протягом 1 години при 37°С. Планшети потім промивали однократно із надлишком PBSTween 20. Додавали собачу або мишачу сироватку в розведенні 1:50 до головного ряду планшетів ELISA і двократно послідовно розведену сироватку додавали повністю на дно планшенту. Планшети інкубували протягом 1 години при 37°С. Потім, 23 планшети промивали 3 рази з надлишком PBSTween 20. До планшентів, інкубованих з вищевказною собачою сироваткою, додавали марковані пероксидазою козячі анти-собачі IgG (Η+L), розведені до 1:2000, в кількості 100мкл/лунка. Планшети потім інкубували протягом 1 години при 37°С. До планшетів, інкубованих із вищевказаною мишачою сироваткою, додавали марковані пероксидазою козячі анти-мишачі IG (Н+L), розведені в 1:4000, в кількості 100мкл/лунка. Планшети потім інкубували протягом 1 години при 37°С. Потім планшети промивали 3 рази надлишком PBS-Tween 20. Додавали ABTS субстрат в кількості 100 мкл/лунка. Приблизно через 20 хвилин, планшети зчитувалися молекулярним пристроєм або еквівалентним зчитувачем планшет при 405-490нм. Аналіз даних: Різниця в результатах лікування собак, що кашляють, перевіряли, використовуючи Fisher's Exact Test. Застосовували 5%-ий ступінь значимості. ELISA титри логарифмічно трансформували перед аналізом, використовуючи загальну лінійну змішану модель. Використовували 95%-ий рівень довірності, щоб оцінити різницю в лікуванні. Ознаки спостереження піддавалися моніторингу двічі на день, кожний по 30 хвилин. Результати: Культура трахеального змиву й титри аглютинації Оцінювали культури трахеальних змивів й титри аглютинації, щоб контролювати статус тварин з В. bronchiseptica, зареєстрованих у дослідженні. Безліч собак демонструвало збільшені титри в різних точках часу, але титр не збільшився вище 128 до сенсибілізування. Спостереження місця ін'єкції Реакції місця ін'єкції після першої вакцинації представлені у Таблиці 1. Найбільші реакції місць ін'єкцій спостерігали в Т05 (64мкг) групі вакцинованих тварин, з найбільшою середньою реакцією місця ін'єкції, що вимірюється тільки 14,69см3 (два дні після вакцинації). Групи Т03 (4мкг), Т04 (16мкг) і Т06 (256мкг) вакцинованих тварин демонстрували перемінні реакції місця ін'єкції до 7 днів після вакцинації. Група Т02 (1мкг) вакцинованих тварин тільки демонстрували реакції в 1 день після вакцинації. На сьомий день після вакцинації не було статистично значних розходжень у реакціях місця ін'єкції серед груп обробки. На 14-й день, всі реакції місця ін'єкції мали спад. Реакції місця ін'єкції під час другої вакцинації представлені у Таблиці 2. Під час другої вакцинації найбільші реакції місця ін'єкції спостерігалися в групі Т06 (256мкг), з найбільшою середньою реакцією місця ін'єкції, що вимірюється 50,03см3 (один день після вакцинації). Реакції місця ін'єкції були продемонстровані в групах тварин Т05 (64мкг) і Т04 (16мкг) до семи днів після вакцинації. Мінімальні реакції місця ін'єкції були пропродемонстровані в групах тварин Т03 (4мкг) і Т02 (1мкг) до 7 днів після вакцинації. Реакції місця 91197 24 ін'єкції, які не були статистично відмінні від групи плацебо, були продемонстровані в групах Т02 (1мкг) і Т03 (4мкг) після вакцинації. Через чотирнадцять днів після вакцинації не спостерігали ніяких реакцій місця ін'єкції. Частота реакцій місця ін'єкції після першої вакцинації представлена у Таблиці 3. Найвища загальна частота LSM, 76%, місць ін'єкцій, що проявляли реакцію в будь-який час після першої вакцинації, була в групі Т06 (256мкг). Наступна найбільша частота - 72% місць ін'єкцій, що показують реакцію після першої вакцинації, була в групі Т05 (64мкг), 69% після першої вакцинації була в групі Т04 (16мкг), і 63% після першої вакцинації - в групі Т03 (4мкг). Найнижча частота, 38%, після першої вакцинації - в групі Т02 (1мкг). Частота реакцій місця ін'єкції під час другої вакцинації представлена в Таблиці 4. Найвища частота LSM для кожної вакцини була сумісна з тією, що спостерігалась після першої вакцинації. Кількість випадків і тривалість реакцій місця ін'єкції після вакцинації наведені в Таблиці 5. Кількість випадків (або кількість собак, що демонстрували реакцію в будь-який час) вимірюваної реакції місця ін'єкції - 100% для Т03, Т04, Т05 і Т06 (4мкг, 16мкг, 64мкг і 256мкг відповідно) під час першої і другої вакцинації. Тварини з групи Т02, які одержали 1мкг демонстрували найменшу кількість випадків після вакцинації реакцій місця ін'єкції (57,1%). Тривалість реакції (виражена як середні значення найменших квадратів кількості днів з реакцією, наведених у Таблиці 5) була найдовша для Т04, Т05 і Т06 (16мкг 64мкг і 256мкг відповідно) груп вакцинованих тварин після першої і другої вакцинації (2,7 до 5,1 днів після першої вакцинації й 6,0 до 6,7 днів після другої вакцинації). Групи Т02 і Т03 (1мкг і 4мкг відповідно) вакцинованих тварин демонстрували найменшу кількість днів з реакцією місця ін'єкції після першої і другої вакцинації (0,3 і 1,3 днів після першої вакцинації і 1,9 і 4,5 днів після другої вакцинації). Ректальні температури Отримані середні значення ректальних температур наведені в Таблиці 6. LSM ректальна температура для Т02 (1мкг) у дні 1 і 24, для Т03 (4мкг) у дні 1, 21 і 24, для Т04 (16мкг) у дні 2 і 24, для Т05 (64мкг) у дні 23, і для Т06 (256мкг) у дні 0,1 і 24 суттєво відрізнялися від плацебо. На 23 день усі порівняння щодо плацебо не були статистично суттєвими (Р> 0,05). р68 ELISA Серологія Сумарні р68 ELISA дані представлені у Таблиці 7. Превакцинаційні геометричні значення вірусних титрів р68 ELISA специфічних антитіл в усіх групах були низькими (діапазон 24,9-28,9), і титри для плацебо залишалися низькими протягом всього дослідження. Через двадцять один день після першої вакцинації р68 ELISA середні геометричні значення титрів збільшилися у вакцинованій групі (діапазон: 55,2-4,4117), однак T02 (1мкг) титр не був статистично відмінним від плацебо (Т01). Через сорок два дні після другої вакцинації середні геометричні значення титрів збільшувались у всіх вакцинованих групах 25 (діапазон від 674,6 до 48,3820), що демонструє гарну серологічну реакцію на вакцинацію. Серологія амілоїду А сироватки (SAA) SAA отримані титри наведені в Таблиці 8. До вакцинації середнє геометричне значення SAA титрів було низьким у всіх групах обробки (діапазон від 0,1 до 0,5). Після вакцинації Т01 GMT титри знаходилися в межах від 1,5 до 146,0, де р68 групи обробки коливались в межах від 0,3 до 23,1. Всі групи обробки - статистично відмінні від плацебо в дні 50, 52, 54, і 56. Ніяких статистичних розходжень не було продемонстровано серед р68 вакцин за винятком групи Т02 (1мкг) у 52 день, коли вона демонструвала статистично різні середні геометричні значення від усіх інших р68 груп обробки. Реакція на введення(вакцинацію) Результати реакції на введення вакцини представлені у Таблиці 9. Реакція визначалася моніторингом кашлю після введення, і спостереження аналізували, використовуючи два способи: середнє значення найменших квадратів кількості днів з кашлем і двох послідовних днів з кашлем (випадки захворювання). Аналіз середньої кількості днів з кашлем не демонстрував статистично суттєвого розходження між р68 групами обробки; але собаки, вакциновані плацебо, кашляли в середньому 8,6 днів, тоді як собаки, вакциновані р68 вакцинами, кашляли значно менше, в середньому в діапазоні між 2,2 і 4,7 днів. Коли собак оцінювали, використовуючи випадки захворювання, у всіх Т01 (плацебо) спостерігали кашель протягом двох послідовних днів (100% випадок хвороби). Групи Т04 (16мкг) і Т05 (64мкг) вакцинованих собак демонстрували випадки захворювання 55,6% і 66,7%, відповідно. Тільки у 28,6% групи Т02 (1мкг), 50% групи Т03 (4мкг) і 33,3% групи Т06 (256мкг) вакцинованих собак спостерігали кашель протягом двох послідовних днів. Обговорення Ціллю цього дослідження було встановлення взаємозв'язку між дозою антигену, імунною реакцією і захистом організму собак. Досліджувані дози р68 антигену були 1мкг, 4мкг, 16мкг, 64мкг і 256мкг. Аналіз вимірів реакції місця ін'єкції демонстрував незначну реакцію в р68 групах обробки, за винятком групи Т06 (256мкг) на перший день після другої вакцинації. Реакції, які спостерігали, мали тенденцію бути незначними, взагалі зменшуючись у розмірі протягом періодів спостереження. Розмір цих реакцій був клінічно незначний і буде найбільш імовірно непоміченим на неголених собаках. Поствакцинальні ректальні температури були незначними й знаходилися в межах норми для всіх собак у всіх групах. 91197 26 Серологічна реакція на вакцинації була відмінною в T03-T06 групах. У цих групах обробки усі демонстрували значно вищі рб8 ELISA титри у порівнянні з плацебо від 21 до 63 дня. Група Т02 (1мкг) демонструвала суттєві р68 ELISA титри в порівнянні з Т01 (плацебо) від 42 до 63 дня. Найвищі титри спостерігалися в групах Т05 (64мкг) і Т06 (256мкг). Дослідження SAA реакції у всіх р68 вакцинованих собак після вакцинації вказувало набагато менше підвищення пост-вакцинального SAA у порівнянні з контрольними групами собак. Не було продемонстровано ніякого розходження між рівнями доз р68 вакцини і пост-вакцинальною імунністю, за винятком групи Т02 (1мкг) у 52 день, що демонструвала статистично різне середнє геометричне значення від усіх інших р68 груп обробки. Спостереження постсенсибілізувального кашлю аналізували, використовуючи середнє значення найменших квадратів (LSM) кількості днів з кашлем або двох послідовних днів кашлю (випадок захворювання). Використовуючи середнє значення найменших квадратів днів з кашлем, було продемонстровано значне розходження між плацебо і усіма р68 вакцинованими групами, хоча не було продемонстровано ніякого розходження між різними рівнями доз р68 вакцини. Використовуючи випадки захворювання в групах Т02 (1мкг), Т03 (4мкг) і Т06 (256мкг), можна констатувати, що вакциновані собаки кашляли значно менше, ніж у групі плацебо. Висновки: Дослідження проводилося, щоб встановити взаємозв'язок між дозою антигену, імунною реакцією, і захистом організму собак. Досліджувані дози р68 антигену становили 1мкг, 4мкг, 16мкг, 64мкг та 256мкг. Всі вакцини були безпечні, як продемонстровано мінімальними реакціями місця ін'єкції, нормальними ректальними температурами й відсутністю побічної реакції на вакцинацію. Розмір реакцій місця ін'єкції й тривалість цих реакцій була меншою в групах обробки з більш низькими концентраціями антигенів у вакцині. Серологічна реакція на вакцинацію, як виміряно ELISA титрами, була відмінною в групах обробки вакциною з більш високими концентраціями антигенів, що демонструють більш високі серологічні реакції. При використанні середнього значення найменших квадратів днів з кашлем, як спосіб порівняння, всі групи обробки демонстрували значне зменшення кашлю, в порівнянні із плацебо. Ніякі розходження не були відзначені між групами обробки. Коли два послідовні дні з кашлем (або випадок хвороби) використовувалися для порівняння, в групах Т02 (1мкг), Т03 (4мкг) і Т06 (256мкг) вакциновані собаки кашляли значно менше, ніж у групі плацебо. 27 91197 28 29 91197 30 31 91197 32 33 91197 34 35 Приклад 2 Дослідження імуногенності р68 Bordetella у собак Тварини Було придбано сорок п'ять самців і самок змішаної породи. MLV парвовірусна вакцина вводилася усім щенятам у день прибуття на місце дослідження. Ніякі інші вакцини, відмінні від експериментальних продуктів, не застосовувалися до щенят протягом дослідження. Собаки були приблизно 9 тижневого віку (±1 тиждень) у 0 день (перший день вакцинації). Собаки утримувалися в умовах ізоляції, необхідних для профілактики інфікування Bordetella і іншими собачими патогенами до вакцинації. Після інгаляційної сенсибілізації з Bordetella, процедури ізоляції були продовжені, щоб запобігти інфікуванню іншими собачими патогенами. Вакцини Стерильний фізіологічний розчин використовувався як вакцина-плацебо в групах обробки Т01 і Т02. Собача рекомбінантна р68 Bordetella Bronchiseptica вакцина використовувалася у групах обробки Т03 і Т04. Структурний ген р68 антигену клонували в Escherichia coli і експресія гену регулювалася термочутливим промотором. Клітини піддавали лізису і тільця включення відділяли 91197 36 центрифугуванням. Рекомбінантний р68 у тільцях включення солюбілізували SDS. Рекомбінантний р68 (15мкг/мл) комбінували з 50мкг Quil A й 50мкг/мл холестерину у стерильному сольовому розчині як розріджувачі. Кожний один мілілітр містив 0,28% етилового спирту та 0,01% тімеросалу. Посівний матеріал (інокулят) вакцини Штам Bordetella bronchiseptica Bihr Cat був одержаний як посівний матеріал способом, використовуваним на той час мікробіологічною лабораторією біологічного контролю. Планшети з агаром Bordet-Genou були вкриті конфлуентним ростом Bordetella bronchiseptica - штам Bihr Cat й інкубувалися протягом 48 годин при 37,5+/-2,5°С. Вірулентні колонії фази 1 відбирали й сіяли штрихами на Bordet-Genou агар й інкубували протягом 24 годин при 37,5+/-2,5°С. Після інкубації Bordetella використовували сольовий розчин для промивання колоній від агару, і антиген розводили до оптичної щільності 0,80 при 600нм. Підрахунок клітин виконувався до і після вакцинації для конфірмації нефелометричного зчитування. Сенсибілізувальна концентрація була приблизно 1 109 CFU. Пред-сенсибілізаційна концентрація становила 2,37 109 CFU (100% Фаза 1) і концентрація постсенсибілізаційна складала 1,35 109 CFU (100% Фаза 1). Дизайн дослідження 37 91197 38 Сумарна таблиця Група Обробки Т01 Т02 Т03 Т04 Обробка Фізіологічний розчин (контроль) Фізіологічний розчин (контроль) р68 15мкг/доза р68 15мкг/доза Рандомізоване сліпе дослідження На період часу від вакцинації до дня вакцинації тварини були поділені на групи обробки згідно з загальним блочним дизайном дослідження. Групи обробки були рандомізовано розподілені на кімнати. У день вакцинації тварини були рандомізовано розподілені блочно на кімнати вакцинації. Фахівці, не знаючи позначені групи обробки, проводили мікробіологічні й серологічні дослідження й оцінювали місця ін'єкцій, вимірювали ректальні температури і спостерігали за кашлем. Аналіз даних Поствакцинальні варіабельні реакції складалися з даних місця ін'єкції, ректальних температур і р68 ELISA титрів. Дані місця ін'єкції були отримані в підсумку в наступних напрямках: 1) кількість тварин, що мають вимірну реакцію при обробці на день дослідження, 2) кількість точок часу у тварин, що мають вимірну реакцію при обробці, 3) кількість тварин, що мають вимірну реакцію в будь-яку крапку часу при обробці. Окремо для першої і другої вакцинації, об'єм місця ін'єкції (см3), ректальні температури й натуральний log трансформованих даних титрів р68 ELISA були проаналізовані, використовуючи загальну лінійну змішану модель. Апріорі будували графік лінійних відмінностей в лікуванні шляхом спостереження в кожний період часу середніх значень за методом найменших квадратів для того, щоб перевірити відмінності у групах лікування у кожний момент часу спостереження й порівняти їх в межах кожної групи лікування. Використовували 5%-ий рівень значимості для усіх порівнянь. Варіабельні поствакцинальні реакції складалися із щоденних спостережень за кашлем, р68 ELISA титрами і серологічними титрами амілоїду А. Кількість днів з кашлем протягом поствакцинального періоду аналізували, використовуючи загальну лінійну змішану модель. Будували графік відмінностей в лікуванні за методом найменших квадратів для того, щоб перевірити розходження у групах обробки. Використовували 5%-ий рівень значимості для усіх порівнянь. Окремо для першої і другої вакцинації використовували точний тест Фішера, щоб порівняти групи обробки для випадків двох днів послідовного кашлю. Використовували 5%-ий рівень значимості для усіх порівнянь. Для поствакцинальних даних титру сироваткового амілоїду (SAA) застосовували трансформацію натурального логарифму до Шлях введення Внутрішньом'язово Підшкірно Підшкірно Внутрішньом'язово Кількість тварин 8 7 15 15 значень титру до аналізу, використовуючи загальну лінійну змішану модель. Апріорі будували графік лінійних відмінностей в лікуванні шляхом спостереження в кожний період часу середніх значень за методом найменших квадратів для того, щоб перевірити відмінності у групах лікування у кожний момент часу спостереження й порівняти їх в межах кожної групи лікування. Використовували 5%-ий рівень значимості для усіх порівнянь. Процедура дослідження Детальні процедури тварини Сорок п'ять (45) серонегативних і бактеріологічно негативних щенят були рандомізовано призначені до однієї з 4 груп обробки. Вісім і сім собак були розподілені на внутрішньом'язову (ІМ (внутрішньом'язово)) або підшкірну (SC(підшкірно)) контрольні групи відповідно, для загальної кількості 15 контрольних собак. П'ятнадцять собак були розподілені на р68 SC (підшкірно) групу обробки і 15 собак були розподілені на р68 ІМ (внутрішньом'язово) групу обробки. Групи обробки деталізовані в секції дизайну дослідження вище. День 0 визначався як перший день вакцинації. Вакцинації проводилися в день 0 і повторювалися через 21 день. Для першої вакцинації використовували правосторонню область шиї і для другої вакцинації, використовували лівосторонню область шиї. Внутрішньом'язові ін'єкції здійснювалися в правий і лівий напівперетинчастий м'яз для першої і другої вакцинації, відповідно. Усі місця ін'єкції були обмірювані тривимірно протягом семи днів після кожної вакцинації з проведенням додаткового вимірювання на 14 день після вакцинації. Ректальні температури були піддавалися моніторингу у день вакцинації (перед вакцинацією) і протягом трьох днів після кожної вакцинації. На 35 день у всіх тварин брали трахеальні змиви для В. bronchiseptica культури і збирали кров на титри аглютинації. Всі тварини були негативними щодо трахеальних змивів і серологічно негативними щодо Bordetella і вважалися прийнятними для вакцинації. На 45 день, через двадцять чотири дні після другої вакцинації, до всіх собак застосовувалася інгаляційна провокація В. bronchiseptica. Собак, що знаходилися під дією седативних засобів, сенсибілізували, використовуючи доступний носовий конус, що був пристосований на морді собак, що знаходились під дією седативних засобів. Носовий конус була приєднаний до розпилювача, що в своючергу приєднаний до вакуумного насосу при тиску від 5,5 до 6,0 psi. Один мл сенсибілізувального матеріалу поміщали 39 91197 у розпилювач, і аерозоль сенсибілізувального матеріалу вводили кожній собаці протягом 4 хвилин. Контролюючий персонал не знав розподіл групи обробки. Тварини піддавали моніторингу щодо кашлю протягом 14 днів після сенсибілізування (Дні 4659). Спостереження здійснювали 2 рази, приблизно 30-хвилинними періодами в приблизно той же самий час щодня, один проведений при AM і один при РМ й результати реєстрували. Забір крові Кров на титри аглютинації збирали до першої вакцинації і до сенсибілізування. Кров на анти-р68 ELISA збирали до вакцинації в дні 0 і 21 і в дні 35, 45, і 59. Кров на амілоїд сироватки (SAA) збирали в день сенсибілізування (день 45) і в дні 46, 48, 50, 52 і 54. Тести, виконані на зразках Трахеальні змиви оцінювали на наявність В. bronchiseptica бактеріологічно (культурально). Кожний трахеальний змив сіяли штриховим способом на планшет з селективним агаром Bordetella. Позитивні й негативні контрольні групи були включені. Планшети інкубували при 37,5±2,5°С протягом 48±4 години. Одержані колонії на кожному планшеті були порівняні з позитивним контролем і будь-якою колонією, що здавалася ідентичною позитивному контролю, додатково тестували, щоб підтвердити наявність В. bronchiseptica. Підтверджувальні тести включали використання TSI, цитратний агар і сечовинний і середовище Nitrate ReD. Сироватку оцінювали на титри аглютинації, р68 ELISA аналіз або SAA аналіз, використовуючи наступні способи: Титри аглютинації - Сироватку послідовно розводили в мікротитрованих планшетах, використовуючи фізіологічний розчин з Bordetella. Позитивні й негативні контрольні групи були включені в кожний планшет. Штам 87 В. bronchiseptica (вирощений на Bordet Genou агарі, зібраний, інактивований і розведений до 20% Τ при 630нм) використовували як антиген 40 аглютинації й додавали до кожної лунки. Планшети збовтували й інкубували при 35±2°С протягом 2 годин. Планшети зчитували після другої інкубації при кімнатній температурі протягом 22 годин. Титр кінцевого моменту визначали, використовуючи останню лунку, щоб показати 50% аглютинацію. р68 ELISA титри - Рекомбінантний р68 антиген наносили на 96 лунковий мікротитрувальний планшет, покритий поліклональною антисироваткою, специфічною до Bordetella p68 антигену. До планшету додавали двократно розведену собачу сироватку й інкубували. Позитивні й негативні контрольні групи при 1:1000 розведенні були включені в кожний планшет. Маркірований пероксидазою афінний очищений анти-собачий IgG індикаторний кон'югат використовували, щоб виявити антитіла, специфічні до р68 антигену. Потім додавали хромогенний субстрат ABTS і планшет зчитували, коли позитивні контрольні лунки мали оптичну щільність (O.D.) 1,2+0,2. Титр даного зразка був розрахований як зворотний з останнього розведення з оптичною щільністю більшою, ніж середнє значення з розведення сироватки негативного контролю плюс п'ять припустимих відхилень. SAA титри - Титри амілоїду А сироватки собак оцінювали, використовуючи набір, куплений від Accuplex Co., Університет Медичного Центру Штату Небраска, Омаха, NE 68198. Коротко, SAA наносили на мікротитровану пластину, вкриту моноклональними антитілами анти-собачого SAA. Розведені зразки собачої сироватки додавали до планшету з біотин-маркованим кон'югатом антисобачого антитіла. Після інкубації додавали хромогенний субстрат пероксидаз-кон'югованого стрептавідину. Планшети зчитували через 30 хвилин. Результати Ректальні Температури Сумарні виміри ректальних температур представлені у Таблицях 10 і 11. Таблиця 10 Середньоквадратичне ректальних температур (С°) у організмі собак після введення фізіологічного розчину(плацебо) або р68 Bordetella вакцинації (після І вакцинаціїа) Обробка Т01 Т02 Т03 Т04 а фізіологічний розчин ІМ фізіологічний розчин SC p68 SC р68 ІМ 0 38,2 38,0 38,1 38,2 Перша вакцинація проводилася в день 0. Ректальні температури (С°), День дослідження 1 2 3 38,2 38,2 38,2 38,3 38,2 38,2 38,3 38,1 38,0 38,4 38,2 38,2 Ст. відхил. 0,08 0,09 0,06 0,06 41 91197 42 Таблиця 11 Середньоквадратичне ректальних температур (С°) у організмі собак після введення фізіологічного а розчину(плацебо) або р68 Bordetella вакцинації (після II вакцинації ) Обробка Т01 Т02 Т03 Т04 а фізіологічний розчин ІМ фізіологічний розчин SC p68 SC р68 ІМ 21 38,1 38,5 38,0 38,1 Ректальні температури (С°), День дослідження 22 23 24 38,3 38,2 38,2 38,5 38,2 38,2 38,3 38,1 38,1 38,4 38,4 38,4 Ст. відхилення 0,10 0,10 0,08 0,08 Друга вакцинація проводилася в день 21. Не було відзначено суттєвого розходження між будь-якими групами в будь-який день після першої вакцинації. Значне розходження було відзначено між собаками, вакцинованими фізіологічним розчином, і усіма собаками, вакцинованими р68 (р=0,0053 для Т01Т02 ν Т03Т04) у день 21. Значне розходження (р=0,0124) між р68 SC (підшкірно) і ЇМ (внутрішньом'язово) вакцинацією було продемонстровано у день 24. Реакції місця ін'єкції Реакції місця ін'єкції наведені в Таблицях 12 і 13. Внаслідок технічної помилки, не проводилися ніякі спостереження місця ін'єкції при 14-денному спостереженні під час другої вакцинації (День 35). Вимірні реакції місць ін'єкцій спостерігали в Т03 (р68 SC) і були мінімальні в розмірі. Малу реакцію місця ін'єкції відзначали в однієї собаки в Т04 (р68 ІМ) у День 3, але мінімальний вплив виміру не відбивався на загальному середньому значенні для групи. Таблиця 12 Середньоквадратичне значення (кубічні см) реакцій місця ін'єкції у собак після введення фізіологічного розчину(плацебо) або вакцинації р68 (15мкг/доза) Bordetella (після І вакцинаціїа) Обробкаb Т01 Т02 Т03 Т04 фізіолог. розчин ІМ фізіолог. розчин SC p68 SC р68 ІМ Середній розмір (см3) ін'єкційного місця реакції по дням дослідження 1 2 3 4 5 6 7 14 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 7,4 4,3 6,8 3,4 2,5 2,6 1,9 0,1 0,0 0,0 0,0с 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 а перша вакцинація проводилася в день 0. стандартна похибка для Т01=0,80, Т02=0,84, Т03=0,70, і Т04=0,70 с одна собака мала незначну реакцію (0,5см2), але внаслідок округлення, мінімальний вплив значення не відбито в повному в середньому. b Таблиця 13 Середньоквадратичне значення (кубічні см) реакцій місця ін'єкції у собак після введення фізіологічного розчину(плацебо) або вакцинації р68 (15мкг/доза) Bordetella (після II вакцинаціїа) Обробкаb Т01 Т02 Т03 Т04 а b фізіолог. розчин ІМ фізіолог. розчин SC p68 SC р68 ІМ Середній розмір (см3) ін'єкційного місця реакції по дням дослідження 22 23 24 25 26 27 28 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 8,6 9,2 9,5 7,3 5,2 4,7 5,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Друга вакцинація проводилася в День 21. стандартна похибка для Т01=1,12, Т02=1,19, Т03=0,92 і Т06=0,92. 43 91197 Значні розходження в вимірах місць ін'єкцій отримані в підсумку в Таблиці 14. Значне розходження в вимірах місця ін'єкції між Т02 (фізіологічний сольовий розчин ЗС(підшкірно)) проти Т03 (р68 15мкг ЗС(підшкірно)) було відзначено протягом шести днів після першої вакцинації. У день 7 і знову в день 14 (повторне 44 оцінювання двохтижневого спостереження) не відзначалось ніяких значних розходжень між будьякими групами обробки. Значні розходження в вимірах місця ін'єкції між Т02 (фізіологічний сольовий розчин SC) і Т03 (р68 15мкг SC) відзначались протягом семи днів під час другої вакцинації. Таблиця 14 Суттєве значення a priori відхилень серед середньоквадратичних значень вимірів реакції місця ін'єкції День дослідження 1 2 3 4 5 22 23 24 25 26 27 Відхилення (обробка проти обробки) Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 T02 v T03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 T01T02 v T03T04 Т02 ν Т03 Т03 ν Τ04 Т01Т02 ν Τ03Τ04 р-значення 0,0001 0,0001 0,0001 0,0007 0,0008 0,0101 0,0001 0,0001 0,0002 0,0044 0,0042 0,0339 0,0313 0,0253 0,0001 0,0001 0,0002 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0013 0,0013 0,0007 0,0172 0,0035 0,0019 0,0313 Представлені лише суттєві (Р