Препарат “родойл” для біологічного очищення грунту і води від забруднень нафтою та нафтопродуктами

1. Препарат для біологічного очищення фунту j води від забруднень нафтою та нафтопродуктами, що складається із вуглеводеньокислюючих мікроорганізмів, який відрізняється тим, що як вуглеводеньокислюючі мікроорганізми містить композицію щонайменше двох штамів бактерій, вибраних з групи: Acinetobacter calcoaceticus 1MB B-7013, Gordonia rubropertinctus 1MB Ac-5005 і Rhodococcus erythropolis 1MB B-7012, і додатково містить нейтральні сорбенти та комплексні мінеральні добрива при наступному співвідношенні компонентів, мас.%: сорбенти з біомасою бактерій 98-70 комплексні мінеральні добрива 2-30. 2. Препарат по п. 1, який відрізняється тим, що включає композицію штамів бактерій Acinetobacter calcoaceticus 1MB B-7013, Gordonia rubropertinctus 1MB Ac-5005 і Rhodococcus erythropolis 1MB B-7012 у співвідношенні 1:1.1. З Препарат по п. 1, який відрізняється тим, що включає композицію штамів бактерій Acinetobacter calcoaceticus 1MB B-7013, Gordonia rubropertinctus 1MB Ac-5005 у співвідношенні 1.1. 4. Препарат по п. 1, який відрізняється тим, що включає композицію штамів бактерій Acinetobacter calcoaceticus 1MB В-7013 і Rhodococcus erythropolis 1MB B-7012 у співвідношенні 1:1. 5 Препарат по п. 1, який відрізняється тим, що включає композицію штамів Gordonia rubropertinctus 1MB Ac-5005 і Rhodococcus erythropolis 1MB B7012 у співвідношенні 1:1 О О) Винахід відноситься до біотєхнологй і екології і призначений для біологічного очищення ґрунтових та водних екосистем від забруднень нафтою та нафтопродуктами в різних природно-кліматичних зонах. Відомі методи боротьби з нафтовими забрудненнями, в яких використовують біологічні препарати "Пупдойл" (А с. СССР № 1076446, кл. С 02 F 3/34, 1984; Авт. свид. СССР № 1428809, кл. С 02 F 3/34, 1988), "Еколан" (рекламна інформація, розробник НПО "Буріння", ВНІІКРнафта), "Бюпрін" (олеворін) (Авт. свид СССР № 1723817, кл. С 12 № 1/20, 1991; ТУ 11279895-12-22-92), а також інтродукцію в забруднене середовище штамів бактерій Acinetobacter oleovorum ЦМПМ В-1878 і ВКПМ У-409 (Патент RU № 2038333 кл. С 02 F 3/34, 1995; Патент SU № 1809822, кл. С 02 F 3/34, 1993), Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum ВКПМ-В 6727 Н-1, ВКПМ-В-6728 G-1, ВКПМ-В-6726 (Патент RU № 2053204, кл С 02 F 3/34, 1996), Pseudomonas fiuorescens ЦМПМ-2а (Патент RU № 2033975, кл. С 02 F 3/34, 1995, Патент RU № 2052394, кл С 02 F 3/34, 1996). Недоліками наведених методів є використання монокультур або близьких за фізіологічними характеристиками штамів одного виду гідрофільних бактерій, які здатні засвоювати тільки розчинні у воді компоненти нафти, що значно знижує ефективність процесу деструкції, яка залежить від швидкості і ступеню розчинності забруднювача. Крім того, деякі з наведених вище препаратів, зокрема "Путідойл", в природних умовах можуть бути малоефективними і виявляти пригнічуючу дію на природні мікробні ценози (Новиков Ю.В., Комзолова Н.В. Исследование бактериального препарата Путидойл, предназначенного для со со 34894 дифузним шляхом, що дозволяє більш ефективно проводити бюдеструкцію нерозчинних у воді гідрофобних субстратів. Ацинетобактерй здатні утворювати єкстрацепюпярні бюемульгатори, які перетворюють шар вуглеводнів в дрібнодисперсну емульсію, що зменшує їх гідрофобність і значно полегшує проникнення в клітину. На відміну від мікроорганізмів, які входять до складу "Devouroil", відібрані нами штами можуть засвоювати не тільки н-алкани, але й більш складні фракції нафти - гас, солідол, мастила та інші. Препарат "Родойл" виготовляється на сипучих сорбентах, які концентрують на своїй поверхні вуглеводні і клітини мікроорганізмів, створюючи активні мікроосередки деструкції нафти та нафтоОсновними недоліками "Нафтокс" є складність продуктів Сорбенти можуть бути використані в технології їх виготовлення і використання, незначгідрофільній (для очищення грунту) або в гідрофоний строк зберігання ( 1 - 6 місяців), а також необбізованій (для очищення води) формі. Збільшення хідність додаткового внесення на забруднені ефективності бюдеструкції вуглеводнів досягаєтьтериторії наповнювача - родючого (садового) грунся шляхом включення до препарату оптимально ту або компосту, що обумовлює високу вартість підібраних мінеральних компонентів - комплексних очищення. азотно-фосфорно-калійних добрив типу амофоски Найбільш близьким за складом бактерій до або нітроамофоски. запропонованого нами препарату є консорціум мікроорганізмів під назвою "Devouroil" (Патент RU Використання біопрепарату «Родойл» ліквідує № 2023686, кл С 02 F 3/34, 1994), який використовказані недоліки при застосуванні наведених вище вується для очищення поверхні води та грунту від препаратів для очищення забруднень грунту та забруднень нафтопродуктами і може бути прийняводи від нафти та нафтопродуктів. «Родойл» хатий за прототип винаходу Консорціум включає рактеризується широким спектром нафтоокислюгідрофільні та ліпофільні бактерії (Pseudomonas ючо'і активності і може проводити ефективне очиstutzeri 367-1, Rhodococcus sp 367-2, Rhodococcus щення середовищ, забруднених н-парафінами Сю man's 367-5, Rhodococcus erythropolis 367-6) і дріж- Сзо, сирою нафтою, дизельним паливом, гасом, джі (Candida sp. 367-3), що дозволяє проводити солідолом, мастилами та іншими речовинами, які окислення нафтопродуктів як в зоні контакту з вомістять вуглеводні, «Родойл» має значну емульдою, так І безпосередньо в нафтовій плівці. Недогуючу здатність по відношенню до нафти в прісній ліком цього препарату є те, що його дія обмежена та морській воді і може застосовуватися для очиочищенням поверхні засолених грунтів та води, щення поверхні нафтотенків та інших ємкостей від культури виявляють незначну деструктивну активзалишків нафтопродуктів. ність при мінералізації' середовища нижче 1% і не Препарат виявляє високу активність на протязі випробувані в природних умовах. Враховуючи те, тривалого часу, що пояснюється збереженням що вказані вище мікроорганізми, зокрема дріжджі, стабільної кількості життєздатних клітин мікробнозасвоюють лише н-парафіни, вони можуть бути го компоненту, як в самому препараті, так і в нафнеконкурентноздатні в навколишньому середовитозабрудненому середовищі при його використанщі. ні. Біопрепарат непатогенний, не токсичний, зручний при транспортуванні, не забруднює доЗавданням винаходу було створення на основі вкілля. активних штамів апканотрофних бактерій, які домінують в природних мікробних спільнотах нафтоМікробний компонент препарату включає бакзабруднених екосистем, новий комплексний висотеріальні культури, селекціоновані в процесі кулькоефективний біопрепарат широкого спектру дії тивування на мінеральному середовищі з додадля очищення поверхні грунту, відкритих водойм і ванням нафти як єдиного джерела вуглецю і підземних вод від забруднень нафтою і нафтопровідібрані з врахуванням спектру їх вуглеводеньодуктами кислюючо'і активності. Завдання вирішується тим, що до складу преШтам Acinetobacter calcoaceticus 1MB В-7013 парату "Родойл" входить штучно створена компоізольований із забрудненого при аварійному роззиція природних вугливоденьокислюючих мікроорливі нафти грунту в районі озера "Опечень", м. ганізмів, яка може включати три або будь які два із Київ вказаних далі штамів ліпофільні нокардюподібні 1. Морфологічні ознаки. Грамнегативні, нерухбактерГі Gordonia rubropertinctus 1MB Ас-5005, ливі, короткі паличковидні клітини На МПА через Rhodococcus erythropolis 1MB В-7012та гідрофільні 24 години росту прямі овоідні або коковидні клітибактерії Acinetobacter calcoaceticus 1MB В-7013. ни (1,0 - 1,5 х 1,5 - 2,5мкм). Розташовані попарно Родококи та гордонії характеризуються значними або в коротких ланцюжках. Рідко зустрічаються перевагами перед іншими вугливоденьокислююнитковидні, неправильної форми клітини, які розчими мікроорганізмами; вони стійкі до несприятлипадаються з часом на коки Спори не утворюють вих умов існування, мають потужну ліпофільну 2. Культуральні ознаки. Колонії на МПА світлоклітинну стінку, яка містить МІКОЛОВІ кислоти і засірі, напівпрозорі, ріст пастоподібний, незначний. безпечує їм легке поглинання вуглеводнів всією З ФІЗІОЛОГІЧНІ ознаки. Каталазопозитивні, окповерхнею клітин пасивно-дифузним шляхом, що сидазонегативні. Хемоорганотрофи з окислюваль для очищения водоёмов от нефти. Водное хозяйство, 1992, № 2 , с. 121 -123). Існують нафтоокислюючі біопрепарати "Нафтокс", що можуть використовуватися в рідкій формі {Патент RU № 2053206, кл. С1 F 3/34, 1996) або виготовлятися на твердому органічному субстратіносіі (торфі), в який додатково вводиться суміш вуглеводнів Сі2-Сі8 і щавлевокислий амоній (Патент RU № 2041172, кл. С 02 F 3/34, 1995; Патент RU № 2053205, кл. С 02 F 3/34, 1996) Препарати включають один із штамів нафтоокиспюючих бактерій- Mycobactenum paraffimcum 4T, Mycobactenum parafflnicum 9KB, Mycobactenum phlei 5KB, Pseudomonas aeruginosa Д або Rhodococcus sp. 34894 6 ним метаболізмом Підкислюють середовища з тинної стінки, містять МІКОЛОВІ кислоти. глюкозою, фруктозою, манозою, ксилозою, галак5 Зберігання штаму Штам підтримується на тозою Слабо засвоюють цитрат, ацетат, фумарат, м'ясо-пептонному агарі (МПА) і в люфілізованому піруват, сукцинат і малат Ростуть в присутності 0 стані Для зберігання штаму використовують ме4% NaCI Активно засвоюють етанол, н-алкани d e , тод періодичного пересіву на МПА ( 3 - 4 рази на Q17, С20, С23, а також суміш Сго-Сзо, дизельне парік) Штам інкубують при температурі 28°С на проливо, солідол, гас або нафту як єдині джерела тязі 48 годин і зберігають в холодильнику при 4°С вуглецю і енергії та NHV як джерело азоту Всі запропоновані штами непатогенні і нале4 Зберігання штаму Штам зберігається на жать до групи авірулентних, не токсичних, не токМПА Для підтримки життєздатності клітин викорисигенних мікроорганізмів, які не проявляють алерстовується метод періодичних пересівів на МПА генної ди і не здатні до інвазії у внутрішні органи через 2 МІСЯЦІ Інкубують 72 години при темпералабораторних тварин Штами депоновані в Депотурі 28°С і зберігають в холодильнику при 4°С зитарії Інституту мікробіологи і вірусологи НАН України за номерами 1MB Ас-5005 (Gordonia Штам Gordonia rubropertinctus 1MB Ас-5005 rubropertinctus), 1MB В-7012 (Rhodococcus erythroізольований із забрудненого нафтою чорноземноpolis) та 1MB В-7013 (Acmetobacter calcoaceticus) го грунту, відібраного на території нафтопереробного заводу в смт Качанівка Охтирського району Для виготовлення препарату штами AcmetoСумської області bacter calcoaceticus 1MB В-7013, Gordonia rubroper1 Морфологічні ознаки Грампозитивні, нерухtinctus 1MB Ас-5005 і Rhodococcus erythropohs 1MB ливі, не утворюють спори На МПА через 18 годиВ-7012 вирощують окремо в присутності вуглеводни росту клітини короткі, паличковидні (0,5 - 0,8 х нів на мінеральному середовищі, яке включає 2,0 - 3,0мкм, інколи 4,0 - 6,0мкм), прямі, розташоджерела азоту, фосфору, калію і магнію Культивані поодинці або під кутом одна до одної вування проводять в аеробних умовах при температурі 28°С Отримані біомаси культур змішують у 2 Культуральні ознаки Колонії на МПА оранспіввідношенні 1 1 1 ( при використанні композиції жево-рожеві або інтенсивно рожеві, ріст слизисз трьох штамів), або у співвідношенні 1 1 ( при витий, помірний користанні композиції з двох штамів), додають до 3 ФІЗІОЛОГІЧНІ ознаки Каталазопозитивні, аених сорбенти та комплексні мінеральні добрива і роби Утворюють кислоту із глюкози, сахарози, висушують до вологості не більшої ніж 10% Комманіту, сорбіту Утилізують ацетат і бензоат Відпоненти препарату знаходяться у співвідношенні новлюють нітрати в нітрити Ростуть в присутності (мас %) сорбенти з біомасою нафтоокислюючих 0 - 2% NaCI Активно засвоюють н-алкани Се, Сіє, бактерій - 98 - 70%, комплексні мінеральні добриСі7, Сго, Сгз, а також суміш Сго-Сзо, дизельне пава - 2 - 30% В 1 грамі готового препарату повинно ливо, газолін, солідол, моторні мастила, гас і нафміститися не менше 1 103 бактеріальних клітин, які ту на середовищах з амонійним і нітратним джеокислюють вуглеводні Нижче наведені приклади, релом азоту що підтверджують високу ефективність біопрепа4 Хемотаксономічні ознаки Мають IY тип клірату «Родойл». і тинної стінки, містять МІКОЛОВІ кислоти 5 Зберігання штаму Штам підтримується в Приклад 1 колекції на МПА і в люфілізованому стані Для Визначення впливу тривалості культивування зберігання штамів використовують метод періодина ступінь бюдеструкци вуглеводнів нафти мікрочного пересіву на МПА через 2 місяці Інкубують бним компонентом препарату "Родойл", який при температурі 28°С на протязі 72 годин і зберівключає штами Acinetobacter calcoaceticus 1MB Вгають в холодильнику при 4°С 7013, Gordonia rubropertinctus 1MB Ас-5005 і Штам Rhodococcus erythropolis 1MB В-7012 Rhodococcus erythropolis 1MB В-7012 В колби об'ізольований із сірого опідзоленого грунту, відібраємом 750мл, що містять по 200мл мінерального ного в районі с Старожинець Чернівецької облассередовища, вносять 780мг/л сирої нафти і суті спензію клітин трьох культур (у співвідношенні 111), які вирощені окремо до кінця логарифмічної 1 Морфологічні ознаки Грампозитивні, нерухфази росту на мінеральному середовищі з 0,2% ливі паличковидні клітини На сусло-агарі через 16 дизельного палива Як контроль використовують - 18 годин росту прямі або злегка викривлені (0,6 мінеральне середовище з нафтою без внесення 1 х 6 - 8мкм, інколи 15 - 19мкм} слабо розгалужені, культур КІЛЬКІСНИЙ облік бюдеструкци нафти пророзташовані під кутом або полісадовидно Спори водять ІЧ-спектрофотометричним методом на не утворюють аналізаторі нафтопродуктів АН-1 ВІДПОВІДНО ДО 2 Культуральні ознаки Колонії на сусло-агарі ОСТ 38 01378-85 або за ГОСТом 26449 1-85 Чекремові, ріст слизистий, інтенсивний рез 14 діб інкубації при кімнатній температурі в 3 ФІЗІОЛОГІЧНІ ознаки Каталазопозитивні, аестатичних умовах без перемішування і аерації дероби Добре ростуть на ацетаті, цитраті, лактаті і струкція вуглеводнів нафти досягала 69,1%, а в сукцинаті Активно засвоюють індивідуальні ндинамічному режимі з перемішуванням при кульалкани Сю С13-С15, С17-С19, а також суміш С20-С30тивуванні в колбах на качалках (п = 160об/хв) дизельне паливо, солідол, гас або нафту як єдині ступінь очищення складала 95,3% В контрольних джерела вуглецю та енергії Утворюють кислоту із дослідженнях без внесення препарату в статичних глюкози, ксилози, сахарози, фруктози Слабо пді динамічних умовах за рахунок випаровування ролізують крохмаль і тирозин Ростуть в середолегких фракцій кількістьвнесеної нафти зменшивищі з 0 - 7% NaCI Використовують амонійний і лась ВІДПОВІДНО на 1,1% та 1,9% (Табл 1) нітратний азот 4. Хемотаксономічні ознаки Мають IY тип клі 34894 Таблиця 1 Вплив тривалості культивування на ступінь біодеструкції вуглеводнів нафти мікробним компонентом препарату "Родойл" Варіанти досліду Тривалість культивування (доба) 3 4 5 Бюдеструкція (%) 0 0 0 1 1. Середовище + нафта 2. Середовище + нафта + бактеріальні культури 3. Середовище + нафта 4. Середовище + нафта + бактеріальні культури 2 0 0 9,1 20,2 48,9 52,3 0 0 0 21,1 35,2 63,5 7 | 14 0 1,1 53,1 55,4 69,1 1,7 1,8 1,8 1,9 74,9 76,2 81,4 95,3 Примітки: 1,2- статичні умови культивування; 3,4 - культивування при перемішуванні. Приклад 2 Випробування препарату, для очищення грунту від нафти проводили на протязі 90 діб на модельних ділянках в природних умовах з використанням двох типів грунтів - дерново-підзолистого і чорнозему звичайного, в які вносили сиру нафту по 18200мг/кг грунту і препарат в кількості 10% від вмісту нафти. Для дослідів використовували препарат, який включає (мас. %): сорбенти з біомасою штамів Acmetobacter calcoaceticus 1MB В-7013, Gordonia rubropertinctus 1MB Ас-5005 і Rhodococcus erythropolis 1MB B-7012 (у співвідношенні 1:1:1) - 98,0 і комплексні мінеральні добрива - 2,0. Контролями були забруднені нафтою грунти без вне забруднені нафтою грунти без внесення препарату. Ступінь очищення від вуглеводнів нафти при використанні препарату "Родойл" досягала 98,5 - 99,2% (Табл. 2). Приклад З Випробування препарату для очищення води від нафтозабруднень проводили в колбах об'ємом 1000мл, в які вносили по 200мл прісної або морської' води і нафту (до кінцевої концентрації' 780мг/л). В воду додавали препарат «Родойл» (10% від вмісту забруднювача), який включає (мас. %): пдрофобізовані сорбенти з біомасою штамів Acinetobacter calcoaceticus Таблиця 2 Деструкція вуглеводнів препаратом «Родойл» в забрудненому нафтою грунті Варіанти досліду Грунт дерново-підзопистий + нафта Грунт чорноземний + нафта Грунт дерново-підзолистий + нафта + препарат Грунт чорноземний + нафта + препарат Початкова кількість вуглеводнів (мг/кг грунту) 18200 18200 Ступінь дестру- Швидкість деструкції за кції (%) добу (мг/кг грунту) 2,1 4,2 10,3 20,8 18200 98,5 199.2 18200 99,2 200,6 1MB В-7013, Gordonia rubropertinctus 1MB Ас5005 і Rhodococcus erythropolis 1MB В-7012 у співвідношенні 1:1:1 - 90,0 і комплексні мінеральні добрива - 10,0. Ступінь деструкції вуглеводнів нафти через 10 діб культивування на механічній качалці (п = 160об/хв) при температурі - - 26 - 28°С дорівнював в прісній воді - 81,9%, а в морській воді 83,1% (Табл. 3). Таблиця З Деструкція вуглеводнів препаратом «Родойл» в забрудненій нафтою воді Варіанти досліду Вода прісна + нафта Вода морська + нафта • Вода прісна + нафта + препарат Вода морська +нафта + препарат Початкова кількість вуглеводнів (мг/л) 780 780 Кількість залишкових вуглеводнів (мг/л) 770 766 Ефективність бюдеградаЦії(%) 1,3 1.8 780 141 81,9 780 132 83,1 34894 10 11 12 34894 Приклад 4 Визначення життєздатності мікробного компоненту препарату "Родойл" при низьких температурах проводили шляхом обліку КІЛЬКОСТІ бактерій, які виросли на твердому поживному середовищі (м'ясо-пептонному агарі) після зберігання біопрепарату в морозильній камері при -10°С на протязі ЗО діб Досліди показали, що КІЛЬКІСТЬ життєздатних клітин в 1г препарату на початку досліду дорі8 внювала 4-Ю життєздатних клітин (ЖК), а після е заморожування - 1 10 ЖК, що свідчить про збереження життєздатності мікробного компоненту біопрепарату під дією екстремальних температур. Приклад 5 З метою порівняльної оцінки ефективності мікробного компоненту препарату «Родойл» відносно відомого консорціуму мікроорганізмів "Devouroil" (прототип) проведені дослідження аналогічні наведеним в методиці № 2 патенту RU № 2023686, але в них замість "Devouroil" використовувався «Родойл». Визначення впливу мінералізації" середовища на ступінь бюдеструкцГі вуглеводнів нафти мікробним компонентом препарату «Родойл», який включає штами Acmetobacier calcoacebcus 1MB В7013, Gordonia rubropertinctus 1MB Ас-5005 і Rhodococcus erythropolis 1MB В-7012 у співвідно сл їв відношенні 1:1:1, проводили в колбах об'ємом 0,5л, що містили мінералізоване середовище, нафту і біомасу клітин у співвідношенні 99:1:0,0001. Проби відбирали через 3, 5 і 10 діб культивування при перемішуванні (п = бОоб/хв). Ступінь деструкцГі визначали за зміною концентрації н-парафінів С7-С30. Результати досліджень наведені в табл 4 свідчать про те, що на відміну від консорціуму "Devouroil", мікробний компонент препарату «Родойл» виявляє високу ефективність як деструктор вуглеводнів в середовищі з різною мінералізацією. «Родойл» здатний проводити активну деструкцію парафінових вуглеводнів не тільки при концентрації NaCI від 1 до 3%, але й при мінералізації' середовища нижче 1%. Так, при вмісті NaCI 0,1% через 10 діб культивування ступінь біодеструкцГі вуглеводнів мікроорганізмами препарату «Родойл» складає 89,7%, а препарату "Devouroil" - лише 7,0% (Табл. 4). Аналогічні дослідження (за Прикладам 1 - 5), проведені з використанням композицій, які складаються із будь-яких двох вказаних вище штамів нафтоокислюючих бактерій, які входять до складу мікробного компоненту препарату «Родойл», показали близькі за значеннями результати. Таблиця 4 Залежність ступеню деструкції парафінових вуглеводнів сирої нафти від засоленості середовища Доба Препарат Солоність (% NaCI) 0,05 0,1 1 3 Родойл 49,5 51,6 53,6 54,9 3 5 10 Devouroil Родойл Devouroil Родойл Devouroil Д/в 67,2 79,8 81,3 80,2 д/в 7 80 80 74,1 89,7 90,3 87,6 д/в 7 87 87 5 50 55 Примітки: дані для препарату Devouroil приведені за патентом RU № 2023686, д/в - дані відсутні Таким чином, наведені приклади свідчать про те, що використання препарату «Родойл» дозволяє ефективно проводити біологічне очищення грунту, прісної і морської води від нафти та наф Комп'ютерна верстка А Крулевський топродуктів Витрати препарату залежать від ступеню забруднення і складають в середньому 10% 30% від вмісту полютанту Підписано до Друку 05.09.2003 Тираж 39 прим. Міністерство ОСВІТИ і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комттет", вул. Артема, 77, м. Київ, 04050, Україна