Поліпептид анти-egfrviii scfvs з поліпшеною цитотоксичністю та виходом, молекула нуклеїнової кислоти, що кодує вказаний поліпептид, та спосіб руйнування клітини з використанням цього поліпептиду

1. Поліпептид, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (VН) антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL) антитіла, кожен з яких має три ділянки, що визначають комплементарність (CDR), які пронумеровані відповідно від CDR1 до CDR3, починаючи з амінокінця, поліпептид, перетворений в імунотоксин з 38 kD фрагментом екзотоксину А Pseudomonas, у якому був вилучений домен І ("РЕ38"), утворює імунотоксин, який проявляє цитотоксичність по відношенню до клітин, які мають антиген типу рецептора до епідермального фактора росту типу III (EGFR vІІІ), яка як мінімум дорівнює цитотоксичності вихідного антитіла MR1 в порівнянні з імунотоксином РЕ38, та має вищий вихід, коли експресується злитий білок з РЕ38, ніж вихід MR1, перетвореного в імунотоксин із РЕ38, та де CDR 1-3 ділянки VH ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності CDR 1-3 антитіла MR1 відповідно та CDR 1-3 ділянки VL ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності CDR 1-3 ділянок VL ланцюга антитіла MR1 відповідно за винятком: (а) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Pro, Trp для Ser у положенні 98 CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла MR1, та (б) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Tyr, Asn, Trp, Ile, Phe та Val для Thr у по UA (21) 2002086976 (22) 23.02.2001 (24) 15.11.2006 (86) PCT/US01/05923, 23.02.2001 (31) 60/185,039 (32) 25.02.2000 (33) US (46) 15.11.2006, Бюл. №11, 2006р. (72) Пастан Іра, US, Бірс Річард, US, Чодхурі Партха С., IN, Бігнер Дарелл, US (73) ЗЕ ГАВЕРНМЕНТ ОФ ЗЕ ЮНАЙТЕД СТЕЙТС, ЕЗ РЕПРЕЗЕНТІД БАЙ ЗЕ СЕКРЕТАРІ ОФ ЗЕ ДЕПАРТМЕНТ ОФ ХЕЛС ЕНД Х'ЮМАН СЕРВІСИС, US, ДЬЮК ЮНІВЕРСІТІ, US (56) C.KUAN ET AL. "EGFRvIII as a promising target for antibody-based brain tumor therapy", BRAIN TUMOR PATHOLOGY, vol.17, no.2, 2000, pages 7178. I.LORIMER ET AL. "Directed evolution of higher affinity single chain Fv antibodies specific for the mutant EGF receptor EGFRvIII", PROCEEDINGS OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR THE CANCER RESEARCH, vol. 39, March 1998, page 65. P.CHOWDHURY ET AL. "Improving antibody affinity by mimicking somatic hypermutation in vitro", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol.7, June 1999, pages 568-572. G. ARCHER ET AL. "MR1scFvPE38DEL (MR1), a sIngle chain immunotoxin for the treatment of tumors expressing EGFRvIII, a deletion mutation of the EGFR", PROCEEDINGS OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR THE CANCER RESEARCH, vol.39, March 1998, pages 438-439. I.LORIMER ET AL. "Immunotoxins that target an oncogenic mutant epidermal growth factor receptor expressed in human tumors", CLINICAL CANCER 2 (19) 1 3 ложенні 99 CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла MR1. 2. Поліпептид за пунктом 1, що включає заміну у CDR3 варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла для CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла MR1 Trp на Phe у положенні 92. 3. Поліпептид за пунктом 1, що включає заміну у CDR1 або CDR2 варіабельної ділянки легкого ланцюга. 4. Поліпептид за пунктом 1, що включає заміну у CDR1 або CDR2 варіабельної ділянки важкого ланцюга. 5. Поліпептид за пунктом 1, в якому вказаний поліпептид є scFv. 6. Поліпептид за пунктом 1, в якому вказаний поліпептид є dsFv, Fab або F(ab')2. 7. Поліпептид за пунктом 1, в якому замінами у важкому ланцюгу є S98P-T99Y та заміною у легкому ланцюгу є F92W (антитіло MR1-1). 8. Поліпептид за пунктом 1, який додатково включає ефекторну молекулу, терапевтичний залишок або мітку, яку визначають. 9. Поліпептид за пунктом 8, в якому терапевтичний залишок є токсичним залишком. 10. Поліпептид за пунктом 9, в якому токсичний залишок є екзотоксином A Pseudomonas або його цитотоксичним фрагментом. 11. Поліпептид за пунктом 9, в якому токсичний залишок є цитотоксичним фрагментом, який є РЕ38. 12. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид має ІС50 7нг/мл або нижче. 13. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид має ІС50 5нг/мл або нижче. 14. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид має IC50 3,5нг/мл або нижче. 15. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид має принаймні одну амінокислотну заміну у VН, де вказана заміна вибрана з групи, яка складається з: P98-S99, W98-V99, S98-W99 та Р98-Т99. 16. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид експресує злитий білок з 38 kD фрагментом екзотоксину A Pseudomonas, в якому був видалений домен І, та має вихід принаймні 3%. 17. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид експресує злитий білок з 38 kD фрагментом екзотоксину A Pseudomonas, в якому був видалений домен І, та має вихід принаймні 7%. 18. Поліпептид за пунктом 9, в якому вказаний токсичний залишок вибраний з групи, яка складається з дифтерійного токсину або його цитотоксичного фрагмента, сапорину або його цитотоксичного фрагмента, антивірусного токсину фітолакти американської або його цитотоксичного фрагмента, рицину або його цитотоксичного фрагмента та бріодину або його цитотоксичного фрагмента. 19. Поліпептид за пунктом 10, в якому замінами у важкому ланцюгу є S98P-T99Y, у легкому ланцюгу F92W (антитіло MR1-1). 20. Поліпептид за пунктом 1, який є злитим з геном 3 білка М13 бактеріофага. 21. Молекула нуклеїнової кислоти, яка включає нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, щовключає варіабельну ділянку важкого ланцюга 77157 4 (VН) антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL) антитіла, кожен з яких має три ділянки, що визначають комплементарність (CDR), які пронумеровані відповідно від CDR1 до CDR3, починаючи з амінокінця, поліпептид, перетворений в імунотоксин з 38 kD фрагментом екзотоксину А Pseudomonas, у якому був вилучений домен І ("РЕ38"), утворює імунотоксин, який проявляє цитотоксичність по відношенню до клітин, які мають антиген типу рецептора до епідермального фактора росту типу III (EGFR VIII), яка як мінімум дорівнює цитотоксичності вихідного антитіла MR1 в порівнянні з імунотоксином РЕ38, та має вищий вихід, коли експресується злитий білок з РЕ38, ніж вихід MR1, перетвореного в імунотоксин із РЕ38, та де CDR 1-3 ділянки VН ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності CDR 1-3 антитіла MR1 відповідно та CDR 1-3 ділянки VL ланцюга поліпептидна мають амінокислотні послідовності CDR 1-3 ділянок VL ланцюга антитіла MR1 відповідно за винятком: (а) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Pro, Trp для Ser у положенні 98 CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла MR1, та (б) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Туг, Asn, Trp, Ile, Phe та Val для Thr у положенні 99 CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла MR1. 22. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 21, що включає заміну як мінімум однієї амінокислоти у CDR1 або CDR2 вказаного варіабельного регіону важкого ланцюга, амінокислота кодується кодоном, який включає нуклеотид, що знаходиться у ділянці гарячої точки, вибраний з AGY або RGYW, де R є А або G, Y є С або Т та W є А або Т. 23. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 21, в якій поліпептид має заміну F92 CDR3 ділянки VL ланцюга. 24. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 23, в якій заміни у VН ланцюгу вибрані з S98P-T99Y, S98P-T99W, S98P-T99I, S98P-T99V. 25. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 23, в якій замінами у важкому ланцюгу є S98P-T99Y та заміною у легкому ланцюгу є F92W (антитіло MR11). 26. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 21, оперативно зв'язана з промотором. 27. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 22, оперативно зв'язана з промотором. 28. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 23, оперативно зв'язана з промотором. 29. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 24, оперативно зв'язана з промотором. 30. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 25, оперативно зв'язана з промотором. 31. Спосіб руйнування клітини, яка має антиген EGFR vІІІ, який передбачає контакт клітини з імунотоксином, що включає токсичний залишок та націлювальний залишок, при цьому націлювальний залишок включає поліпептид, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (VН) антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL) антитіла, кожен з яких має три ділянки, що визначають комплeментарність (CDR), які пронумеровані відпові 5 77157 6 дно від CDR1 до CDR3, починаючи з амінокінця, поліпептид, перетворений в імунотоксин з 38 kD фрагментом екзотоксину A Pseudomonas, у якому був вилучений домен І ("РЕ38"), утворює імунотоксин, який проявляє цитотоксичність по відношенню до клітин, які мають антиген типу рецептора до епідермального факторa росту типy III (EGFR vІІІ), яка як мінімум дорівнює цитотоксичності вихідного антитіла MR1 в порівнянні з імунотоксином РЕ38, та має вищий вихід, коли експресується злитий білок з РЕ38, ніж вихід MR1, перетвореного в імунотоксин із РЕ38, та де CDR 1-3 ділянки VH ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності CDR 1-3 антитіла MR1 відповідно та CDR 1-3 ділянки VL ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності CDR 1-3 ділянок VL ланцюга антитіла MR1 відповідно за винятком: (а) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Pro, Trp для Ser у положенні 98 CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла MR1, та (б) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Tyr, Asn, Trp, Ile, Phe та Val для Thr у положенні 99 CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла MR1. 32. Спосіб за пунктом 31, в якому вказаний поліпептид має заміну як мінімум однієї амінокислоти у CDR1 або CDR2 вказаного варіабельного регіону важкого ланцюга, амінокислота кодується кодоном, який включає нуклеотид, що знаходиться у ділянці гарячої точки, вибраний з AGY або RGYW, де R є А або G, Y є С або Т та W є А або Т. 33. Спосіб за пунктом 31, в якому CDR3 варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла включає амінокислотну заміну, вибрану з групи, яка складається з: P98-Y99, Р98-N99, P98-W99, Р98-І99, P98-F99, P98-V99. 34. Спосіб за пунктом 31, в якому CDR3 варіабельної ділянки легкого ланцюга містить фенілаланін, заміщений на триптофан у положенні 92. 35. Спосіб за пунктом 31, в якому націлювальний залишок є MR1-1. 36. Спосіб за пунктом 31, в якому клітина є злоякісною клітиною.37. Спосіб за пунктом 31, в якому злоякісна клітина є клітиною гліоми. 38. Спосіб за пунктом 31, в якому злоякісна клітина є клітиною карциноми молочної залози. 39. Спосіб за пунктом 31, в якому злоякісна клітина є клітиною карциноми легень. 40. Спосіб за пунктом 31, в якому злоякісна клітина є клітиною карциноми яєчника. Мутантна форма рецептора епідермального фактора росту, позначеного як “EGFRvlll", експресується на високому рівні у 50-60% гліобластом та, як було показано, присутня у 70-80% карцином молочної залози та яєчника, а також у приблизно у 16% недрібноклітинних карцином легень [Wikstrand et al. // Cancer Res. – 1995/ - 55/ - P. 3140-3148; Moscatello et al. // Cancer Res. – 1995. 55. – P.5536-5539]. Мутація складається з делеції у рамці екзонів 2-7 поблизу амінотермінального кінця екстрацелюлярного домену, що приводить до експресії мРНК EGFR з делецією 801 основи. Мутантний білок містить новий гліциновий кодон у місці сплайсингового злиття [Moscatello et al. // Cancer Res. –1995. – 55. – P.5536-5539]. Мутантний рецептор експресується на поверхні клітин та створює новий специфічний для пухлин епітоп (послідовність) на поверхні клітин при делеційному злитті. Рецептор має конститутивну тирозинкіназну активність, що посилює онкогенність гліобластоми in vivo [Nishikawa et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. – 91. P.7727-7731]. Завдяки наявності пухлиноспецифічної екстрацелюлярної послідовності, мутантний рецептор представляє собою привабливу потенційну мішень для терапії пухлин, зокрема, шляхом використання імунотоксинів. Імунотоксини одержують при злитті націлювального залишку, такого, як антитіло або частина антитіла, з білковим токсином таким, як екзотоксин Pseudomonas. Як було продемонстровано, імунотоксини мають активність проти солідних пухлин у людини, що було показано при клінічному дослідженні фази І, в якому імунотоксин, одержаний при використанні антитіла, специфічного для Yасоційованого антигену Левіса, надекспресувався у багатьох пухлинах, демонструючи регресію пухлини [Pai et al. // Nat Med. – 1996. – 2. – P.350-353]. Імунотоксини, такі, як один з описаних у дослідженні Раі, що були створені на основі мишиного моноклонального антитіла, проте, мали певні недоліки. Вони є відносно великими, що обмежує їх проникнення у пухлину. Крім того, часто існує гетерогенність зв'язку антитіла та токсину, і важко одержувати кон'югати у великій кількості. Подібно до цього, різноманітні антитіла проти EGFRvlll, що відомі у даній галузі, мають обмеження для конструювання імунотоксинів [US, 5,212,290; WO, 96/16988; Reist et al. // Cancer Res. – 1995. – 55. – P.4375-4382]. Спроби подолати ці проблеми шляхом створення повністю рекомбінантних імунотоксинів, в яких клонований Fv використовували для націлювання, були затруднені, оскільки більшість варіабельних доменів антитіла слабо функціонує як Fv або оскільки існує нестабільність завдяки ослабленню асоціації VH-VL або з причини слабкої зв'язувальної активності. MR1 є одноланцюговим варіабельним доменом антитіла (scFv), що специфічно зв'язується з EGFRvlll. MR1 scFV було ізольовано з бібліотеки фагового виявлення антитіл [Lorimer et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. – 93/ - P.14815-14820]. Бібліотеку scFv, що містить MR1, готували з мРНК селезінки миші, яку було імунізовано за допомогою EGFRvlll специфічного пептиду плюс екстрацелюлярний домен EGFRvlll, очищений шляхом афінної хроматографії з пухлинних ксенотрансплантантів, 7 що експресують EGFRvlll [Lorimer et al. // Clin. Cancer Res. – 1995. – 1. – P.859-864]. MR1 удосконалювали як перспективний препарат для одержання терапевтичного агента, який буде специфічно націлений на EGFRvlll-позитивні пухлинні клітини. Послідовність MR1 було депоновано у GenBank під депозитним номером U76382. Імунотоксин MR1(Fv)-PE38 було сконструйовано шляхом злиття MR1 scFv з вкороченою формою екзотоксину A Pseudomonas, PE38, в якому увесь домен Іа та амінокислоти 365-380 домену Іb було делетовано [Lorimer et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – 93. – P.14815-14820]. Декілька інших рекомбінантних імунотоксинів РЕ38 зараз піддають клінічним дослідженням [Kreitman et al. // Blood. – 1999. - 94(10). – P.3340-3348; Pai-Scherf et al. // Clin. Cancer Res. (готується до друку) (1999); Pai et al. // Clin. Application Immunotoxins. – 1998. – 234. P.83-96]. Взагалі, гени scFv поєднують з геном РЕ38 за допомогою короткого лінкеру та клонують в експресійний вектор, що базується на Т7. Рекомбінантні імунотоксини експресували в E.coli, де вони акумулювались у тільцях включення. Після інтенсивного промивання тілець включення їх розчиняли у гуанідин гідрохлориді, а білок піддавали ренатурації та очищали за допомогою іоннообмінної хроматографії та гель-фільтрації. Одержані молекули є активними та спрямовані на специфічний клітинний антиген за допомогою scFv. Загибель клітин було спричинено активністю токсину. Для того,щоб бути корисними як терапевтичні агенти, імунотоксини повинні мати високу афінність для антигену, що приводить до високої цитотоксичності по відношенню до клітин, що експресують антиген. Для полегшення обробки та заощадження коштів також бажано, якщо імунотоксин має можливість вироблятись з високим виходом. MR1(scFv)-PE38 володіє найвищою афінністю, представляє собою найбільш цитотоксичний імунотоксин, спрямований проти клітин, що експресують EGFRvlll, але він далекий від ідеалу. Він має Kd 8нМ та вихід менше, ніж 3%. Таким чином, було б бажаним розвивати антитіла, які зв'язуються з EGFRvlll з більшою афінністю, та які, коли зливаються з РЕ38 або іншими токсинами, утворюють імунотоксини з високою цитотоксичністю по відношенню до клітин, що експресують EGFRvlll. Крім того, було б корисним одержати антитіла, які утворюють імунотоксини з високим виходом. Деякі спроби вирішити ці проблеми шляхом розвитку додаткових scFv з моноклональних антиEGFRvlll антитіл не були успішним. MR1 залишається єдиним scFv, доступним у даній галузі для націлювання анти-EGFRvlll імунотоксинів. В одному аспекті винахід забезпечує антитіла з поліпшеним зв'язуванням для мутантної форми рецептора епідермального фактора росту, що відомий як EGFRvlll. Зокрема винахід забезпечує поліпептиди з мутованими варіабельними ділянками важких ланцюгів (VH) антитіла або з мутованою ділянкою легких ланцюгів (VL), такий поліпептид має Kd для EGFRvlll 7нМ, 6нМ, 5нМ, 4нМ, 3.5нМ, 3нМ або нижче, мутовані VH або VL мають послідовності, які відрізняються від таких (VH або 77157 8 VL) MR1 вихідного антитіла, відповідно, амінокислотними замінами, принаймні, однієї амінокислоти у ділянці, що визначає комплементарність (CDR), при цьому амінокислота кодується кодоном, який включає нуклеотид, що належить до ділянки гарячої точки, вибраний з AGY або RGYW, де R є А або G, Υ є С або Т, та W є А або Т. У деяких втіленнях заміна може відбуватись у VH CDR3 або VL CDR3. В інших втіленнях заміни можуть відбуватись у VH CDR1 або VH CDR2 або обох, або у VL CDR1 або VL CDR2, або обох, або у будь-якій комбінації VH та VL CDR1, 2, та 3. Наприклад, в одному втіленні заміни можуть виникати у VL CDR3, VL CDR2 та VH CDR1. У бажаному втіленні поліпептид має заміну у VH CDR3, принаймні, однієї амінокислоти, вибраної з групи, яка складається з S98 та Т99. В інших бажаних втіленнях заміни вибрані з P98-Y99, P98N99, P98-W99, Р98-І99, P98-F99 та P98-V99. Поліпептид також може мати заміну у VL CDR3, де W заміщує F у положенні 92. В особливо бажаному втіленні поліпептид має заміни у важкому ланцюгу S98P-T99Y та у легкому ланцюгу, що включає заміну F92W (що визначає антитіло, позначене "MR1-1"). Поліпептид, описаний вище, може бути одноланцюговою варіабельною ділянкою антитіла ("scFv"), дисульфідно стабілізованим Fv, Fab, F(ab')2 або іншим фрагментом антитіла, який, зберігає здатність впізнавати антиген та зв'язуватись з ним. Вони можуть також включати поверхневий білок бактеріофага. У бажаних втіленнях поліпептиди, описані вище, мають Kd для EGFRvlll, принаймні, на 1нМ нижче, ніж таке для MR1. Поліпептиди можуть мати Kd 7, 6, 5, 4, 3,5, 3 або нижче. Поліпептиди, описані вище, можуть також бути злиті, приєднані або іншим чином зв'язані з молекулою ефектора, терапевтичним залишком, або міткою, що детектується. Терапевтичним залишком може бути токсин або цитотоксична частина токсину (“токсичний залишок"), який перебуває у зв'язку з поліпептидними формами імунотоксину. Токсичний залишок може бути дифтерійним токсином або цитотоксичним фрагментом останнього, сапорином, противірусним білком фітолакки американської, рицином або цитотоксичним фрагментом останнього, та бріодином 1. У бажаних втіленнях токсин є екзотоксином Pseudomonas ("ΡΕ") або цитотоксичним фрагментом РЕ. В особливо бажаних втіленнях РЕ представляє собою РЕ38. Імунотоксини, що утворюються комбінацією поліпептиду та токсичного залишку, можуть мати ІС50 7нг/мл або нижче, 6нг/мл або нижче, 5нг/мл або нижче, 4нг/мл або нижче, близько 3,5нг/мл або нижче. Імунотоксин може мати вихід при рекомбінантній експресії, принаймні, 3%, та може бути 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% або вище. Винахід також забезпечує молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з мутованими ділянками варіабельного важкого ланцюга (VH) або мутованою ділянкою легкого ланцюга (VL), або обох, кожний поліпептид має Kd для EGFRvlll 7 або нижче, мутовані VH або VL, мають послідовність, яка відрізняється від VH або VL вихідного 9 антитіла MR1, відповідно, амінокислотною заміною, принаймні, однієї амінокислоти у ділянці, що визначає комплементарність (CDR), при цьому амінокислоти кодується кодоном, який включає нуклеотид, що належить до ділянки гарячої точки, вибраний з AGY або RGYW, де R є А або G, Υ є С або Т, a W є А або Т. У деяких втіленнях заміна може відбуватись у VH CDR3 або VL CDR3. В інших втіленнях заміни можуть відбуватись у VH CDR1 або VH CDR2, або обох, або в VL CDR1 або VL CDR2, або обох, або у будь-якій комбінації VH та VL CDR1, 2 та 3. Наприклад, в одному втіленні заміни можуть відбуватись y VL CDR3 та VH CDR1. У бажаному втіленні молекула нуклеїнової кислоти кодує поліпептид, що має заміни у VH CDR3 у порівнянні з MR1 принаймні однієї амінокислоти, вибраної з групи, яка складається з S98 та Т99. В інших бажаних втіленнях заміни вибрані з P98Y99, Р98-N99, P98-W99, Р98-І99, P98-F99 та P98V99. Молекула нуклеїнової кислоти може також кодувати поліпептид, що має заміну у VL CDR3 порівняно з MR1, та включає F, заміщене на W, у положенні 92. Молекули нуклеїнової кислоти можуть кодувати поліпептиди, які є одноланцюговими варіабельними ділянками антитіла ("scFv"), дисульфідно стабілізованими Fv, Fab, F(ab')2, або іншими фрагментами антитіла, що зберігає здатність до впізнання та зв'язування антигену. Поліпептиди можуть також включати поверхневий білок бактеріофага. Молекули нуклеїнової кислоти, описані вище, можуть бути оперативно зв'язані з промотором. В іншому наборі втілень винахід забезпечує способи знищення клітини, що несе антиген, включаючи контакт клітини з імунотоксином, що містить токсичний залишок та залишок для націлювання, який включає поліпептид з мутованими варіабельними ділянками важкого ланцюга антитіла (VH) або мутованою ділянкою легкого ланцюга (VL), або обох, при цьому ці поліпептиди мають Kd для EGFRvlll 7нМ або нижче, мутовані VH та VL мають послідовності, які відрізняються від таких для VH та VL вихідного антитіла MR1, відповідно, амінокислотною заміною, принаймні, однієї амінокислоти у ділянці, що визначає комплементарність (CDR), при цьому амінокислота кодується кодоном, що включає нуклеотид, який належить до ділянки гарячої точки, вибраний з групи, що включає AGY або RGYW, де R є А або G, Υ є С або Т, a W є А або Т. У деяких втіленнях заміни можуть відбуватись в VH CDR1 або VH CDR2, або обох, або в VL CDR1 або VL CDR2, або обох, або у будьякій комбінації VH та VL CDR1, 2, 3. У бажаному втіленні спосіб передбачає націлювання залишку, що включає поліпептид, який має заміну у VH CDR3, принаймні, однієї амінокислоти, вибраної з групи, яка складається з S98 та Т99. В інших бажаних втіленнях націлювальний залишок включає поліпептид, що містить заміни, вибрані з P98-Y99, P98-N99, P98-W99, Р98-І99, P98-F99 та P98-V99. В особливо бажаному втіленні націлювальний залишок є MR1-1. Націлювальний залишок може бути одноланцюговою варіабельною ділянкою антитіла ("scFv"), 77157 10 дисульфідно стабілізованим Fv, Fab, F(ab')2 або іншим фрагментом антитіла, який зберігає здатність до впізнання антигену та зв'язування з ним. Клітина, що несе антиген, може бути пухлинною клітиною, такою, як клітина гліоми, клітина карциноми молочної залози, клітина карциноми легень, або клітина карциноми яєчника. Короткий опис малюнків Фіг.1. Стратегія для ПЛР конструювання мутантних бібліотек: A. pCANTAB5E-MR1 може застосуватись як матриця для ампліфікації при використанні розміщеного вище праймера S1 та розміщеного нижче праймера CDR3H Ь, d або f, що містять вироджені ділянки (NNS) у націлювальних зонах. В. pCANTAB5E-MR1 застосовували як матрицю для ампліфікації, використовуючи продукти реакції етапу А як розміщені вище праймери та нижче розміщений праймер AMBN. С. Продукти реакції В перетравлювали та клонували у pCANTAB5E. Фіг.2. ВІАсоге сенсограмма MR1, MR1-1 та MR1 з S98P-T99Y мутаціями у VH CDR3. Фіг.3. Виживання атимічних пацюків з інтракраніальними пухлинами людських клітин гліобластоми, трансфікованих EGFRvlll, обробленим MR11-націленим імунотоксином. Вісь Y показує процент тварин, що вижили у даній точці часу. Вісь Х показує час виживання у днях. Напис MR1-1 означає MR1-1-PE38 імунотоксин. Заштриховані ромби - тварини, яким вводили 6мкг MR1-1-PE38 імунотоксину протягом 7-денного періоду шляхом 24годинної інфузії. Незаштриховані трикутники - тварини, яким вводили 2мкг MR1-1-PE38 імунотоксину протягом того самого періоду часу. Незаштриховані кола - тварини, яким вводили фізіологічний розчин у той самий період часу. Фіг.4. Виживання атимічних пацюків з інтракраніальними пухлинами людських клітин гліобластоми, трансфікованих EGFRvlll, обробленим MR11-націленим імунотоксином або контрольним фізіологічним розчином. Вісь Y показує процент тварин, що вижили у даній точці часу. Вісь Х показує час виживання у днях. Напис MR1-1 означає MR11-PE38 імунотоксин. Незаштриховані ромби - тварини, яким вводили 0,2мкг MR1-1-РЕ38 імунотоксину (у 200мкл PBS) протягом 7-денного періоду шляхом 24-годинної інфузії. Незаштриховані трикутники - тварини, яким вводили 0,6мкг MR1-1PE38 імунотоксину протягом того самого періоду часу. Незаштриховані кола - тварини, яким вводили 2,0мкг MR1-1-PE38 імунотоксину тим самим чином. "X" - тварини, яким вводили контрольний фізіологічний розчин тим самим чином. Фіг.5. Виживання атимічних пацюків з неопластичними менінгітами з одержаних за допомогою інтратекальної ін'єкції людських клітин гліобластоми, трансфікованих EGFRvlll, обробленим MR1-1націленим імунотоксином або фізіологічним розчином як контролем. Вісь Y показує процент тварин, що вижили у даній точці часу. Вісь X показує час виживання у днях. Напис MR1-1 означає MR11-PE38 імунотоксин. Трикутники - тварини, яким вводили 2мкг MR1-1-PE38 імунотоксину у 40мкл PBS з 0,2% гемаглютиніну на 3, 5 та 7 дні після пухлинної ініціації, при загальній дозі 6мкг. Ромби 11 тварини, яким вводили 1мкг MR1-1-PE38 імунотоксину у 40мкл PBS з 0,2% гемаглютиніну на 3, 5 та 7 дні після пухлинної ініціації при загальній дозі 3мкг імунотоксину. Кола - тварини, яким вводили 40мкл PBS з 0,2% гемаглютиніну на 3, 5 та 7 дні після пухлинної ініціації, як контрольні. Фіг.6. Об'єми пухлин протягом періоду часу у атимічних мишей, яких піддавали ін'єкції у правий бік людськими клітинами гліобластоми, трансфікованими EGFRvlll, та обробці MR1-1-націленим імунотоксином або фізіологічним розчином як контролем. Вісь Y показує об'єм пухлини у мм3. Вісь Х показує час у днях від ініціації обробки (тварин піддавали ін'єкції клітинами пухлини протягом 7 днів перед днем "0"). Напис MR1-1 означає MR1-1PE38 імунотоксин. Площі - тварини, яким вводили 1мкг болюсної ін'єкції MR1-1-PE38 імунотоксину у 20мкл на 0, 2 та 4 дні для загальної дози 3мкг імунотоксину. Праві верхні трикутники - тварини, яким вводили 2мкг болюсної ін'єкції MR1 -1-РЕ38 імунотоксину на 0, 2 та 4 дні для загальної дози 6мкг імунотоксину. Нижні трикутники - тварини, яким вводили 3мкг болюсної ін'єкції MR1-1-PE38 імунотоксину у 20мкл фізіологічного розчину на 0, 2 та 4 дні для загальної дози 9мкг імунотоксину. Ромби тварини, яким вводили 20мкл болюсної ін'єкції фізіологічного розчину на 0, 2 та 4 дні, як контрольні. Даний винахід забезпечує scFv антитіла та інші антитіла з вищою афінністю для EGFRvlll, ніж така для MR1. Він також забезпечує імунотоксини з вищою цитотоксичністю для клітин, що експресують EGFRvlll, ніж така тих самих імунотоксинів при використанні MR1 як націлювальної частини молекули. Антитіла створюють з MR1, але вони є мутованими у зонах гарячої точки ділянок, що визначають комплементарність (CDR). На подив, імунотоксини, що містять ці мутовані форми MR1 як націлювальний залишок, не тільки мають високу афінність для EGFRvlll, але також можуть бути одержані зі значно вищими виходами, ніж подібні імунотоксини, що використовують MR1 як націлювальну частину молекули. Лімітуючим фактором для конструювання бібліотек антитіл з рендомізацій у CDR є велика кількість залишків, що складають CDR. Оскільки структури рентгенівського проміння недоступні для більшості антитіл, звичайно не було спроб ідентифікувати кілька CDR залишків, в яких мутації можливо використовувати для забезпечення вищої афінності варіантів. Тому необхідно сконструювати гранично великі рендомізовані (випадкові) бібліотеки для забезпечення ізоляції варіантів з високою афінністю. В ілюстративних вивченнях мутації проводили у CDR3 варіабельної ділянки (VH) важкого ланцюга MR1. VH CDR3 MR1 має одинадцять амінокислотних залишків. Кінцеві два залишки VH ділянки, D101 та Y102, були виключені з дослідження мутагенезу, оскільки їх вважають неможливими для участі у антигенному зв'язуванні з двох причин. Перша полягає у тому, що ці два залишки, звичайно, лежать на межі розділу VL ланцюга. В результаті, їх не піддавали обробці. По-друге, ці залишки роблять свій внесок до J сегменту та подальшої 3' 77157 12 з'єднувальної ділянки VН CDR2. В результаті цього вони є відносно більш консервативними, ніж решта VH CDR3. Інші дев'ять амінокислот у кожному положенні VH CDR3 були заміщені кожною з інших природних амінокислот. Вивчення показало, що тільки мутації у ділянках, відомих як гаряча точка (ділянки, відомі як такі, що піддаються гіпермутації під час розвитку афінності антитіла, найкраще характеризуються ділянками RGYW та AGY, де R є А або G, Υ є С або Т, та W є А або Т), що приводить до утворення антитіл з вищою цитотоксичністю, ніж для вихідного антитіла MR1. Мутації також були знайдені для підвищення виходу імунотоксину, коли ці мутовані scFv були вбудовані в імунотоксини, у порівнянні з подібним імунотоксином, що був одержаний з scFv вихідного MR1. У подальших дослідженнях одержували мутації CDR3 варіабельної ділянки легкого ланцюга MR1. У цих дослідженнях мутації були зроблені тільки стосовно амінокислот усередині гарячої точки. Мутації приводили до утворення антитіл з вищою цитотоксичністю та виходом, ніж для вихідного антитіла MR1. Базуючись на цих результатах, немає необхідності рендомізувати кожний залишок у CDR для ідентифікації тих, де мутації будуть приводити до утворення варіантів з більшою афінністю. Передбачається, що мутації у гарячих точках VH та VL CDR1 або CDR2 будуть також приводити до утворення антитіл з поліпшеною афінністю для EGFRvlll, поліпшеною цитотоксичністю для клітин, що експресують EGFRvlll при вбудовуванні в імунотоксини, та покращувати вихід імунотоксинів, що містять такі scFv у порівнянні з імунотоксинами, що базуються на MR1. Оскільки поліпшені властивості забезпечуються завдяки замінам амінокислот, такі самі позитивні ефекти будуть виявлятись у випадку, коли ці мутовані форми MR1 (включаючи такі, що мутовані у VH та VL CDR3) вбудовані у дисульфідно стабілізовані Fv (dsFv), або у Fab’, F(ab')2 або Fab. Збільшена цитотоксична активність необов'язково корелює зі збільшеною афінністю (табл. 4 та табл. 5). Немає очевидного пояснення цій відсутності кореляції. Окрім зв'язувальної афінності, яка звичайно вимірюється при 22°С, існує багато аспектів у токсичному процесі, на які впливають мутації у гарячій точці. Такі аспекти включають стабільність при 37°С, величину засвоєння, протеолітичну обробку та перенос до компартментів, що необхідні для транслокації. Можливо, що вплив буде поширюватись на один з цих або більше аспектів. Проте, антитіла з вищою афінністю для EGPRvlll є корисними для різноманітних цілей, особливо для діагностичних цілей та при аналізах in vitro для визначення присутності або відсутності клітин, що експресують EGFRvlll у зразку. Наприклад, при використанні in vitro такого антитіла як scFv, що має з вищу афінність для EGFRvlll, воно може бути кон'юговане з радіонуклідами або з будь-якими іншими мітками, що визначаються та можуть використовуватись для визначення присутності клітин, що експресують EGFRvlll у зразках біопсії від пацієнтів для визначення того факту, що пухлина ще не була знищена у пацієнта, який, як відомо, мав 13 таку пухлину. Подібно до цього, при використанні in vivo scFv, dsFv або інших антитіл згідно з винаходом, вони можуть бути кон'юговані з радіонуклідами або іншими мітками, що детектуються, та використовуватись для визначення присутності клітин, що експресують EGFRvlll у пацієнта, і таким чином, діагностики, чи має пацієнт пухлину, що характеризується присутністю таких клітин, або, що пухлина не була знищена у пацієнта, який, як відомо, мав таку пухлину. На завершення однією визначною відмінністю, що спостерігається серед CDR мутантів, був заключний вихід активного мономерного білка. Рекомбінантні токсини акумулюються у тільцях включення як нерозчинний агрегований білок. Активні мономери одержують шляхом розчинення тілець включення у 6М Гуанідин НСІ, після цього проводять контрольовану ренатурацію у редокс-системі та відокремлення мономерів від мультимерів та агрегатів. Вивчення показало, що мутації у 1 або 2 амінокислотах у CDR можуть значно збільшувати вихід імунотоксину (табл. 6), як визначається та пояснюється нижче. Вихід MR1(Fv)-PE38 складає тільки 2%, але значно збільшується до 17% при використанні CDR3 важкого ланцюга, що містить мутації S98P-T99S. Очевидно, ці мутації мають глибокий вплив на спосіб зборки. Взагалі, усі мутанти важкого ланцюга, ізольовані при початковому мутагенезі важкого ланцюга, мали більший вихід, ніж вихідний MR1. Таким чином, CDR3 важкого ланцюга є дуже важливим для процесу самозборки, а фагові експресійні системи можуть вибиратись певним чином для білків, що збираються більш ефективно. Таким чином, фаг буде містити кращим чином зібрані Fv, які будуть присутніми у більшій кількості, і вони будуть переважно збагаченими під час пенінгу антигену. Базуючись на цих результатах, можна очікувати, що фаг може використовуватись для вибору Fv, мутованих у CDR1 або CDR2 VH та VL ланцюгах, які подібним чином демонструють збільшення продукційного виходу у порівнянні з вихідним MR1 scFv. Тести in vivo проводили для визначення ефекту зразкових імунотоксинів, націлених за допомогою MR1-1 на тваринних моделях людських пухлин. Для введення пухлин атимічним пацюкам та мишам вводили інтракраніально, інтратекально або підшкірно клітини людської гліабластомної клітинної лінії (U87MG), яку трансфікували для експресії EGFRvlll (трансфікована клітинна лінія, що експресує EGFRvlll, позначена як U87MG.AEGFRvlll, вона була описана у [Nishikawa et al. // Proc Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - 91(16). – P.7727-7731]. Після утворення пухлин пацюків та мишей лікували за допомогою болюсних ін'єкцій або безперервних інфузій різних доз імунотоксину. Як описано у прикладах нижче та Фіг.3-6, незважаючи на локалізацію пухлини та спосіб призначення імунотоксину, тварини, що одержували імунотоксин у дозах 1мкг або 2мкг, показали помітно менший пухлинний ріст та більший період виживання, ніж тварини, яким вводили контрольний фізіологічний розчин. 77157 14 Одиниці, слова та символи наведені У Міжнародній Системі Одиниць (СІ) у прийнятній формі. Нумераційні інтервали є такими, що включають номери, визначені у інтервалах. Якщо інше не зазначене, нуклеїнові кислоти записані зліва направо у 5'-3' орієнтації; амінокислотні послідовності записані зліва направо у напрямку від аміно- до карбокси кінця. Заголовки, що наведені у заявці, не є обмеженнями різних аспектів або втіленнями винаходу і можуть вводитись як посилання на опис у цілому. Таким чином, терміни, визначені безпосередньо нижче, більш повно визначаються посиланнями на опис в його цілісності. Мутовані залишки відомих послідовностей умовно позначають за допомогою однобуквеного коду залишку, що звичайно знаходиться у визначеному положенні послідовності, положення у послідовності мутованих залишків, та залишку, що заміщує вихідний залишок. Таким чином, відносно CDR3 VН MR1 термін "S98P" вказує, що серін, який у нормі знаходиться у положенні 98 нормального CDR3 важкого ланцюга MR1, було мутовано у пролін. Позначення, таке, як "S98", в якому після номера не вказується посилання на залишок, означає, що залишок у нормі знаходиться у цьому положенні нормальної послідовності пептиду, або, що цей специфічний залишок зараз присутній у цьому положенні (тобто, що позначений залишок був заміщений на залишок, що у нормі присутній у цьому положенні). Яке використання розуміють у даній заявці буде ясно з контексту заявки. Посилання у даній заявці на певні пронумеровані амінокислотні залишки MR1-1 відносяться до залишків, пронумерованих згідно з Кабат. Послідовність білків, що представляють імунологічний інтерес, Департамент здоров'я та обслуговування населення США (1987). Це посилання далі вказується як "Kabat", зміст якого введений у дану заявку як посилання, при цьому послідовність scFv вирівняна та пронумерована згідно з системою Кабат. "EGFRvlll" означає мутантну форму рецептора епідермального фактора росту, позначеного як MR1 scFv та яка характеризується делецією 801 п.о. екзонів 2-7 поблизу амінотермінального кінця. Ця форма рецептора відома у даній галузі, та була описана Вікстрандом та інш., Москателло та інш. та Лорімером та інш., посилання на яких містяться у розділі "Передумови винаходу". Завдяки зміні в термінології, EGFRvlll був спочатку позначений як мутація II типу у деяких більш ранніх роботах у даній галузі, як, наприклад, згадано у [US, 5,212,290]. Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "антитіло" включає посилання на молекулу імуноглобуліну, що є імунологічно реактивною з певним антигеном, та включає як прийнятні поліклональні, так і моноклональні антитіла. Термін також включає одержані за допомогою генетичної інженерії форми, такі, як химерні антитіла (наприклад, олюднені мишині антитіла), гетерокон'югати антитіл (наприклад, біспецифічні антитіла). Термін, зокрема, відноситься до рекомбінантних одноланцюгових фрагментів Fv (scFv), дисульфідно стабілізованих фрагментів Fv (dsFv) [див. U.S.S.N. 08/077,252], що введений у дану 15 заявку як посилання), або pFv фрагментів [див. US, 60/042,350; US, 60/048,848]. Термін "антитіло" також включає антиген-зв'язувальні форми антитіл, включаючи фрагменти з антигензв'язувальною здатністю (наприклад, Fab', F(ab')2, Fab та rlgG [див. Каталог та керівництво Пірса 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J. Immunology, 3rd Ed. - New York: W.H.Freeman & Co., 1998]. Який особливий зміст або змісти вкладаються у термін буде ясно із контексту. Антитіло, імунологічно реактивне з певним антигеном, може бути одержане за допомогою рекомбінантних методів, таких як селекція бібліотек рекомбінантних антитіл у фагових або подібних векторах [див. Huse et al., // Science/ 1989. – 246. P.1275-1281; Ward et al. // Nature. – 1989. – 341. – P.544-546; Vaughan et al. // Nature Biotech. – 1996. – 14. – P.309-314], або імунізацією тварини антигеном або за допомогою ДНК, що кодує антиген. Типово, імуноглобулін має важкий і легкий ланцюги. Кожний важкий та легкий ланцюг містить постійну ділянку та варіабельну ділянку (ці ділянки також відомі як "домени"). Варіабельні ділянки легкого та важкого ланцюгів містять чотири структурні ділянки, що перериваються трьома гіперваріабельними ділянками, які також називаються "ділянками, що визначають комплементарність" або "CDR". Протяжність структурних ділянок та CDR була визначена з системою Кабат. Послідовності структурних ділянок різних легких або важких ланцюгів є відносно консервативними усередині видів. Структурна ділянка антитіла, що є комбінацією структурних ділянок складових легких та важких ланцюгів, служать для позиціювання та вирівнювання CDR у тривимірному просторі. CDR, головним чином, відповідають за зв'язування з епітопом антигену. CDR кожного ланцюга типово називається як CDR1, CDR2, CDR3, що пронумеровані послідовно, починаючи від Nтермінального кінця, вони також типово визначаються ланцюгом, в якому розміщений певний CDR. Таким чином, CDR3 VH розміщений у варіабельному домені важкого ланцюга антитіла, в якому він знаходиться, у той час, як CDR1 VL є CDR1 з варіабельного домена легкого ланцюга антитіла, в якому він знаходиться. Позначення "VH" або "VH" відноситься до варіабельної ділянки важкого імуноглобулінового ланцюга антитіла, включаючи Fv, scFv, dsFv або Fab важкого ланцюга. Позначення "VL" або "VL" відноситься до варіабельної ділянки легкого імуноглобулінового ланцюга антитіла, включаючи Fv, scFv, dsFv або Fab легкого ланцюга. Фраза "один ланцюг Fv" або "scFv" відноситься до антитіла, в якому варіабельні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга традиційного дволанцюгового антитіла з'єднані між собою для формування одного ланцюга. Типово, лінкерний пептид вбудований між двома ланцюгами для того, щоб дозволити проводити самозборку та створення активного зв'язувального сайту. Термін “лінкерний пептид" включає вказівку на пептид усередині зв'язувального фрагменту антитіла (наприклад, Fv фрагмент), який служить для безпосереднього зв'язування варіабельного доме 77157 16 ну важкого ланцюга з варіабельним доменом легкого ланцюга. Термін “вихідне антитіло" взагалі відноситься до антитіла, що представляє інтерес, яке було мутовано або змінено для одержання антитіл або фрагментів останнього, що зв'язує той самий епітоп, що і вихідне антитіло. Як такий, що використовується у контексті заявки, термін “вихідне антитіло" відноситься до scFv, що позначається як “MR1" [номер доступу GenBank U76382], якщо інше не зазначене, або не вимагається по контексту. Термін "гаряча точка" означає частину нуклеотидної послідовності CDR або структурну ділянку варіабельного домену, який представляє собою сайт особливо високої природної мутації. Незважаючи на те, що CDR самі по собі вважаються ділянками гіперваріабельності, було вивчено, що мутації не є визначально розподіленими у CDR. Певні сайти, або гарячі точки, були ідентифіковані у цих позиціях, які піддавали концентрованим мутаціям. Гарячі точки характеризується рядом структурних ознак або послідовностями. Ці фрагменти "гарячих точок" можуть використовуватись для ідентифікації гарячої точки. Дві консенсусні послідовності ділянок, які є особливо добре охарактеризованими, є тетрануклеотидною послідовністю RGYW та сериновою послідовністю AGY, де R є А або G, Υ є С або Т, a W є А або Т. "Націлювальний залишок" або "націлювальна молекула" є частиною імунокон'югату, який має здатність до націлювання імунокон'югату на клітини, що представляють інтерес. Типово, націлювальні залишки є антитілом, scFv, dsFv, або F(ab')2, який впізнає специфічний антиген на клітинах, що представляють інтерес. "Токсичний залишок" є цитотоксином або частиною цитотоксину, який при вбудовуванні в імунотоксин надає імунотоксину цитотоксичності по відношенню до клітин, що представляють інтерес. "Імунотоксин" є молекулою, що включає націлювальну молекулу, таку як scFv, та токсичний залишок, такий як екзотоксин Pseudomonas (“PE") або цитотоксичний фрагмент останнього. Імунотоксини, що обговорюються у даній заявці, є такими, що типово експресуються як тільця включення в Е.соli, після цього тільця включення очищають, розчиняють у 6М Гуанідин НСІ, та білок піддають повторній зборці. Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "вихід" відноситься до кількості мономерно імунотоксину, що правильно збирається під час цього способу. Вихід виражають як співвідношення міліграмів білка після MonoQ іоннообмінної хроматографії до міліграмів повторно зібраного білка тілець включення. "Терапевтичний залишок" є частиною імунокон'югату, призначеного діяти як терапевтичний агент. Термін "терапевтичний агент" включає будьякий ряд сполук, що на сьогоднішній день відомі або пізніше поліпшені для впливу як антинеопластики, протизапальні агенти, цитокіни, антиінфекційні агенти, активатори ферментів або інгібітори, алостеричні модифікатори, антибіотики або інші агенти, які призначаються для індукції бажаного 17 терапевтичного ефекту у пацієнта. Терапевтичний агент може також бути токсином або радіоізотопом, при цьому терапевтичний ефект полягає, наприклад, у руйнуванні пухлинної клітини. "Мітка, яку детектують" означає у зв'язку з імунокон'югатом частину імунокон'югату, яка надає властивості виявляти його присутність. Наприклад, імунокон'югат може бути міченим радіоактивним ізотопом, що дозволяє клітинам, в яких імунокон'югат присутній, виявлятись у імуногістохімічних аналізах. Термін "ефекторний залишок" та "ефекторна молекула" означає частину імунокон'югату, призначеного мати вплив на клітину націлювання за допомогою націлювального залишку або для ідентифікації присутності імунокон'югату. Таким чином, ефекторний залишок може бути, наприклад, терапевтичним залишком, токсином, радіоміткою або флуоресцентною міткою. Термін "імунокон'югат" означає химерну молекулу, що включає націлювальну молекулу (таку як scFv), приєднану безпосередньо (наприклад, через ковалентний зв'язок) або опосередковано (наприклад, через лінкерний пептид) до ефекторної молекули. У наборі імунокон'югатів ефекторна молекула є токсином, химерною молекулою, що більш специфічно називається „імунотоксином". Термін "ефективна кількість" або "кількість, ефективна для" або "терапевтично ефективна кількість" включає посилання на дозу терапевтичного агента, достатню для одержання бажаного результату, такого як інгібування синтезу клітинних білків, принаймні, на 50%, або руйнування цих клітин. Термін "токсин" включає посилання на абрин, рицин, екзотоксин Pseudomonas (ΡΕ), дифтерійний токсин (DT), токсин ботулізму або їх модифіковані токсини. Наприклад, РЕ та DT є високо токсичними сполуками, що типово викликають смерть від печінкової токсичності. РЕ та DT, проте, можуть бути модифіковані у форму, придатну для використання як імунотоксину, шляхом видалення нативного націлювального компоненту токсину (наприклад, домену Іа РЕ або В ланцюга DT) та заміни їх різними націлювальними залишками, такими, як антитіло. Термін "ІС50" відноситься до концентрації токсину або імунотоксину (вираженому у нг/мл), що необхідний для інгібування білкового синтезу на 50%. Термін "контакт" включає посилання на розміщення у безпосередньому фізичному сполученні. “Експресійна плазміда" включає нуклеотидну послідовність, що кодує молекулу, яка представляє інтерес, та яка оперативно зв'язана з промотором. Як такий, що використовується у контексті заявки, "поліпептид", "пептид" та "білок" використовуються почергово та включають посилання на полімер амінокислотних залишків. Термін використовується для амінокислотних полімерів, в яких один або більше амінокислотних залишків є штучними хімічними аналогами відповідної одержаної з природи амінокислоти, а також до одержаних з природи амінокислотних полімерів. Терміни також 77157 18 використовуються для полімерів, що містять консервативні амінокислотні заміни, такі, що білок залишається функціональним. Термін "залишок" або "амінокислотний залишок" включає посилання на амінокислоту, що введена у білок, поліпептид, або пептид (які всі називаються “пептидом"). Амінокислота може бути такою, що одержана з природи, якщо інше не передбачено, може охоплювати відомі аналоги природних амінокислот, що можуть функціонувати таким самим чином, як і амінокислоти, одержані з природи. Амінокислоти та аналоги відносяться до вказаних та описаних за допомогою коротких позначень, як наведено у Таблиці 1. Таблиця 1 Номенклатура амінокислот Назва амінокисОднобуквений Трибуквений код лоти код Аланін Ala A Аргінін Arg R Аспарагін Asn N Аспартамова Asp D кислота Цистеїн Cys С Глутамінова Glu Ε кислота Глутамін GIn Q Гліцин Gly G Гістидин His Η Ізолейцин IIe I Лейцин Leu L Лізин Lys К Метіонін Met Μ Феніаланін Phe F Пролін Pro Ρ Серин Ser s Треонін Thr τ Триптофан Trp W Тирозин Tyr Υ Валін Val ν "Консервативна заміна" при описі білка відноситься до зміни в амінокислотному складі білка, що суттєво не змінює білкову активність. Таким чином, "консервативно модифіковані варіації" певної амінокислотної послідовності відносяться до амінокислотних замін таких амінокислот, що не є вирішальними для білкової активності або до заміни амінокислот іншими амінокислотами, що мають подібні властивості (тобто, кислотні, основні, позитивно чи негативно заряджені, полярні або неполярні тощо), такі, що заміни навіть вирішальних амінокислот не змінюють суттєво активність. Таблиці консервативних замін, що забезпечують функціонально подібні амінокислоти, добре відомі у даній галузі. Кожна з наступних шести груп у Таблиці 2 містить амінокислоти, що є типово консервативними при заміні однієї на іншу [див. також Creighton, Proteins, W.H.Freeman and Company, New York, 1984]. 19 77157 Таблиця 2 Групи функціонально подібних амінокислот № групи аміноНазва амінокислот групи кислот 1 Аланін (А), Серин (S), Треонін (Т) 2 Аспарагінова кислота (D), Глутамінова кислота (Е) 3 Аспарагін (N), Глутамін (Q) 4 Аргінін (R), Лізин (К) 5 Ізолейцин (І), Лейцин (L), Метіонін (М), Валін (V) 6 Фенілаланін (F), Тирозин (Y), Триптофан (W) Слід зазначити, проте, що хоча фенілаланін та триптофан взагалі вважаються консервативними при заміні один на інший, заміна фенілаланіну на триптофан у гарячій точці VL CDR3 scFv MR1 приводить до утворення імунотоксину, який буде більш активним, ніж вихідний scFv. Згідно з цим, оскільки ці амінокислоти вважаються консервативними замінами для частин антитіла за межами CDR у контексті цього винаходу ці дві амінокислоти не є консервативними замінами одна на іншу усередині гарячої точки. Базуючись на цих результатах, ніякі амінокислотні заміни усередині гарячої точки не можуть вважатись консервативними замінами за винятком, коли вони тестуються, наприклад, за допомогою аналізів, наведених у даній заявці для визначення того факту, чи впливають вони, чи ні на зв'язувальну афінність одержаної молекули, на вихід імунотоксину, одержаного при використанні цієї молекули як націлювального залишку, або обох. Термін "суттєво подібний" у контексті пептиду позначає, що пептид включає послідовність з принаймні 90%, а бажано 95%, ідентичністю з референс-послідовністю при порівнянні ділянки розміром 10-20 амінокислот. Значення ідентичності послідовності визначали шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей більших за ділянку порівняння, де частина полінуклеотидної послідовності порівнюваної ділянки може включати вставки або делеції (тобто, пробіли) при порівнянні зі згаданою послідовністю (яка не включає вставок або замін) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Значення вираховують шляхом визначення номера положення, в якому ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок має місце в обох послідовностях, для одержання номера прийнятних положень, ділення отриманого прийнятного положення на загальний номер положення у ділянці порівняння та множення результату на 100 для одержання значення ідентичності послідовності. Фраза "дисульфідний зв'язок" або "цистеїнцистеїновий дисульфідний зв'язок" відноситься до ковалентної взаємодії між двома цистеїнами, в яких атоми сірки цистеїнів окислені для утворення дисульфідного зв'язку. Середня енергія зв'язування дисульфідного зв'язку складає приблизно 60ккал/мол, порівняно з 1-2ккал/мол для воднево 20 го зв'язку. У контексті даного винаходу цистеїни, що утворюють дисульфідний зв'язок, знаходяться у середині структурних ділянок одноланцюгового антитіла та служать для стабілізації конформації антитіла. Терміни "кон'югація", "поєднання", "сполучення" та "зв'язування" відносяться до створення двох поліпептидів в одній сумісній поліпептидній молекулі. У контексті даного винаходу, терміни включають посилання на приєднання залишку антитіла до ефекторної молекули (ЕМ). Зв'язок може бути створений хімічно або рекомбінантним чином. Хімічні способи відносяться до реакції між залишком антитіла та ефекторною молекулою, завдяки якому ковалентний зв'язок утворюється між двома молекулами для створення однієї молекули. Як такий, що використовується у контексті даної заявки, "рекомбінант" включає посилання на білок, одержаний при використанні клітин, що не мають у своєму активному стані ендогенної копії ДНК, здатної до експресії білка. Клітини виробляють рекомбінантний білок, оскільки вони були генетично змінені шляхом вбудовування прийнятної ізольованої послідовності нуклеїнової кислоти. Термін також включає посилання на клітину, або нуклеїнову кислоту або вектор, який було модифіковано вбудовуванням гетерологічної нуклеїнової кислоти або зміни нативної нуклеїнової кислоти для створення неприродної для цієї клітини, або такий, що клітина, яка походить від цієї клітини, є модифікованою. Таким чином, наприклад, рекомбінантні клітини експресують гени, що не містяться у нативній (нерекомбінантній) формі клітини, експресують мутанти генів, які не містяться у нативній формі, або експресують нативні гени, що в іншому випадку ненормально експресуються, надекспресуються або не експресуються взагалі. Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "нуклеїнова кислота" або "послідовність нуклеїнової кислоти" включає посилання на дезоксирибонуклеїновий або рибонуклеїновий полімер в одно- або дволанцюговій формі, та, якщо інше не вказано, охоплює відомі аналоги природних нуклеотидів, що гібридизуються з нуклеїновими кислотами способом, подібним до того, що має місце для природних нуклеотидів. Якщо інше не вказано, певна послідовність нуклеїнової кислоти включає комплементарну їй послідовність, а також консервативні варіанти, тобто, нуклеїнові кислоти, присутні у положенні, що може змінюватися, її кодонів та варіантів, так, що при трансляції у білок це приводить до консервативної заміни амінокислоти. Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін, "той, що кодує" по відношенню до специфічної нуклеїнової кислоти включає посилання на нуклеїнові кислоти, які містять інформацію для трансляції у специфічний білок. Інформація задається використанням кодонів. Типово, амінокислотна послідовність кодується нуклеїновою кислотою при використанні "універсального" генетичного коду. Проте, варіанти універсального коду, такі як ті, що присутні у деяких рослинах, тваринах та мітохондріях грибів, бактерії Mecoplasma capricolum [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 21 – 1985. – 82. P.2306-2309], або у війках Macronucleus, можуть використовуватись, якщо нуклеїнова кислота експресується при використанні трансляційного механізму цих організмів. Фраза "злиття у рамці" відноситься до поєднання двох або більше нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують поліпептиди, так, що приєднана послідовність нуклеїнової кислоти транслюється в одноланцюговий білок, який включає оригінальні поліпептидні ланцюги. Як такий, що використовується у контексті даної заявки, "експресований" включає посилання на трансляцію нуклеїнової кислоти у білок. Білки можуть експресуватись та залишатись інтрацелюлярними, ставати компонентом клітинної поверхневої мембрани або бути секретованими у екстрацелюлярний матрикс або середовище. Під "хазяйською клітиною" розуміють клітину, яка може підтримувати реплікацію або експресію експресійного вектора. Хазяйські клітини можуть бути прокаріотичними клітинами, такими як Е.соli, або еукаріотичними клітинами, такими як дріжджі, комахи, амфібії або клітинами ссавців. Фраза "фагова бібліотека" відноситься до популяції бактеріаофагів, кожний з яких містить сторонню кДНК, рекомбінантно злиту у рамці з послідовністю поверхневого білка. Після реплікації у бактеріальному хазяїні, типово Е.соli, фаг, який містить сторонню кДНК, що представляє інтерес, вибирають за допомогою експресії стороннього білка на поверхні фага. Термін "ідентичний" або процент "ідентичності" у контексті двох або більше нуклеїнових кислот або поліпептидних послідовностей відноситься до двох або більше послідовностей, або субпослідовностей, які є такими самими або мають вказаний процент амінокислотних залишків або нуклеотидів, що є такими самими, при порівнянні та вирівнюванні для максимальної відповідності, як це роблять при використанні одного з наступних алгоритмів порівняння послідовностей або візуального огляду. Фраза "суттєво ідентичний" у контексті двох нуклеїнових кислот або поліпептидів відноситься до двох або більше послідовностей або субпослідовностей, що мають принаймні 60%, бажано 80%, а більш бажано - 90-95%, ідентичності нуклеотидів або амінокислотних залишків при порівняння та вирівнюванні для максимальної відповідності, як це роблять при використанні одного з наступних алгоритмів порівняння послідовностей. Бажано, щоб суттєва ідентичність існувала понад ділянку послідовності, що містить принаймні близько 50 залишків, більш бажано понад принаймні 100 залишків, та найбільш бажано, якщо послідовності є суттєво ідентичними принаймні 150 залишків. У найбільш бажаному втіленні, послідовності є суттєво ідентичними понад повну довжину кодувальних ділянок. Для порівняння послідовностей, звичайно, одна послідовність виступає як референспослідовність, з якою порівнюються тестові послідовності. При використанні алгоритму порівняння послідовностей тестові та референс-послідовності вводяться в комп'ютер, субпослідовності коорди 77157 22 нують, та визначають, якщо необхідно, після цього визначають програмні параметри алгоритму порівняння послідовностей. Алгоритм порівняння послідовностей потім визначають як процент ідентичності для тестової послідовності(ей), споріднених з референс-послідовністю, базуючись на визначених програмних параметрах. У даній галузі техніки відомий цілий ряд програм для такого вимірювання. Подальше визначення того факту, що дві послідовності нуклеїнової кислоти або поліпептидів є суттєво ідентичними, полягає у тому, що поліпептид, який кодується першою нуклеїновою кислотою, є імунологічно перехресно реактивним з поліпептидом, що кодується другою нуклеїновою кислотою, як описано нижче. Таким чином, поліпептид є типово суттєво ідентичним до другого поліпептиду, наприклад, якщо два поліпептиди відрізняються тільки консервативними замінами. Інше визначення того факту, що дві послідовності нуклеїнової кислоти є суттєво ідентичним, полягає у тому, що дві молекули гібридизуються одна з одною у жорстких умовах, як описано нижче. Термін "in vivo" включає посилання на те, що процес відбувається усередині тіла організму, з якого одержана клітина. "Ex vivo" та "in vitro" означає, що мова йде про процеси поза тілом організму, з якого одержана клітина. Фраза "злоякісна клітина" або "злоякісність" відноситься до пухлин або пухлинних клітин, які є інвазивними та/або здатні піддаватись метастазу, тобто, мається на увазі пухлинна клітина. Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "клітини ссавця" включає посилання на клітини, що походять від ссавців, включаючи людину, щурів, мишей, гвінейських свиней, шимпанзе, або макак. Клітини можуть культивуватись in vivo або in vitro. Термін "селективно реактивний" відноситься у зв'язку з антигеном до бажаної асоціації антитіла, як у цілому, так і частини, до клітини або тканини, що несе цей антиген, та не відноситься до клітин або тканин, що не мають цього антигену. Звичайно визнається, що певна ступінь неспецифічної взаємодії може виникати між молекулою та ненаціленою клітиною або тканиною. Проте, селективна реактивність може бути визначною, як така, що опосередковується через специфічне впізнання антигену. Незважаючи на те, що селективно реактивні антитіла зв'язують антиген, вони можуть робити це з низькою афінністю. З іншого боку, специфічне зв'язування приводить до набагато сильнішої асоціації між антитілом та клітинами, що несуть антиген, ніж таке між зв'язаним антитілом та клітинами, які не мають цього антигену. Специфічне зв'язування типово приводить до двократного збільшення, бажано до п'ятикратного збільшення, ще більш бажано до десятикратного збільшення та найбільш бажано понад стократного збільшення кількості зв'язаного антитіла (на одиницю часу) з клітиною або тканиною, що несе EGFRvlll, у порівнянні з клітиною або тканиною, в якій відсутній EGFRvlll. Специфічне зв'язування з білком при таких умовах вимагає антитіла, яке вибране за його специфічність до певного білка. 23 Різноманітність методів імунологічного визначення є прийнятною для вибору антитіл, специфічно реактивних з певним білком. Наприклад, твердофазні імуноаналізи ELISA, звичайно, використовуються для вибору моноклональних антитіл, специфічно імунореактивних з білком. Опис методів імуноаналізу та умов, що можуть використовуватись для визначення специфічної імунореактивності, наведено у [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications. - New York, 1988]. Термін "імунологічно реактивні умови" включає посилання на умови, які дозволяють генерувати антитіло до певного епітопу для зв'язування з цим епітопом для значно більшого рівня детектування, ніж та/або для суттєвого виключення зв'язування з суттєво усіма епітопами. Імунологічно реактивні умови залежать від методу проведення реакції зв'язування антитіла та типово є такими, що використовуються у прописах імунологічних аналізів або тими умовами, що зустрічаються in vivo [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications. - New York, 1988]. Бажано, щоб імунологічно реактивні умови, які використовуються у способах згідно з даним винаходом, були "фізіологічними умовами", які включають посилання на умови (наприклад, температура, осмотичний тиск, рН), що є типовими усередині тіла живих ссавців або клітин ссавців. Незважаючи на те, що визнається, що деякі органи є об'єктами крайніх умов, середовище всередині організму та інтрацелюлярне середовище у нормі мають рН близько 7,0 (тобто від рН 6,0 до рН 8,0, більш типово рН 6,5-7,5), містять воду як переважний розчинник, та існують при температурі вище 0°С та нижче 50°С. Осмотичний тиск лежить всередині інтервалу, що є таким, який забезпечує підтримання клітинної життєздатності та проліферації. Створення антитіл з вищою афінністю для EGFRvlll, ніж така для MR1 Антитіла зв'язуються з антигенами через залишки у їх CDR. Тому мутагенез CDR широко використовується для збільшення афінності Fab та Fv фрагментів антитіл. Існує велика кількість різноманітних підходів домутагенезу CDR. Більшість з них, такі як мутагенез, що базується на кодонах [Yelton et al. // J. Immunol. – 1995. – 155. – P.19942004], метод скринінгу CDR [Barbas et al. // Trends Biotech. – 1996. – 14. – P.230-234; Yang et al. // J. Mol. Biol. – 1995. – 254. – P.392-403], помилкова протяжна реплікація [Low et al. // J. Mol. Biol. – 1996. – 260. – P. 359-368], конструювання синтетичних CDR [de Kruif et al. // J. Mol. Biol. – 1995. – 248. P.97-105] вимагають конструювання великих бібліотек, що є технічно утрудненим та важким для виконання. Основний напрямок розвитку афінності антитіл полягає в ізоляції високоафінних зв'язувальних агентів з відносно невеликих бібліотек [Ріпі et al. // J. Biol. Chem. – 1988. – 273. P. 21769-21776; Wu et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – 95. – P.6037-6042; Chowdhury et al. // Nature Biotechnol. – 1999. – 17. – p.568-572]. Усі з цих підходів передбачають конструювання експресійних 77157 24 бібліотек антитіл з мутаціями у CDR та селекцію кращих зв'язувальних агентів. Технологія фагового виявлення стала корисним знаряддям для скринінгу великих пептидних або білкових бібліотек [Winter et al. // Annu. Rev. Immunol. – 1994. – 12. – P.433-455; McCafferty // J. Nature. – 1990. – 348. – P.552-554; Barbas et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991. – 88. – P.79787982]. Одноланцюгові Fv можуть експресуватись у фагових частинках як злиття з геном 3 білка М13 у фагемідному векторі. Білки злиття експресуються в Е.соli та у присутності фагового хелпера виявляються на поверхні фага М13, який може збиратись з культурального середовища. Фаг, який виявляє scFv злиті білки, що зв'язуються зі специфічним антигеном, піддають селекції шляхом пенінгу фагових бібліотек на клітинах, що експресують антиген, або на поверхні, з якою зливається антиген, такою як магнітні кульки. Фаг, який не зв'язується, вимивається, зв'язаний фаг елюють та ампліфікують шляхом повторного інфікування Е.соli. Декілька кіл пенінгу приводять до збагачення специфічних зв'язувальних агентів. Шляхом створення умов пенінгу більш жорсткими кращі зв'язувальні агенти можуть більш ефективно відокремлюватись від слабких зв'язувальних агентів. Технологія фагового виявлення може використовуватись для одержання антитіл, які зв'язують EGFRvlll з вищою афінністю, ніж MR1. Як добре відомо у даній галузі техніки, непошкоджене антитіло включає два важких ланцюга та два легких ланцюга. Кожний ланцюг має три CDR, позначені як 1, 2, 3 відповідно. Кожний CDR, як відомо, робить свій внесок у процес антигенного зв'язування, але вони роблять це не в рівній мірі [Kuby J. Immunology. 3rd Ed. - New York: W.H.Freeman&Co., 1998]. Незважаючи на те, що амінокислоти будьякого CDR можуть бути мутовані для виявлення мутацій, які збільшують афінність, взагалі CDR3 кожного ланцюга робить більший внесок у антигенне зв'язування, ніж це робить CDR1 або CDR2 цього ланцюга. Крім того, VH та VL CDR3 MR1 є відносно більш довгими для мишиного CDR3, який може робити свій внесок у відносну стабільність MR1 scFv відносно інших scFv. Після виключення останніх двох амінокислот VH CDR3, що є слабоймовірними стосовно впливу на антигенне зв'язування з причин, що обговорювались у Вступі, дев'ять залишків, що залишились у VH CDR3, були заміщені кожною з 19 природних амінокислот. Тільки мутації серину та треоніну в амінокислотних положеннях 98 та 99, відповідно, приводили до поліпшення цитотоксичності одержаного імунотоксину (амінокислотні послідовності VH та VL CDR3 представлені в однобуквеному коді у табл. 5-7. Послідовність, що представляє VH, не показує двох залишків, D101 та Y102, які вважають такими, що малоймовірно впливають на процес антигенного зв'язування). Бажаними замінами у VH CDR3 були P98-V99, які давали ІС50 у РЕ38 імунотоксині 3,5нг/мл, P98-N99, P98-W99 та P98-J99, усі з яких давали IC50 4,5нг/мл, P98-F99 з ІС50 6нг/мл та P98-V99, які давали ІС50 6,5нг/мл чотири клони, P98-S99, W98-V99 та Р98-Т99, які давали значення ІС50, рівне такому для вихідного клону. (Звичай 25 но, термін, такий як "P98-Y99", означає, що амінокислота пролін виявляється у положенні 98 вказаного поліпептиду, у даному випадку у VH CDR3 MR1, і що тирозин з'являється у положенні 99, але, що решта молекули така сама, як і у нормального поліпептиду, у даному випадку, вихідного антитіла MR1). Відносно мутації VL CDR3, то слід сказати, що тільки одна мутація F92W дає імунотоксин, що є більш активним, ніж вихідний. Його ІС50 складає 1,3нг/мл. У цьому випадку "вихідною" молекулою є MR1 з замінами P98-Y99 у VH CDR3, яка при відсутності додаткових замін у VL CDR3 має ІС50 3,5нг/мл. Це мутоване MR1, яке поєднує мутації у CDR3 як у VH, так і у VL ланцюгах (VH S98PT99Y.VL F92W) було найбільш цитотоксичною формою при тестуванні як націлювальної частини імунотоксину, і зараз називається "MR1-1". Ці результати показують, що мутації у різних CDR можуть мати додатковий ефект та можуть збільшувати цитотоксичність одержаного імунотоксину. Беручи до уваги ці результати мутації амінокислот у гарячій точці CDR1 та CDR2 VH та VL ланцюгів MR1 будуть, очевидно, приводити в антитілах до подальшого поліпшення афінності для EGFRvlll та до створення імунотоксинів з ще більш поліпшеною цитотоксичністю у порівняння з MR1. Найкращим часом для аналізу клонів є початок процесу. Пенінг після збагачення піків може бути шкідливим, оскільки виникає ризик загублення клонів. Можливо, що Fv з низькою афінністю, але з високою експресією, може бути відповідним чином збагачений, тоді як добрий зв'язувальний агент може бути загублений. Докази, що це підтверджують, одержували при пенінгу бібліотек легких ланцюгів CDR3: мутант F92S з низькою афінністю (Kd 22нМ) було знайдено у 7 з 10 клонів, перевірених після третього кола, у той час, як кращий зв'язувальний агент, F92W, був присутній тільки один раз. На противагу цьому, у другому колі F92S було знайдено у 2-ох з 17 клонів, у той час як F92W був присутній у 6 з 17 клонів. Анти-EGFRvlll антитіла Даний винахід забезпечує антитіла, які зв'язуються з EGFRvlll з вищою афінністю, ніж антитіла, відомі з рівня техніки, та які селективно реагують з EGFRvlll. Зокрема, винахід забезпечує антитіла, які мають нижче значення Kd по відношенню до EGFRvlll, ніж MR1, найкращі відомі scFv, націлені на цей антиген. Крім того, ці антитіла формують імунотоксини, які мають вищу цитотоксичність для клітин, що експресують EGFRvlll, ніж той самий імунотоксин, одержаний на основі MR1. Винахід також забезпечує спосіб одержання антитіл з вищою афінністю та більшою цитотоксичністю для EGFRvlll, ніж має MR1. Імунокон'югати, розкриті нижче, націлюють EGFRvlll при використанні антитіл згідно з даним винаходом. Ці антитіла є селективно реактивними при імунологічних умовах до тих детермінант EGFRvlll, що виявляються на поверхні клітин ссавців, та доступні для антитіла з екстрацелюлярного середовища. У бажаному втіленні даного винаходу антиEGFRvlll антитіло є рекомбінантним антитілом, таким, як scFv або дисульфідно стабілізованим Fv 77157 26 антитілом. Fv антитіло типово має вагу 25кДа та містить повний антиген-зв'язувальний сайт з трьох CDR як у важкому, так і в легкому ланцюгах. Якщо VH та VL ланцюги експресуються несумісно, ланцюги Fv антитіла типово тримаються разом за допомогою нековалентних взаємодій. Проте, ці ланцюги мають тенденцію до дисоціації під час розчинення, і таким чином, були розвинуті способи для зшивання ланцюгів за допомогою глютаральдегіду, внутрішньомолекулярних дисульфідів або пептидного лінкеру. Дисульфідно стабілізовані Fv вивчаються, наприклад, у [US, 5,747,654]. В особливо бажаному втіленні антитіло є одноланцюговим Fv (scFv). VH та VL ділянки scFv антитіла включають один ланцюг, який зібраний для створення антиген-зв'язувального сайту, подібного до того, що знайдений у дволанцюгових антитілах. При зборці нековалентні взаємодії стабілізують єдиний ланцюг антитіла. У більш бажаному втіленні scFv одержують рекомбінантним способом. Будь-який спеціаліст у даній галузі зможе зрозуміти, що можуть бути одержані консервативні варіанти антитіл згідно з даним винаходом. Такі консервативні варіанти, що використовуються у фрагментах scFv, будуть зберігати критичні амінокислотні залишки, необхідні для правильної зборки та стабілізації між VH та VL ділянками. У деяких втіленнях даного винаходу scFv антитіло безпосередньо зв'язане з ефекторною молекулою (ЕМ) через легкий ланцюг. Проте, scFv антитіла можуть бути зв'язані з ЕМ через аміноабо карбокси-термінальний кінець. Оскільки VH та VL ділянки у деяких втіленнях антитіл можуть бути безпосередньо сполучені разом, будь-який спеціаліст у даній галузі, може оцінити, що ділянки можуть бути відокремлені пептидним лінкером, який складається з однієї або більше амінокислот. Пептидні лінкери та їх використання добре знайомі спеціалістам у даній галузі техніки, наприклад, [Huston et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1988. – 8. – P.5879; Bird et al. // Science. – 1988. – 242. – P. 4236; Glockshuber et al. // Biochemistry. – 1990. – 29. – P.1362; US, 4,9466778; US, 5,132,405; Stemmer et al. // Biotechniques. - 1993. - 14. - P.256-265]. Взагалі пептидний лінкер не буде мати специфічної біологічної активності іншої, ніж сполучення ділянок або для збереження мінімальної відстані або інших просторових взаємозв'язків між VH та VL. Проте, постійні амінокислоти пептидного лінкера можуть бути вибрані для впливу на деякі властивості молекули, такі як зборка, загальний заряд або гідрофобність. Одноланцюгові Fv (scFv) антитіла необов'язково включають пептидний лінкер, що має розмір не більше 50 амінокислот, та більш бажано, не більше 40 амінокислот, бажано не більше 30 амінокислот, та найбільш бажано не більше 20 амінокислот у довжину. У деяких втіленнях пептидний лінкер є конкатамером послідовності Gly-GlyGly-Gly-Ser, бажано 2, 3, 4, 5 або 6 таких послідовностей. Проте, необхідно оцінити, що можуть бути зроблені деякі амінокислотні заміни усередині лінкера. Наприклад, гліцин може бути заміщений на валін. 27 Одержання scFv Як описано вище, у бажаних втіленнях антитіло (наприклад, для націлювання залишку імунотоксину) представляє собою scFv. Способи для одержання scFv антитіл були описані у [Huse et al. // Science. – 1989. – 246. – P. 1275-1281; Ward et al. // Nature. – 1989. – 341. – P. 544-546; Vaughan et al. // Nature Biotech. 1996. – 14. – P. 309-314]. Коротко, була ізольована мРНК з В-клітин та було приготовлено кДНК, яку ампліфікували за допомогою відомих способів, таких як ПЛР, за допомогою праймерів, специфічних для варіабельних ділянок важкого та легкого ланцюгів імуноглобуліну. Продукти ПЛР очищали за допомогою, наприклад, електрофорезу в агарозному гелі, та поєднували послідовності нуклеїнових кислот. Якщо лінкерний пептид є бажаним, послідовності нуклеїнових кислот, що кодують пептид, вбудовували між послідовностями нуклеїнових кислот важкого та легкого ланцюгів. Послідовності можна поєднувати за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки, таких як лігування тупих кінців, вбудовування рестрикційних сайтів на кінцях продуктів ПЛР або шляхом сплайсингу за допомогою перекриваючого подовження [Chowdhury et al. // Mol. lmmunol. 1997. – 34. – P. 9]. Після ампліфікації нуклеїнові кислоти, що кодують scFv, вбудовували у вектор, знову за допомогою способів, добре знайомих спеціалісту у даній галузі. Бажане, щоб вектор був здатний до реплікації у прокаріотах та для того, щоб експресуватись як у прокаріотах, так і в еукаріотах. У бажаному втіленні scFv гени поєднують з РЕ38 геном за допомогою короткого лінкера та клонують в експресійний вектор, що базується на Т7. В особливо бажаних втіленнях scFv експресується під контролем промотора Т7 у E.coli BL21 ( DE3). Як було зазначено у попередніх розділах, scFv, що специфічно зв'язується з EGFRvlll, знаходять за допомогою пенінгу. Пенінг можна проводити одним з наступних способів. У бажаному способі у зв'язку з даним винаходом, пенінг може відповідно виконуватись при використанні клітин, які представлені у прикладах нижче. Пенінг можна також проводити на твердій поверхні шляхом покриття твердої поверхні EGFRvlll та при інкубації фага на поверхні протягом прийнятного періоду часу при прийнятних умовах. Зручно, коли поверхня буде поверхнею магнітної кулькою. Відкриття антитіла з найвищою афінністю визначається ефективним селекційним процесом та залежить від ряду клонів, що можуть піддаватись скринінгу, та від жорсткості умов, в яких проводять цей процес. Типово, висока напруженість відповідає більш селективному пенінгу. Проте, якщо умови є дуже суворими, фаг не буде зв'язуватись. Після першого кола пенінгу фаг, який зв'язався з вкритими EGFRvlll планшетами або з клітинами, що експресують EGFRvlll на своїй поверхні, розмножують в E.coli та піддають іншому колу пенінгу. Таким чином, збагачення у багато разів відбувається протягом 3 кіл пенінгу. Отже, навіть, коли збагачення у кожному колі є низьким, багаторазові кола пенінгу будуть приводити до ізоляції рідкісного фага та генетичного матеріалу, що міститься усередині, та який кодує scFv з найвищою афінніс 77157 28 тю або один з яких найкраще експресується у фагові. Незважаючи на те, що спосіб пенінгу вибраний, фізичний зв'язок між генотипом та фенотипом, що забезпечується фаговим виявленням, робить можливим тестування кожного члена бібліотеки кДНК для зв'язування з антигеном, навіть з великими бібліотеками клонів. Зв'язувальна афінність антитіл Антитіла згідно з даним винаходом зв'язуються з епітопом EGFRvlll з Kd принаймні на 1нМ нижче, ніж така для вихідного антитіла MR1. Зв'язувальна афінність для цільового антигену типово вимірюється або визначається стандартними методами антиген-антитіло, такі як конкурентні аналізи, аналізи насичування, або аналізи, такі як ELISA a6o RIA. Такі аналізи можуть використовуватись для визначення константи дисоціації антитіла. Фраза “константа дисоціації" відноситься до вимірювання афінності антитіла для антигену. Специфічність зв'язування між антитілом та антигеном існує, якщо константа дисоціації (Kd=1/K, де К є константою афінності) антитіла лежить у мікромолярному інтервалі, бажано < 100нМ, найбільш бажано < 0,1нМ. Молекули антитіл будуть типово мати Kd у низьких інтервалах. Kd=[Ab-Ag]/[Ab][Ag], де [Ab] представляє собою концентрацію при рівновазі антитіла, [Ад] є концентрацією при рівновазі антигену, а [АЬ-Ад] є концентрацією при рівновазі комплексу антитіло-антиген. Типово, зв'язувальні взаємодії між антигеном та антитілом включають двосторонні нековалентні асоціації, такі як електростатичне притягування, сили Ван дер Ваальса та водневі зв'язки. Цей метод визначення зв'язувальної специфічності застосовується до одноланцюгових важких та/або легких ланцюгів, CDR, злитих білків або фрагментів важкого та/або легкого ланцюгів, що є специфічними для EGFRvlll. Імуноаналізи Антитіла можуть бути визначені та/або кількісно оцінені при використанні ряду добре відомих аналізів імунологічного зв'язування, наприклад, [US, 4,366,241; US, 4,376,110; US, 4,517,288; US, 4,837,168]. Для огляду загальних імунологічних аналізів, дивись також [Methods in Cell Biology, Vol.37, Asai, - New York: ed.Academic Press, Inc., 1993; Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds., 1991]. Аналізи імунологічного зв'язування (або імуноаналізи) типово використовують ліганд (наприклад, EGFRvlll) для специфічного зв'язування та часто мобілізації антитіла. Антитіла, що використовуються у імуноаналізах згідно з даним винаходом, обговорювались більш детально вище. Імуноаналізи також часто використовують мітку при специфічному зв'язуванні, мітка зв'язувального комплекса утворюється лігандом та антитілом. Мітка може сама по собі бути одним з залишків, що включає комплекс антитіло/аналіт, тобто анти-EGFRvlll антитіло. Альтернативно, мітка може бути третім залишком, таким як інше антитіло, що специфічно зв'язується з комплексом антитіло/EGFRvlll білок. 29 В одному аспекті конкурентний аналіз проводять, якщо мітка є другим анти-EGFRvlll антитілом, що несе мітку. Два антитіла потім конкурують за зв'язування з імобілізованим EGFRvlll. У втіленнях, де питання полягає у порівнянні афінності першого антитіла з таким MR1, друге антитіло може бути MR1. Альтернативно, у неконкурентних умовах EGFRvlll антитіло не має мітки, але друге антитіло, специфічне для антитіл різних видів, від яких одержане EGFRvlll антитіло, наприклад, мишине, та яке зв'язується з анти-EGFRvlll антитілом, є міченим. Інші білки, здатні до специфічного зв'язування з імуноглобуліновими постійними ділянками, такі як Білок А або Білок G, можуть також використовуватись як агент для мічення. Ці білки є нормальними складовими клітинних стінок стафілококової бактерії. Вони демонструють сильну неімуногенну реактивність з постійними ділянками імуноглобуліну з різних видів [Kronwal et al. // J. Immunol. 1973. – 111. – P. 1401-1406; Akerstrom et al. // J. Immunol. 1985. – 135. – P. 2589-2542]. Під час аналізів етапи інкубації та/або промивання можуть бути необхідними після кожної комбінації реагентів. Етапи інкубування можуть варіювати від приблизно 5с до кількох годин, бажано від 5хв. до приблизно 24год. Проте, час інкубації буде залежати від виду аналізу, антитіла, об'єму розчину, концентрацій, тощо. Звичайно, аналізи будуть виконуватись при температурі навколишнього середовища, незважаючи на те, що їх можна проводити за межами інтервалу температур, при температурах від 4°С до 40°С. Оскільки деталі імуноаналізів згідно з даним винаходом можуть варіювати в залежності від певного способу, що використовується, спосіб визначення анти-EGFRvlll антитіл у зразку, що містить антитіла, взагалі включає етапи приведеннязразку у контакт з антитілом, яке специфічно реагує при імунологічно реактивних умовах з комплексом EGFRvlІІ/антитіло. Одержання імунокон'югатів Анти-EGFRvlll антитіла, одержані у даному винаході, можуть приєднуватись до ефекторних молекул (ЕМ) за допомогою карбокситермінального кінця, амінотермінального кінця ЕМ, через внутрішній амінокислотний залишок ЕМ такий, як цистеїн, або за допомогою їх комбінації. Подібно до цього ЕМ може зв'язуватись безпосередньо з важкою, легкою, Fc (постійною ділянкою) або структурними ділянками антитіла. Зв'язок може утворюватись через аміно- або карбокси-термінальний кінець антитіла, або через внутрішній амінокислотний залишок. Якщо РЕ або його цитотоксичний фрагмент використовуються як ЕМ, зв'язки у або поблизу карбокситермінального кінця будуть створені таким чином, щоб підтримувати або додавати (якщо зв'язок знаходиться на С-термінальному кінці) послідовність, яка функціонує як сигнальна послідовність для направлення молекули до цитозолю. Прийнятні сигнальні амінокислотні послідовності, такі як REDLK (послідовність природного РЕ в однобуквенному коді), KDEL, RDEL та повтори KDEL, відомі у даній галузі техніки, наприклад, [WO, 91/18099]. Крім того, багаточисельні ЕМ молекули 77157 30 (наприклад, будь-яка від 2 до 10) можуть зв'язуватись з анти-EGFRvlll антитілом та/або багаточисельними антитілами (наприклад, будь-яким від 2 до 5), що можуть бути зв'язані з ЕМ. Молекула, утворена шляхом зв'язування ефекторної молекули з антитілом, відома як імунокон'югат. Терапевтичний агент є агентом з певною біологічною активністю, направленою проти певної цільової молекули або клітини, що несе цільову молекулу. Будь-який спеціаліст у даній галузі може оцінити, що терапевтичні агенти можуть включати різноманітні лікарські засоби, такі як вінбластин, дауноміцин та подібні, цитотоксини, такі, як природний або модифікований екзотоксин Pseudomonas або дифтерійний токсин, інкапсульовані агенти (наприклад, ліпосоми), які самі по собі містять фармакологічні композиції, радіоактивні агенти, такі як 125І, 32Р, 14С, 3Н, 35S та інші мітки, націлювальні залишки та ліганди. Вибір певного терапевтичного агенту залежить від конкретної цільової молекули або клітини та біологічного ефекту, який бажано викликати. Таким чином, наприклад, цитотоксичний агент може бути цитотоксином, який використовується для руйнування певної цільової клітини. Навпаки, якщо бажано викликати тільки нелетальну біологічну відповідь, терапевтичний агент може бути кон'югований з нелетальним фармакологічним агентом або ліпосомою, що містить нелетальний фармакологічний агент. З терапевтичними агентами та антитілами, що забезпечуються у даному винаході, будь-який спеціаліст у даній галузі легко зможе сконструювати різноманітність клонів, що містять функціонально еквівалентні нуклеїнові кислоти, такі нуклеїнові кислоти, які відрізняються послідовностями, але які кодують ту саму послідовність ЕМ або послідовність антитіла. Таким чином, даний винахід забезпечує нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла та кон'югати, а також їх злиті білки. Рекомбінантні способи Послідовності нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом можуть бути приготовлені будьяким прийнятним способом, включаючи клонування прийнятних послідовностей або прямим хімічним синтезом за допомогою методів, таких як фосфодіестеровий спосіб [Narang et al. // Meth. Enzymol. – 1979. – 68. P.90-99]; фосфодіестеровим способом [Brown et al. // Meth. Enzymol. – 1979. – 68. – P.109-151]; діетилфосфорамідатним способом [Beaucage et al. // Tetra. Lett. - 1981. – 22. – P.1859-1862]; твердофазним фосфорамідатним триестеровим способом [Beaucage & Caruthers // Tetra. Letts. – 1981. - 22(20). – P.1859-1862], наприклад, використовуючи автоматичний синтезатор [Needhaman-VanDevanter et al. // Nucl. Acids Res. – 1984. – 12. – P. 6159-6168]; та способом при використанні твердої основи згідно з [US, 4,458,066]. Хімічним синтезом одержують одноланцюговий олігонуклеотид. Він може бути перетворений у дволанцюгову ДНК шляхом гібридизації з комплементарною послідовністю, або шляхом полімеризації з ДНК-полімеразою при використанні одного ланцюга як матриці. Будь-який спеціаліст у даній галузі знає, що оскільки хімічний синтез ДНК об 31 межений послідовностями довжиною приблизно 100 пар основ, довші послідовності можуть бути одержані лігуванням коротших послідовностей. У бажаному втіленні послідовності нуклеїнових кислот згідно з винаходом готують при використанні методики клонування. Приклади прийнятних методик клонування та секвенування та інструкції, достатні для того, щоб дати підказки спеціалістові, що має навички у клонуванні, можуть бути знайдені у [Sambrook et al. // Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2nd Ed.). Cold Spring Harbor Laboratory. – 1989. - Vols. 1-3.; Berger, Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego CA, 1987; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1987]. Інформація виробників стосовно біологічних реагентів та експериментального обладнання також може забезпечити корисну інформацію. Такі виробники включають хімічну компанію SIGMA (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WT), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen (San Diego, CA) та ΡΕ Applied Biosystems (Foster City, CA), а також стосуються багатьох інших комерційних джерел, відомих спеціалісту у даній галузі. Нуклеїнові кислоти, що кодують природні ефекторні молекули (ЕМ) або анти-EGFRvlll антитіла, можуть бути модифіковані для створення ЕМ, антитіл, або імунокон'югатів згідно з даним винаходом. Модифікації при використанні сайтнаправленого мутагенезу добре відомі у даній галузі техніки. Нуклеїнові кислоти, що кодують ЕМ або анти-EGFRvlll антитіла, можуть ампліфікуватись за допомогою способів in vitro. Способи ампліфікації включають полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), лігазну ланцюгову реакцію (ЛЛР), ампліфікаційну систему, що базується на транскрипції (TAS), самопідтримувану систему реплікації послідовностей (3SR). Широка різноманітність способів клонування, хазяйських клітин та ампліфікаційних методик добре відомі спеціалісту у даній галузі. У бажаному втіленні імунокон'югати готують вбудовуванням кДНК, яка кодує анти-EGFRvlll scFv антитіло, у вектор, який включає кДНК, що кодує ЕМ. Інсерція була зроблена таким чином, що scFv та ЕМ зчитуються у рамці, і містяться в одному поліпептиді, який має функціональну ділянку Fv та функціональну ділянку ЕМ. В особливо бажаному втіленні кДНК, що кодує фрагмент дифтерійного токсину, лігують до scFv. У найбільш бажаному втіленні кДНК, що кодує РЕ або його цитотоксичний фрагмент, лігується до scFv так, що токсин розташовується на карбоксильному кінці scFv. У найбільш бажаному втіленні цитотоксичний фрагмент представляє собою РЕ38. Нуклеїнова кислота, яка кодує ЕМ, антиEGFRvlll антитіло, або імунокон'югат згідно з даним винаходом ізолюють та клонують, при цьому 77157 32 будь-яка особа може експресувати бажаний білок у клітині, одержаній за допомогою генетичної інженерії. Очікується, що спеціаліст у даній галузі має достатньо знань стосовно багаточисленних експресійних систем, доступних для експресії білка, включаючи Е.соli, інших бактеріальних хазяїв, дріжджі та різноманітні вищі еукаріотичні клітини, такі, як COS, CHO, HeLa та мієломні клітинні лінії. Не може бути зроблено жодної спроби описати у деталях різноманітні способи, відомі для експресії білків у прокаріотах або еукаріотах. Коротко, експресія природних або синтетичних нуклеїнових кислот, що кодують ізольовані білки згідно з винаходом, буде типово досягатись за допомогою оперативного з'єднання ДНК або кДНК з промотором (який є або конститутивним або індуцибельним), після цього проводять вбудовування в експресійну касету. Касети можуть бути придатними для реплікації та інтеграції або у прокаріотах, або в еукаріотах. Типові експресійні касети містять термінатори транскрипції та трансляції, послідовності ініціювання, промотори, корисні для регуляції експресії ДНК, що кодує білок. Зручно, коли касети вводять у плазміди, які також містять один або більше генів стійкості до антибіотиків. Для одержання високого рівня експресії клонованого гена бажано конструювати експресійні касети, які містять, як мінімум, сильний промотор для керування транскрипцією, сайт, що зв'язує рибосому для ініціації трансляції та термінатор транскрипції/трансляції. Для Е.соli такий включає промотор, такий як промотор Т7, trp, lac або фага лямбда, сайт зв'язування рибосоми та бажано сигнал термінації транскрипції. Для еукаріотичних клітин контрольні послідовності можуть включати промотор та бажано енхансер, що має походження від імуноглобулінових генів, SV40, цитомегаловірусу та послідовності поліаденілування, а також може включати донорні та акцепторні послідовності сплайсингу. Касети згідно з винаходом можуть бути перенесені у вибрану хазяйську клітину добре відомими способами, такими, як опосередкована хлоридом кальцію трансформація або електропорація для Е.соli, обробка фосфатом кальцію, електропорація або ліпофекція для клітин ссавців. Клітини, трансформовані касетами, можуть піддаватись селекції на стійкість до антибіотиків, що забезпечується генами стійкості, що містяться у касетах, такими як amp, kan, gpt, neo, hyg генами. Стійкість до канаміцину та стійкість до ампіциліну є бажаними втіленнями при роботі з фагом. Будь-який спеціаліст у даній галузі повинен визнати, що модифікації можуть бути проведені з нуклеїновою кислотою, яка кодує поліпептид згідно з даним винаходом (тобто, анти-EGFRvlll антитіло, РЕ, або імунокон'югат, утворений їх комбінацією) без зменшення їх біологічної активності. Можуть бути зроблені деякі модифікації для поліпшення клонування, експресії, або вбудовування цільової молекули у злитий поліпептид. Такі модифікації добре відомі спеціалісту у даній галузі та включають, наприклад, метіонін, який додається до амінотермінального кінця для забезпечення сайту ініціації, або додаткові амінокислоти (наприклад, полі His), які розміщують або на кінці для створен 33 ня зручних рестрикційних сайтів, або кодонів термінації, або послідовностей очистки. Додатково до рекомбінантних способів, імунокон'югати, ЕМ та антитіла згідно з даним винаходом можуть також бути сконструйовані взагалі та зокрема при використанні стандартного способу синтезу пептидів. Твердофазний синтез поліпептидів згідно з даним винаходом менших, ніж 50 амінокислот у довжину, може виконуватись шляхом приєднання С-термінального кінця амінокислотної послідовності до нерозчинної основи, після цього проводять послідовне додання у послідовність амінокислот, що залишились. Методики для твердофазного синтезу описані [Barany & Merrifield. The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. P. 3-284; Merrifield et al. // J. Am. Chem. Soc. – 1963. – 85. – P. 2149-2156; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd, Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984)]. Білки більшої довжини можуть бути синтезовані шляхом конденсації аміно- та карбокси-термінальних кінців коротших фрагментів. Способи формування пептидних зв'язків шляхом активації карбокситермінального кінця (наприклад, шляхом використання зв'язувального реагенту Ν, Ν'-дициклогексилкарбодиіміду) відомі спеціалісту у даній галузі. Очистка Після експресії рекомбінантні імунокон'югати, антитіла та/або ефекторні молекули згідно з даним винаходом повинні бути очищені згідно зі стандартними способами, відомими у даній галузі, включаючи преципітацію сульфатом амонію, афінні колонки, іон-обмінні колонки, колонки для гельфільтрації та серійної хроматографія, тощо [R.Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag. N.Y., 1982]. Суттєво чисті композиції, принаймні ті, що мають приблизно 90-95% гомогенність, є бажаними, а ті, що мають гомогенність 98-99%, є найбільш бажаними для фармацевтичного використання. Очищені частково або до бажаної гомогенності поліпептиди, якщо використовуються терапевтично, будуть суттєво вільними від ендотоксину. Способи для експресії одноланцюгового антитіла та/або повторної зборки до прийнятно активної форми, включаючи одноланцюгові антитіла, одержані від бактерій, таких як Е.соli, описані та добре відомі, вони є такими, що застосовуються до антитіл згідно з даним винаходом, та введені у заявку як посилання [Buchner et al. // Anal. Biochem. - 1992. - 205. - P. 263-270; Pluckthum // Biotechnology. - 1991. - 9. - P. 545; Huse et al. // Science/ - 1989. - 246. - P. 1275; Ward et al. // Nature. - 1989. – 341. - P. 544]. Часто функціональні гетерологічні білки з Е.соli або інших бактерій, ізольовані з тілець включення, потребують розчинення при використанні сильних денатурантів, та подальшої повторної зборки. Під час етапу розчинення, що добре відомий у даній галузі техніки, відновлювальний агент може бути присутнім для відновлення дисульфідних зв'язків. Типовий буфер з відновлювальним агентом містить 0,1Μ Трис, рН 8, 6М гуанідин, 2мМ ЕДТА, 0,ЗМ DTE (дитіоеритритол). Повторне окис 77157 34 лення дисульфідних зв'язків може відбуватись у присутності тіолових реагентів з низькою молекулярною вагою у редукованій та окисленій формі, як описано у [Saxena et al. // Biochemistry. – 1970. – 9. – P.5015-5021], що введене у дану заявку як посилання, та зокрема описане у [Buchner et al. // Anal. Biochem. –1992. – 205. – P.263-270]. Ренатурація типово супроводжується розведенням (наприклад, 100-кратним) денатурованого та редукованого білка у буфері для самозборки. Типовий буфер має склад 0,1Μ Трис, рН 8,0, 0,5Μ L-аргінін, 8мМ окислений глутатіон (GSSG) та 2мМ ЕДТА. Як модифікація пропису, що стосується очистки дволанцюгового антитіла, ділянки важкого та легкого ланцюгів окремо розчиняють та редукують, а потім комбінують у розчині для повторної зборки. Бажаний вихід одержували, коли ці два білки перемішували у молярному співвідношенні, такому, що 5-кратний молярний надлишок одного білка понад іншим, не було перевершено. Бажано додавати надлишок окисленого глутатіону або інших окислювальних сполук з низькою молекулярною вагою до середовища зборки після закінчення окисно-відновлювального перерозподілу. Екзотоксин Pseudomonas та інші токсини Для одержання імунотоксинів токсини можуть використовуватись разом з антитілами згідно з даним винаходом. Типові токсини включають рицин, абрин, дифтерійний токсин або їх субодиниці, а також токсини ботулізму від А до F. Ці токсини є легкодоступними з комерційних джерел [Sigma Chemical Company, St.Louis, MO]. Дифтерійний токсин ізольований з Corynebacterium diphtheriae. Рицин представляє собою лектин RCA60 з Ricinus communis (Castor bean). Цей термін також відноситься до його токсичних варіантів, наприклад, [US, 5,079,163; US, 4,689,401]. Аглютинін Ricinus communis (RCA) існує у двох формах, позначених як RCA60 та RCA12o, У відповідності з їх молекулярною вагою приблизно 65кДа та 120кДа, відповідно [Nicholson & Blaustein // J. Biochim. Biophys. Acta. - 1972. - 266. - P. 543]. Ланцюг А відповідає за інактивацію білкового синтезу та руйнування клітин. Ланцюг В зв'язує рицин з галактозними залишками на поверхні клітини та покращує транспорт А ланцюга у цитозоль [Olsness et al. // Nature. 1974. - 249. - P. 627-631; US, 3,060,165]. Абрин включає токсичні лектини з Abrus precatorius. Токсичні складові абрину а, b, с та d мають молекулярну вагу 63-67кДа та складаються з двох поліпептидних ланцюгів А та В, з'єднаних за допомогою дисульфідного зв'язку. Ланцюг А інгібує білковий синтез, В-ланцюг (абрин-b) зв'язується з залишками D-галактози [Funatsu et al. // Agr. Biol. Chem. - 1988. - 52. - P. 1095; Olsness // Methods Enzymol. 1978. - 50. - P. 330-335]. У бажаних втіленнях даного винаходу токсин є екзотоксином A Pseudomonas (ΡΕ). Нативний ΡΕ представляє собою дуже активний мономерний білок (молекулярна вага 66кДа), що секретується Pseudomonas aeruginosa, який інгібує синтез білків в еукаріотичних клітинах. Нативна РЕ послідовність забезпечується відповідно до [US, 5,602,095]. Спосіб дії полягає в інактивації фактора 2 елонга 35 ції (EF-2) за допомогою АДФ-рибозилування. Екзотоксин містить три структурні домени, які впливають узгоджено на цитотоксичність. Домен Іа (амінокислоти 1-252) опосередковує клітинне зв'язування. Домен II (амінокислоти 253-364) відповідає за транслокацію у цитозоль, а домен III (амінокислоти 400-613) опосередковує АДФ рибозилювання фактора 2 елонгації. Функція домена Ib (амінокислоти 365-399) залишається невизначеною, незважаючи на те, що він складає велику частину, амінокислоти 365-380, можуть бути делетовані без втрати цитотоксичності. Термін "екзотоксин Pseudomonas", як такий, що використовується у контексті даної заявки, відноситься до нативної послідовності, цитотоксичного фрагменту нативної послідовності та консервативно модифікованих варіантів нативного РЕ та їх цитотоксичним фрагментам. У бажаному втіленні молекула РЕ модифікується для делетування домену Іа, для зменшення або руйнування неспецифічного зв'язування токсину. Цитотоксичні фрагменти РЕ включають ті, які мають цитотоксичність з або без відповідним протеолітичним або іншим процесуванням у цільовій клітині (наприклад, як білок або попередник білка). Цитотоксичні фрагменти РЕ включають РЕ40, РЕ35. РЕ40 є вкороченою похідною РЕ, як було раніше описано у даній галузі техніки [Pai et al. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1991. - 88. - P. 3358-3362; Kondo et al. // J. Biol. Chem. - 1988. - 263. - P. 9470-9475]. PE35 є карбокситермінальним фрагментом РЕ з молекулярною вагою 35кДа, що відповідає амінокислоті 280, після якої йдуть амінокислоти 281-364 та 381-613 нативного ΡΕ. ΡΕ38 є вкороченим попередником РЕ, що складається з амінокислот 253-364 та 381-613 ΡΕ. ΡΕ38 активується до своєї цитотоксичної форми при процесуванні усередині клітини [US, 5,608,039]. В особливо бажаних втіленнях РЕ38 є токсичним залишком імунотоксину згідно з винаходом. Проте, цитотоксичні фрагменти РЕ35 та РЕ40 також можуть використовуватись. Ці фрагменти розкриті у [US, 5,602,095; US, 4,892,827], кожний з яких введений у дану заявку як посилання. Спираючись на роботу, що проводилась з імунотоксинами, які базуються на MR1, KDEL є бажаною модифікацією С-термінальної послідовності [Lorimer et al. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1996. - 93. P.14815-14820]. Консервативно модифіковані варіанти РЕ Консервативно модифіковані варіанти РЕ або його цитотоксичні фрагменти мали принаймні 80% подібність до послідовності, бажано принаймні 85% подібності до послідовності, більш бажано принаймні 90% подібності до послідовності, та найбільш бажано принаймні 95% подібності до послідовності на амінокислотному рівні з РЕ, що представляє інтерес, таким як РЕ38. Термін "консервативно модифіковані варіанти" застосовується як до амінокислотних послідовностей, так і для послідовностей нуклеїнових кислот. Стосовно певних послідовностей нуклеїнових кислот консервативно модифіковані варіанти відносяться до тих послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або суттєво ідентичні аміно 77157 36 кислотні послідовності, або, якщо нуклеїнова кислоти не кодує амінокислотної послідовності, то до суттєво ідентичних послідовностей нуклеїнових кислот. З причини виродженності генетичного коду велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодує будь-який даний поліпептид. Наприклад, кодони GCA, GCC, GCG та GCU усі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожному положенні, де аланін визначається кодоном, кодон може бути змінений на відповідні кодони, що описують без зміни поліпептид, що кодується. Такі варіації нуклеїнової кислоти є "мовчазними варіаціями", що представляють собою один з видів консервативно модифікованих варіацій. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти у даній заявці, що кодує поліпептид, також описує кожну можливу мовчазну варіацію нуклеїнової кислоти. Будь-який спеціаліст у даній галузі визнає, що кожний кодон у нуклеїновій кислоті (за винятком AUG, який звичайно є єдиним кодоном для метіоніну, та UGG, який є єдиним кодоном для триптофану) може бути змінений для одержання функціонально ідентичної молекули. Таким чином, кожну мовчазну варіацію нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, мають на увазі у кожній описаній послідовності. Щодо амінокислотних послідовностей, то слід сказати, що будь-який спеціаліст знає, що індивідуальні заміни, делеції або вставки у послідовність нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або білка, які змінюють, додають або делетують одну амінокислоту або невеликий процент амінокислот у послідовності, що кодується, є "консервативно модифікованими варіантами", в яких заміна приводить до заміни амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. Аналіз цитотоксичності РЕ Екзотоксини Pseudomonas, що використовуються у даному винаході, можна визначати для бажаного рівня цитотоксичності за допомогою аналізів, що добре знайомі спеціалісту у даній галузі. Наприклад, цитотоксичність часто вимірюють при використанні інгібування білкового синтезу за допомогою екзотоксину Pseudomonas як заміщувального засобу, наприклад, [Lorimer et al. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1996. - 93. - P.14815-14820]. Зручно, щоб це можна було зробити вимірюванням поглинання радіоактивно міченої амінокислоти клітинами як показано у [Proir et al. // Cell. 1991. - 64. - P.1017-1023], що у нормі не експресують EGFRvlll, але які було трансфіковано за допомогою кДНК EGFRvlll. У прикладах, наведених нижче, надходження лейцину, міченого тритієм, вимірювали в NR6M клітинах (Swiss 3T3 клітини, вибрані завдяки відсутності експресії мишиного EGFRvlll та трансфіковані кДНК EGFRvlll людини). Таким чином, цитотоксичні фрагменти можуть бути легко проаналізовані на цитотоксичність. Велика кількість кандидатних РЕ молекул може бути перевірена одночасно на цитотоксичність за допомогою способів, що добре відомі у даній галузі техніки. Наприклад, підгрупи кандидатних молекул можуть бути перевірені на цитотоксичність. Підгрупи кандидатних молекул, що мають 37 позитивну реакцію, можуть бути розділені та повторно проаналізовані до тих пір, поки не буде ідентифіковано бажаний цитотоксичний фрагмент(и). Такі способи дозволяють проводити швидкий скрінінг великої кількості цитотоксичних фрагментів або консервативних варіантів РЕ. Інші терапевтичні залишки Антитіла згідно з даним винаходом можуть також використовуватись для націлювання будь-якої кількості різноманітних діагностичних або терапевтичних сполук на клітини, які експресують EGFRvlll на своїй поверхні. Таким чином, антитіло згідно з даним винаходом, таке, як анти-EGFRvlll scFv, може бути приєднане безпосередньо або за допомогою лінкера до препарату, який прямо доставляється до клітин, що несуть EGFRvlll. Терапевтичні агенти включають такі сполуки як нуклеїнові кислоти, білки, пептиди, амінокислоти або їх похідні, глікопротеїни, радіоізотопи, ліпіди, вуглеводи або рекомбінантні віруси. Нуклеїнова кислота терапевтичних та діагностичних залишків включає антисмислові нуклеїнові кислоти, дериватизовані олігонуклеотиди для ковалентного перехресного зв'язування з одноланцюговою або дволанцюговою ДНК та олігонуклеотиди, що формують триплети. Альтернативно, молекула, зв'язана з антиEGFRvlll антитілом може бути інкапсуляційною системою, такою як ліпосома або міцела, що містить терапевтичну композицію, таку як лікарський препарат, нуклеїнова кислота (наприклад, антисмислова нуклеїнова кислота), або інший терапевтичний залишок, що бажано захищений від прямої дії циркуляторної системи. Способи приготування ліпосом, приєднаних до антитіл, добре відомо спеціалісту у цій галузі, наприклад, [US, 4,957,735; Connor et al. // Pharm. Ther. - 1985. - 28. - P.341365]. D. Мітки, що детектують Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути необов'язково ковалентно або нековалентно зв'язані з міткою, що детектується. Мітки, що детектуються, та які придатні для такого використання, включають будь-яку композицію, що визначається спектроскопічними, фотохімічними, імунохімічними, електричними, оптичними способами. Корисні мітки у даному винаході включають магнітні кульки (наприклад, DYNABEADS), флуоресцентні барвники (наприклад, флуоресцеїн ізотіоціанат, техаський червоний, родамін, зелений флуоресцентний білок тощо), радіомітки (наприклад, 3Н, 125І, 35S, 14C або 32Р), ферменти (наприклад, пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, люциферазу та інші, що широко використовуються в ELISA) та колориметричні мітки, такі як колоїдне золото або кульки з кольорового скла або з пластику (наприклад, полістерину, поліпропілену, латексу тощо). Засоби для визначення таких міток добре знайомі спеціалісту у даній галузі. Таким чином, наприклад, радіомітки можуть детектуватись при використанні фотографічної плівки або сцинтиляційного лічильника, флуоресцентні маркери можуть визначатись за допомогою фотодетектора для визначення випромінюваного світла. Ферментативні мітки типово детектуються при забезпе 77157 38 ченні ферменту та субстрату та визначенні реакції продукту, що утворюється при дії ферменту на субстрат, та колориметричних міток, які визначаються простою візуалізацією кольорової мітки. Кон'югація з антитілом У нерекомбінантному втіленні винаходу ефекторні молекули, наприклад, терапевтичні, діагностичні, або детектувальні залишки, зв'язуються з анти-EGFRvlll антитілом згідно з даним винаходом при використанні будь-якого з цілого ряду засобів, що добре відомі спеціалісту у даній галузі. Засоби як ковалентного, так і нековалентного приєднання, можуть використовуватись з анти-EGFRvlll антитілами за даним винаходом. Процедура приєднання ефекторної молекули до антитіла буде варіювати в залежності від хімічної структури ЕМ. Поліпептиди типово містять різноманітність функціональних груп; наприклад, карбоксильну кислоту (СООН), вільний амін (-NH2) або сульфгідрильні (-SH) групи, які є доступними для реакції з прийнятною функціональною групою антитіла для того, щоб приводити до зв'язування ефекторної молекули. Альтернативно, антитіла дериватизують для піддання дії або приєднання додаткових реактивних функціональних груп. Дериватизація може включати приєднання будь-якого числа лінкерних молекул, таких, як ті, що доступні від Pierce Chemical Company, Rockford Illinois. "Лінкер" як такий, як використовується у контексті даної заявки, є молекулою, що використовується для приєднання антитіла до ефекторної молекули. Лінкер здатний до формування ковалентних зв'язків як з антитілом, так і з ефекторною молекулою. Прийнятні лінкери добре знайомі спеціалісту у даній галузі та включають, але не обмежені, вуглецеві лінкери з нерозгалуженими або розгалуженими ланцюгами, гетероциклічні вуглецеві лінкери або пептидні лінкери. Якщо антитіло та ефекторна молекула є поліпептидами, лінкери можуть приєднуватись до складових амінокислот через їх бічні групи (наприклад, через дисульфідний зв'язок до цистеїну). Проте, у бажаному втіленні лінкери будуть приєднуватись до альфа-карбонову аміно- та карбоксильну групу термінальних амінокислот. У деяких випадках бажано вивільнити ефекторну молекулу з антитіла, коли імунокон'югат досягне свого цільового сайту. Розщеплення лінкера для вивільнення ефекторної молекули з антитіла може бути викликане ферментативною активністю або умовами, дії яких піддається імунокон'югат або усередині цільової клітини або поблизу цільового сайту. Коли цільовий сайт є пухлиною, то може використовуватись лінкер, який розрізується при умовах, які присутні у пухлинному сайті (наприклад, коли піддається дії асоційованих з пухлиною ферментів або кислого рН). З огляду на велику кількість способів, які були викладені для приєднання різноманітності радіодіагностичних сполук, радіотерапевтичних сполук, лікарських препаратів, токсинів та інших агентів, до антитіл будь-який спеціаліст у даній галузі здатний визначити прийнятний спосіб для приєднання даного агенту до антитіла або іншого поліпептиду. 39 VII. Фармацевтичні композиції та введення Композиції антитіла та/або імунокон'югату згідно з винаходом (тобто РЕ, зв'язані з антитілом, з Kd для епітопу EGFRvlll, що є принаймні на 1нМ нижче, ніж таке для MR1), є корисними для введення у мозок. Використання імунотоксинів для терапії мозкових пухлин було нещодавно розкрито в огляді [Oldfield, Ε., Youle, R. // Curr. Top. Microbiol. lmmunol. 1998. - 234. - P.97-114]. Невеликі поліпептиди долають гемато-енцефалічний бар'єр. Для довших поліпептидів, які не можуть подолати гемато-енцефалічний бар'єр, добре відомі способи введення білків у мозок. Наприклад, білки, поліпептиди та інші сполуки клітин можуть доставлятись до мозку ссавців за допомогою інтрацеребровентрикулярної (ICV) ін'єкції або через канюлю [Motta & Martini // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1981. - 168. - P.62-64); Peterson et al. // Biochem. Pharmacol. 1982. - 31. - P.2807-2810; Rzepczynski et al. // Metab. Brain Dis. - 1988. - 3. - P.211-216; Leibowitz et al. // Brain Res. Bull. - 1988. - 21. P.905-912; Sramka et al. // Stereotact. Funct. Neorisurg. - 1992. - 58. - P.79-83; Peng et al. // Brain Res. - 1993. - 632. - P.57-67; Chem et al. // Exp. Neurol. - 1994. - 125. - P.72-81; Nikk'hah et al. // Neuroscience. - 1994. - 63. - P.57-72; Anderson et al. // J. Comp. Neurol. - 1995. - 357. - P.296-317; Brecknell & Fawcett // Exp. Neurol. - 1996. - 138. P.338-344]. Таким чином, гліобластома може лікуватись за допомогою локалізованої доставки через канюлю або шприц до тканини, що оточує пухлину, або більш загально усередину компартменту центральної нервової системи шляхом ICV. Додатково, імунокон'югати можуть вводитись системно, якщо, наприклад, гліобластома пацієнта зруйнувала епітеліальні клітини достатньо для того, щоб дозволити порушення гемато-енцефалічного бар'єру. Антитіло або імунокон'югати за даним винаходом можуть також вводитись локально або системно для лікування карциноми молочної залози, яєчника, легень. Наприклад, ці злоякісні утворення можуть лікуватись шляхом прямої ін'єкції у пухлини, які не можуть бути видалені хірургічно. Ці карциноми можуть також лікуватись шляхом парентерального введення імунокон'югатів, наприклад, локалізуватись та руйнувати будь-які метастатичні клітини, що ще не сформували пухлини достатнього розміру для того, щоб лікуватись радіацією або хірургічними способами, або бути такими, що легко визначаються. Композиція для введення буде взагалі включати розчин антитіла та/або імунокон'югату, розчиненого у фармацевтично прийнятному носії, бажано водному носії. Може використовуватись різноманітність водних носіїв, наприклад, забуферений фізіологічний розчин, тощо. Ці розчини є стерильними та, звичайно, вільні від небажаних речовин. Ці композиції можуть стерилізуватись за допомогою традиційних, добре відомих способів стерилізації. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні ауксилярні речовини, як вимагається для наближення до фізіологічних умов, такі як агенти для доведення рН та забуферювальні агенти, агенти для доведення токсичності тощо, 77157 40 наприклад, ацетат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію, лактат натрію тощо. Концентрація злитого білка у цих композиціях може дуже широко варіювати та буде вибиратись, головним чином, базуючись на рідких об'ємах, в'язкості, вазі тіла, тощо, згідно зі специфічним вибраним способом призначення та потребами пацієнта. Таким чином, типова фармацевтична композиція імунотоксину згідно з даним винаходом для введення у мозок буде складати приблизно 1,21200мкг на день. Типова композиція для інтравенозного призначення при лікуванні карциноми молочної залози, яєчника, або легень буде складати приблизно 0,1-10мг на день для пацієнта. Дози 0,1-100мг на пацієнта на день можуть використовуватись, зокрема, якщо лікарський препарат вводиться до віддаленого сайту та не потрапляє у циркуляторну або лімфатичну систему, як наприклад у порожнину тіла або у просвіт органу. Існуючі способи для приготування композицій для введення є відомими та зрозумілими для спеціаліста у даній галузі, а також описані у деталях у таких публікаціях, як [Remington's Pharmaceutical Science, 19th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995]. Композиції згідно з винаходом можуть вводитись для терапевтичного лікування. При терапевтичних застосуваннях композиції вводяться пацієнтові, що страждає на захворювання, такого як гліобластома, карцинома молочної залози, карцинома яєчника або легенева карцинома, у кількості, достатній принаймні для уповільнення розвитку або частинного затримання захворювання або його ускладнень. Кількість, необхідна для досягнення цього, визначається як "терапевтично ефективна доза". Кількості, ефективні для цього використання, залежать від тяжкості захворювання та загального стану здоров'я пацієнта. Ефективна кількість сполуки є такою, що забезпечує або суб'єктивне позбавлення від симптомі, або поліпшення стану, що об'єктивно визначається клінічними або іншим кваліфікованим обстеженням. Одноразове або багаторазове введення композиції призначають в залежності від дози та частоти, які необхідні та допустимі для пацієнта. У будь-якому випадку композиція буде забезпечувати достатню кількість білків за винаходом для ефективного лікування пацієнта. Бажано, щоб доза вводилась один раз, але може застосовуватись періодично або до тих пір, поки не буде досягнуто терапевтичного результату, або до тих пір, поки побічні ефекти не призведуть до закінчення терапії. Взагалі, доза є достатньою для лікування або полегшення симптомів або ознак захворювання без продукування неприйнятної для пацієнта токсичності. Контрольоване вивільнення парентеральних композицій імунокон'югатних композицій за даним винаходом може бути досягнуто при використанні як імплантату, так і масляних ін'єкцій, або сипучих систем. Системи білкової доставки розглянуті у [Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, HF, 1995]. Специфічні системи включають мікросфери, 41 мікрочастинки, мікрокапсули, нанокапсули, наносфери та наночастинки. Мікрокапсули містять терапевтичний білок як центральне ядро. У мікросферах терапевтична речовина диспергується у частинці. Частинки, мікросфери та мікрокапсули менші, ніж приблизно 1мкм, взагалі називаються як наночастинки, наносфери, нанокапсули, відповідно. Капіляри мають діаметр приблизно 5мкм, таким чином, тільки наночастинки призначаються внутрішньовенно. Мікрочастинки мають розмір 100мкм у діаметрі та призначаються підшкірно або внутрішньом'язово, наприклад, у джерелах [Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp.219-342 (1994); Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A.Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp.315-339 (1992)], що введені у дану заявку як посилання. Полімери можуть використовуватись для іонконтрольованого вивільнення імунокон'югатної композиції за даним винаходом. Різноманітні полімерні матрикси, які є такими, що піддаються деградації, або ті, що не піддаються деградації, можуть використовуватися при контрольованій доставці препарату і є відомими у даній галузі техніки [Langer, R. // Accounts Chem. Res. – 1993. – 26. – P.537-542]. Наприклад, блок сополімеру, полаксамеру 407 існує як густа, ще мобільна рідина при низьких температурах, але утворює напівтвердий гель при температурі тіла. Було показано, що він є ефективним носієм для створення та підтримання доставки рекомбінантного інтерлейкину-2 та уреази [Johnston et al. // Pharm. Res. - 1992. - 9. - P.425434); Pec et al. // J. Parent. Sci. Tech. - 1990. - 44(2). - P.58-65]. Альтернативно, гідроксиапатит використовувався як мікроносій для контрольованого вивільнення білків [Ijntema et al. // Int. J. Pharm. 1994. - 112. - P.215-224]. Ще в одному аспекті, ліпосоми використовуються для контрольованого вивільнення, а також для націлювання ліпідінкапсульованих лікарських засобів [Betageri et al. Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)]. Відомі багато чисельні додаткові системи для контрольованої доставки терапевтичних білків, наприклад, введені у дану заявку як посилання [US, 5,055,303; US, 5,188,837; US, 4,235,871; US, 4,501,728; US, 4,837,028; US, 4,957,735; US, 5,019,369; US, 5,055,303; US, 5,514,670; US, 5,413,797; US, 5,268,164; US, 5,004,697; US, 4,902,505; US, 5,506,206; US, 5,271,961; US, 5,254,342; US, 5,534,496]. Різноманітні способи використання імунотоксинів за даним винаходом включають симптоми захворювання, спричинені специфічними людськими клітинами, що експресують EGFRvlll, ці симптоми можуть бути усунені за допомогою токсичної дії імунокон'югату. Одним бажаним застосуванням для імунотоксинів за винаходом є лікування пухлинних клітин, що експресують EGFRvlll. Типові пухлинні клітини включають клітини гліобластоми, карциноми молочної залози, карциноми яєчника та карциноми легень. Діагностичні набори для використання in vitro 77157 42 В іншому втіленні цей винахід забезпечує набір для детектування EGFRvlll у біологічному зразку. "Біологічний зразок", як використовується у контексті даної заявки, є зразком біологічної тканини або рідини, що містить EGFRvlll. Такі зразки включають, але не обмежені, тканину, одержану шляхом біопсії, слину, амніотичну рідину, кров та клітини крові (наприклад, лейкоцити). Рідкі зразки можуть представляти деякий інтерес, але вони звичайно не є бажаними, оскільки концентрації EGFRvlll, що визначаються, рідко знаходять у зразку. Біологічні зразки також включають фрагменти тканин, такі як заморожені фрагменти, узяті для гістологічних досліджень. Біологічний зразок типово одержують з багатоклітинних еукаріот, бажано ссавців, таких як щури, миші, корови, собаки, гвінейські свині, або кролі та більш бажано від приматів, таких як макаки, шимпанзе. Більш бажаними є біологічні зразки, одержані від людини. Набори будуть типово включати анти-EGFRvlll scFv за даним винаходом, що має вищу афінність для EGFRvlll, ніж така для MR1 scFv. Крім того, набори будуть звичайно включати інструкційні матеріали, що розкривають способи використання антитіла за даним винаходом (наприклад, для детектування клітин, що містять EGFRvlll, у зразку). Набори можуть також включати додаткові компоненти для поліпшення специфічного застосування, для якого призначений набір. Таким чином, наприклад, набір може додатково містити мітку для детектування (наприклад, ферментні субстрати для ферментативних міток, комплекти для визначення флуоресцентних міток, прийнятні вторинні мітки, такі як баранячі антимишині-HPR, та інші). Набори можуть додатково включати буфери та інші реагенти, що звичайно використовуються на практиці для певного способу. Такі набори та прийнятні складові добре відомі спеціалістам у даній галузі. В одному втіленні даного винаходу діагностичний набір включає імуноаналіз. Як описано вище, хоча деталі імуноаналізів за даним винаходом можуть варіювати в залежності від специфічного способу, що використовується, спосіб детектування EGFRvlll у біологічному зразку типово включає етапи контакту біологічного зразка з антитілом, яке специфічно реагує в імунологічно реактивних умовах з EGFRvlll з вищою афінністю, ніж така, для MR1 scFv. Антитілу дозволяють зв'язуватися з EGFRvlll в імунологічно реактивних умовах, а присутність зв'язаного антитіла визначають безпосередньо або опосередковано. Завдяки збільшеній афінності антитіл, одержаних за допомогою методів, описаних у даній заявці, та, зокрема scFv, який позначається як MR1-1, антитіла, які забезпечуються даною заявкою, будуть особливо корисними як діагностичні агенти та в аналізах in vitro для визначення присутності EGFRvlll у біологічних зразках. Наприклад, MR1-1 та інші антитіла, одержані за допомогою способів, описаних у даній заявці, можуть використовуватись як націлювальні залишки імунокон'югатів у імуногістохімічних аналізах для визначення, чи містить зразок клітини, що експресують EGRFvlll. Якщо зразок узятий з тканин пацієнта, які 43 не здатні до нормальної експресії EGFRvlll, визначення EGFRvlll буде показувати або, що пацієнт має пухлину, що характеризується присутністю клітин, що експресують EGFRvlll, або, що лікування такої пухлини ще не було успішним у знищенні пухлини. Спеціалісти у даній галузі також зможуть оцінити, що анти-EGFRvlll антитіла за винаходом, злиті з прийнятною міткою, можуть, очевидно, використовуватись in vivo для визначення присутності клітин, що експресують EGFRvlll, надаючи, таким чином, можливість індикації того факту, що пацієнт має пухлину, або, що лікування такої пухлини ще не було успішним у знищенні пухлини. Приклади Приклад 1. Одержання антитіл з кращим зв'язування, ніж таке для MR1 Для відкриття антитіл з кращим зв'язуванням з EGFRvlll, ніж MR1, з використанням MR1 scFv були створені бібліотеки фагового виявлення. Випадкові мутації були введені у ділянку-3, яка визначає комплементарність, важкого ланцюга (VH CDR3), у зону, яка відіграє основну роль у зв'язуванні антигену [MacCallum et al. // J. Mol. Biol. 1996. – 262. – P.732-745]. Пенінг на клітинах, що експресують EGFRvlll, дав змогу одержати декілька мутацій, які, якщо використовуються для конструювання імунотоксинів, дають поліпшені афінність, цитотоксичність та вихід. Аналіз цих варіантів виявив, що вони усі мають мутації, локалізовані у ділянці VH CDR3, яка визначена як гаряча точка для гіпермутації [Neuberger et al. // Curr. Opin. Immunol. – 1995. – 7. – P.248-254; Jolly, С. J. // Semin. Immunol. – 1996. – 8. – P.159-168; Neuberger et al. // Immunological Rev. – 1998. – 62. – P.107-116]. Гаряча точка визначаються консенсусними послідовностями G/A-G-T/С-АЯ або A-GC/T. Остання містить серинові кодони, які знаходять у варіабельному домені генів антитіл [Goyenechea et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – 93. – P.13979-13984]. Гарячі точки є ділянками, які піддаються мутаціям з великою частотою під час формування антитіл. Пенінг VH CDR3 бібліотеки не приводить до одержання клонів, що містять мутації за межами гарячої точки. Цей результат підтверджує нещодавні відкриття, що рендомізуючі гарячі точки більш сприятливі для одержання мутантів з поліпшеною афінністю [Chowdhury et al. // Nature Biotechnol. - 1999. – 17. – P.568-572]. Найкращі зв'язувальні агенти, одержані шляхом пенінгу VH CDR3 бібліотеки, використовувались для створення бібліотеки фагового виявлення при рендомізації гарячої точки у легкому ланцюгу CDR3. Пенінг цієї бібліотеки дав змогу одержати ще декілька мутантних клонів з більш бажаними характеристиками. Приклад 2. Конструювання мутантної бібліотеки VH VH CDR3 MR1 складається з одинадцяти амінокислот. Як було зазначено у вступі, малоймовірно, щоб дві з цих амінокислот приймали участь в антигенному зв'язуванні. Інші дев'ять амінокислот у VH були мутовані шляхом заміщення усіх інших природних амінокислот, як визначено для амінокислотного залишку, який у нормі присутній у цьому положенні. Олігомери ДНК призначені для одер 77157 44 жання трьох бібліотек кожного з дев'яти рендомізованих нуклеотидів (три послідовні амінокислоти). MR1 фагемід використовували як матрицю для вбудовування трьох амінокислотних рендомізацій CDR3 важкого ланцюга у 3 окремих двоетапних полімеразних ланцюгових реакціях (ПЛР) (Фіг.1). Використовуються наступні олігомери: У першій ПЛР, 50пг фагеміди pCANTAB 5EMR1 застосовували як матрицю у трьох окремих реакціях, використовуючи 20пмоль ДНК олігомеру S1 разом з 20пмоль ДНК олігомеру CDR3Hb, CDR3Hd or CDR3Hf. Матрицю та олігомери перемішували з 2 Ready-To-Go PCR Beads (Pharmacia) в об'ємі 50мкл, а потім піддавали циклізації, використовуючи наступні профілі: 1 цикл при 95°С протягом 5хв., після цього виконували 30 циклів при 94°С протягом 1хв., при 55°С протягом 1хв. та при 72°С протягом 1хв. Ці реакції приводили до одержання продукту, який містить мутації. Продукти, одержані на першому етапі, потім застосовували як праймери у трьох окремих реакціях з праймером AMBN, використовуючи MR1 фагеміду як матрицю. У цих реакціях 1мкл продукту з першої реакції використовували з 20пмоль ДНК олігомеру AMBN з 50пмоль фагеміди pCANTAB 5E-MR1 як матриці. Праймери та матриці перемішували з 2 Ready-To-Go PCR Beads (Pharmacia) в об'ємі 50мкл, та піддавали циклізації, використовуючи описаний вище спосіб. Кожна реакція генерувала бібліотеку 876 п.о. Продукти ПЛР перетравлювали за допомогою рестрикційних ферментів Sfil та Not І та очищали. 150нг очищеного продукту ПЛР лігували з 250нг ДНК вектора фагового виявлення pCANTAB5E (попередньо перетравленого, як забезпечується Pharmacia). Суміші лігування обезсолювали, та 40нг кожної використовували для трансформації E.coli TG1. Кожна трансформація приводила до одержання приблизно 1,5x106 клонів. Фагові бібліотеки були потім вивільнені з трансформованих бактерій. Клітини, одержані від кожної трансформації, вирощували у 10мл 2xΥΤ (16г бакто-триптону, 10г бактерійно-дріжджового екстракту, 5г NaCI/на літр Н2О), що містить 2% глюкози при 37°С при струшуванні при 250об./хв. Через одну годину додавали ампіцилін (100мг/мл заключна концентрація) та 1x1010 бляшкоутворювальних одиниць (БУО) М13КО7 хелперного фага. Культури вирощували протягом однієї години, осаджували, а потім ресуспендували у 10мл 2xΥΤ плюс ампіцилін (100мкг/мл) та канаміцин (50мкг/мл) та вирощували протягом 16год. при 37°С, при струшуванні при 250об./хв. Бактерії осаджували шляхом центрифугування у Sorval SS34 роторі при 45 8000об./хв. протягом 20хв. Супернатанти, що містять фаг, фільтрували, використовуючи syringe фільтр 0,45мкм. Фаг потім піддавали преципітації шляхом додання 2мл ПЕГ, NaCI (20% ПЕГ8000 у 2,5Μ NaCI вага/об'єм), інкубували на льоду протягом 30хв. Преципітований фаг осаджували шляхом центрифугування у Sorval SS34 роторі при 10000об./хв. протягом 20хв., потім ресуспендували в 1мл ΝΤΕ (100мМ NaCI, 10мМ Трис рН 7,5 ЕДТА). Ресуспендовані фагові бібліотеки титрували та зберігали при 4°С. Пенінг VH CDR3 бібліотеки NR6M клітини, вирощені у середовищі DMEM, що містить 10% фетальної сироватки великої рогатої худоби плюс 750мкг/мл G418, збирали, використовуючи 0,02% ЕДТА (Sigma №Е-8008). 2x107 клітин осаджували та ресуспендували у 10мл холодного буфера блокування (2% BSA, 0,02% NaN3 у DPBS) та піддавали повільному центрифугуванню протягом 1год. при 4°С. Клітини осаджували та ресуспендували у 5мл холодного буфера блокування. 1x109 фагів з кожного важкого ланцюга CDR3 бібліотек додавали до клітинної суспензії та суміш повільно центрифугували при 4°С протягом 2год. Клітини промивали двічі за допомогою 10мл холодного буфера блокування. Зв'язаний фаг елюювали шляхом ресуспендування промитих клітин у 1,5мл льодяної 50мМ НСІ, та інкубували на льоду протягом 10хв. NR6M клітини осаджували та елюйований фаг титрували для визначення кількості захопленого фагу. Потім 0,5мл елюйованого фага ампліфікували шляхом повторного інфікування E.coli TG1 для використання у наступному колі пенінгу. Конструювання VL мутантної бібліотеки Важкий ланцюг CDR3 мутанта (S98P-T99Y) використовували як матрицю у двоетапній ПЛР, за допомогою якої вбудовували рендомізації у гарячу точку, розташовану у легкому ланцюзі CDR3. У першій реакції, 50пг фагеміди, що містить мутант важкого ланцюга (S98P-T99Y), перемішували з 20пмоль ДНК олігомерів VLMUT (5'GATTACTACTGTTTGCAANNSNNSAACGTGCCTC TTACA-3') та AMBN у 50мкл об'єму. Суміш піддавали циклізації, використовуючи той самий спосіб, який застосовували для одержання бібліотеки важкого ланцюга CDR3. За допомогою реакції одержували продукти розміром 150 пар основ, що містять рендомізацію "гарячої точки" у легкому ланцюзі CDR3. Після очистки 1мкл продукту реакції, одержаного у першій ПЛР, використовували з 20пмоль ДНК олігомеру (S98P-T99Y) як матриці. Матрицю та праймери перемішували з 2 Ready-ToGo PCR Beads (Pharmacia) в об'ємі 50мкл, а потім піддавали циклізації, використовуючи описаний вище спосіб. Реакції давали змогу одержати бібліотеку з 876 п.о., яка містила VH CDR3 мутацію (S98P-T99Y) та рендомізації гарячої точки CDR3L. Продукти ПЛР перетравлювали за допомогою рестрикційних ферментів Sfi І та Not І, очищали та лігували за допмогою pCANTAB5E вектора як і з бібліотеками важкого ланцюга CDR3. Лігаційну суміш обезсолювали та одну десяту (40нг) реакційної суміші використовували для трансформації E.coli TG1. Фагову бібліотеку, яка містить 3x105 77157 46 клонів, виділяли, як описано для конструювання важкого ланцюга CDR3. Одну четверту її ампліфікували та використовували для першого етапу пенінгу. Пенінг бібліотеки VL CDR3 NR6M клітини збирали, як і для процедури пенінгу VH CDR3. Усі етапи та промивання проводили у холодному буфері блокування за винятком, як зазначено нижче. 5x106 клітин ресуспендували в 1мл буфера блокування та центрифугували протягом 1год. Клітини осаджували та ресуспендували, додавали вивільнену фагову бібліотеку та суспензію повільно центрифугували при 4°С протягом 2год. Клітини промивали тричі, потім ресуспендували у буфері блокування, що містить 2пМ мутанта важкого ланцюга MR1 (S98P-T99Y) scFv-PE38 та повільно центрифугували при 4°С протягом 2год. Клітини промивали тричі, а зв'язаний фаг елюювали та нейтралізували, як описано для бібліотеки важкого ланцюга CDR3. Елюйований фаг титрували та зберігали для наступного кола пенінгу. Вивільнення фагу Захоплений після кожного кола пенінгу фаг ампліфікували для використання у наступному колі пенінгу· Для вивільнення E.coli TG1 вирощували у 10мл 2xYT, що містить 2% глюкозу, інкубували при 37°С, при 250об./хв. Коли оптична щільність (OD600) досягала 0,3, 0,5мл захопленого фага додавали до культури та продовжували інкубацію. Через 1год. додавали ампіцилін (100мкг/мл кінце10 ва концентрація) та 1x10 бляшкоутворювальних одиниць М13КО7 хелперного фага, та інкубацію продовжували протягом 1год. Культуру потім центрифугували, а осаджені бактерії ресуспендували у 10мл свіжого середовища 2xΥΤ, що містить ампіцилін (100мкг/мл) та канаміцин (50мкг/мл), та інкубували при 37°С та 250об./хв протягом 16год. Бактерії осаджували шляхом центрифугування у Sorval SS34 роторі при 8000об./хв. протягом 20 хвилин. Супернатанти, що містять фаг, фільтрували, використовуючи syringe фільтр 0,45 одиниць. Фаг потім преципітували доданням 2мл ΠΕΓ/NaCI (20% ПЕГ 8000 у 2,5М NaCI вага/об'єм) та інкубували на льоду протягом 30хв. Преципітований фаг осаджували центрифугуванням у Sorvall SS34 роторі при 10000об./хв. протягом 20хв., потім ресуспендували у 1мл ΝΤΕ (100мл NaCI, 10мМ Трис, 1мМ ЕДТА рН 7,4). Вивільнену фагову бібліотеку титрували та зберігали при 4°С. Визначення позитивних клонів Після третього кола пенінгу 48 клонів бібліотеки важкого ланцюга CDR3 аналізували на зв'язування з EGFRvlll пептидом (LEEKKGNYVVTDHSGGK-біотин), використовуючи ELISA. Двадцять два клони, які давали найсильніший сигнал, піддавали ДНК-секвенуванню та аналізували далі. Після четвертого кола пенінгу 48 клонів аналізували за допомогою ELISA та визначали ДНК послідовності 10 клонів з найсильнішим сигналом ELISA. Для бібліотеки легкого ланцюга після другого кола пенінгу 48 клонів аналізували за допомогою ELISA, та 17 клонів, які давали найсильніший сигнал, піддавали ДНК-секвенуванню. Після третього кола пенінгу 20 клонів аналізували 47 та 10 клонів з найсильнішими сигналами ELISA піддавали секвенуванню. Для вивільнення фагу з індивідуальних клонів, відбирали один клон з заключних титрувальних планшетів для пенінгу та інокулювали в 150мкл 2xYT з 2% глюкози та 100мкг/мл ампіциліну у планшеті на 96 комірок. Планшет інкубували при 37°С при 150об./хв. Через 3год. 20мкл культури переносили до комірок другого планшету, що містить 100мкл 2xΥΤ з 2% глюкози та 100мкг/мл ампіциліну плюс 1x108 М13КО7 хелперного фага та інкубували протягом 2год. Культури осаджували та ресуспендували та у 50100мкл супернатантів, що містять фаг, піддавали ELISA. Фаговий ELISA виконували, як описано [Lorimer et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – 93. – P. 14815-14820], за винятком наступного: 100мкл 3, 3', 5, 5'-тетраметил бензидину (ВМ голубий, Boehringer Mannheim) використовували як субстрат для детектування. Після розвинення забарвлення у голубий/зелений колір 100мкл 2М H2SO4 додавали для зупинки розвитку забарвлення. Поглинання вимірювали при 450нм. Секвенування ДНК Секвенування ДНК проводили, використовуючи РЕ Applied Biosystems (Foster City, CA) Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit. Зразки розганяли та аналізували на ΡΕ автоматизованому секвенсері Applied Biosystems Model. Плазмідна конструкція scFv імунотоксину, експресія та очистка ScFv з відібраних фагемідних клонів піддавали ампліфікації, використовуючи праймери, в які вводили Ndel та Hindlll рестрикційні сайти. Продукти потім піддавали перетравлюванню та клонували в експресійний вектор, що базується на Т7, в якому scFv злитий з вкороченим варіантом екзотоксину A Pseudomonas. Плазміди трансформували в експресійного хазяїна BL21( DE3). MR1 мутантні імунотоксини експресували та готували так, як описано раніше [Buchner et al. // Anal. Biochem. – 1992. – 205. – P. 263-270]. Поверхневий плазмонний резонанс Кінетику зв'язування вимірювали, використовуючи ВІАсоге 2000 біосенсор (Biacore, Inc., Piscataway, NJ). Стрептавідин зв'язували з CMS дослідницьким ступінчастим сенсорним чіпом, використовуючи аміно зв'язувальні реагенти, що забезпечуються Biacore. Біотинильований EGFRvlll пептид зв'язували зі стрептавідином шляхом внесення 10мкл 10нМ розчину пептиду на чіп. Імунотоксини розводили до концентрації 25мкг/мл у забуфероному Hepes фізіологічному розчині (HBS). Значення усередині інтервалу та поза ним вимірювали шляхом внесення 50мкл розведеного імунотоксину на поверхню чіпа при швидкості 10мкл/хв., а потім давали можливість зв'язаному матеріалу дисоціюватись протягом 5хв. або більше. Матеріал, що залишився після зв'язування, видаляли з EGFRvlll пептиду шляхом введення 5мкл 100мМ фосфорної кислоти. Кінетику зв'язування аналізували, використовуючи ΒΙΑ оцінку 2.1 Software. Культура клітин та аналізи цитотоксичності NR6M клітини культивували у DMEM плюс 10% фетальної сироватки великої рогатої худоби, 77157 48 забезпеченої 750мкг/мл G418. Аналізи цитотоксичності передбачали вимірювання інгібування вбудовування [3Н]-лейцину, як було описано вище [Prior et al. // Cell. – 1991. – 64. – P. 1017-1023]. Лінії бактерій та клітин Е.coli TG1; К12 (lac-pro), supE, thi, hsd 5/F'[traD36, proAB, laclq, lacZ Ml 5]. E.coli BL21( DE3); F' ompT [Ion] hsdSB (rB' mB' штам Ε.coli В) з DE3, -профаг, що несе РНКполімеразний ген Т7. NR6 був Swiss 3T3 мишиною фібробластною варіантною клітинною лінією, в якій не визначався EGFR. NR6M була NR6 клітинною лінією, трансфікованою за допомогою кДНК для мутантного EGFRvlll рецептора під контролем -актинового промотора. Джерела NR6 та NR6M були раніше описані [Lorimer et al., Clin. Cancer Res. 1: 859-864 (1995)]. Приклад 3. Конструювання бібліотеки VH CDR3 Для збільшення афінності MR1(Fv) та активності відповідного імунотоксину MR1(Fv)-PE38, ми мутували VH CDR3 та VL CDR3 оскільки ці частини антитіла мають значні контакти з антигеном [MacCallum et al. // J. Mol. Biol. – 1996. – 262. – P.732-745]. Перші дев'ять з одинадцяти амінокислот VH CDR3 представлені в табл. 5 (останні два, D101 та Y102 виключались, оскільки вони, як вважається, малоймовірно роблять свій внесок у зв'язування антигену). Оскільки повна бібліотека, в якій дев'ять рендомізованих амінокислотних залишків вимагали більше, ніж 5x1011 індивідуальних клонів, то ми готували три різні бібліотеки, що містили залишки 95-97, 98-100 та 101А-101С, як описано у прикладі 1. Бібліотека H-CDR3 95-97 містила 1,6x106 клонів, бібліотека H-CDR3 98-100 містила 4x105 клонів, бібліотека H-CDR3 100А100С містила 1,6x106 клонів. Для того, щоб впевнитись, що бібліотеки складені правильно, п'ять клонів з кожної бібліотеки були секвеновані. Як і очікувалось, кожний клон мав різні амінокислотні комбінації у ділянках, що є цільовими для мутацій. Оскільки повна відмінність бібліотеки, що рендомізує 3 амінокислоти, буде вимагати тільки 8x103 незалежних клонів, розмір бібліотек підтверджував, що усі можливі послідовності ДНК добре представлені. Пенінг VH CDR3 бібліотеки та аналіз відібраних клонів Оскільки заключна ціль поліпшення MR1 мутанта полягала у націлюванні токсину на EGFRvlllпозитивні пухлинні клітини, ми використовували EGFRvlll-позитивні NR6M клітини для пенінгу. Пенінг виконували у присутності імунотоксину MR1(Fv)-PE38, який, як очікувалось, діє як конкурент проти селекції дикого типу MR1Fv у бібліотеці. Фаг з кожної бібліотеки був вивільнений та рівні кількості фагу (1x109) з кожної бібліотеки поєднували для початку першого кола пенінгу. Елюйований фаг титрували та вивільняли для наступного кола пенінгу. Відповідні пенінги виконували без визначення титру вивільненого фага, до тих пір, поки не закінчувався пенінг. Це було зроблено для економії часу, та для зменшення можливості, що нестабільні зв'язувальні агенти можуть бути загублені протягом 24год., необхідних для титрування вивільненого фагу. Типово вивільнення давало 49 вихід 1x1012 КУО/мл. Таблиця підсумовує кількість фага, захопленого протягом кожного з чотирьох кіл пенінгу. Збагачення було досягнуто, у четвертому колі відбувалося зменшення. Початково ми перевіряли фаг, відібраний після чотирьох кіл пенінгу. 48 клонів було проаналізовано для зв'язування у фаговому ELISA, та було визначено послідовності ДНК десяти клонів, що мали найсильніший сигнал. У табл. 6 показано, що у положеннях 98 та 99 тільки відновлені мутації були. Аналіз послідовності ДНК показав клони, які відносяться до п'яти різних груп: вихідного S98T99 та мутантів P98-N99, P98-Y99, Р98-F99, P98W99. Ми також перевіряли фаг, вибраний після третього кола для демонстрації того, що добрі зв'язувальні агенти були загублені між 3 та четвертим колами. Ми аналізували 48 індивідуальних клонів на зв'язування з EGFRvlll-пептидом шляхом ELISA, та 22 з них, які виявили найсильніший сигнал, піддавали ДНК-секвенуванню. І знову, тільки відновлені мутації були у положеннях 98 та 99 (табл. 6). Цілий ряд амінокислот було відновлено у цих положеннях. Частіше за інших зустрічався S98-T99 (дикий тип), після якого йшли P98-S99, P98-Y99, P98-N99 та A98-D99. Четверте коло пенінгу приводило до збагачення клонів P98-N99 та P98-Y99 понад диким типом (S98-T99), до втрати кількох клонів, а також до одержання нового клону, що містить P98-F99. Цитотоксичність та афінність мутантів VHCDR3 Кожний з 12 мутантів, що були одержані шляхом пенінгу MR1 VH CDR3 бібліотеки використовували для створення імунотоксину. Кожний імунотоксин конструювали за допомогою ПЛР, ампліфікуючи Fv з фагового вектора та субклонуючи їх в експресійний вектор для експресії імунотоксину. Усі імунотоксини (за винятком одного, що містив A98-D99 мутацію VH CDR3) можуть бути очищені до більш, ніж 90-95% гомогенності, очищені імунотоксини використовували для визначення їх цитотоксичності на NR6M клітинах. Зв'язувальну афінність вимірювали шляхом способу Diacore, використовуючи або пептид, іммобілізований на чіпі, або мутантну форму екстрацелюлярного домену EGFR, приєднаного до чіпу. Результати однієї серії експериментів представлені у табл. 6; у порівнянні з вихідним клоном (S98-Т99), який мав ІС50 8,0нг/мл, існували шість клонів, які були найбільш токсичними. Це були P98-Y99, який мав ІС50 3,5нг/мл, після нього йшли P98-N99, P98W99, Р98-І99, які мали ІС50 4,5нг/мл, P98-F99 з ІС50 6нг/мл та P98-V99 з ІС50 6,5нг/мл. Чотири клони, Р98-S99, W98-F99, S98-W99 та Р98-Т99 мали ІС50, ідентичне для вихідного клону. Конструювання VL CDR3 бібліотеки Усі мутанти, вивільнені після пенінгу VH CDR3 бібліотек локалізувались у положеннях 98 та 99. Послідовність ДНК цих двох залишків складає гарячу точку, яка є ділянкою, що піддається мутаціям під час in vivo афінного дозрівання антитіла. Мутант з найвищою цитотоксичною активністю з бібліотеки VH використовували та піддавали мутагенезу, націлюючи тільки гарячу точку VL CDR3. Послідовність VL CDR3 представлена у табл. 3. 77157 50 Бібліотека вводить рендомізації у гарячу точку, що кодує залишки 91 та 92. VL CDR3 фагова бібліотека з 400 клонів необхідна для досягнення усіх можливих амінокислотних комбінацій у двох положеннях, що вибрані для мутації, таким чином, можна очікувати, що усі можливі послідовності ДНК були охоплені у цій бібліотеці. Пенінг VL CDR3 бібліотеки та аналіз вибраних клонів Виконували три кола пенінгу та фаг, захоплений на кожному етапі, показано у табл. 3. Для цієї бібліотеки ми одержали більше збагачення у другому колі пенінгу, ніж у третьому колі. Після другого кола пенінгу 48 індивідуальних клонів було вивільнено, зв'язування пептиду вимірювали шляхом ELISA, та визначали послідовність ДНК сімнадцяти клонів, що мали найсильніший сигнал. Як показано у табл. 7, були одержані п'ять різних мутантів. Усі зберігали залишок серину дикого типу у положенні 91, та мали мутацію у положенні 92. Найчастіше спостерігали F92W (6 з 17), після неї йшли F92R (3 з 17), F92S (2 з 17), F92L (1 з 17) та F92M (1 з 17). З 17 проаналізованих 4 були знайдені такими, що відповідають вихідному типові. Також аналізували властивості клонів, ізольованих після третього кола пенінгу (Таблиця 7). Двадцять клонів відбирали випадково, фаг вивільняли та перевіряли на зв'язування з пептидом за допомогою ELISA. Десять клонів, що мали найсильніший сигнал, були відібрані для аналізу ДНК послідовності. Послідовність ДНК виявила, що були присутні 3 різні клони, усі з яких були представлені у третьому колі. Крім одного вихідного клону, ці клони були F92S (7 з 10), F92W (1 з 10) та F92R (1 з 10). Не було знайдено нових мутантів та не було знайдено мутантів F92L та F92M. Таблиця 3 Фагове збагачення під час пенінгу Етап пенінгу VH CDR3 1 2 3 4 VL CDR3 1 2 3 Внесений фаг Елюйований фаг 3x109 Зх1011 5х1011 5х1011 1,5х105 1,0х106 1,5x108 2,0x107 1х1010 1х1010 1х1010 2,4x105 5,5х106 2,0х107 Цитотоксичність та зв'язувальні властивості мутантів VL CDR3 Різноманітні FV, які одержували, використовували для одержання імунотоксинів, а їх цитотоксичні активності та зв'язувальні афінності вимірювали, використовуючи очищені рекомбінантні білки. Тільки один мутант F92W давав імунотоксин, який був більш активним, у порівнянні з вихідними. Його ІС50 складало 1,3нг/мл у порівнянні з 3,5нг/мл для вихідного (Таблиця 7). Інші мутанти мали нижчі активності. Дані Таблиці 7 також показують, що F92W має найвищу афінність (Kd ЗнМ), ніж вихідний клон F92 (Kd 6нМ). Інший мутант, F92L, мав 51 77157 слабко збільшену афінність (Kd 4нМ), але не мав збільшення цитотоксичності. Фіг.2 показує ВІАСоге сенсограмму, що порівнює зв'язувальні властивості вихідного клону з найбільш активним імунотоксином, одержаним з Fv, яке одержували з VH CDR3 бібліотеки (VHS98P-T99Y) та найбільш активним клоном, одержаним з бібліотеки VL CDR3 (VHS98P-T99Y-VLF92W), що зараз називається MR1-1. Фігура показує, що два мутанти мають менші значення дисоціації, ніж вихідний Fv. Аналіз імунотоксину (MR1-1-(Fv)-PE38) з обома VH та VL мутаціями показав, що вони мають зменшення у kвикл. та слабко збільшене у kвкл., що приводить до Kd 3нМ. В Таблиці 4 представлені результати двох експериментів, в яких цитотоксичні активності MR1(Fv)Pe38 порівнювали з двома поліпшеними варіантами: MR1(Fv)(VHS98P-T99Y)-РЕ38 та MR11(Fv)-PE38. В обох експериментах MR1(Fv)-PE38 був принаймні активним, a MR1-1(Fv)-PE38 був найбільш активним. Таблиця 4 Порівняння цитотоксичної активності MR1(Fv)-PE38 з двома мутантами зі збільшеною афінністю для EGFRvlll Імунотоксин MR1(Fv)-PE38 MR1 (Fv)(VH S98P-T99Y)РЕ38 MR1-1(Fv)-PE38 IC50*), нг/мл Дослід 1 Дослід 2 9,2±2,1**) 6,6±0,2***) 6,0±3,9 4,6±0,7 2,6±6,2 2,0±1,0 Примітки: *) IC50 підраховували з аналізів, використовуючи різні кількості імунотоксинів; **) В Досліді 1 значення, виражені як ± S.D, мали значення Ρ < 0,01 при порівнянні MR1(Fv)PE38 з MR1-1(Fv)-PE38 та MR1(Fv)(VH S98PT99Y)-PE38 з MR1-1(Fv)-РЕ38; ***) В Досліді 2 значення, виражені як ± S.D, мали значення Ρ < 0,01 при порівнянні MR1(Fv)-PE38 з MR1(Fv)(VH S98P-T99Y)-PE38 та MR1(Fv)(VH S98P-T99Y)-PE38 з MR1-1(Fv)PE38 Приклад 4. Одержання імунотоксину Значне збільшення виходу різних мутантних імунотоксинів спостерігали під час процесів очистки. Після повторної зборки білки діалізували та очищали хроматографією [Buchner et al. // Anal. Biochem. – 1992. – 205. –P. 263-270]. Білок спочатку серійно очищають на Q-сефарозній аніоннообмінній смолі, яка видаляє великі білкові агрегати, нуклеїнові кислоти та інші контамінанти. Після цього елюйований білок завантажували у MоноQ колонку, а білки елюювали за допомогою суцільного градієнту 0-0,3Μ NaCI. На цьому етапі видаляють менші агрегати. Правильно зібраний мономерний імунотоксин елюють з MоноQ при характеристичній концентрації NaCI 280нМ. Чистоту зібраних фракцій MоноQ підтверджують спостереженням одного мономерного піку, елюйованого 52 з TSK G3000SW колонки для виключення за розмірами та за допомогою SDS-PAGE. Вихід кожного мутантного імунотоксину MR1(Fv)Pe38 вираховували, базуючись на кількості білка, зібраного з пікових MоноQ фракцій, та на присутності єдиного піку за розмірами хроматограмах (TSK3000). Таблиці 6 та 7 показують виходи, коли 100мг білка тілець включення піддавали очистці. Очевидно, що вихід імунотоксину піддається значному впливові мутацій у CDR та збільшується з 2% для вихідного MR1(Fv)Pe38 до більше, ніж 10-17,5% для багатьох мутантів. Приклад 5 EGFRvlll інтракраніальні пухлини ініціювали у атимічних щурів шляхом ін'єкції 105 U87G. EGFRvlll клітин (людська гліобластомна клітинна лінія, створена шляхом трансфекції U87MG клітин EGFRvlll [Nishikava et al. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 1994. – 91. – P.7727-7730]) через катетер, розміщений на 1мм вперед та 4мм латеральніше до брегми. Пухлини оброблювали шляхом інфузії MR1-1PE38 імунотоксину або контрольного фізіологічного розчину через катетер безпосередньо у пухлину. Імунотоксин призначали при дозах або 2мкг або 6мкг у 200мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину (PBS) з 0,2% людського сироваткового альбуміну (HSA) протягом семиденного періоду, використовуючи Alzet 2MI осмотичний насос (Durect Corp., Cupertino, CA), контрольним тваринам вводили 200мкл PBSHSA розчину. Лікування починали через 3 дні після інокуляції пухлини. Як показано на Фіг.3, усі тварини, що одержували контрольний фізіологічний розчин, помирали протягом 20 днів. Десять процентів тварин, що одержували дозу 6мкг, залишались живими протягом 160 днів. Більше тридцяти процентів тварин, оброблених дозою 2мкг, залишались живими протягом 160 днів. Різниця у виживанні між дозами 2мкг та 6мкг передбачає, що при інтракраніальну введенні імунотоксин у дозі 6мкг може бути достатньою для спричинення деякої неспецифічної токсичності для мозкових тканин, яка зменшувалась або не була присутня при дозі 2мкг, але обидві дози імунотоксину забезпечували подовження виживання. Приклад 6 EGFRvlll інтракраніальні пухлини ініціювали у атимічних щурів шляхом ін'єкції 105 U87G. EGFRvlll клітин через катетер, розміщений на 1мм вперед та 4мм латеральніше до брегми. Пухлини оброблювали шляхом інфузії MR1-1PE38 імунотоксину або контрольного фізіологічного розчину через катетер безпосередньо у пухлину. Імунотоксин (0,2мкг, 0,6мкг та 2,0мкг) вводили у 200мкл PBS з HSA протягом 7 днів, використовуючи Alzet® 2МІ осмотичний насос, як описано у прикладі 5. Лікування починали через 3 дні після інокуляції пухлини. Як показано на Фіг.4, тільки десять процентів тварин, що одержували дози 0,2мкг або 0,6мкг імунотоксину виживали після 25 днів, у той час як виживало близько 22% тварин, що одержували контрольний фізіологічний розчин. На противагу цьому, з тварин, які одержували дозу 2мкг, виживало близько 55%, що у два рази більше, ніж про 53 77157 цент тварин, які одержували контрольний фізіологічний розчин. Результати дають змогу запропонувати, що дози 0,2мкг та 0,6мкг були достатньо низькими для спричинення виживання, у той час як доза 2,0мкг імунотоксину значно подовжувала період виживання. Приклад 7 EGFRvlll неопластичні менінгіти ініціювали у атимічних щурів шляхом ін'єкції 5x106 U87G. EGFRvlll клітин у 40мкл розчину PBS-HSA через постійно введений інтратекальний катетер. Обробку усіх тварин, що несли пухлину, починали через 3 дні після інокуляції пухлини. MR1-1-PE38 імунотоксин давали у 40мкл PBS-HSA на 3, 5 та 7 день після пухлинної ініціації. Контрольним тваринам вводили 40мкл PBS-HSA у ті самі дні. Як показано на Фіг.5, усі тварини, які одержували контрольний фізіологічний розчин, помирали приблизно на 10 день. На противагу цьому, тварини, які одержували імунотоксин, мали подовжений час виживання принаймні до 14 дня, а 30% тварин, що одержували дозу 1мкг, та 50% тварин, що одержували дозу 2мкг, виживали протягом 60 днів. Приклад 8 Пухлини ініціювали у атимічних мишей шля 54 хом ін'єкції U87G. EGFRvlll гомогенату пухлинних клітин за 7 днів перед початком лікування (початок лікування позначали як день "0" для цього вивчення). Пухлини оброблювали за допомогою трьох болюсних внутрішньопухлинних ін'єкцій MR1-1PE38 імунотоксину при дозах 1мкг, 2мкг, 3 мкг, або контрольного фізіологічного розчину (PBS-HSA розчин, описаний у попередніх прикладах) на 0, 2 та 4 дні. Пухлини мали середній об'єм 600мм3 на початку лікування на 0 день. Як показано на Фіг.6, ріст розмірів пухлин у тварин, яких піддавали лікуванню будь-якою дозою імунотоксину, що залишалась приблизно сталою, при вимірюванні на 2 день після першого введення, ефективно призупинявся. На противагу цьому, тварини, яким вводили тільки контрольний фізіологічний розчин, показали швидке збільшення росту пухлини з об'ємом пухлини, що збільшувався настільки, що сягав 7500мм3 на 7 день. Усі публікації та патенти, згадані у цьому описі, введені у дану заявку як посилання в описі для деякого розширення, і кожна індивідуальна публікація або патент, є специфічними та індивідуальними як посилання. Таблиця 5 Амінокислотні послідовності та послідовності ДНК важкого ланцюга CDR3 та легкого ланцюга CDR3 MR1Fv Примітка: - Гарячі точки, що мають послідовності Pu G Py A/T, підкреслені Таблиця 6 Послідовності та властивості мутантного фага, ізольованого з бібліотеки важкого ланцюга CDR3, та імунотоксинів, одержаних з використанням мутантного scFv Положення Вихідна амінокислота 3 коло, залишок 95 96 97 98 99 100 G Υ S S Τ S S Ρ Ρ Ρ Ρ Α Ρ W Ρ Ρ *) Τ S Υ Ν W D**) Ι F V W № за ІС50, 100Α 100Β 100С межами нг/мл 22 Υ Α 5 4 3 2 2 2 1 1 1 1 1 Вихід,% 8,0 Μ Kd, нМ 8,0 2,0 8,0 8,0 3,5 4,5 4,5 н/в 4,5 8,0 6,5 8,0 8,0 8,0 н/в 6,0 11,0 4,0 н/в 5,0 н/в н/в н/в 8,0 2,0 17,5 7,0 10,0 10,0 н/в 10,0 10,0 7,0 5,0 ? 55 77157 56 Продовження таблиці 6 4 коло, залишок S Ρ Ρ Ρ Ρ № за межами 10 1 3 3 2 1 Τ*) Ν Υ F W 8,0 4,5 3,5 6,0 4,5 8,0 11,0 6,0 20,0 4,0 2,0 10,0 7,0 3,0 10,0 Примітки: - *) Дикий тип; **) Не можна одержати імунотоксин Таблиця 7 Послідовності та властивості мутантного фага, ізольованого з бібліотеки легкого ланцюга CDR3, та імунотоксинів, виготовлених з використанням мутантного scFv Положення Вихідна амінокислота 2-е коло, залишок 89 90 91 92 93 94 95 96 97 L Q S F N V Ρ L Τ S S S S S S F W R S L Μ S № за ІС50, межами нг/мл 17 F S S S S W R Kd, Вихід,% нМ 3,5 1 7 1 1 7 3,5 1,3 6,0 15,0 5,5 9,0 6 3 9 22 4 6 7 7 8 16 8 2 3,5 4 6 3 2 1 1 № за межами 10 6 6 7 15,0 1,3 6,0 22 3 9 16 7 8 57 Комп’ютерна верстка В. Сердюк 77157 Підписне 58 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601