Вакцинна композиція проти респіраторно-синцитіального вірусу, спосіб стимулювання імунної системи індивідуума для індукції захисту проти респіраторно-синцитіального вірусу

1. Вакцинная композиция против респираторно-синцитиального вируса, включающая чувствительный к температуре (ts) мутант вируса, отличающаяся тем, что содержит в физиологически приемлемом носителе один аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус, по меньшей мере, с двумя аттенуирующими мутациями, который выбран из чувстви тельных к температуре мутантов пассированного на холоде респираторно-синцитиального вируса с ограниченным кругом хозяев или адаптированных к холоду мутантов пассированного на холоде респираторно-синцитиального вируса с ограниченным кругом хозяев, или чувствительных к температуре мутантов респираторно-синцитиального вируса, имеющих дополнительные температурно-чувстви тельные мутации. 2. Вакцинная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что содержит, кроме того, адъювант для усиления иммунного ответа. 3. Вакцинная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вирус представляет собой пассированный на холоде респираторно-синцитиальный вирус с ограниченным кругом хозяев, который был аттенуирован далее введением одной или нескольких дополнительных мутаций, которые делают вир ус чувстви тельным к температуре или C2 (54) ВАКЦ ИННА КОМПОЗИЦІЯ ПРОТИ РЕСПІРАТОРНО-СИНЦИТІАЛЬНОГО ВІРУСУ, СПОСІБ СТИМУЛЮВАННЯ ІМУННОЇ СИСТЕМИ ІНДИВІДУУМА ДЛЯ ІНДУКЦІЇ ЗАХИСТУ ПРОТИ РЕСПІРАТОРНОСИНЦИТІАЛЬНОГО ВІРУСУ 41315 530/1178, 530/1074, 530/963, 530/977, 530/1030, 530/1003; (d) cp RSV 3131 D1; (e) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8, A-15-7, A-25-8, A-21; (f) RSV ts-4/F-15-8, F-19-1, F-20-7, F-29-7, F-31-2. 12. Вакцинная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что аттен уированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (a) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts sp RSV 248/1228; (b) cpts 530; (c) cpts RSV 3131 D1; (d) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8; (e) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7. 13. Вакцинная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (a) cpts RSV 248, 248/404; (b) cpts RSV 530; (c) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8; (d) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7. 14. Вакцинная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (a) cpts RSV 248/404; (b) cpts RSV 530; (c) RSV ts-1 NG 1/A-20-4. 15. Вакцинная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что содержит аттенуированный вирус в дозе 103-106 БОЕ. 16. Способ стимулирования иммунной системы индивидуума для индукции защиты против респираторно-синцитиального вируса, отличающийся тем, что осуществляют введение индивидууму иммунологически достаточного количества одного аттенуированного респираторно-синцитиального вируса, по меньшей мере, с двумя аттенуированными мутациями, который выбран из чувствительных к температуре мутантов пассированного на холоде респираторно-синцитиального вируса с ограниченным кругом хозяев или адаптированных к холоду мутантов пассированного на холоде респираторно-синцитиального вируса с ограниченным кругом хозяев, или чувстви тельных к температуре мутантов респираторно-синцитиального вируса, имеющих дополнительные температурночувствительные мутации, в физиологически приемлемом носителе. 17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что вирус является пассированным на холоде респираторно-синцитиальным вирусом с ограниченным кругом хозяев, который был аттенуирован далее введением двух или нескольких мутаций, которые делают вирус чувствительным к температуре или неспособным к образованию бляшек нормального размера в культуре ткани. 18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус является пассированным на холоде респираторно-синцитиальным вирусом с ограниченным кругом хозяев, который был пассирован на холоде при температурах приблизительно 20-25°С для дальнейшей аттенуации вируса и превращения его в адаптированный к холоду вирус. 19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус является вирусом ts-1 NG-1 или ts-4, который был аттенуирован введением одной или более мутаций при помощи пассирования на холоде или химического мутагенеза, которые делают вирус неспособным к образованию бляшек нормального размера на культуре ткани или более чувствительным к температуре. 20. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (a) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, сpts sp RSV 248/1228; (b) cpts RSV 475; (c) cpts RSV 530, 530/9, 530/346, 530/653, 530/667, 530/403, 530/188, 530/464, 530/1009, 530/1178, 530/1074, 530/963, 530/977, 530/1030, 530/1003; (d) cp RSV 3131 D1; (v) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8, A-25-8, A-15-8, A-21; (e) RSV ts-4/F-15-8, F-19-1, F-20-7, F-29-7, F-31-2. 21. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (а) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts sp RSV 248/1228; (b) cpts RSV 530; (c) cpts RSV 3131 D1; (d) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8; (e) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7. 22. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (a) cpts RSV 248, 248/404; (b) cpts RSV 530; (c) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8; (d) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7. 23. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус выбран из группы: (а) cpts RSV 248/404; (b) cpts RSV 530; (c) RSVts-1 NG 1/A-20-A. 24. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят индивидууму в количестве 103-106 БОЕ. 25. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят в верхние дыхательные пути индивидуума. 26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят в носоглотку. 27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят при помощи распыляемого раствора, капель или аэрозоля. 28. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят индивидууму, серонегативному по антителам к этому вирусу. 29. Способ по п. 16, отличающийся тем, что аттенуированный вирус вводят индивидууму, серопозитивному по указанному вирусу. 2 41315 Инфекция человека респираторно-синцитиальным вирусом (RSV) варьирует от бессимптомного до тяжелого заболевания дыхательных путей. У младенцев и детей респираторно-синцитиальный вирус (RSV) рассматривается как одна из наиболее важных причин заболевания нижних дыхательных путей во все х географических зонах мира. RS вирус превосходит все другие микробные патогены в качестве причины пневмонии и бронхиолита у младенцев до 1 года и является главной причиной летального заболевания дыхательных путей у таких младенцев. Фактически все дети инфицируются в возрасте двух лет. Реинфекция имеет место с заметной частотой у детей старшего возраста и у молодых взрослых людей (Chanock et al., in Viral Infections of Humans, 3d ed., A.S. Evans, ed., Plenum Press, N. Y. (1989)). Хотя большая часть взрослых людей не имеет серьезных заболеваний, вызываемых инфекцией RS вирусом, пожилые больные и индивидуумы с нарушенной иммунной системой могут иметь тяжелые и, возможно, угрожающие жизни инфекции. Лечение RSV инфекции было проблематичным. Маленькие дети имеют ослабленные ответные реакции в виде образования сывороточных и секреторных антител на антигены RSV и поэтому страдают от более тяжелых инфекций, тогда как кумулятивный иммунитет, по-видимому, защи щает более старших детей и взрослых от серьезных форм этой инфекции. Было показано, что одно антивирусное соединение, рибавирин, может быть перспективним в лечении инфицированных младенцев в тяжелом состоянии, хотя не получены доказательства того, что оно сокращает продолжительность госпитализации или уменьшает необходимость поддерживающей терапии. Ме ханизмы иммунитета к инфекции RSV недавно стали центром внимания исследователей. По-видимому, секреторные антитела являются наиболее важными в защите верхних дыхательных путей, тогда как высокие уровни сывороточных антител, возможно, играют главную роль в устойчивости к инфекции RSV в нижних дыхательных путя х. Очи щенный человеческий иммуноглобулин, содержащий высокий титр нейтрализующи х антител к RSV, может оказаться применимым в иммунотерапевтических подходах к лечению тяжелого заболевания нижних дыхательных путей у младенцев и детей младшего возраста. Однако препараты иммуноглобулина имеют серьезные недостатки, такие как возможность передачи находящихся в крови вирусов и трудности и большие расходы при их приготовлении и хранении. Несмотря на настоятельную потребность в эффективной вакцине против RS вируса, в частности, для младенцев и детей младшего возраста, прежние попытки получения надежной и эффективной вакцины были неудачными. Вакцина с инактивированным формалином вирусом, исследованная в середине 1960-х годов, не давала защиты против инфекции RS вирусом или заболевания. Вместо этого заболевание обострялось при последующей инфекции RS вирусом. Kim et al., Am. J. Epidemiol. 89: 422-434, Chin et al., Am. J. Epidemiol. 89: 449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol. 89: 405-421 (1969). Для того, чтобы обойти проблемы, связанные с инактивированными вакцинами и возможным изменением вируснейтрализующей антигенной детерминанты, усилия были направлены на получение анонсированных RS мутантов. Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968) сообщили о получении низкотемпературного пассированного мутанта RS вируса, который, по-видимому, обладал достаточной аттенуацией для того, чтобы быть кандидатом на вакцину. Этот мутант проявлял слегка увеличенную эффективность роста при 26°С по сравнению с родительским вирусом дикого типа, но его репликация была нечувствительной к температуре и не была адаптирована к холоду. Однако пассированный на холоде мутант был аттен уированным (ослабленным) для взрослых. Хотя этот мутант был достаточно аттенуированным и иммуногенным для младенцев и детей, ранее инфицированных RSV (например, серопозитивных индивидуумов), он сохранял низкий уровень вирулентности для верхних ды хательных путей серонегативных младенцев. Этот мутант был пассирован в культуре клеток почки быка при низкой температуре (26°С) и в результате приобрел аттенуирующие мутации круга хозяев. Приобретение этих мутаций позволяло мутанту эффективно реплицироваться в бычьих тканях, тогда как те же самые мутации ограничивали рост мутанта в дыхательных путях человека по сравнению с родительским штаммом А2 RSV. Подобно этому, Garpure et al., J. Virol. 3: 414421 (1969) сообщили о выделении чувствительных к температуре (ts) мутантов, которые также были перспективными кандидатами на вакцины. Один мутант, ts-1, был подвергнут детальному исследованию в лаборатории и на добровольцах. Myтант вызывал бессимптомную инфекцию у взрослых добровольцев и устойчивость к введению вируса дикого типа через 45 дней после иммунизации. Опять-таки, в то время как серопозитивные младенцы и дети подвергались бессимптомной инфекции, серонегативные младенцы обнаруживали признаки ринита и другие легкие симптомы. Кроме того, была обнаружена нестабильность ts фенотипа, хотя вирус, проявляющий частичную или полную потерю чувствительности к температуре, представлял небольшую часть извлекаемого из вакцин вируса и не был ассоциирован с иными признаками заболевания, чем легкий ринит. Таким образом, эти исследования выявили, что пассированные на холоде и чувствительные к температуре штаммы были недостаточно аттенуированы и вызывали легкие симптомы заболевания у некоторых вакцинированных индивидуумов, в частности, у серонегативных младенцев, тогда как другие штаммы избыточно аттенуированы и не реплицируются в доста точном количестве для индуцирования защитных иммунных ответных реакций (Wrigt et al., Infect. Immun. 37:397-400 (1982)). Генетическая нестабильность, позволяющая мутантам-кандидатам на вакцины терять их устойчивый к температуре фенотип, также была нарушающим планы открытием (см.: 3 41315 Hodes et al., Proc Soc. Exp. Biol. Med. 145:11591164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8:689-696 (1974) и Belshe et al., J. Med. Virоl. 3:101-110 (1978)). Оставив подход, предусматривающий применение вакцин с аттенуированным RS вирусом, исследователи испытали потенциальные субъединичные вакцины, основанные на гликопротеинах оболочки RS вируса, очищенных из лизатов инфицированных клеток. Эти гликопротеины индуцировали устойчивость к инфекции RS вирусом в легких хлопковых (cotton) крыс, Walsh et al., J. Infect. Dis. 155: 1198-1204 (1987), но индуцированные антитела имели очень слабую вируснейтрализующую активность, и иммунизация грызунов очищенной субъединичной вакциной приводила к усилению заболевания (Murphy et al., Vaccine. 8:497-502 (1990)). Исследовались также вакцины, основанные на рекомбинантном вирусе осповакцины, который экспрессирует гликопротеин оболочки F или G. Эти рекомбинанты экспрессируют гликопротеины RSV, которые неотличимы от аутентичной вирусной копии, и мелкие грызуны, инфицированные внутрикожно рекомбинантными вирусами осповакцины, экспрессирующими F- и G-RSV, обнаружили высокие уровни специфических антител, которые нейтрализовали инфекционностъ вируса. Действительно, инфицирование хлопковых крыс рекомбинантами вируса осповакцины - F стимулировало почти полную устойчивость к репликации RSV в нижних дыхательных путя х и значительную устойчивоcть в верхних ды хательных путях. Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 74627466 (1986). Однако иммунизация шимпанзе рекомбинантами вирус осповакцины - F и вирус осповакцины - G почти не дала защиты против введения RSV (Collins et al., Vaccine 8:164-168 (1990)). Это привело к заключению, что этот подход, по-видимому, не сможет обеспечить удачной вакцины. В то время как исследователи испытывали несколько различных подходов для получения эффективной и надежной RS вакцины в течение ряда лет, RS вирус оставался наиболее обычной причиной тяжелого вирусного заболевания нижних дыхательных путей у младенцев и детей. В результате остается настоятельная потребность в надежной вакцине, которая способна предотвращать серьезное заболевание в этой популяции, требующее часто госпитализации, и предотвращать заболевание у други х индивидуумов. Совершенно удивительно, данное изобретение решает эти и близкие к ним проблемы. Данное изобретение обеспечивает вакцинные композиции аттенуированного респираторно-синцитиального вируса. Аттенуированный вирус обеспечен в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа в хозяине-человеке, в соединении с физиологически приемлемым носителем и может иногда содержать адъювант для усиления иммунного ответа хозяина. Изобретение рассматривает несколько различных антигенных подгрупп аттенуированного RS вируса, которые произведены из неполностью ослабленного RS вируса и обладают свойствами, до сих пор не обнаруживаемыми аттенуированными RS вируса ми, описанными ранее в литературе. В одном из вариантов изобретения аттенуированный вирус содержит RS вирус с ограниченным кругом хозяев, неполностью ослабленный пассированием на холоде (ср RSV), в который введены, по меньшей мере, одна или несколько дополнительных мутаций для получения вируса и его потомства, имеющих чувствительный к температуре фенотип (ts), обозначаемый далее сpts RSV. В другом варианте RS вирус с ограниченным кругом хозяев, не полностью ослабленный пассированием на холоде (ср RSV), адаптируют к холоду (са) пассированием при более пониженных температурах для введения дополнительных, ограничивающих рост, мутаций. Еще в одном варианте не полностью ослабленные ts мутанты RSV, такие как ts-4 и ts-1 NGI RSV, ослаблены далее введением дополнительных мутаций. Аттен уированные производные ts или сp штаммов получают несколькими путями, но, предпочтительно, введением дополнительных, чувствительных к температуре, мутаций при помощи химического мутагенеза, дальнейшим пассированием в культуре при ослабляющих температурах 20-24°С или введением мутаций малых бляшек (small plaque) (sp) и отбором производных, которые более ограничены в репликации, чем не полностью аттенуированный родительский мутантный штамм. Этот аттенуированный вирус изобретения принадлежит к антигенной подгруппе либо А, либо В, и вирус из обеих подгрупп может быть объединен в вакцинных препаратах для большего охвата преобладающих RSV инфекций. Вакцину обычно готовят в дозе 103106 бляшкообразующи х единиц (PFU) или в более высокой дозе для максимальной эффективности. В других вариантах изобретение обеспечивает способы стимулирования иммунной системы индивидуума для индуцирования защиты против респираторно-синцитиального вируса. Способы предусматривают введение индивидууму иммунологически достаточного количества RSV, аттенуированного введением мутаций, которые придают характер ts, са и(или) sр фенотипа RSV, исходно неполностью аттенуированному ts мутацией (мутациями) или пассированием при низкой температуре, например, при 26°С. Ввиду потенциальных тяжелых последствий инфекции RSV у новорожденных, серонегативных и серопозитивных младенцев и детей младшего возраста, а также у пожилых людей, иммунизация в соответствии с данными способами обычно наиболее полезна для этих индивидуумов. В большинстве случаев аттенуированный вирус вводят в дыха тельные пути индивидуума, предпочтительно, интраназально в виде аэрозоля или капель. В дальнейших вариантах изобретение обеспечивает чистые культуры аттенуированного RS вируса, в которых вирус был более полно аттенуирован дальнейшей дериватизацией идентифицированных ранее ts или ср мутантов. Этот аттенуированный вирус способен вызывать защитный иммунный ответ в инфицированном хозяине-человеке, но в то же время достаточно ослаблен, так что не вызывает нежелательных симптомов тяжелого респираторного заболевания в иммунизированном хозяине. Аттен уированный вирус может находиться в супернатанте клеточ 4 41315 ной культуры, может быть выделен из культуры или частично либо полностью очищен. Вирус может быть лиофилизирован и может быть соединен со множеством других компонентов для хранения или доставки хозяину, по желанию. Данное изобретение обеспечивает RS вирус, пригодный для применения в качестве вакцины для человека. RS вирус, описанный здесь, получают введением дополнительных мутаций в штаммы во время роста вируса в клеточных культурах, к которым добавляют химический мутаген, отбором вируса, подвергнутого пассированию при субоптимальной температуре для введения ограничивающих рост мутаций, или отбором подвергнутого мутагенезу вируса, который продуцирует малые бляшки в клеточной культуре. Таким образом, вакцина данного изобретения содержит аттенуированный RS вирус и физиологически приемлемый носитель. Вакцину вводят в иммуногенно достаточном количестве индивидууму, нуждающемуся в иммунологической защите против RS вируса, например, младенцу, ребенку, пожилым людям или взрослым для иммуносупрессивной терапии. Вакцина вызывает иммунный ответ, защищающий против серьезного заболевания нижних дыхательных путей, например, пневмонии и бронхиолита, при последующем инфицировании индивидуума RS вирусом дикого типа. Хотя циркулирующий в природе вирус еще способен вызывать инфекцию, в частности, в верхних дыхательных п утя х, в результате вакцинации очень сильно снижается возможность ринита и возможно повышение устойчивости при последующей инфекции вирусом дикого типа. После вакцинации образуются детектируемые уровни сывороточных и секреторных антител у хозяина, которые способны нейтрализовать гомологичный (той же самой подгруппы) вирус дикого типа in vitro и in vi vo. Во многих случая х антитела хозяина будут также нейтрализовать вирус дикого типа другой, невакцинной подгруппы. Для достижения более высоких уровней перекрестной защиты, т. е. защиты против гетерологичных штаммов другой подгруппы, предпочтительно вакцинировать индивидуумов аттен уированным вирусом, по меньшей мере, из одного предпочтительного штамма как подгруппы А, так и В. Аттенуированный вирус, являющийся компонентом вакцины, находится в ней в выделенном и, обычно, очищенном виде. Под словом "выделенный" имеют в виду, что аттен уированный модифицированный RS вирус находится в другой среде по сравнению с обычной природной средой обитания вируса дикого типа, такой как носоглотка инфицированного индивидуума. Более конкретно, "выделенный" обозначает, что аттенуированный вирус находится в виде гетерологичного компонента в клеточной культуре или иной системы. Например, аттенуированный RS вирус данного изобретения может быть продуцирован инфицированной клеточной культурой, отделен от нее и добавлен к стабилизатору, содержащему другие, не встречающиеся в природе RS вирусы, например, вирусы, которые выбраны как аттенуированные по устойчивости к нейтрализующим моноклональным антителам к F-белку, как описано в одновременно представленном U. S. patent application attorney docket 15280-11-2, представленным здесь в виде ссылки. Аттенуированный RS вирус данного изобретения обнаруживает очень заметное уменьшение вирулентности при сравнении с вирусом дикого типа, циркулирующего природно в людях. Аттенуированный вирус достаточно ослаблен, так что симптомы инфекции не наблюдаются в большинстве иммунизированных индивидуумов. В некоторых случаях аттен уированный вирус еще способен диссеминировать к невакцинированным индивидуумам. Однако его вирулентность достаточно подавлена, так что в вакцинированном или случайном хозяине не бывает серьезных инфекций нижних дыхательных путей. Уровень аттенуации можно определить, например, определением количества вируса, присутствующего в дыха тельных путях иммунизованного хозяина и сравнением этого количества с количеством, продуцируемым RS вирусом дикого типа или другими аттенуированными RS вирусами, которые оценивались как кандидаты вакцинных штаммов. Например, аттенуированный вирус данного изобретения имеет более высокую степень ограничения репликации в верхних дыхательных путях высокочувствительного хозяина, такого как шимпанзе, по сравнению с уровнями репликации вируса дикого типа, например, в 101000 раз меньше. Также уровень репликации аттенуированного вакцинного штамма RSV в верхних ды хательных путях шимпанзе был ниже, чем уровень репликации неполностью аттенуированного мутанта A2ts-1 RSV. Для дальнейшего снижения развития ринореи, связанной с репликацией вируса в верхних дыхательных путях, идеальный вакцинный вирус-кандидат должен проявлять пониженный уровень репликации, как в верхних, так и в нижних дыхательных путях. Однако аттенуированные вирусы данного изобретения должны быть достаточно инфекционными и иммуногенными в человеке для выработки защиты в вакцинированных индивидуумах. Способы определения уровней RS вируса в носоглотке инфицированного хозяина хорошо известны в литературе. Пробы получают аспирацией или вымыванием носоглоточных секреций (выделений), и количество вируса определяют при помощи лабораторного способа (см., например, Belshe et al., J. Med. Virоlоgy 1:157-162 (1977), Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969) и Wright et al., Arch. Ges. Virusforsch. 41:238-247 (1973)). Вирус может быть измерен пригодным для этого способом в носоглотке хозяев-животных, таких как шимпанзе. Для получения удовлетворительно аттенуированного производного вируса данного изобретения мутации вводится родительский вирусный штамм, который неполностью или частично аттенуирован, такой как ts-1 или ts-4 мутант или ср RSV. Для вируса подгруппы А предпочтительным неполностью аттенуированным родительским вирусом является ts-1 или ts-1 NG-1, или сp RSV, которые представляют собой мутанты штамма А2 подгруппы А или их производные, или субклоны. Частично ослабленные мутанты вируса подгруппы В можно получить биологическим клони 5 41315 рованием вируса подгруппы В дикого типа в приемлемом клеточном субстрате и получением из него мутантов пассированием на холоде, a также при помощи химического мутагенеза с образованием ts мутантов или отбором мутантов, образующи х малые бляшки. Различные способы отбора можно также комбинировать для получения частично аттенуированных мутантов подгрупп А или В, пригодных для дальнейшей, описанной здесь, дериватизации. Как только отобран (отобраны) желаемый, частично аттенуированный, родительский штамм (штаммы), дальнейшее аттенуирование, достаточное для получения вакцины, приемлемой для применения в человеке, согласно данному изобретению, выполняется несколькими путями, как описано здесь. Согласно данному изобретению, cр мутант может быть подвергнут дальнейшему мутагенезу различными путями. В одном из вариантов способ предусматривает пассирование частично ослабленного вируса в клеточной культуре при прогрессивно более низких, ослабляющих температурах. Например, в то время как вирус дикого типа в типичном случае культивируют, приблизительно, при 34-35°С, частично аттенуированные мутанты получают пассированием в клеточных культурах (например, в первичных клетках почек быков) при субоптимальных температурах, например, при 26°С. Эти мутанты имеют слабое, но четко выраженное доказательство адаптации к холоду (са), т. е. повышенную эффективность роста при 26°С по сравнению с родительским вирусом дикого типа, но обычно не ts. Так, в одном способе данного изобретения ср мутант или другой, частично ослабленный, штамм, например, ts-1 или sр, адаптируют для эффективного роста при пониженной температуре пассированием в клетках MRС-5 или Vero до температуры, приблизительно, 20-24°С, предпочтительно, 20-22°С. Этот отбор мутантного RS вируса во время холодного пассирования, в основном, исключает какую-либо остаточную вирулентность в производных штаммах по сравнению с частично аттенуированным родителем. В другом варианте изобретения неполностью аттенуированные штаммы подвергают химическому мутагенезу для введения ts мутаций или, в случае вир усов, которые уже ts (чувствительны к температуре), дополнительные ts мутации достаточны для увеличения стабильности ts фенотипа аттенуированного производного. Способы для введения ts мутаций в RS вирус предусматривают репликацию вируса в присутствии мутагена, такого как 5-фторуридин или 5-фторурацил в концентрации приблизительно 10-310-5 М, предпочтительно, приблизительно 10-4 М или экспонирование вируса с нитрозогуанидином при концентрации приблизительно 100 мкг/мл в соответствии с общим способом, описанным, например, в Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969) и Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100 (1978). Можно использовать и другие химические мутагены. Аттен уирование может быть результатом ts мутации почти в любом гене RS вируса. Уровень температурной чувствительности репликации аттенуированного RS вируса изобретения опре деляют сравнением его репликации при разрешающей температуре с репликацией при нескольких ограничивающих температурах. Самая низкая температура, при которой репликация вируса снижается в 100 раз или более по сравнению с его репликацией при пермиссивной температуре, названа температурой выключения (shutoff). В экспериментальных животных и людях как репликация, так и вирулентность RS вируса коррелируют с температурой выключения мутанта. Репликация мутантов с температурой выключения 39°С умеренно ограничена, тогда как мутанты с температурой выключения 38°С размножаются менее хорошо, и симптомы болезни, в основном, ограничиваются верхними дыхательными путями. Вирус с температурой выключения 3537°С должен быть полностью ослаблен в человеке. Так, аттенуированный RS вирус изобретения, который чувствителен к температуре, имеет температуру выключения в диапазоне приблизительно 35-39°С, предпочтительно, 35-38°С. Добавление свойства чувствительности к температуре частично аттенуированному штамму создает полностью аттенуированный вирус, применимый в вакцинных композициях данного изобретения. В дополнение к критериям жизнеспособности, ослабленности и иммуногенности, свойства производного, которое отбирают, должны также быть насколько возможно стабильными, так, чтобы желаемые признаки сохранялись. Генетическая нестабильность ts фенотипа после репликации in vi vo была правилом для ts вирусов (Murphy et al., Infect. and Immun. 37:235-242 (1982)). Затем идеально, если вирус, применимый в вакцинах данного изобретения, сохраняет жизнеспособность, ослабленность, способность размножаться в иммунизированном хозяине (хотя и с низкими уровнями) и способность эффективно индуцировать иммунный ответ в вакцинированных индивидуумах, достаточный для защиты против серьезного заболевания, вызываемого последующей инфекцией вирусом дикого типа. Очевидно, что известные до сих пор и описанные мутанты RS вируса не отвечают всем этим критериям. Действительно, вопреки ожиданиям, основанным на результатах, сообщенных для известных аттенуированных RS вирусов, некоторые из вирусов данного изобретения, имеющие минимально две-три разные мутации, не только жизнеспособны и более ослаблены, чем прежние мутанты, но и более стабильны генетически in vivo, чем исследованные ранее мутанты, и сохраняют способность стимулировать защитный иммунный ответ и, в некоторых случаях, расширять защиту, полученную в результате множественных модификаций, например, индуцировать защиту против различных вирусных штаммов или подгрупп или защиту на различной иммунологической основе, например, на основе секреторных, а не сывороточных иммуноглобулинов, на основе клеточного иммунитета и т. п. Аттенуированный вирус данного изобретения может быть размножен в ряде клеточных линий, которые пригодны для роста RS вируса. RS вирус растёт во многих человеческих и животных клетках. Предпочтительными клеточными линиями 6 41315 для размножения аттенуированного RS вируса, для применения в вакцинах, являются клетки DBS-FRhL-2, MRC-5 и Vero. Наибольшие выходы вируса обычно достигаются в гетероплоидных линиях, таких как клетки Vero. Обычно клетки инокулируют вирусом при множественности заражения в диапазоне 0,001-1,0 или более. Клетки культивируют при условиях, разрешающих репликацию вируса, например, при 30-37°С в течение 35 дней или так долго, как это необходимо для достижения требуемого титра. Вирус удаляют из клеточной культуры и отделяют от клеточных компонентов обычно хорошо известными способами, например, центрифугированием, и, если нужно, очищают далее при помощи способов, известных специалистам данной области. Вирус, аттен уированный как описано здесь, может быть испытан в моделях in vitro и in vi vo для подтверждения адекватного аттенуирования, генетической стабильности и иммуногенности для применения в вакцинах. В теста х in vitro модифицированный вирус тестируют на sp фенотип. Далее модифицированные вирусы тестируют в животных моделях RS инфекции. Описаны многие животные модели, которые суммированы в Meignier et al., eds., Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication (1991), даваемой в виде ссылки. Модель инфекции RSV хлопковых крыс описана в U. S. 4800078 и Рrіnсе еt al., Virus Res. 3:193-206 (1985), включенных в ссылки. Эта модель, как считают, предсказывает аттенуирование и эффективность в человеке. Модель RS инфекции приматов с применением шимпанзе, предсказывает аттенуирование и эффективность в человеке и описана в деталях в Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100 (1978); Wright et al., Infect. Immun., 37:397-400 (1982); Crowe et al., Vaccine (1993) (in press), включенных в ссылки. Например, было показано, что терапевтическое действие RSV нейтрализующи х антител в инфицированных крысах было очень близким к последующему опыту с иммунотерапией обезьян и человека, инфицированных RSV. Действительно, хлопковая (cotton) крыса, по-видимому, является надежным экспериментальным заменителем для изучения ответа инфицированных обезьян и людей на иммунотерапию RSV нейтрализующими антителами. Например, количество RSV нейтрализующи х антител, дающих терапевтический эффект на крысах, измеренный по уровню таких антител в сыворотке обработанных животных (т. е. титр RSV нейтрализующей сыворотки 1:3021:518) лежит в том же самом диапазоне, который продемонстрирован для обезьян (т. е. титр 1:539) или младенцев человека или детей младшего возраста (т. е. 1:877). Терапевтическое действие в крысах проявлялось в виде 100-кратного или большего снижения титра вируса в легком (Prince et al., J. Virol. 61: 1851-1854), тогда как в обезьянах терапевтическое действие проявлялось в виде 50-кратного снижения титра легочного вируса (Hemming et al., J. Infect. Dis. 152:1083-1087 (1985)). Наконец, терапевтическое действие в младенцах и детях младшего возраста, госпитализированных с тяжелым RSV бронхиолитом или пневмонией, проявлялось в виде значительного увеличения оксигенации в подвергнутой лечению группе и значительном снижении количества RSV, извлекаемого из верхних дыхательных путей у прошедших лечение больных (Hemming et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31:1882-1886 (1987)). Следовательно, на основе этих исследований видно, что хлопковая крыса представляет собой удобную модель для предсказания успеха RSV вакцины у младенцев и детей младшего возраста. Другие грызуны, в том числе хомяки и мыши, должны быть также применимыми, поскольку эти животные могут допускать репликацию в них RSV и имеют температуру вн утри тела, подобную температуре человека (Wight et al., J. Infect. Dis. 122:501-512 (1970) и Anderson et al., J. Gen. Virol. 71:(1990)). Для применения в вакцинах аттенуированный вирус данного изобретения можно использовать непосредственно в препарате вакцины, или он может быть лиофилизирован, если желательно, при помощи известных протоколов лиофилизации. Лиофилизированный вирус обычно хранят приблизительно при 4°С. Перед использованием лиофилизированный вирус воссоздают в стабилизирующем растворе, например, солевом растворе или в растворе, содержащем SPG, Mg++ и HEPES, с адъювантом или без него, как описано ниже. Таким образом, RS вирусные вакцины изобретения содержат в качестве активного ингредиента иммуногенно эффективное количество аттенуированного RS вируса, как описано здесь. Аттенуированный вирус может быть введен в хозяина, в частности, человека, с физиологически приемлемым носителем и(или) адъювантом. Применимые носители хорошо известны в этой области и представляют собой, например, воду, содержащую буфер воду, 0,4%-ный солевой раствор, 0,3%-ный глицин, гиалуроновую кислоту и т. п. Полученные водные растворы могут быть упакованы для применения или лиофилизированы, причем лиофилизированный препарат соединяют со стерильным раствором перед введением, как упомянуто выше. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества , необходимые для создания близких к физиологическим условий, такие как корректоры рН и буферные средства, корректоры тоничности, смачивающие вещества и т. п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, олеат триэтаноламина и т. п. При инокуляции композицией аттенуированного RS вируса, как описано здесь, через аэрозоль, капли, грубый спрей, пероральным, топическим или иным путем, наиболее предпочтительным для интраназальной доставки, иммунная система хозяина отвечает на вакцину образованием антител, как секреторных, так и сывороточных, специфических для белков RS вируса. В результате вакцинации хозяин становится, по меньшей мере, частично или полностью иммунным к инфекции RS вирусом или устойчивым к развитию умеренной или тяжелой RS вирусной инфекции, в частности, нижних дыхательных путей. Вакцинные композиции, содержащие аттенуированный RS вирус данного изобретения, вводят 7 41315 лицу, восприимчивому к инфекции RS вирусом или по иной причине подвергающемуся опасности инфекции RS вирусом, для усиления возможностей собственной иммунной системы индивидуума. Такое количество определено как "иммуногенно эффективная доза". При этом точные количества зависят от состояния здоровья больного и его веса, способа введения, природы препарата и т. п., но находятся в диапазоне, приблизительно, 103-106 бляшкообразующих единиц (PFU) или более вируса на больного, более типично, приблизительно, 104-105 РFU вируса на больного. В любом случае вакцинные препараты должны обеспечить количество аттенуированного RV вируса данного изобретения, достаточное для эффективной защиты больного против тяжелой или угрожающей жизни инфекции RS вирусом. Аттенуированный RS вирус изобретения одной определенной RS подгруппы или одного штамма может быть соединен с аттенуированными вирусами другой подгруппы или других штаммов для получения защиты против множественных RS вирусов. В типичном случае различные модифицированные вирусы должны находиться в смеси и вводиться одновременно, но они могут вводиться и раздельно. Благодаря феномену перекрестной защиты среди определенных штаммов вируса, иммунизация одним штаммом может защищать против нескольких различных штаммов той же самой или другой подгруппы. В некоторых случая х может быть желательным комбинирование вакцин аттенуированного вируса данного изобретения с вакцинами, которые индуцируют защитные ответные реакции на другие агенты, в частности, на другие, поражающие детей, вирусы. Например, вакцину данного изобретения можно вводить одновременно (в типичном случае - раздельно) или последовательно с вакциной против вирyca парагриппа, как это описано в Clements et al., J. Clin. Micrоbiol. 29:1175-1182 (1991). Можно проводить одноразовые или множественные введения вакцинных композиций изобретения. Для новорожденных и младенцев до 2 лет множественное введение может быть необходимым для индуцирования достаточных уровней иммунитета. Введение следует начинать на первом месяце жизни и продолжать с интервалами, например, в 2 месяца, шесть месяцев, один год и два года, что необходимо для поддержания достаточных уровней защиты против нативной (дикого типа) RS вирусной инфекции. Подобным образом взрослым, которые особенно восприимчивы к повторяющейся или тяжелой RS вирусной инфекции, например, работникам медико-санитарной помощи, дневной медицинской помощи, членам семей с детьми младшего возраста, пожилым людям, индивидуумам с нарушенной кардио-легочной функцией и т. д. могут быть необходимы многократные иммунизации для создания и(или) поддержания иммунных ответных реакций. Уровни индуцированного иммунитета могут прослеживаться путем измерения количеств нейтрализующи х секреторных или сывороточных антител, и корректированные дозировки или вакцинации могут повторяться, при необходимости, для поддержания желаемых уровней защиты. Для иллюстрации (но не для ограничения) приведены следующие примеры. Пример I Выделение и характеристика полученных в результате мутагенеза производных пассированного на холоде RSV. Этот пример описывает химический мутагенез неполностью аттенуированного ср RSV с ограниченным кругом хозяев для получения производных ts и sp штаммов, которые более сильно ослаблены и, следовательно, предпочтительны для применения в вакцинных препаратах RSV. Был приготовлен родительский исходный запас пассированного на холоде RSV (ср RSV). Вирус Flow Laboratories Lot 3131, родительский ср RSV, который неполностью аттенуировали в человеке, пассировали дважды в клетках MRC-5 при 25°С, в конце разбавляли в два раза в клетках MRC-5 при 25°С, затем пассировали три раза в клетках MRC-5 для получения суспензии ср RSV для мугагенеза. ср RSV подвергали мутагенезу выращиванием родительской исходной популяции в MRC-5 клетках при 32°С в присутствии 5-фторурацила в среде при концентрации 4´10-4 М. В предварительных исследованиях было показано, что эта концентрация является оптимальной, поскольку она вызывала 100-кратное снижение титра вируса на 5-й день роста в культуре клеток по сравнению со средой без 5-фторурацила. Затем подвергнутую мутагенезу исходную популяцию анализировали методом бляшек (пятен) на клетках Vero, которые поддерживались под верхним слоем агара, и после определенного интервала инкубирования бляшки окрашивали красителем - нейтральным красным. 854 бляшки извлекали, и потомство каждой бляшки отдельно размножали путем выращивания на свежих монослоях клеток Vero. Содержимое каждой из тканевых культур инокулировали потомством одной бляшки, подвергнутого мутагенезу cр RSV, собирали отдельно, когда эффекты повреждения на клетках Vero казались максимальными. Потомство вируса, обнаруживающее чувствительный к температуре (ts) или содержащий малые бляшки (sp) фенотип, находили титрованием пулов бляшек на НЕр-2 клетках при 32°С и 38°С. Каждый вирус, обнаруживающий sp фенотип (размер бляшек был уменьшен на 50% или более по сравнению с родительским вирусом при 32°С) или ts фенотип (100-кратное снижение титра при ограничивающей температуре 37°-40°С по сравнению с 32°С) оценивали далее. Эти штаммы биологически клонировали серийной очисткой бляшек на клетках Vero три раза и затем размножали на клетках Vero. Клонированные штаммы титровали при 32°, 37°, 38°, 39° и 40° (в тесте эффективности бляшкообразования (ЕОР)) для подтверждения их sp и ts фенотипов. Поскольку титры некоторых клонированных штаммов были относительно низкими даже при пермиссивной температуре (32°С), эти вирусы пассировали один раз в НЕр-2 клетках, получая вирусные суспензии для анализа in vitro. Фенотипы потомства подвергнутого мутагенезу ср RSV представлены в табл. 1. Одно из мутантных потомств имело фенотип малых бляшек, RSV cpsp-143 (sp обозначает 8 41315 фенотип малых бляшек (sp)), остальные мутантные потомства имели ts фенотип. RSV срts мутанты обнаруживают вариации в способности продуцировать бляшки в монослойных культурах in vitro в диапазоне температур 37°C-40°С. Так, срts 368 сохраняет способность продуцировать бляшки при 40°С, тогда как наиболее чувстви тельный к температуре (ts) вирус, cpts 248, не мог продуцировать бляшки при 38°С. Таким образом, некоторые из подвергнутых мутагенезу ср RSV потомств обнаруживают заметное отличие от родительского ср RS вируса в отношении чувствительности к температуре бляшкообразования. Исследование репликации и генетической стабильности в мышах. Уровень репликации ср RSV потомства вируса в верхни х и нижних дыхательных путях ВAL В/с мышей изучали на следующем этапе исследований (таблица 2). Было обнаружено, что cpts 530 и cрts 248, два из наиболее чувствительных к температуре ts вирусов (см. табл. 1), имели в 712 раз сниженную репликацию в носовых раковинах мышей (таблица 2). Однако ни один из этих вирусов не был ограничен в репликации в легких, по сравнению с ср RSV родительским вирусом. Большее ограничение размножения в нocoвыx раковинах, чем в легких, не является характерным для ts мутантов, которые обычно имеют более ограниченное размножение в более теплых нижних дыхательных путя х (Richman and Murphy, Rev. Infect. Dis. 1:413-433 (1979). Вирус, образовавшийся в легких и носовых раковинах, сохранял ts характер вошедшего вируса (данные не представлены). Эти открытия предполагают, что комбинация ts мутаций на фоне мутаций родительского ср вируса привела к ts потомству ср RSV с более высоким уровнем стабильности ts фенотипа после репликации in vivo, чем это было показано для изучаемых ранее ts мутантов. Для дальнейшего изучения уровня генетической стабильности ts фенотипа потомств ср RSV эффективность бляшкообразования вируса, присутствующего в легких и в носовых раковинах мышей, исследовали для двух потомств подвергнутого м утагенезу ср RSV, которые были среди наиболее чувстви тельных к температуре (ts) потомств, а именно: ts 248 и ts 530. Голые мыши были выбраны, поскольку их иммунная система нарушена вследствие врожденного отсутствия функциональных Т-клеток, и вирус может реплицироваться в этом хозяине в течение более длительного периода времени. Более длительный период репликации благоприятствует появлению вирусных мутантов с измененным фенотипом. Вирус, присутствующий на 12-ый день (примечание: в нормальных мышах в это время уже нельзя детектировать вирус), был охарактеризован и обнаружили, что он сохраняет неизмененный ts фенотип (таблица 3). Как и ожидали, ts-1 мутант, включенный в тест в качестве положительного контроля, обнаруживал нестабильный ts фенотип in vivo. Таким образом, в противоположность прежней оценке ts мутантных вирусов в грызунах, эти результаты показывают, что после пролонгированной репликации в грызунах был достигнут высокий уровень стабильности ts фено типа, что является важным и до сих пор не достигаемым очень желательным свойством вирусов данного изобретения. В шимпанзе. Далее уровень аттенуирования ts потомства ср RSV оценивали в серонегативннх шимпанзе, хозяине, наиболее близком к человеку. Опыты на шимпанзе или совинолицых мартышках проводили согласно общему протоколу Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91/100 (1979); Crowe et al., Vaccine (1993) (in press). Один мл суспензии, содержащей приблизительно 104 бляшкообразующих единиц (PFU) мутантного аттенуированного вируса, вводили интраназально каждому животному. Альтернативным способом является инокуляция RSV как в верхние, так и в нижние дыхательные пути в дозе 104 PFU к каждому caйтy. Шимпанзе брали для взятия проб ежедневно в течение 10 дней, затем каждые 3-4 дня до 20-го дня. Пробы из нижних дыхательных путей шимпанзе брали при помощи трахеального лаважа согласно протоколу Snyder et al., J. Infect. Dis. 154:370-371 (1986) и Сгоwе et aI., Vaccine (1993) (in рrеss). Некоторых животных заражали спустя 4-6 недель вирусом дикого типа. Животных оценивали на признаки респираторного заболевания каждый день при взятии проб из носоглотки. Ринорея, оцениваемая от 0 до 4+, считалась сильным заболеванием верхних дыхательных п утей при оценке 2+ или выше. Вирус выделяли из проб-мазков из носа и горла и жидкостей трахеального лаважа путем инокуляции в чувствительные к RSV НЕр-2 клетки, как описано выше. Количества вируса можно также определять непосредственно по методу бляшек с применением НЕр-2 клеток, как описано Schnitzer et al., J. Virol. 17:431-438 (1976). Пробы крови брали перед введением вируса и через 34 недели после инокуляции для определения RSV нейтрализующи х антител, как описано в Mills et al., J. Immunol. 107:123-130 (1970). Наиболее ts и аттенуированное потомство ср RSV (ср RSV 248) исследовали и сравнивали с RSV дикого типа и родительским ср RSV (табл. 4). Репликация родительского ср RSV была слегка понижена в носоглотке по сравнению с диким типом, наблюдали снижение ринореи по сравнению с вирусом дикого типа, а также приблизительно 300-кратное уменьшение репликации вируса в нижних дыхательных путях по сравнению с вирусом дикого типа. Ясно, что ср вирус имел значительное ограничение репликации в нижних дыхательных путя х шимпанзе, что является очень желательным признаком, не обнаруживаемым ранее при прежних оценках ср RSV в животных и человеке. Более важно то, что ср RSV 248 вирус имел 10-кратное ограничение размножения в носоглотке по сравнению с вирусом дикого типа, и это ограничение было связано с заметным уменьшением ринореи. Эти результаты показали, что это производное ср RSV обладает двумя крайне желательными свойствами для живой RSV вакцины, а именно: аттенуацией как в верхних, так и в нижних дыхательных путях высокочувствительных серонегативных шимпанзе. Далее оценивали уровень генетической стабильности вируса, присутствующего в дыхательных путях шимпанзе (таблица 5). Вирус, присутствующий в выделениях 9 41315 дыхательных путей, сохранял ts фенотип, и это было видно даже для вируса из шимпанзе 3 на 8-ой день, имеющего 100-кратное снижение титра при 40°С и обнаруживающего фенотип малых бляшек при 40°С, что свидетельствует о том, что его размножение все еще было чувствительным к температуре. Это наиболее генетически стабильный ts мутант, идентифицированный до настоящего времени. Увеличенная стабильность ts фенотипа вирусов ср RSV 248 и ср RSV 530 отражает влияние ср мутаций на генетическую стабильность тех мутаций, которые важны для ts фенотипа in vivo. Таким образом, ts мутации в сочетании с мутациями, присутствующими в родительском вирусе ср 3131, по-видимому, являются более стабильными, чем можно было бы ожидать в их отсутствие. Это важное свойство не было обнаружено и сообщено ранее. Инфицирование шимпанзе вирусом срts 248 индуцировало высокий титр нейтрализующи х антител, а также антител к F и G гликопротеинам (таблица 6). Существенно, что иммунизация при помощи cpts 248 защищала животных от заражения RSV (таблица 7), что указывает на то, что этот мутант действует как эффективный вакцинный вирус в хозяине, близкородственном человеку. Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что срts 248 вирус обладает многими свойствами, желательными для живой RSV вакцины, в том числе: 1) аттенуацией для верхних и нижних дыхательных путей; 2) повышенной генетической стабильностью после репликации in vi vo даже после пролонгированной репликации в животных с супрессией иммунного ответа; 3) удовлетворительной иммуногенностью; 4) значительной защитной эффективностью против заражения RSV дикого типа. Вирус срts 530 имеет подобную чувствительность бляшкообразования к температуре по сравнению с cpts 248, подобную степень ограничения размножения в носовых раковинах мышей и высокий уровень генетической стабильности в иммунонедостаточной голой мыши. Поэтому он также представляет собой вакцинный штамм RSV. Дальнейшее аттенуирование. Поскольку RS вирус вызывает больше симптомов заболевания нижних дыхательных путей у человека, чем у шимпанзе, и поскольку мутанты, которые удовлетворительно ослаблены для шимпанзе, могут быть недостаточно ослабленными для серонегативных младенцев и детей, производные cpts 248 и 530, обладающие нехарактерными свойствами ts мутантов, а именно: ограниченным размножением и аттенуированием в верхних ды хательных путя х и высоким уровнем генетической стабильности, были подвергнуты дальнейшему мутагенезу. Для дальнейшего исследования были выбраны потомства вирусов, которые обнаружили более высокую степень чувствительности к температуре in vitro, чем cpts 248, или которые имели фенотип малых бляшек. Мутантные производные cрts 248, обладающие одной или несколькими дополнительными ts мутациями, получали при помощи мутагенеза в присутствии 5-фтор урацила (таблица 8). Тs мутанты, более чувстви тельные к температуре (ts), чем cpts 248, были идентифи цированы и некоторые из них имели фенотип малых бляшек (sр). Эти производные ср 248 вводили мышам. Мутанты cpts 248/804, 248/955, 248/404, 248/26, 248/18 и 248/240 были более ограничены в размножении в верхних и нижних дыхательных путях мышей, чем их родительский вирус cpts 248 (таблица 9). Таким образом, были идентифицированы жизнеспособные мутанты cpts 248, которые были более аттенуированы, чем cpts 248, и эти производные cpts 248 обнаружили широкий диапазон действия на размножение в мышах, причем ts 248/26 имел наибольшее ограничение размножения. Ts фенотип вируса, присутствующий в носовых раковинах и легких мышей, был почти идентичен ts фенотипу введенного вируса, что свидетельствует о генетической стабильности. Высокоаттенуированное производное сpts 248, вирус срts 248/404, был в 1000 раз более ограничен в размножении в носоглотке по сравнению с вирусом такого типа. Мутант срts 248/404, обладающий по меньшей мере тремя аттенуированными мутациями, был также значительно ограничен в размножении в верхних и нижних дыхательных путя х двух серонегативных шимпанзе и инфекция не вызывала ринореи (таблица 10). Этот вирус также обнаруживал високую степень ограничения размножения по сравнению с диким типом, имея сниженную в 80000 раз репликацию в носоглотке и в 100000 раз - в легких. Тем не менее эти два шимпанзе были высокоустойчивы к последующему заражению RS вирусом дикого типа (таблица 11). Кроме того, были получены ts производные вируса cpts 530 (таблица 12). Эти результаты представляют собой дальнейшее усовершенствование в свойствах RS вирусов данного изобретения и такжe являются очень важным и значительным успехом в разработке вакцинных штаммов RS вируса. Эти результаты были совершенно неожиданными, если основываться на опыте, приобретённом во время пpeжниx исследований. Например, результаты более раннего исследования указывали на то, что in vivo своства ts мутантов RSV, полученных в одном цикле мутагенеза с применением 5-фторурацила, не могут быть предсказаны a priori. Более того, хотя один из первых четырех ts мутантов, полученных этим способом, обнаруживал ту же самую температуру выключения бляшкообразования, что и другие мутанты, он был чрезмерно ослаблен при тестировании в восприимчивых шимпанзе и младенцах и детях младшего возраста (Wright et al., Infect. Immun. 37(1): 397-400 (1982). Это свидетельствовало о том, что получение ts фенотипа, приводящего к температуре выключения бляшкообразования 37°38°С, не давало надежно мутанта с желаемым уровнем аттенуирования для восприимчивых шимпанзе, младенцев и детей. Действительно, эти результаты исследований с известными до сих пор мутантами были полностью не способны обеспечить какую-либо основу для вывода о том, что введение трех независимых мутаций (или множества мутаций) в RSV путем пассирования на холоде с последующими двумя последовательными циклами химического мутагенеза могут дать жизнеспособные мутанты, которые сохранят инфекционность для шимпанзе (и путем экстрапо 10 41315 ляции - для младенцев) и обнаружат желаемый уровень аттенуирования, иммуногенности и защитную эффективность, требуемые для живой вирусной вакцины, которая могла бы применяться для предотвращения RSV заболевания. Представленные выше результаты ясно демонстрируют, что определенные ts производные сp RSV данного изобретения являются инфекционными и обнаруживают значительную степень аттенуирования для мышей и шимпанзе. Эти производные ts мутанта атгенуированы и обнаруживают высокую генетическую стабильность после репликации in vivo. Эти мутанты также индуцируют значительную устойчивость к инфекции RSV у шимпанзе. Таким образом, эти производные ср RSV представляют собой вирусные штаммы, пригодные для применения в живых вакцинах, предназначенных для предотвращения тяжелого заболевания, вызываемого респираторно-синцитиальным вирусом у человека. Пример II Применение адаптации к холоду для аттенуирования ср RSV мутантов. Этот пример описывает введение ограничивающи х рост мутаций в неполностью аттенуированные ср RSV штаммы с ограниченным кругом хозяев, путем дальнейшего пассирования этих штаммов при все более сниженных температурах, для получения производных штаммов, более удовлетворительно аттенуированных для использования в вакцинах для человека. Эти подходы адаптации к холоду (са) были применены для введения дальнейшего аттенуирования в ср RSV 3131 вируса, который неполностью ослаблен в серонегативных детях. При первой стратегии родительский исходный запас популяции пассированного на холоде RSV (ср RSV 3131), полученного из Flow Laboratories, был приготовлен пассированием в MRС-5 клетках при 25°С, как описано в примере I. Вкратце, пассированный на холоде вирус инокулировали в монослойную культур у MRС-5 или Vero клеток при множественности заражения £0,01, и инфицированные клетки инкубировали в течение 3-14 дней перед последующим пассированием. Вирус пассировали свыше 20 раз при 20-22°С для получения более ослабленного вируса. Способ быстрого пассирования, как только становилось очевидным первое указание на репликацию вируса (т. е. 3-5 дней), был предпочтительным для отбора мутантов, способных эффективно реплицироваться при низких температурах. Дополнительно штамм RSV подгруппs В, St. Louis (14617) 85 клон IАI, был выделен из первичных клеток почек африканской зеленой мартышки, а также пассирован и клонирован в МRC клетках (IAI-М C14) и пассирован на холоде 51 раз в эти х клетках при 32-22°С. Вторая стратегия предусматривала применение биологически клонированного производного неклонированного родительского вируса ср RSV 3131. Вирус биологически клонировали в клетках почки эмбриона быка (ВЕК) (ткань, применяемая для исходного получения вируса cp RSV 3131, - см. Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968). Клонированный вирус затем пассировали с 10-дневными интервалами в Vero клетках при низкой температуре. Альтер нативно, вирус ср RSV 3131 клонировали конечным разведением (ТD2Р4) в MRC-5 клетках и пассировали с 10-дневными интервалами в Verо клетках. Третья стратегия предусматривала отбор мутантов, продуцирующих бляшки при низкой температуре. Было идентифицировано производное вируса RS\/ ср 3131, названное рlаquе D1, лродуцирующее большие бляшки при 25°С. Этот вирус получали из уровня третьего пассирования (РЗ) ср 3131-1 (ВЕК) cp 3131-17 (ВЕК) линии. Самую большую бляшку, продуцируемую Р3 вирусом, размножали при 32°С, затем получали бляшки при 25°С. Опять выбирали самую большую бляшку, размножали и вновь получали бляшки. После пяти таких циклов был получен мутантный вирус D1 с большими бляшками. D1 клонировали биологически при помощи двух дополнительных циклов очистки при помощи повторения бляшкообразования. Биологически клонированный вирус D1 образует заметно и равномерно большие бляшки при 25°С, чем сp 3131 или вирус А2 дикого типа. Таким образом, D1 адаптирован к холоду согласно критерию большого размера бляшек при 25°С. Предварительные исследования позволили предположить, что D1 не является чувствительным к температуре. При 37°С бляшки (D1 неотличимы от бляшек RSV дикого типа или ср 3131, что позволяет предположить, что D1 не ограничен в росте при этой температуре. В соответствии с этим D1 производит сильное цитопатогенное действие в монослоях Vero клеток при 37°С и 40°С (т.е. при самых высоких испытуемых температурах). Пример III Введение дальнейших аттенуирующи х м утаций в ts RSV. Этот пример описывает применение ts мутантов в качестве родительских вирусов для получения более полно аттенуированных штаммов. Для этого способа выбирали два ts мутанта RSV А2, а именно: ts-4 и ts-1 NG1. Для введения дополнительных мутаций в ts мутанты RSV были выбраны два разных способа. Во-первых, неполностью аттенуированный ts мутант RSV подвергали химическому мутагенезу и мутантные потомства, которые были более чувстви тельны к температуре относительно бляшкообразования, отбирали для дальнейшего анализа. Во-вторых, ts мутанты RSV пассировали при низкой температуре для отбора ts мутантов RSV с са фенотипом, т. е. с увеличенной способностью размножаться при субоптимальной температуре по сравнению с родительским вирусом дикого типа. Родительскую исходную популяцию ts-1 NG-1 вируса готовили из ts-1 NG-1 мутанта живого RSV (А-2) из Flow Laboratories Lot М2, росшего в MRC-5 клетках. Этот мутант, полученный из ts-1 мутанта во втором цикле мутагенеза в присутствии 5-фторурацила, имеет две пли более независимых ts мутаций, но все еще вызывает ринорею в восприимчивых к нему шимпанзе. Вирус пассировали дважды в \/еrо клетках при 32°С для получения ts-1 NG-1 суспензии для мутагенеза. Затем вирус выращивали в присутствии 4 x10-4 М 5-фторурацила для индуцирования мутаций во время репликации или экспонировали с 5-азаци 11 41315 тидином при 36°С после обработки 5-фторурацилом. Затем мутантную популяцию анализировали при помощи теста бляшкообразования на Verо клетках, которые выдерживали под верхним слоем агара и после определенного периода времени инкубации бляшки идентифицировали микроскопически. Затем извлекали 596 бляшек, и потомство каждой бляшки отдельно размножали при помощи роста на свежих монослоях Vero клеток. Содержимое каждой из культур ткани, инокулированных потомством отдельной бляшки мутагенизированного вируса ts-1 NG-1, собирали отдельно при достижении максимальных цитопатогенных эффектов на Vero клетках. Потомство вируса, более чувствительное к температуре, чем ts-1 NG-1, находили титрованием пулов бляшек на НЕр-2 клетках при 32°С и 36°С. Каждый вирус, обнаруживающий большую чувстви тельность к темпеpaтуре, чем ts–1 NG-1 (т. е. 100-кратное снижение титра при ограничивающей температуре (36°C) по сравнению с 32°С), оценивали далее. Были идентифицированы шесть потомств бляшек, более ts, чем ts–1 NG-1 RSV. Эти штаммы клонировали биологически серийной очисткой с применением бляшкообразования на Vero клетках (3 раза) и затем размножали на Vero клетках. Клонированные штаммы титровали при 32°С, 35°С, З6°С, 37°С и 38°С (тестом эффективности бляшкообразования) для подтверждения их ts фенотипов. Данные эффективности бляшкообразования, полученные на НЕр-2 клетках, дали дальнейшее подтверждение фенотипов шести мутантов (таблица 13). Два наиболее ts (чувствительных к температуре) вируса, А-20-4 и А-37-8, были сильно аттенуированы в мышах по сравнению с их родительским вирусом ts–1 NG-1, что свидетельствует о том, что приобретение увеличенного уровня чувствительности к температуре сопровождается увеличенной аттенуацией (таблица 14). Эти вирусы были инфекционными для мьшей, так как они индуцировали образование антител. Вирус ts–1 NG-1/А-20-4 аттенуирован для шимпанзе (таблица 15) и инфицирование шимпанзе ts–1 NG-1/А20-4 вызывало устойчивость к заражению вирусом дикого типа (таблица 16). Важным является то, что ринорея не наблюдалась. Проводили также мутагенез вируса ts-4 при помощи того же способа, который применяли для мутагенеза вируса ts–1 NG-1. Пять потомств бляшек, более чувствительных к температуре, чем родительский вирус ts-4 RSV, были идентифицированы (таблица 17). Мутации были введены также в ts–1 NG-1 и ts-4 вирусы пассированием на холоде. Вирус ts-4 размножается до высокого титра при 22°С после 38 пассирований на холоде. Исследования на человеке. Аттенуированный вирус изобретения вводили человеку в соответствии с хорошо упрочившимися протоколами для RS вакцин, предназначенных для человека, описанных, например, Wright et al., Infect. Immun. 37:397-400 (1982). Кіm et al., Pediatrics 52:56-63 (1973) и Wright et al., J. Pediatr. 80:931-936 (1976), которые включены в качестве ссылки. Вкратце, взрослых или детей инокулировали интраназально в виде капель с 103- 105 PFU аттенуированного вируса на мл в объеме 0,5 мл. Образование антител оценивали фиксацией комплемента, нейтрализацией бляшек и(или) твердофазным иммуноферментным анализом. Наблюдали появление признаков и симптомов заболевания верхних ды хательных путей у индивидуумов. Как и при введении шимпанзе, аттенуированный вирус вакцины растет в носоглотке вакцинированных индивидуумов при уровнях, приблизительно более чем в 10 раз более низких по сравнению с уровнями вируса дикого типа и приблизительно в 10 раз или менее при сравнении с уровнями ср RSV или другого, неполностью аттенуированного родительского штамма. Последующие иммунизации проводили периодически, по необходимости, для поддержания достаточных уровней защитного иммунитета. Из вышесказанного должно быть понятно, что хотя здесь описаны специфические варианты изобретения для иллюстрации и понимания, могут быть введены различные модификации без отхода от дyxa и сферы действия данного изобретения. Соответственно этому, изобретение не ограничивается за исключением ограничений, указанных в формуле изобретения. 12 41315 Таблица 1 Эффективность бляшкообразования девяти производных пассированного на холоде RSV (cpts или срsр мутантов) в НЕр-2 клетках при разрешающей и ограничивающих температурах Вирус Дикий тип А2 cp -RSW ts-1 cpsp-143 сpts-368 cpts-274 cpts-347 cpts-142 cpts-299 cpts-475 cpts-530 cpts-248 Титр вируса (log10 PFU (мл) при указанной температуре (°С)) 32 37 38 39 40 5,5 4,4 4,5 3,8 3,8 6,0 5,8 5,8 6,2 5,4 5,7 4,5 2,7 2,4 1,7* 4,2* 4,1* 3,8* 3,9* 3,8* 6,7 6,3 6,1* 5,8** 2,0** 7,3 7,1 6,6 5,8* 1,0** 6,2 6,1 5,7* 5,5**