Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів, а саме використовують суміш гліцерину (0,9-1,1 %, об'ємна частка) та меляси (1,9-2,1 %, масова частка). UA 108705 C2 (12) UA 108705 C2 UA 108705 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UА, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 [Пат. 81804 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Шулякова М.О., Мащенко О.Ю. Опубл. 10.07.2013, Бюл. № 13], який включає культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для підвищення умовної концентрації ПАР як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану і гліцерину у молярному співвідношенні 1:7, а концентрація гексадекану і гліцерину становить (%, об'ємна частка) 0,590,61 і 0,83-0,85 відповідно. Недоліком цього способу є недостатньо висока ПАР-синтезувальна здатність (кількість грам ПАР, синтезованих 1 г біомаси). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує ΠАР-синтезувальну здатність. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів. Згідно з винаходом як джерело вуглецю використовують суміш гліцерину (0,9-1,1 %, об'ємна частка) та меляси (1,9-2,1 %, масова частка). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецю для культивування штаму N. vaccinii IMB В-7405 суміші гліцерину (0,9-1,1 %, об'ємна частка) та меляси (1,9-2,1 %, масова частка) дає змогу підвищити у 2,3-2,4 разу ПАР-синтезувальну здатність (до 3,1-3,2 г ПАР/г біомаси). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO4-7H2O-0,1, СаСl2-2Н2О 0,1, KН2РО4-0,1, FeSO4-7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (1,0 %, об'ємна частка) та меляси (2,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) з і меляси (0,5 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 2,3-2,4 разу ПАР-синтезувальну здатність. Приклад 1. Синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на суміші гліцерину та меляси залежно від природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту. Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO4-7H2O-0,1, СаСl2-2Н2О - 0,1, KН2РО4-0,1, FeSO4-7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) та меляси (1,0 %, масова частка), а також моносубстрати: гліцерин (0,92 %, об'ємна частка) і мелясу (2,2 %, масова частка). Концентрації моно- і змішаного субстратів еквімолярні за вуглецем. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка), а також гліцерин (0,5 %, об'ємна частка) чи мелясу (1,0 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. 1 UA 108705 C2 5 10 15 20 Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 Μ НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 Μ НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 залежно від природи джерела вуглецю у середовищі для одержання посівного матеріалу. Таблиця 1 Вплив природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту на біосинтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 Джерело вуглецю у середовищі для біосинтезу, % Гліцерин, 0,5 + Меляса, 1,0 Гліцерин, 0,92 Меляса, 2,2 25 30 35 40 Джерело вуглецю у середовищі для одержання інокуляту, % Гліцерин, 0,5 Меляса, 1,0 Гліцерин, 0,25 + Меляса 0,5 Гліцерин 0,5 Меляса 1,0 Показники синтезу ПАР ПАР, г/л Е24, % 3,0±0,15 2,6±0,13 3,8±0,19 2,3±0,12 1,9±0,09 55±2,8 59±2,9 55±2,8 51±2,6 52±2,6 Наведені у табл. 1 дані свідчать, що за умов росту штаму IMB В-7405 на змішаному субстраті показники синтезу ПАР є вищими, ніж на відповідних моносубстратах, причому найвища концентрація ПАР досягається за використання посівного матеріалу, вирощеного на суміші гліцерину і меляси. Приклад 2. Синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на суміші вищих концентрацій гліцерину та глюкози Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (1,0 %, об'ємна частка) та меляси (2,0 %, масова частка), а також моносубстрати: гліцерин (1,84 %, об'ємна частка) і мелясу (4,4 %, масова частка). Концентрації моно- і змішаного субстратів еквімолярні за вуглецем. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка), а також гліцерин (0,5 %, об'ємна частка) чи мелясу (1,0 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію синтезованих ПАР та індекс емульгування визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, і у разі підвищення у два рази концентрації гліцерину та меляси у суміші показники синтезу ПАР є вищими, ніж на відповідних моносубстратах, а найвища концентрація ПАР досягається за використання посівного матеріалу, вирощеного на суміші гліцерину і меляси. 2 UA 108705 C2 Таблиця 2 Синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на суміші субстратів Джерело вуглецю у середовищі для біосинтезу, % Гліцерин, 1,0 + Меляса, 2,0 Гліцерин, 1,84 Меляса, 4,4 5 10 Джерело вуглецю у середовищі для одержання інокуляту, % Гліцерин, 0,5 Меляса, 1,0 Гліцерин, 0,25 % + Меляса 0,5 Гліцерин 0,5 Меляса 1,0 Показники синтезу ПАР ПАР, г/л Е24, % 2,8±0,14 2,5±0,13 3,9±0,19 1,7±0,09 2,0±0,10 54±2,7 61±3,0 56±2,8 51±2,6 52±2,6 Приклад 3. Визначення оптимальної концентрації гліцерину та меляси у змішаному субстраті для синтезу ПАР N. vaccinii IMB В-7405 Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (0,8-1,2 %, об'ємна частка) та меляси (1,8-2,2 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка). Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію синтезованих ПАР визначають як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР на суміші різних концентрацій гліцерину та глюкози наведено у табл. 3. Таблиця 3 Синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на суміші різних концентрацій гліцерину та глюкози Концентрація гліцерину, % 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 15 20 25 30 Концентрація меляси, % 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 ПАР, г/л 3,3±0,16 3,8±0,19 3,9±0,19 3,8±0,19 3,3±0,16 3,2±0,16 3,8±0,19 3,9±0,19 3,9±0,19 3,5±0,17 Як видно з наведених у табл. 3 даних, найвища концентрація ПАР (3,8-3,9 г/л) спостерігається за концентрації гліцерину та меляси у суміші 0,9-1,1 та 1,9-2,1 % відповідно. Приклад 4. Порівняння показників синтезу ПАР штамами R. erythropolis IMB Ас-5017 і N. vaccinii IMB В-7405 на суміші ростових субстратів Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (1,0 %, об'ємна частка) та меляси (2,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування штаму IMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,3; MgSO4-7H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO4-7H2O0,001; рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану та гліцерину об'ємною часткою 0,60 і 0,84 % відповідно. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гексадекану. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. 3 UA 108705 C2 5 Концентрацію біомаси визначають ваговим методом, концентрацію ПАР - як описано у прикладі 1. ПАР-синтезувальну здатність визначають як відношення концентрації ПАР (г/л) до концентрації біомаси (г/л) і виражають у г ПАР /г біомаси. Показники синтезу ПАР штамами R. erythropolis IMB Ас-5017 і N. vaccinii IMB В-7405 на суміші ростових субстратів наведено у табл. 4. Таблиця 4 Синтез ПАР за умов росту N. Vaccinii IMB В-7405 і R. erythropolis IMB Ас-5017 на суміші ростових субстратів Штам R. erythropolis IMB Ас-5017 (прототип) N. vaccinii IMB В-7405 10 ПАР-синтезу вальна здатність, г ПАР/г біомаси Гексадекан + гліцерин 1,35±0,07 Гліцерин + меляса 3,2±0,15 Змішаний субстрат Як видно з наведених у табл. 4 даних, культивування N. vaccinii IMB В-7405 на суміші гліцерину і меляси дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність у 2,4 разу (до 3,2 г ПАР/ г біомаси) порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю використовують суміш гліцерину (0,9-1,1 %, об'ємна частка) та меляси (1,9-2,1 %, масова частка). Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4