Спосіб одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії

Реферат: Винахід належить до способу одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії шляхом багаторазової екстракції рослинної сировини хлорорганічним розчинником з наступним упарюванням екстракту до видалення екстрагента, де як сировину використовують траву буркуну лікарського (Melilotus officinalis) та/або траву буркуну білого (Melilotus albus), екстракцію здійснюють хлороформом при загальному співвідношенні сировина:екстрагент-1:(10-12), при UA 104458 C2 (12) UA 104458 C2 постійно підтримуваній температурі 55-60 °C з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі протягом 28-32 годин. UA 104458 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до хіміко-фармацевтичної галузі, а саме до способів одержання з рослинної сировини біологічно активних речовин (БАР) ліпофільної природи та їх комплексів з антимікробною дією, які можуть бути використані як активні субстанції при створенні лікарських препаратів зазначеної фармакологічної активності у різних лікарських формах. Відомий спосіб одержання ліпофільного екстракту з природної сировини - обніжжя бджолиного [1], шляхом екстракції подрібненої сировини зрідженим газом 2 дихлордифторметаном при тиску 4,5-5,5 кгс/см , що перевищує атмосферний, при співвідношенні сировина-екстрагент 1:5-1:6, температурі 18-25 °C протягом 2,75-3,25 годин з наступним видаленням екстрагенту з екстракту при випарюванні. Спосіб передбачає рециркуляцію екстрагента у замкненому циклі. До недоліків зазначеного способу можна віднести високу вартість та складність технологічного процесу, а також необхідність використання спеціального обладнання для проведення екстракції при високому тиску. Відомий спосіб одержання ліпофільного екстракту грінделії розчепіреної з протимікробною та репаративною активністю [2]. Зазначений спосіб полягає у екстракції трави грінделії розчепіреної 50 %-вим етанолом у співвідношенні сировина-екстрагент 1:9-1:11 з подальшим упарюванням отриманого екстракту до водного залишку у вакуумі при температурі 85-90 °C, 68-ми кратною обробкою залишку хлороформом та упарюванням отриманої ліпофільної фракції до видалення хлороформу. Недоліком наведеного способу є багатостадійність, що ускладнює його здійснення у виробничих умовах, надмірні витрати спирту етилового та хлороформу. При використанні як розчинника 50 %-го етанолу, окрім ліпофільних сполук, у розчин екстрагується комплекс інших біологічно активних речовин, у тому числі фенольні сполуки, глікозиди та ін., що потребує додаткових операцій по виділенню ліпофільних сполук із суміші. Найближчим до заявленого за технологічними прийомами є спосіб одержання ліпофільного комплексу з рослинної сировини [3], що складається з екстракції сировини органічним розчинником при співвідношенні сировина:екстрагент 1:(5-20), вилучення розчинника шляхом упарювання екстракту, змішування отриманого залишку з водою, очистку хлоровмісними похідними вуглеводню з подальшим упарюванням під вакуумом. Як рослинну сировину використовують ромашку аптечну або календулу, або пижмо, або звіробій, або золотушник. Як органічний розчинник використовують ацетон або нижчі спирти - спирт метиловий, спирт етиловий, спирт пропіловий, спирт ізопропіловий, спирт бутиловий; як хлоровмісні похідні вуглеводню використовують хлороформ або хлористий метилен, або чотирихлористий вуглець. До недоліків зазначеного способу слід віднести використання великих об'ємів органічних розчинників, що веде до здорожчання виробництва, та послідовність технологічних стадій, яка унеможливлює інтенсифікацію та спрощення процесу отримання цільового продукту. Задачею винаходу є створення способу одержання засобу рослинного походження шляхом екстракції хлороформом трави буркуну лікарського та/або трави буркуну білого, в результаті чого одержують ліпофільний комплекс БАР з вираженою антимікробною дією. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії шляхом багаторазової екстракції рослинної сировини хлорорганічним розчинником з наступним упарюванням екстракту до видалення екстрагента, згідно з винаходом, як сировину використовують траву буркуну лікарського (Melilotus officinalis) та/або траву буркуну білого (Melilotus albus), екстракцію здійснюють хлороформом при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:(10-12), при постійно підтримуваній температурі 55-60 °C з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі протягом 28-32 годин. Винаходом передбачено, що як рослинну сировину використовують траву буркуну лікарського та/або траву буркуну білого. Буркун лікарський (Melilotus officinalis) та буркун білий (Melilotus albus) - дворічні трав'янисті рослина родини Fabaceae, які мають достатню сировинну базу у флорі України та культивуються як кормові культури, широко використовуються у народній медицині з лікувальною метою. Препарати буркуну лікарського і білого мають відхаркувальні, пом'якшувальні, седативні, болетамувальні, вітрогонні та антикоагулянтні властивості. Вони посилюють кровообіг, сприяють зменшенню набряків і усуненню запальних процесів [4]. Буркун лікарський також застосовується в офіційній медицині як кумариновмісна сировина [5]. Ліпофільний комплекс обох рослин представлено біологічно активними речовинами - хлорофілами, терпеноїдами, кумаринами та ароматичними сполуками. Авторами вперше було досліджено антимікробну дію комплексу буркуну лікарського та буркуну білого, невідому з джерел інформації. Вибір хлороформу як хлорорганічного розчинника при здійсненні заявленого способу обумовлено його здатністю максимально екстрагувати ліпофільні сполуки буркуну лікарського 1 UA 104458 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 та буркуну білого. У сучасному фітохімічному виробництві хлороформ широко застосовують як знежирюючий агент, але отримувані при цьому ліпофільні фракції не є цільовим продуктом та, найчастіше, у подальше виробництво не включаються. Експериментальним шляхом встановлено, що оптимальним при здійсненні заявленого способу є використання співвідношення сировини до екстрагенту як 1:(10-12). При цьому, якщо співвідношення менше 1:10, не забезпечується достатня екстракція БАР, що призводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Навпаки, якщо співвідношення більше 1:12, це веде до ускладнення та подовження технологічного процесу, збільшення використання розчинника та енерговитрат. Екстракція протягом 28-32 годин забезпечує максимальне вилучення ліпофільних сполук з сировини. Згідно з заявленим способом, упарювання проводять до видалення екстрагенту з подальшим отриманням густого екстракту. Отриманий густий екстракт являє собою темно-зелену в'язку масу з різким характерним запахом. Заявлений спосіб здійснюють в умовах рециркуляції екстрагента у замкненому циклі, що запобігає виходу хлороформу в оточуюче середовище. Сукупність ознак заявленого способу є новою, невідомою з джерел інформації. Винахід здійснюють наступним чином. Суху, подрібнену траву буркуну лікарського та/або буркуну білого, заготовлену у фазі цвітіння, завантажують у циркуляційний екстрактор, заливають хлороформом у співвідношенні сировина:екстрагент 1:(10-12) та вичерпно екстрагують при постійно підтримуваній температурі 55-60 °C протягом 28-32 годин з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі. Новий спосіб здійснюють за простою технологією, яку можливо здійснити на стандартному заводському обладнанні, екстракцію проводять до повного вилучення ліпофільного комплексу БАР з сировини. Одержують субстанцію рослинного походження з ефективною антимікробною дією, нетоксичну, придатну до тривалого застосування без звикань та побічної дії. Для здійснення заявленого способу існує достатня вітчизняна сировинна база. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. 1 кг заготовленої у фазі цвітіння і подрібненої трави буркуну лікарського завантажили у циркуляційний екстрактор, залили 10 л хлороформу та вичерпно екстрагували при постійно підтримуваній температурі 55 °C протягом 32 годин при загальному співвідношенні сировина: екстрагент 1:10 з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі до знебарвлення екстрагенту. Отриманий екстракт упарили до видалення парів хлороформу у вакуумі до отримання густого екстракту. Вихід ліпофільної фракції склав 7,04 %. Приклад 2. 1 кг заготовленої у фазі цвітіння і подрібненої трави буркуну білого завантажили у циркуляційний екстрактор, залили 11 л хлороформу та вичерпно екстрагували при постійно підтримуваній температурі 57 °C протягом 28 годин при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:11 з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі до знебарвлення екстрагенту. Отриманий екстракт упарили до видалення парів хлороформу у вакуумі до отримання густого екстракту. Вихід ліпофільної фракції склав 7,06 %. Приклад 3. 1 кг суміші заготовленої у фазі цвітіння і подрібненої трави буркуну лікарського та буркуну білого у рівних частках завантажили у циркуляційний екстрактор, залили 12 л хлороформу та вичерпно екстрагували при постійно підтримуваній температурі 60 °C протягом 32 годин при загальному співвідношенні сировина: екстрагент 1:12 з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі до знебарвлення екстрагенту. Отриманий екстракт упарили до видалення парів хлороформу у вакуумі до отримання густого екстракту. Вихід ліпофільної фракції склав 7,1 %. Приклад 4. Антимікробну дію ліпофільного комплексу трави буркуну лікарського та буркуну білого, отриманого за заявленим способом, вивчали у дослідах in vitro за відомими методиками [6, 7] методом дифузії в агар та методом серійних розведень. Для оцінки антимікробної активності досліджуваного ліпофільного комплексу використовували стандартні штами мікроорганізмів, регламентовані ВООЗ для вивчення антимікробної дії препаратів: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 4636, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans 885-663. Для визначення антимікробної дії культури мікроорганізмів вирощували на м'ясо-пептонному агарі при t=37 °C. Термін культивування мікроорганізмів складав 24 години. Для кількісної оцінки антимікробної дії ліпофільних комплексів буркуну лікарського і буркуну білого та визначення їх 2 UA 104458 C2 мінімальних пригнічуючих ріст мікроорганізмів концентрацій використовували метод серійних розведень. Ліпофільні комплекси використовували у вигляді 2 % спиртових розчинів. Результати проведених досліджень наведені в табл. 1 і табл. 2. 5 Таблиця 1 Антимікробна дія ліпофільного комплексу буркуну лікарського, одержаного за заявленим способом Тест - штами мікроорганізмів S. aureus ATCC 25923 Е. coli ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 P. vulgaris ATCC 4636 B. subtilus ATCC 6633 С. albicans ATCC 885-663 Діаметр зон затримки росту в мм 24,4±0,3 х 18,3±0,1 14,2±0,3 20,3±0,2 х *МБсК, мкг/мл **МБцК, мкг/мл 62,5 125 250 125 125 250 500 250 *МБсК - мінімальна бактеріостатична концентрація **МБцК - мінімальна бактерицидна концентрація х - зони затримки росту мікроорганізмів не спостерігається. Таблиця 2 Антимікробна дія ліпофільного комплексу буркуну білого, одержаного за заявленим способом Тест - штами мікроорганізмів S. aureus АТСС 25923 Е. соlі АТСС 25922 P. aeruginosa АТСС 27853 P. vulgaris АТСС 4636 В. subtilus АТСС 6633 С. albicans АТСС 885-663 Діаметр зон затримки росту в мм 18,4±0,2 х 14,3±0,1 26,0±0,2 21,2±0,2 10,0±0,1 *МБсК, мкг/мл **МБцК, мкг/мл 125 125 62,5 125 250 250 500 125 250 500 *МБсК - мінімальна бактеріостатична концентрація, **МБцК - мінімальна бактерицидна концентрація, x - зони затримки росту мікроорганізмів не спостерігається. 10 15 20 25 Аналіз даних таблиці 1 свідчить про те, що діаметри зон затримки росту по відношенню до S. aureus, E.coli, P. aeruginosa, P. vulgaris та B. subtilis складають 14-24 мм, що свідчить про чутливість мікроорганізмів до ліпофільного комплексу трави буркуну лікарського, який має виражену антимікробну дію відносно до грам-позитивних та грам-негативних бактерій. Досліджуваний комплекс виявився не активним відносно до С. albicans та Е. соlі.відносно відношенню до S. aureus, E. Coli, P. aeruginosa, P. vulgaris та B. subtilis складають 10-26 мм, що свідчить про чутливість мікроорганізмів до ліпофільного комплексу трави буркуну білого, який має виражену антимікробну дію відносно до грам-позитивних та грам-негативних бактерій. Досліджуваний комплекс виявився неактивним лише відносно до Е. соlі. Таким чином, заявлено спосіб одержання ліпофільних комплексів з антимікробною дією з трави буркуну лікарського та/або трави буркуну білого. Заявлений спосіб простий, економічний, передбачає використання доступної вітчизняної сировини, є екологічно безпечним і може бути здійснений на будь-якому фармацевтичному підприємстві зі стандартним обладнанням. Ліпофільний комплекс БАР, одержаний заявленим способом, може бути використаний як лікарська субстанція для створення препаратів з антимікробною дією у різних лікарських формах. Джерела інформації: 1. Пат. 25670А Україна, Заявл. 30.12.1997, Опубл. 25.12.1998, Бюл. № 6/1998. 2. Пат. 31032А, Україна, Заявл. 02.07.1998, Опубл. 15.12.2000, Бюл. № 7, 2000 р. 3. Пат. 64075КА, Україна, Заявл. 21.08.2002, Опубл. 16.02.2004, Бюл. № 2, 2004 р. 3 UA 104458 C2 5 4. Лікарські рослини. Енциклопедичний довідник. За ред. A.M. Гродзинського. Головна редакція Української радянської енциклопедії ім. М.П. Бажана, Київ. - 1991. – С. 72-73. 5. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Caprifoliaceae-Plantaginaceae. - Л.: Наука, 1990 – 326 с. 6. Методические рекомендации определения активности антибактериальных средств наружного применения для лечения гнойно-воспалительных инфекций: Метод, реком. / Калиниченко Н.Ф., Волянский Ю.Л., Старобинец З.Г. и соавторы / Харьков. - 1991. - 16 с. 7. Вивчення специфічної активності протимікробних лікарських засобів: Метод. Реком. / Волянський Ю.Л., Гриценко І.С., Широбоков В.П. і співавт. – К.: - 2004. - 40 c. 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 Спосіб одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії шляхом багаторазової екстракції рослинної сировини хлорорганічним розчинником з наступним упарюванням екстракту до видалення екстрагента, який відрізняється тим, що як сировину використовують траву буркуну лікарського (Melilotus officinalis) та/або траву буркуну білого (Melilotus albus), екстракцію здійснюють хлороформом при загальному співвідношенні сировина:екстрагент-1:(10-12), при постійно підтримуваній температурі 55-60 °C з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі протягом 28-32 годин. 20 Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4