Мутантний поліпептид tgfb

Реферат: Винахід стосується мутантного поліпептиду TGF, який здійснює антагоністичний вплив на активність природних лігандів TGFβ, опосередковану рецептором ALK5, який включає мутацію за типом амінокислотної заміни в положеннях амінокислотних залишків W30, LI01, 151 і L51 UA 115678 C2 (12) UA 115678 C2 нативних лігандів TGFβ1, TGFβ2 або TGFβ3 людини. Даний винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка призначена для лікування раку, захворювань, які супроводжуються фіброзом, і хронічних інфекційних захворювань. UA 115678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується галузей біотехнології і медицини. Даний винахід, зокрема, стосується використання мутованих варіантів молекули TGFβ, які є антагоністами передачі сигналів їх природних аналогів, і терапевтичного застосування зазначених варіантів. Рівень техніки Встановлено, що цитокіни TGFβ мають здатність стимулювати колонієутворення клітин (Roberts A. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5339-43, 1981); тому що даний процес є класичним маркером трансформації клітин, зазначена молекула отримала назву трансформуючого β-фактора росту. В наш час ліганди TGFβ (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) вважаються прототипами багатофункціональних факторів росту. Клітини майже всіх типів в організмі продукують зазначені ліганди і експресують комплекс рецепторів. Такі молекули є сильнодіючими інгібіторами проліферації епітеліальних, ендотеліальних і гемопоетичних клітин (Ravitz M. L. et al., Adv. Cancer Res. 71: 165-207, 1997) і одними із найсильніших регуляторів продукування і відкладення позаклітинного матриксу (Massague J. The Annu. Rev. Cell Biol. 6: 597-641, 1990) і системи репарації тканини (Roberts A. B. and others, 275-308 Plenum, 1996). Зазначені молекули також регулюють різні механізми в процесі розвитку ембріона, такі як диференціювання і міграція клітин, а також розвиток кровоносних судин (Taya Y. et al., Development 126: 3869-79, 1999; Lidral A. et al., Am. J. Hum. Genet. 63:557-68, 1998). Передача сигналів TGFβ в імунній системі є дуже важливим регулюючим вузлом. Однією із його найважливіших функцій є збереження гомеостазу лімфоцитів і імунологічної толерантності шляхом інгібування проліферації ненавчених Т-клітин, індукованої аутоантигенами в умовах лімфопенії. (Bevan M. et al., Nat. Immunol. 27, 13(7): 667-73, 2012. Зазначена молекула також пригнічує або змінює активацію, дозрівання і диференціювання природних клітин-кілерів (Laouar Y. et al., Nature Immnol. 6: 600-607, 2005), дендритних клітин (Luo X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 2821-2826, 2007; Bekeredjian Ding I. et al., Immunology 128:439-450, 2009), макрофагів (Sica A. et al., Semin. Cancer Biol. 18, 349-355, 2008, Torroella M. et al., Cancer Res. 69: 4800-09, 2009), нейтрофілів (Fridlender Z. G. et al., Cancer cell 16: 183-194, 2009), ефекторних Т-клітин і Тклітин пам'яті (Gorelik I. & Flavell R. A., Nature Med. 7: 1118-1122, 2001; Flavell R. A., Immunity 31: 131-44, 2009). TGFβ відіграє важливу роль в індукції, диференціюванні і збереженні природних і індукованих регуляторних Т-клітин (CD4+Foxp3+) і TCD4+IL17+(TH17) ефекторних Т-клітин (Kryczek I. et al., J. Immunol. 178: 6730-33, 2007; Moo-Young T. A. et al., J. Immunother. 32: 12-21, 2009; Fantini M. C. et al., J. Immunol. 172: 5149-53, 2004; Flavell R. A., Cell 134: 392-404, 2008). Зрілі ліганди TGFβ є гомодимерами, які складаються із 112 амінокислотних залишків. Зазначені ліганди виділяють із молекули-попередника, утвореної латентно асоційованим пропептидом (LAP), локалізованим у положенні N-кінцевого і активного домену в напрямку Скінця. Обидва домени розділяються усередині клітини протеолізом, після чого ліганди секретуються у вигляді неактивних попередників, утворених продоменом, оборотно зв'язаним із активним доменом, і регулюють, таким чином, доступ до клітинних рецепторів (Geoffrey D., Young and Joanne E. Мurрhу-Ullrich. JBC Vol. 279, No. 36: 38032-39, 2004). Встановлено, що латентно асоційований пропептид також має важливе значення для секреції зрілого домену (Gray A. and A. Mason, Science 247: 1328-30, 1990). Усі три ізоформи (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) взаємодіють у плазматичній мембрані із рецепторами ТβRI, ТβRII і ТβRIII. Останній рецептор, також відомий як бетаглікан, експресований не у всіх типах клітин і, будучи необов'язковим для передачі сигналів, опосередкованої лігандами TGFβ1 і TGFβ3, утворює сховище таких лігандів при насиченні ТβRII. (Wang X. F. et al., Cell 67: 797-805, 1991; Lebrin F. et al., Cardiovasc. Res. 65: 599-608, 2005). ТβRIII утворює комплекси із рецепторами ТβRI і ТβRII, представляючи їм ліганд. Зазначені рецептори зв'язуються головним чином із ТβRII, і комплекс ТβRII/TGFβ здійснює рекрутинг і активацію разом із високоафінним рецептором ТβRI, у результаті чого утворюється сигнальний гетеротривимірний комплекс. TGFβ1 і TGFβ3 можуть зв'язуватися із ТβRII із високою спорідненістю (5-30 пМ), у той час як TGFβ2 може зв'язуватися аналогічним чином тільки у присутності ТβRIII (De Crescenzo et al., J. Biol. Chem. 279: 26013-18, 2004; Crescenzo et al., J. Mol. Biol. 328: 1173-1183, 2003; Groppe et al., Molecular Cell 29: 157-168, 2008). Дотепер у науковій літературі були відсутні дані про те, що ліганди сімейств TGFβ1, TGFβ2 і TGFβ3 здатні зв'язуватися із іншими рецепторами типу II, які належать до того ж сімейства білків ТβRII (Huang F. and Y. G. Chen, Cell Biosc. Mar. 15, 2:9, 2012). Однак, зазначені ліганди можуть зв'язуватися із декількома рецепторами типу I. Як зазначено в науковій літературі, ALK5 є еталонним рецептором ТβRI підродини лігандів. Після його рекрутингу в комплекс ТβRII/TGFβ відбувається фосфорилування білків SMAD2/3 (Huang F. and Y. G. Chen, Cell Biosc., Mar 15; 2:9, 2012). ALK1 активується у відповідь на утворення комплексу TGF/ТβRII у ендотеліальних 1 UA 115678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинах і передає сигнали SMAD1 і SMAD5 (Goumans M. J. et al., Mol. Cell 12(4): 817-28, 2003). У деяких епітеліальних клітинах передачу сигналів SMAD1/5 індукують рецептори ALK2, ALK3 і ALK6 (Daly A. C. et al., Mol. Cell Biol., 28: 6889-6902, 2008). ALK2 також асоційований із процесами, які стосуються розвитку in vivo серцево-судинної системи (Olivey H. E. et al., Dev. Dyn. 235(1): 50-9, 2006). Слід зазначити, що рецептори ТβRII і ALK5 є єдиними для сімейства лігандів TGFβ1, TGFβ2 і TGFβ3, у той час як ALK1/2/6/3 є різнобічними і використовуються також активінами і кістковими морфогенетичними білками (Sebald W. et al., Biol. Chem., 385 (8): 697710, 2004). ALK5-опосередкована передача сигналів асоційована із різними патогенними механізмами у визначених захворюваннях. Наприклад, у випадку раку зазначена передача сигналів виконує складну функцію і асоційована із пригніченням імунної реакції і стимуляцією розвитку пухлини. Пригнічення імунної реакції відбувається головним чином на ранніх стадіях онкогенезу. На пізніх стадіях онкогенезу роль зазначеної передачі сигналів як стимулятор розвитку пухлини полягає в утворенні метастазуючих інвазивних фенотипів і пригніченні протипухлинної імунної реакції (Miyazono K., Nat. Rev. Cancer 10: 415-24, 2010; Miyazono K., Cancer Sci. 101 (2): 306-12, 2010; Hawinkels L. J. et al., Growth Factors 29(4): 140-52, 2011). Іншими захворюваннями, у яких активність TGFβ також здійснює шкідливий вплив, є хронічні інфекційні захворювання, які викликаються патогенними мікроорганізмами, такими як ВІЛ, HBV, HCV, CMV, мікобактерії і паразит Trypanosoma cruzi. TGFβ негативно впливає на захисну імунну реакцію, роблячи можливим ріст і виживання внутрішньоклітинних патогенних мікроорганізмів (Reed G. S., Microbes and Infection 1: 1313-1325, 1999). У багатьох захворюваннях надпродукування TGFβ сприяє утворенню патологічного надлишку фіброзної тканини, яка порушує нормальну функцію ураженого органа. Деякими прикладами патологічного надлишку фіброзної тканини є поряд із іншими захворюваннями фіброз легені, саркоїдоз, фіброз серця, кардіоміопатія, цироз печінки, системний склероз, гломерулярний склероз і первинний біліарний цироз печінки (Kopp J. B. et al., Microbes and Infection, 1: 1349-1365, 1999). Були розроблені багато методів для інгібування передачі сигналів TGFβ. Більшість інгібіторів було оцінено в передклінічних моделях, хоча були початі клінічні дослідження деяких інгібіторів у різних типах раку і фіброзу (Flavell R. A., Nat. Rev. Immunol. 10(8): 554-67, 2010; Connolly E. C. et al., Int. J. Biol. Sci. 8(7): 964-78, 2012; Hawinkels L. J. et al., Growth Factors 29(4): 140-52, 2011). У даній галузі відомі наступні методи інгібування: 1. нейтралізація лігандів за допомогою розчинних форм позаклітинних доменів їх рецепторів (заявки на патенти США 2002/0004037 і 2007/0244042), антитіл проти TGFβ (заявки на патенти США 2002/076858, 2005/0276802) або олігонуклеотидів, які блокують трансдукцію генів цитокінів (заявки на патенти США 2004/0006036, 2007/0155685); 2. блокування передачі сигналів за допомогою дрібних молекул, які зв'язуються із доменом кінази TβRI/ALK5 (заявки на патенти США 2006/0057145, 2005/0136043, 2006/0234911); 3. блокування рецептора II за допомогою антитіл, які впізнають його позаклітинний домен (заявки на патенти США 2010/0119516, 2009/7579186). В наш час у науковій літературі відсутня інформація про метод інгібування із використанням мутеїнів лігандів TGFβ як антагоністів передачі сигналів. Короткий опис винаходу Даний винахід стосується наукового відкриття, яке полягає в тому, що мутовані варіанти сімейства TGFβ (TGFβ1, TGFβ2 і TGFβ3) можуть інгібувати функцію своїх природних аналогів. При виконанні експериментів in vitro було встановлено, що мутовані варіанти TGFβ можуть інгібувати передачу сигналів, індуковану природними варіантами, і, таким чином, нейтралізувати їх біологічні впливи. Дане відкриття створює основу нової стратегії модуляції передачі сигналів TGFβ у таких захворюваннях як рак, фіброз або хронічне інфекційне захворювання, у яких зазначені ліганди проявляють шкідливу активність. Даний винахід стосується поліпептидів, які мають високу гомологію із TGFβ людини на рівні початкової послідовності за винятком деяких положень, у яких нативна амінокислота мутувала і втратила або значним ступенем послабила здатність передавати сигнали через рецептор ALK5 1-го типу. Зазначені мутовані варіанти TGFβ зберігають здатність зв'язуватися із високою спорідненістю із рецепторами ТβRII і ТβRIII, але не можуть передавати сигнали, тому що не взаємодіють із рецептором ALK5 1-го типу, які негативно модулюють передачу сигналів природними варіантами, конкуруючи із ними за зв'язування із високоафінними рецепторами ТβRII і ТβRIII. Даний винахід також стосується терапевтичних застосувань зазначених мутованих варіантів, використовуваних окремо або в комбінації із вакцинами або іншими терапевтичними засобами для лікування таких захворювань як рак, фіброз або хронічні інфекційні захворювання, на розвиток яких впливає TGFβ. 2 UA 115678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відмітною ознакою даного винаходу є створення нового терапевтичного методу модуляції передачі сигналів TGFβ і, отже, модуляції інвазивної і метастазуючої здатності різних пухлин і активності різних клітин імунної системи і з'єднувальної тканини у випадку захворювань, у яких функція TGFβ послаблює природну захисну імунну реакцію або захисну реакцію, викликану вакцинацією, або викликає надмірну репарацію і фіброз тканини. У жодному із вищевказаних методів інгібування не відзначене використання мутеїнів лігандів TGFβ як антагоністів передачі сигналів. Мутанти TGFβ, за даним винаходом, фактично є аутобілками і тому мають низьку імуногенність, яка мінімізує ризик виникнення реакції антитіл проти зазначених мутантів. Висока специфічність таких мутантів відносно системи рецепторів TGFβ зменшує непередбачену токсичність (яка звичайно має місце в методах на основі низькомолекулярних інгібіторів). Мутовані варіанти TGFβ зберігають здатність зв'язуватися із рецептором TβRII щонайменше подібно нативним лігандам TGFβ1 і TGFβ3 (6-10 рМ). Така спорідненість не може бути досягнута в інших методах інгібування рецепторів або лігандів за допомогою моноклональних антитіл або інших лікарських засобів. Дуже дивним відкриттям є те, що мутовані варіанти TGFβ зберігають здатність взаємодіяти із рецепторами TβRII і TβRIII, що надає їм перевагу порівняно із антитілами проти рецептора TβRII, тому що мутеїни блокують усі можливі сайти зв'язування природних лігандів із поверхнею клітини. Докладний опис винаходу Даний винахід стосується поліпептидів, які здійснюють антагоністичний вплив на активність, опосередковану рецептором ALK5 придатних лігандів TGFβ. Зазначені поліпептиди більше, ніж на 90 % гомологічні амінокислотній послідовності природних лігандів TGFβ. Поліпептиди, за даним винаходом мають, щонайменше одну мутацію в первинній послідовності у положенні одного із залишків, вибраних із групи, яка складається із Y6, W30, W32, I51, L51, Q67 і L101. У конкретному варіанті здійснення винаходу початковий амінокислотний залишок заміняють одним із амінокислотних залишків, вибраних із групи, яка включає: для положення 6: А; для положення 30: N, R, K, D, Q, L, S, P, V, I, G, C, T, A, E; для положення 32: А; для положення 51: Q, W, Y, A; для положення 67: H, F, Y, W і для положення 101: А, Е. Іншим об'єктом даного винаходу є поліпептиди, у яких мутації додані в області контакту із рецепторами TGFβRII і/або TGFβRIII для збільшення спорідненості до зазначених рецепторів. Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, застосовуваних при лікуванні раку, захворювань, супроводжуваних фіброзом, і хронічних інфекційних захворювань, які містять один поліпептид або суміш поліпептидів, за даним винаходом, і фармацевтично прийнятний наповнювач. Такі поліпептиди можуть бути ковалентно зв'язані із білком-носієм, який може бути альбуміном або Fc-ділянкою імуноглобулінів людини. В іншому варіанті здійснення даного винаходу поліпептиди можуть бути пегильовані. Крім того, даний винахід стосується застосування поліпептидів за даним винаходом для приготування фармацевтичної композиції, яка використовується при лікуванні раку, захворювань, супроводжуваних фіброзом, і хронічних інфекційних захворювань, а також для посилення клітинної і/або гуморальної реакції на вакцини, які замінюють нативний TGFβ, особливо в тому випадку, коли використовувана вакцина є терапевтичною вакциною, призначеною для лікування раку. Отримання мутантних поліпептидів TGFβ Даний винахід стосується поліпептидів, які складаються із 112 амінокислот. Зазначені поліпептиди характеризуються високою ідентичністю послідовності із різними нативними молекулами TGFβ, яка перевищує 90 %. Послідовності поліпептидів містять 1-6 мутацій порівняно із нативним TGFβ. Залишки, які замінюють початкові залишки, вибирають із можливістю досягнення фізико-хімічних властивостей, відмінних від початкової амінокислоти, при цьому неполярний залишок замінюють полярним залишком, заряджений залишок заміняють незарядженим залишком, великий залишок заміняють дрібним залишком і кислий залишком заміняють основним залишком. Зазначені поліпептиди, які можуть бути також названі мутеїнуми ТGFβ, були створені на основі тривимірної структури нативного TGFβ1, TGFβ2 і TGFβ3 у комплексі із рецепторами TβRII і ALK5 (і внесені в базу даних PDB). Мутації були зроблені тільки в положеннях TGFβ, які відповідають амінокислотам, значним ступенем піддані впливу розчинника, які утворюють частину ділянки зв'язування рецептора ALK5, але не ділянки зв'язування рецептора TβRII. На основі прогнозування за допомогою загальнодоступних програм для біоінформатики було 3 UA 115678 C2 5 встановлено, що зазначені залишки мають важливе значення для взаємодії із ALK5. У нижчеподаній таблиці наведені залишки, розташовані в ділянці зв'язування із ALK5, які за результатами прогнозування мають важливе значення для взаємодії, і можливі мутації, які впливають на зазначене зв'язування. На основі отриманих результатів була створена база даних усіх теоретично можливих мутеїнів і були вибрані мутанти, які мають найбільшу антагоністичну активність in vitro. Таблиця 1 Амінокислоти в послідовності TGFβ, які мають важливе значення для взаємодії із TβRI/ALK5, і мутації, які за результатами теоретичного прогнозування дестабілізують зазначене зв'язування Залишок TGFβ W30 W32 L101 I51 Q67 Y6 10 15 20 25 30 35 40 45 Еволюційно консервативний залишок Ідентично консервативний Ідентично консервативний Ідентично консервативний Ідентично консервативний Неконсервативний Неконсервативний Мутації N, R, K, D, Q, L, S, P, V, I, G, C, T, A, E A A, E Q, W, Y, A H, F, Y, W A Поліпептиди, за даним винаходом, можуть бути отримані різними методами, включаючи хімічний синтез білків. Зазначені поліпептиди можуть бути також отримані методами генетичної інженерії, наприклад, шляхом їх експресії у вигляді тілець включення в бактеріях, таких як E. coli, або в клітинах ссавців, таких як СНО і НЕК293, за допомогою будь-якого методу трансфекції, відомого в даній галузі. Мутації у визначених положеннях можуть бути також отримані методами сайтспрямованого мутагенезу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Вибір мутантних поліпептидів TGFβ на основі їх біологічної активності Поліпептиди, за даним винаходом, вибирають при виконанні експериментів in vitro і in vivo з урахуванням одночасної наявності нижченаведених властивостей. - Мутовані варіанти TGFβ, також обумовлені в даному описі винаходу як мутеїни, зберігають здатність зв'язуватися із рецептором TβRII. Зв'язувальна здатність може бути оцінена безпосередньо за допомогою комерційно доступного аналізу ELISA, що дозволяє знайти ланцюг рецептора TβRII, або опосередковано із використанням популяцій клітин, які містять даний рецептор. Ступінь пізнавання рецептора TβRII повиннен бути порівнянний із аналогічним показником нативного TGFβ. - Мутеїни блокують зв'язування лігандів TGFβ (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) із рецептором TβRII. Блокування можна виміряти за допомогою конкурентного аналізу ELISA, при виконанні якого планшети покривають (комерційно доступними) лігандами TGFβ і оцінюють здатність мутеїну інгібувати зв'язування TβRII із зазначеними лігандами. - Мутовані варіанти TGFβ втрачають або значно послаблюють здатність передавати сигнали через рецептор TβRI. Дану властивість можна оцінити за допомогою аналізів методом вестернблотингу, роблячи кількісне визначення рівнів фосфорилованого Smad2 і Smad3 у лізатах пухлинних клітин мишачої лінії 4Т1 і людської лінії MDA-MB231, оброблених мутеїнами або нативним TGFβ. Зазначені мутеїни повинні індукувати фосфориловані Smad2 і Smad3 щонайменше в 100 разів менше, ніж нативний TGFβ. Властивість індукування фосфорилування також можна оцінити in vitro за допомогою аналізів інгібування проліферації, індукованої IL-2 у лінії клітин CTLL-2. Зазначені мутанти повинні мати інгібуючу активність, яка щонайменше в 100 разів менша аналогічного показника нативного TGFβ. - Мутовані варіанти TGFβ здатні інгібувати передачу сигналів, індуковану кожним лігандом TGFβ (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3). Дана властивість може бути оцінена за допомогою аналізів методом вестерн-блотингу, які дозволяють кількісно визначити рівні фосфорилованого Smad2 і Smad3 у лізатах пухлинних клітин мишачої лінії 4Т1 і людської лінії MDA-MB231, оброблених мутеїнами або нативним TGFβ. При концентрації у діапазоні 50 нг/мл - 10 мкг/мл мутеїни повинні бути здатні щонайменше 100-кратно інгібувати передачу сигналів, індуковану комерційними лігандами. - Мутовані варіанти TGFβ роблять протипухлинну дію in vitro. Зазначені мутанти можуть інгібувати міграцію декількох ліній пухлинних клітин, оброблених або необроблених нативним лігандом. Прикладами таких ліній клітин є мишача лінія 4Т1 і людська лінія MDA-MB231. При 4 UA 115678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 виконанні аналізів міграції клітин зазначені мутеїни повинні бути здатні інгібувати міграцію пухлинних клітин на статистично значущому рівні. - Мутовані варіанти TGFβ втрачають або значно послаблюють здатність індукувати диференціювання ненавчених СD4+ Т-клітин у фенотипи Treg fохр3+ або ТН17 у присутності відповідно IL-23 або IL-6 і IL-23. Дана властивість може бути оцінена при виконанні аналізів індукції клітин Treg і Th17 in vitro. Зазначені мутанти повинні мати індукуючу здатність, яка щонайменше в 100 разів менша аналогічного показника нативного TGFβ. - Мутовані варіанти TGFβ мають здатність інгібувати диференціювання ненавчених CD4+ Тклітин у фенотипи Treg fохр3+ або ТН17, індуковану їх природними аналогами. Дана властивість може бути оцінена при виконанні аналізів індукції клітин Treg і Th17 in vitro. При концентрації у діапазоні 50 нг/мл - 10 мкг/мл мутеїни повинні бути здатні щонайменше 100кратно інгібувати передачу сигналів, індуковану комерційними лігандами. - Мутовані варіанти TGFβ здійснюють протипухлинну дію in vivo. Зазначені мутанти можуть інгібувати in vivo ріст пухлини і метастазуючу здатність декількох ліній пухлинних клітин у моделі трансплантованої пухлини. Дана властивість може бути оцінена в моделі початкової ортотопічної пухлини лінії пухлинних клітин молочної залози 4Т1 у мишей BALB/c і лінії пухлинних клітин людини MDA-MB231 у "голих" мишей. Зазначені мутеїни повинні викликати статистично значуще зменшення об'єму пухлини і кількості легеневих метастазів порівняно із контрольною групою, якій уводили PBS. - Мутовані варіанти TGFβ мають здатність підсилювати in vivo природну або індуковану вакцинацією протипухлинну імунну реакцію в моделі трансплантованої пухлини. Дана властивість може бути оцінена в моделі початкової ортотопічної пухлини лінії пухлинних клітин молочної залози 4Т1 і підшкірно введені лінії пухлинних клітин ободової кишки СТ26 у мишей BALB/c. Зазначені мутеїни повинні підвищувати цитолітичну активність і секрецію цитокінів природних клітин-кілерів і CD8+ Т-лімфоцитів. Такі мутеїни також повинні підсилювати активність дендритних клітин і CD4+ Т-клітин патерна ТН1 і значно зменшувати кількість регуляторних Т-клітин і мієлоїдних клітин-супресорів і їх пропухлинну активність. В обсяг даного винаходу входять додаткові модифікації мутеїнів TGFβ, із яких може бути продукований LAP із відсутністю зрілого домену при відсутності впливу на його секрецію. Таким чином, мутеїни можуть бути отримані в активній формі із можливістю взаємодії із TβRII, що дозволяє спростити процес отримання. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується додаткових модифікацій мутеїнів TGFβ, які збільшують їх час напівжиття. Зазначені модифікації включають пегильовані, гібридизацію будь-яких вищевказаних імуномодулюючих поліпептидів із білком-носієм, який поряд із іншими може бути альбуміном або Fc-ділянкою імуноглобулінів людини. Найбільш переважний варіант здійснення даного винаходу стосується мутованих варіантів TGFβ (специфічні мутації наведені в таблиці 2), гібридизованих із Fc-фрагментом IgG1 людини, то дозволяє отримати мутеїн, який має вищевказані властивості. Fc-ділянка, вибрана для зв'язування, містить ряд мутацій (ala234, ala235) у домені Сγ2, які перешкоджають його взаємодії із гамма-рецепторами для Fc-ділянки за винятком взаємодії із неонатальним Fcрецептором, пригнічуючи, таким чином, здатність індукувати ефекторні механізми імунної системи (Labrijn A. F. et al., Curr. Opin. Immunol. Aug. 20 (4): 479-85, 2008. Epub 2008 Jul 9). Зазначені мутеїни містять множину замін амінокислот, які суттєво послаблюють їх здатність передавати сигнали через рецептор ALK5. Однак зазначені мутеїни зберігають здатність зв'язуватися із TβRII і TβRIII і інгібувати активність нативного TGFβ. Таблиця 2 Створений мутант, який має мутацію, яка відповідає нумерації TGFβ людини Мутації W30E, L101E, I51Q W30E, L101A, L51Q W30E, L101E, I51Q, Q67H W30E, L101A, K97D, E12H, I51Q, Q67H 50 Стандартна назва G_M1 G_M2 G_M3 G_M4 Інший варіант здійснення даного винаходу також стосується додаткових модифікацій мутеїнів TGFβ, виконаних з метою підвищення спорідненості до TβRII і TβRIII без впливу або навіть поліпшення їх інгібуючої здатності або поліпшення їх фармакокінетики in vivo із збільшенням часу напівжиття. Такі додаткові мутації можуть бути отримані за допомогою 5 UA 115678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 програм для біоінформатики або молекулярних комбінаторних бібліотек різного типу (бібліотеки відображення на фазі, бібліотеки експресії генів у дріжджах або бактеріях). Терапевтичне застосування мутантних поліпептидів TGFβ Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, які включають як активний компонент мутеїни TGFβ і їх аналоги або гібридні білки за даним винаходом, а також до можливих терапевтичних застосувань зазначених композицій для модуляції інвазивної і метастазуючої здатності різних пухлин, активності імунної системи і клітин з'єднувальної тканини у випадку захворювань, при яких функції TGFβ послаблюють природну або індуковану вакцинацією захисну імунну реакцію або викликають надмірну репарацію і фіброз тканини. При терапевтичному застосуванні поліпептиди, за даним винаходом, можуть бути введені хворому суб'єкту окремо або в комбінації із іншими поліпетидами або іншими речовинами, які полегшують або підсилюють їх терапевтичну дію. Поліпептиди, за даним винаходом, можуть бути введені будь-яким способом, відомим у даній галузі, який призначений для парентерального введення лікарських засобів. Зазначені поліпептиди можуть бути переважно введені внутрішньовенно, внутрішньом'язово, підшкірно або внутрішньопухлинно. Поліпептиди або гібридні білки, за даним винаходом, можуть бути також введені в складі фармацевтичної композиції, призначеної для лікування раку, захворювань, супроводжуваних фіброзом, і хронічних інфекційних захворювань. Даний винахід переважно стосується композицій, у тому числі фармацевтичних композицій, які включають фармацевтично прийнятний наповнювач. Композиція, за даним винаходом, містить фармацевтично прийнятні носії. Фармацевтично прийнятні носії включають, не обмежуючись ними, фізіологічний розчин, стерильну воду, фізіологічний розчин із фосфатним буфером і тому подібні. Композиції, за даним винаходом, можуть включати інші буфери, диспергатори і інертні нетоксичні речовини, придатні для введення суб'єкту. Композиції можуть являти собою призначені для введення стерильні розчини, які не містять небажаних частинок. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується способів лікування, які включають введення терапевтично ефективної кількості поліпептидів, гібридних білків або композицій, за даним винаходом, суб'єктам, які страждають на рак, захворюваннями, які супроводжуються фіброзом, або хронічними інфекційними захворюваннями. У конкретному варіанті здійснення винаходу суб'єкт є людиною. Поліпептиди або гібридні білки, за даним винаходом, можуть бути також введені в поєднанні із традиційними методами лікування онкологічних захворювань (хіміотерапія і променева терапія) для посилення впливу таких методів лікування. Для досягнення необхідного терапевтичного ефекту поліпептиди, за даним винаходом, необхідно вводити в досить високих дозах для гарантії досягнення необхідної концентрації в лімфатичному вузлі або в периферичній ділянці, тобто в концентраціях, при яких мутеїн здійснює інгібуючий вплив на нативний TGFβ. Тому доза повинна бути визначена згідно із типом захворювання і способом введення. Наприклад, у випадку лікування пухлини доза повинна бути достатньою для досягнення концентрації мутанта усередині пухлини і/або лімфатичного вузла, необхідної для надання інгібуючої дії. Використовувані дози можуть змінюватися в межах 1,2520 мг/кг/дозу при введенні один раз на тиждень або на два тижні. Кількість введень також повинна бути визначена із урахуванням біорозподілу мутеїну. Вищевказані ефективні концентрації, як правило, повинні робити вплив протягом 2-30 днів. При зв'язуванні мутеїну із білком-носієм частота введення повинна бути визначена відповідним чином. При використанні сполуки або композиції, за даним винаходом, в комбінації із іншим протираковим засобом можуть бути застосовані, наприклад, схеми одночасного, попарного або почергового введення. Таким чином, сполуки, за даним винаходом, можуть бути введені одночасно в різних фармацевтичних композиціях, тобто сполука, за даним винаходом, може бути введена до або після введення іншого протиракового засобу, наприклад, із інтервалом у кілька секунд, хвилин, годин, днів або тижнів. Терапевтична дія може бути визначена як повна або часткова ремісія симптомів захворювання. У випадку раку терапевтичну дію визначають разом із іншими показниками по зменшенню об'єму пухлини або збільшенню часу між рецидивами. Новий терапевтичний метод має багато переваг порівняно із іншими методами модуляції передачі сигналів TGFβ. Наприклад. - Мутанти TGFβ фактично є аутобілками (за винятком декількох мутацій) і тому характеризуються низькою імуногенністю. Даний факт дозволяє звести до мінімуму ризик утворення антитіл проти зазначених мутантів. 6 UA 115678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - Висока специфічність зазначених мутантів стосовно системи рецепторів TGFβ зменшує імовірність несподіваної токсичності, яка звичайно виникає при використанні низькомолекулярних інгібіторів. - Мутовані варіанти TGFβ зберігають спорідненість зв'язування із рецептором TβRII щонайменше відповідного аналогічному показнику нативних лігандів TGFβ1 і TGFβ3 (6-10 пМ). Зазначену спорідненість складно усунути методами інгібування рецепторів або лігандів за допомогою моноклональних антитіл або інших лікарських засобів. - Мутовані варіанти TGFβ характеризуються меншим розміром порівняно із моноклональними антитілами і рецепторами, зв'язаними із Fc-ділянкою. Дана ознака гарантує краще проникнення в пухлину порівняно із іншими лікарськими засобами, інгібуючими передачу сигналів TGFβ, які були описані вище. - Мутовані варіанти TGFβ інгібують передачу сигналів будь-якого ліганду через систему рецепторів TβRII/TβRI (ALK5), які із теоретичної точки зору є перевагою порівняно із антитілами проти панлігандів, тому що зазначені антитіла спрямовано впливають тільки на відомі ізоформи TGFβ і не можуть інгібувати інші ізоформи у випадку їх наявності. - Мутовані варіанти TGFβ зберігають здатність взаємодіяти із рецептором TβRIII. Це є перевагою порівняно із антитілами проти рецепторів TβRII, тому що зазначені мутеїни блокують усі можливі сайти зв'язування природних лігандів TGFβ із поверхнею клітини. - Зв'язування із Fc-фрагментом збільшує час напівжиття мутеїнів, який дає їм перевагу порівняно із низькомолекулярними лікарськими засобами, тому що в даному випадку може бути зменшена доза і збільшений інтервал між введеннями. - Зв'язування із Fc-фрагментом IgG1 людини, який не взаємодіє із гамма-рецепторами для Fc-ділянки, за винятком неонатального Fc-рецептора, перешкоджає запуску імунних ефекторних механізмів на непухлинних клітинах хазяїна, що зменшує імовірність несподіваної токсичності порівняно із антитілами проти рецептора II, які зберігають повну здатність взаємодіяти із гамма-рецепторами для Fc-ділянки. Даний винахід далі ілюстровано нижченаведеними прикладами і кресленнями. Однак зазначені приклади не обмежують обсяг винаходу. Короткий опис креслень Фігура 1. Аналіз методом вестерн-блотингу мутеїну G_M1 і TGFβ. Білки дикого типу, гібридизовані із Fc-ділянкою. Аналіз SDS-PAGE зазначених білків виконували в невідновлювальних і відновлювальних умовах і забарвлювання робили із використанням антитіла проти TGFβ людини. На першу смугу наносили низькомолекулярний стандартний білок, на другу смугу наносили мутеїн GM_1_Fc, на третю смугу наносили TGFβ1 дикого типу_Fc і на четверту смугу наносили стороннє антитіло hR3. Фігура 2. Аналіз ELISA, виконаний для оцінки дізнавання рецептора TβRII мутеїном G_M1_Fc. Як негативний контрольний зразок було використано стороннє антитіло hR3. Мутеїн G_M1 зберігає здатність зв'язуватися із рецептором TβRII, подібну аналогічному показнику нативного TGFβ1. Фігура 3. Аналіз, виконаний для оцінки інгібування IL2-залежної проліферації лінії клітин CTLL-2, індукованого мутантним або нативним TGFβ. На даній фігурі показано, що здатність мутеїну G_M1 інгібувати проліферацію лінії клітин CTLL-2 набагато нижче, ніж у нативного TGFβ1 людини. Дані представлені у вигляді середнього процентного значення інгібування, отриманого в результаті виконання трьох незалежних експериментів. Фігура 4. Аналіз, виконаний для оцінки здатності мутеїну G_M1 нейтралізувати інгібування IL2-залежної проліферації лінії клітин CTLL-2, викликане нативним TGFβ1. На даній фігурі показано середнє процентне значення проліферації клітин, отримане в результаті виконання трьох незалежних експериментів. Фігура 5. Мутеїн G_M1 інгібує in vitro міграцію мишачої лінії пухлинних клітин 4Т1. Знімки загоєння ран, зроблені в різні періоди часу, зазначені на даній фігурі, показують, що при обробці клітин мутеїном швидкість загоєння ран значно нижча в усі періоди часу. Фігура 6. Мутеїн G_M1 інгібує диференціювання/перетворення ненавчених CD4+CD25-GITRТ-клітин у регуляторні Foxp3+CD4+ Т-клітини, індуковане нативним TGFβ. Процентне значення регуляторних Т-клітин, виділених із культур Т-клітин, зменшилося майже до нуля при інкубації ненавчених Т-клітин із 500нг/мл мутеїну. Зазначена концентрація тільки в 30 разів вище концентрації рекомбінантного TGFβ1 людини, використаного для початкової індукції перетворення. Приклади Приклад 1. Створення мутеїнів TGFβ 7 UA 115678 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Мутанти TGFβ були створені за допомогою комп'ютера при використанні методів біоінформатики. Як вихідний матеріал були використані описані в науковій літературі структури трійкового комплексу TGFβ1 і TGFβ3 із рецептором TGFβ. Енергію зв'язування нативних ізоформ і всіх можливих мутованих варіантів визначали за допомогою загальнодоступних програм для біоінформатики. Мутеїн G_M1 був експресований у клітинах СНО-К1 при використанні генетичної конструкції на основі лентивірусного вектора PLW, який включав Скінцеву шарнірну ділянку, домени Сγ2 і Сγ3 IgG людини і кінцевий сегмент гістидину. G_M1 очищували за допомогою афінної хроматографії із використанням протеїну А. Отриманий мутеїн характеризувався (фігура 1) високим ступенем чистоти (>95 %). Приклад 2. Оцінка зв'язування мутеїну G_M1 із TβRII, виконана методом ELISA При виконанні аналізу методом ELISA зразок покривали TβRII (1 мкг/мл) і робили виявлення за допомогою антитіла проти Fc-ділянки людини, зв'язаної із лужною фосфатазою. Як негативний контрольний зразок було використано стороннє антитіло hR3. На фігурі 2 показано, що мутеїн G_M1 зберігає здатність зв'язуватися із рецептором TβRII, яка подібна аналогічному показнику нативного TGFβ1. Приклад 3. Мутеїн G_M1 має знижену здатність передачі сигналів через рецептор TβRI (ALK5) і тому імітує біологічну активність нативного TGFβ Було зроблене порівняння інгібування IL2-залежної проліферації лінії клітин CTLL-2, викликуване мутантом або нативним TGFβ. 5000 клітин CTLL/ямку стимулювали rIL-2 (50 од/мл) і культивували в присутності зазначених концентрацій TGFβ1 дикого типу або мутеїну G_M1 протягом 48 годин. Потім у культуру додавали аламаровий синій реагент і вимірювали його відновлення при довжині хвилі 540 і 630 нМ. Мутеїн G_M1 був не здатний інгібувати проліферацію лінії клітин CTLL-2 при концентрації, яка у 200 разів перевершувала концентрацію комерційного TGFβ1, використаного як позитивний контрольний зразок в даному експерименті (фігура 3). Було показано, що мутеїн G_M1 має набагато нижчу здатністю інгібувати проліферацію лінії клітин CTLL-2 порівняно із комерційним TGFβ1. Приклад 4. Мутеїн G_M1 є антагоністом передачі сигналів TGFβ in vitro 5000 клітин CTLL-2/ямку стимулювали rIL-2 (50 од/мл) і культивували у присутності 2 пМ TGFβ дикого типу при зазначених концентраціях G_M1, моноклонального антитіла контрольного ізотипу hR3 антитіла або проти TGFβ1 як позитивний контрольний зразок. Через 48 годин у культуру додавали аламаровий синій реагент і вимірювали його відновлення при довжині хвилі 540 і 630 нм. Мутеїн G_M1 на відміну від моноклонального антитіла контрольного ізотипу hR3 нейтралізує інгібування IL2-залежної проліферації лінії клітин CTLL-2, яке викликається нативним TGFβ1 (фігура 4). Нейтралізуюча дія, яка викликається зазначеним мутеїном, аналогічно дії антитіла проти TGFβ1, використаного як позитивний контрольний зразок в даному експерименті. Приклад 5. Мутеїн G_M1 здійснює протипухлинну дію in vitro Здатність мутеїну G_M1 інгібувати міграцію мишачої лінії пухлинних клітин 4Т1 оцінювали при виконанні дослідження із загоєння ран in vitro (C. C. Liang et al., Nat. Protoc. Two (2): 329-33, 2007). Конфлюентні клітини ранили, дряпаючи моношар клітин кінцем стерильної піпетки. У ямку додавали мутеїн G_M1 або TGFβ1 дикого типу (як негативний контрольний зразок). На фігурі 5 показано, що швидкість затягування рани є значно нижче (р