Спосіб визначення впливу чинника на рослину

Реферат: Спосіб визначення впливу чинника на рослину включає темнову адаптацію фрагмента рослини, опромінення його світлом у діапазоні хвиль поглинання хлорофілу, прийом, виділення та вимірювання сигналів наведеної флуоресценції у діапазоні хвиль флуоресценції хлорофілу, покроково наростаючий вплив на рослину і вимірювання між кроками впливу максимальної та стаціонарної флуоресценції. За верхню границю приймають критичний стан, який визначають за умови, коли стаціонарна флюоресценція більша за половину варіабельної Fst>0,5Fv, а поточний стан Fsti визначають як процентну частку (2Fsti/Fv)100 % критичного стану, де Fsti флуоресценція і-того поточного стану рослини, Fv - варіабельна флуоресценція. UA 111925 U (12) UA 111925 U UA 111925 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб належить до області дослідження матеріалів шляхом визначення їх фізичних властивостей, зокрема запису і аналізу кривої індукції флуоресценції нативного хлорофілу інтактного листка рослини (індукційна крива Каутського). Спосіб орієнтовано на застосування у сільському господарстві, зокрема в рослинництві, садівництві та в екології при визначенні впливу забруднень на рослинність. Відомо "Спосіб діагностики стійкості винограду до абіотичного стресу методом індукції флуоресценції хлорофілу" патент України № 87319 від 10.02.2014 р. Спосіб полягає у визначенні критичних концентрацій стресових агентів для різних сортів і шляхом порівняння критичних концентрацій визначають стійкість сортів. Спільними рисами запропонованого способу та аналога є нормований вплив різних концентрацій стресових агентів на рослини винограду та порівняння їх разом з флуоресценцією для різних сортів для визначення стійкості винограду. Причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату є те, що критичні концентрації стресових агентів для порівняння ще треба визначити, а як це зробити аналог не дає. Відомо "Спосіб визначення критичної дози впливу на рослину", корисна модель 201512608 від 21.12.2015. "Спосіб визначення впливу чинника на рослину", який включає темнову адаптацію фрагмента рослини, опромінення його світлом у діапазоні хвиль поглинання хлорофілу, прийом, виділення та вимірювання сигналів наведеної флуоресценції у діапазоні хвиль флуоресценції хлорофілу і виділення з поточних значень максимальної флуоресценції Fm та стаціонарної Fst, а також на дослідну рослину впливають покроково наростаючою дозою впливу та між кроками вимірюють індукцію флуоресценції хлорофілу, а дозу впливу, при якій сигнал флуоресценції на рівні стаціонарної Fst стає більшим половини максимальної Fm, Fst>0,5 Fm, вважають критичною дозою впливу чинника на рослину. Спільними рисами прототипу та запропонованого способу є операції отримання флуоресцентних сигналів листя рослин і дія на рослину зовнішнім чинником покроково наростаючої величини та між кроками вимірювання показників індукції флуоресценції хлорофілу. Причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату є те, що прототип визначає критичну дозу впливу, а поточний стан рослини, що знаходиться під поточним впливом, не визначає. В основу корисної моделі поставлена задача створення такого експресного способу визначення впливу на рослину в польових умовах, в якому завдяки введенню у відомий спосіб нових операцій, їх послідовності та інтерпретації результатів стало б можливим експресно визначати та кількісно оцінювати величину впливу на рослину, при відомій величині критичної дози впливу. Позитивний ефект досягають за рахунок того, що спосіб визначення впливу чинника на рослину, включає темпову адаптацію фрагмента рослини, опромінення його світлом у діапазоні хвиль поглинання хлорофілу, прийом, виділення та вимірювання сигналів наведеної флуоресценції у діапазоні хвиль флуоресценції хлорофілу, покроково наростаючий вплив на рослину і вимірювання між кроками впливу максимальної та стаціонарної флуоресценції, а за верхню границю приймають критичний стан, який визначають за умови, коли стаціонарна флюоресценція більша за половину варіабельної Fst>0,5Fv, a i-й поточний стан Fsti визначають як процентну частку (2Fsti/Fv)100 % критичного стану, де Fsti - флуоресценція і-того поточного стану рослини, Fv - варіабельна флуоресценція. Відмінними ознаками запропонованого способу є те, що за верхню границю стану приймають критичний стан, який визначають за умови, коли стаціонарна флюоресценція більша за половину варіабельної Fst>0,5Fv, a поточний стан Fsti визначають як процентну частку (2Fsti/Fv)100 % критичного стану, де Fsti - флуоресценція і-того поточного стану рослини, Fv варіабельна флуоресценція. Для однозначності сприйняття наведемо деякі визначення: ДОЗА ДІЇ (впливу) - кількість дії, добуток інтенсивності дії на час дії. КРИТИЧНА ДОЗА дії (впливу) на рослину - кількість дії, що викликає незворотні зміни рослини, викликає критичний стан. ПОТОЧНИЙ ВПЛИВ НА РОСЛИНУ - черговий вплив із ряду впливів, який викликає і-тий поточний стан рослини. ІФХ - індукція флуоресценції хлорофілу. Знання критичної дози дії чинника на рослину та поточного стану рослини у кількісних одиницях необхідно для визначення стійкості рослин до дії різних природних та антропогенних екзо та ендогенних чинників та оцінки різних фаз стресового стану. 1 UA 111925 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 При дії на рослину стресового чинника вона змінює свій стан, а тим самим змінює показники індукції флуоресценції. Введення у відомий спосіб операцій дії покроково наростаючою дозою впливу і між кроками вимірювання індукції флуоресценції хлорофілу, та дози впливу, при якій сигнал флуоресценції ІФХ на рівні стаціонарної флуоресценції Fst стає більшим половини варіабельної флуоресценції Fv, дозволяє визначити критичну дозу впливу чинника на рослину та кількісно оцінити поточний вплив при поточному стані рослини Fsti. Відомо, що певні ділянки кривої індукції флуоресценції хлорофілу є індикаторами відповідних фізіологічних процесів у ланцюгу фотосинтезу. Тому порушення окремих ланок фотосинтезу, викликані екзо та ендогенними чинниками проявляються у змінах характерних значень кривої ІФХ. Такі зміни індукційної кривої рослини, на яку діє стресор, доцільно використати як діагностичну ознаку. Параметр Fst вибрано у зв'язку з більш високою чутливістю темнових фотосинтетичних процесів до дії стресових чинників. Один з найбільш чутливих показників є активність рибульозобісфосфат-карбоксилази (Рубіско). Зменшення активності рубіско приводить до відновлення переносників ЕТЛ ФС2, в результаті пониження атрагуючої здатності цього ферменту. Але відновлення переносників призводить до відновлення і закриття РЦ ФС2. Останнє супроводжується зниженням спаду ІФХ і реєструється як підвищення Fst. Запропонований спосіб реалізує наступний порядок визначень: за допомогою хронофлуорометра, наприклад ФЛОРАТЕСТА, отримують поточні значення флуоресценції і з них будують індукційну криву листка. Фрагмент листка опромінюють світлом, яке збуджує флуоресценцію хлорофілу. Частіше довжину хвилі опромінення вибирають у діапазоні хвиль поглинання хлорофілу 400650 нм, який охоплює головні λ=450 нм і λ=650 нм та проміжні λ=500 нм, λ=550 максимуми довжин хвиль. Опромінення актинічним світлом здійснюють у діапазоні інтенсивності 1002000 -2 -1 Мкмольфотонів.м с , яка підтримує фотосинтез. Одночасно з опроміненням здійснюють прийом, виділення, вимірювання і реєстрацію сигналів флуоресценції з освітленої плями листка в діапазоні хвиль 670-750 нм. Діапазон флуоресценції охоплює обидва максимуми флуоресценції нативного хлорофілу на λ=680 нм та λ=735 нм. Із поточних значень флуоресценції будують індукційну криву флуоресценції і виділяють характерні значення стаціонарної флуоресценції та значення максимальної і нульової, з яких визначають варіабельну. Запропонований спосіб визначення впливу чинника на рослину, як видно з його опису, може бути реалізований у виробних умовах, так як для його реалізації використовують серійні хлорофілфлуорометри, які дозволяють записувати індукційну криву. При реалізації способу був застосований переносний флуорометр "Флоратест" з сенсором хлорофілу по патенту на винахід № 94814 виробництва Інституту кібернетики НАН України, але можна використати інші прилади, наприклад, портативний хлорофіл-флуорометр РАМ - 2100 німецької фірми Heinz Walz GmbH, або хлорофіл-флуорометр OS-30р фірми OPTI-Sciences, USA. Приклад реалізації способу. Спосіб реалізовано при проведенні лабораторного досліду. Листок суниці садової Fragaria vesca, вирощеної в горщику, охолоджували з кроком 2 °C в інтервалі температур (+21-15)°С. Перед кожним кроком підвищення (пониження) температури міряють індукцію флуоресценції хлорофілу (ІФХ), фіксують величину Fst і порівнюють її з Fv (значення варіабельної флуоресценції Fv нормують). При Fs > 0,5Fv дозу впливу (дії) вважають критичною і вимірювання припиняють. Дозу дії визначають як добуток температури на час дії. Вимірювання ІФХ виконують наступним чином: Листок рослини розміщували між пластинами сенсора і витримували без світла 10 хв. Для опромінення листка рослини було використано 4 синіх світлодіоди NSPB500S (Nicbia) з довжиною хвилі випромінення 460 нм ± 10 нм. Діоди розміщені попарно на протилежних сторонах каркаса, симетрично відносно фотоприймача і в межах плями освітлення діаметром 5 мм створюють рівномірне освітлення. При інтенсивності -2 -1 освітлення 450 мкмоль м с і більше сигнал індукованої флуоресценції надійно фіксується. Для виділення сигналу флуоресценції нами застосовано червоний скляний світлофільтр КС-17, який забезпечує надійне відсікання випромінення світлодіодів і пропускання сигналів флуоресценції. Як фотоприймач використано інтегрований з підсилювачем світлодіод ОРТ301М (Burr-Brown), у якому максимум чутливості в діапазоні хвиль 650800 нм. Для вимірювання і реєстрації сигналів використано мікроконтролер ADuC 842 (Analog Devieces). Спеціалізовані програми роботи контролера дозволяють виділити Fst, Fm і Fo визначити критичну дозу холоду для суниці. Запропонований спосіб дозволяє визначити критичну і поточну дози впливу (дії) чинника при масових експресних визначеннях стійкості рослин до стресових чинників, а також визначати поточні значення впливів при різних фазах стресу. 2 UA 111925 U 5 10 Запропонований спосіб визначення критичної та поточної дози впливу на рослину буде застосовано в Інституті садівництва НААН при тестуванні суниці садової, ожини та ефіроолійних культур, що зимують з листям, (саджанців плодових дерев та ягідників та визначати їх стресові стани. Эксперимент Температура змінюється від -15 °C до 21 °C. При кожній температурі є набір рослин, на які впливає ця температура, наприклад m=10, 5, 8, 15 тощо. При кожній температурі знімають флуоресцентні криві та визначають ψ=2Fst/Fv. При цьому визначають кількість рослин, що вижили після їх повернення до нормальних умов, тобто ψ → 0,38. Тобто флуоресцентна крива рослин, на які був вплив, повертається в початковий стан, тобто ψ=0,38. Другий стовпчик таблиці даних це μ=λ/m (частка тих рослин, що вижили). Помноживши на 100 % отримаємо відсоток тих рослин, що вижили. З даних і графіка видно, що при умові 50 % тих рослин, що вижили (це запропонований критерій) індекс ψ=2Fst/Fv дорівнює 0,5. 15 Т (С) -15,00 -13,00 -11,00 -9,00 -7,00 -5,00 -3,00 -1,00 1,00 3,00 5,00 7,00 9,00 11,00 13,00 15,00 17,00 19,00 21,00 20 μ 0,00 0,30 0,40 0,50 0,60 0,85 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 ψ = 2Fst/Fv 1,00 0,90 0,50 0,48 0,45 0,43 0,42 0,40 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38 0,38 Рівень 0,5 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 Запропонований спосіб визначення критичної та поточної дози впливу на рослину буде застосовано в Інституті садівництва НААН при тестуванні суниці садової, ожини та ефіроолійних культур, що зимують з листям, (саджанців плодових дерев та ягідників) та визначати їх стресові стани. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб визначення впливу чинника на рослину, який включає темнову адаптацію фрагмента рослини, опромінення його світлом у діапазоні хвиль поглинання хлорофілу, прийом, виділення та вимірювання сигналів наведеної флуоресценції у діапазоні хвиль флуоресценції хлорофілу, покроково наростаючий вплив на рослину і вимірювання між кроками впливу максимальної та стаціонарної флуоресценції, який відрізняється тим, що за верхню границю приймають критичний стан, який визначають за умови, коли стаціонарна флюоресценція більша за половину варіабельної Fst>0,5Fv, а поточний стан Fsti визначають, як процентну частку (2Fsti/Fv) 100 % критичного стану, де Fsti - флуоресценція і-того поточного стану рослини, Fv варіабельна флуоресценція. 3 UA 111925 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4