Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію з концентрацією 2 % (об'ємна частка), як попередник біосинтезу ПАР - мелясу, причому концентрація меляси в олієвмісному середовищі становить 0,10-0,15 % (масова частка), а UA 109825 C2 (12) UA 109825 C2 посівний матеріал вирощують на середовищі з концентрацією меляси 1,0-1,5 % (об′ємна частка). UA 109825 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UА, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 [Пат. 63962 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Софілканич А.П., Квятківська І.В. Опубл. 25.12.2011, Бюл. № 20], який включає культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для здешевлення процесу біосинтезу і підвищення концентрації синтезованих ПАР як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи (у тому числі й пересмажену соняшникову олію), а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Недоліком цього способу є недостатньо висока ПАР-синтезувальна здатність (кількість грам ПАР, синтезованих 1 г біомаси). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує ПАР-синтезувальну здатність. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію (2 %, об'ємна частка), як попередник біосинтезу ПАР - мелясу. Згідно з винаходом концентрація меляси в олієвмісному середовищі становить 0,10-0,15 %, а посівний матеріал вирощують на середовищі з мелясою (1,0-1,5 %). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Внесення 0,10-0,15 % меляси у середовище культивування штаму N. vaccinii IMB В-7405 з 2 % пересмаженої соняшникової олії і використання посівного матеріалу, вирощеного на середовищі з 1,0-1,5 % меляси, дає змогу підвищити у 2,3-2,4 разу ПАР-синтезувальну здатність (до 3,1-3,2 г ПАР/г біомаси). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO4-7H2O-0,1, СаСl2-2Н2О 0,1, КН2РО4-0,1, FeSO4-7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 2 % (об'ємна частка), а як попередник біосинтезу ПАР - 0,10-0,15 % меляси (масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0-1,5 % меляси (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 2,3-2,4 рази ПАР-синтезувальну здатність. Приклад 1. Синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 залежно від природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту. Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO4-7H2O-0,1, СаСl2-2Н2О - 0,1, КН2РО4-0,1, FeSO4-7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить як джерело вуглецю та енергії: пересмажену олію (0,5 %, об'ємна частка), глюкозу (0,5 %, масова частка), мелясу (1,0 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. 1 UA 109825 C2 5 10 15 Поверхневий натяг (σ8) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник "умовної концентрації ПАР" (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності σS від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. Перед вимірюванням цього показника культуральну рідину звільняють від залишкового субстрату обробкою бензином. Біомасу визначають ваговим методом. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 залежно від природи джерела вуглецю у середовищі для одержання посівного матеріалу. Таблиця 1 Вплив природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту на біосинтез ПАР N vaccinii IMB В-7405 Джерело вуглецю у середовищі для ПАР* одержання інокуляту Пересмажена соняшникова олія Глюкоза Меляса 20 25 30 Е24, % 6,0±0,30 6,4±0,32 6,7±0,33 58±2,9 60±3,0 60±3,0 Наведені у табл. 1 дані свідчать, що найвища умовна концентрація ПАР (6,7) досягається за використання посівного матеріалу, вирощеного на мелясі. Приклад 2. Залежність синтезу ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на пересмаженій соняшниковій олії від концентрації меляси у середовищі для одержання інокуляту Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 2,0 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5-2,0 % меляси (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР та індекс емульгування визначали як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, найвищі показники синтезу ПАР спостерігаються за концентрації меляси у середовищі для одержання інокуляту 1,0-1,5 %. Таблиця 2 Вплив концентрації меляси у середовищі для одержання інокуляту на біосинтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 Концентрація меляси у середовищі для одержання інокуляту (%, ПАР* масова частка) 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 35 Е24, % 6,0±0,30 6,0±0,30 6,7±0,33 6,7±0,33 6,8±0,33 5,7±0,28 5,7±0,28 57±2,8 57±2,8 60±3,0 60±3,0 61±3,0 55±2,7 55±2,7 Приклад 3. Вплив концентрації меляси на синтез ПАР за умов росту N. vaccinii IMB В-7405 на олієвмісному середовищі 2 UA 109825 C2 5 10 15 20 25 Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 2,0 % (об'ємна частка). Як попередник біосинтезу ПАР у середовище вносять мелясу у концентрації 0,050,25 % (масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0 % меляси. Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Біомасу визначають ваговим методом. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 Μ НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 Μ НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. ПАР-синтезувальну здатність визначають як відношення концентрації ПАР (г/л) до концентрації біомаси (г/л) і виражають у г ПАР /г біомаси. Дані з впливу різних концентрацій меляси на синтез ПАР штамом IMB В-7405 наведено у табл. 3. Як видно з наведених даних, внесення в олієвмісне середовище 0,10-0,15 % меляси забезпечує максимальне значення як концентрації ПАР, так і ПАР-синтезувальної здатності. Таблиця 3 Залежність синтезу ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на пересмаженій олії від концентрації меляси Концентрація меляси масова частка) 0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,3 30 35 40 45 (%, ПАР, г/л 1,7±0,08 2,7±0,13 4,6±0,23 4,7±0,23 3,7±0,18 3,5±0,17 3,5±0,17 ПАР-синтезу вальна здатність, г ПАР/г біомаси 1,5±0,08 2,0±0,10 3,1±0,15 3,2±0,15 2,5±0,12 2,5±0,12 2,5±0,12 Приклад 4. Порівняння показників синтезу ПАР штамами Rhodococcus erythropolis IMB Ас5017 і N. vaccinii IMB В-7405 на пересмаженій соняшниковій олії Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Культивування штаму IMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,3, MgSO4-7H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO4-7H2O0,001; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують пересмажену соняшникову олію у концентрації 2 % (об'ємна частка). У середовище культивування штаму IMB В-7405 додатково вносять 0,15 % меляси (масова частка), а у середовище культивування штаму Ас5017-0,1 % глюкози (масова частка). Як посівний матеріал використовують штами N. vaccinii IMB В-7405 і R. erythropolis IMB Ас5017, вирощені до середини експоненційної фази росту на середовищах наведеного вище складу, що містять 1,0 % меляси (масова частка) і 1,0 % (об'ємна частка) соняшникової олії відповідно. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію біомаси, ПАР і ПАР-синтезувальну здатність визначають як описано у прикладі 3. Показники синтезу ПАР штамами IMB В-7405 і Ас-5017 наведено у табл. 4. 3 UA 109825 C2 Таблиця 4 Синтез ПАР за умов росту N. vaccinii IMB В-7405 і R. erythropolis IMB Ас-5017 на пересмаженій соняшниковій олії Штам R. erythropolis IMB Ас-5017 (прототип) N. vaccinii IMB В-7405 5 ПАР, г/л 5,1±0,25 4,7±0,23 ПАР-синтезувальна здатність, г ПАР/г біомаси 1,35±0,07 3,2±0,15 Як видно з наведених у табл. 4 даних, культивування N. vaccinii IMB В-7405 на пересмаженій соняшниковій олії з внесенням 0,15 % меляси і використанням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі (1,0 %), дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність у 2,4 разу (до 3,2 г ПАР/ г біомаси) порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію у концентрації 2 % (об'ємна частка), як попередник біосинтезу ПАР - мелясу, який відрізняється тим, що концентрація меляси в олієвмісному середовищі становить 0,10-0,15 % (масова частка), а посівний матеріал вирощують на середовищі з концентрацією меляси 1,0-1,5 % (масова частка). 15 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4