Мікробний препарат для очищення води і грунтів від нафтових забруднень

Изобретение относится к области защиты окружающей среды и касается биологической очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, а точнее к способам очистки с применением микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти. Возрастающие с каждым годом объемы добычи, транспортировки, переработки и использования нефти и нефтепродуктов и, в связи с этим, усиленное загрязнение окружающей среды компонентами нефти делают проблему очистки от них все более актуальной. Механические, химические, физические способы имеют ряд существенных недостатков и не могут обеспечить достаточную степень очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений. Преимущества биологических методов являются в настоящее время общепризнанными как с экономической, так и с экологической точек зрения. Тот факт, что в районах интенсивного нефтяного загрязнения всегда обнаруживаются микроорганизмы, способные использовать нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии, трансформируя их до простых соединений углерода, натолкнуло исследователей на мысль использовать эти микроорганизмы для очистки окружающей среды. Первые шаги в этой области были направлены на стимуляцию деятельности микроорганизмов естественных биоценозов путем внесения в загрязненную среду дополнительных источников азота и фосфора [Патент США № 3959127, 25.05.76; 4087356, 02 05.78; 4230562, 28.10.80; Патент Великобритании №№ 1542154, 03.12.75; 2115399, 07 09.83] Однако даже при условии модификации компонентов питательных добавок с целью придания им дополнительных свойств (плавучесть, диспергирующая способность, замедленное выделение азота) для интенсификации процессов деструкции углеводородов нефти не обеспечивалась неудовлетворительная степень и сроки очистки. Намного эффективнее оказались способы, предусматривающие внесение на загрязненные участки воды и почвы бактериальных клеток углеводород-окисляющих микроорганизмов в виде чистых культур или смеси нескольких родов и видов микроорганизмов. Так получило широкое распространение использование микроорганизмов-мутантов, полученных методами генной инженерии, которые обладают высокой нефтеокисляющей активностью. Они способны в короткие сроки разрушать нефть при малых масштабах загрязнений, но быстро гибнут, когда· количество загрязнений требует более длительных сроков деструкции. Например мутантэ рада Pseudomonas период существования от начала размножения до гибели составляет лишь 7,5 суток [Патент США № 4521515, 04,06.85]. Более стабильными свойствами обладают чистые культуры, выделенные из природной среды. Известные способы с применением штамма Pseudomonas putida-36 [Авт.св. СССР № 1428809, 07.10.88; Межд. заявка № 87/07316, 03.12.87; Авт.св. СССР № 1759793, 1992, БИ № 33]. Большее количество фактов, имеющихся а литературе, свидетельствуют о том, что сложные субстраты типа нефти неблагоприятны для роста монокультур [Гуревич Ю.Л. Смешанные проточные культуры микроорганизмов, Новосибирск, 1981, с.168-181], поэтому вполне закономерны попытки исследователей использовать для очистки от нефтезагрязненмй искусственно созданные сообщества микроорганизмов (консорциумы) - представителей разных родов и видов [Патент Великобритании № 1353682,22.05.75; 1484512, 01.09,72; Авт.св. СССР № 823314, 23.04.81; 925875,07.05.82; 1172887]. Наиболее близким к заявляемому (с точки зрения видового состава) является способ очистки от нефтепродуктов с использованием смеси штаммов микроорганизмов Rhodococcus crythropolis, Rh. luteus и Micrococcus flatus при соотношении культур (0,5-1,5):(0,5-1,5):(0.5-1,5) (a.c. CCCP № 1493666, on. 15.07.89), выбранный в качестве прототипа. В способе используются специально селекционированные штаммы, обладающие высокой нефтеокисляющей активностью и хорошей физиологической совместимостью. В прототипе для получения препарата следует провести 4 операции по культивированию, а затем составить ассоциацию в требуемом соотношении. Очистка подспанцевых вод от нефтезагрязнений возможна только в условиях очистных станций. В случае удаленности загрязненных объектов возникает необходимость транспортировки загрязненных вод к месту расположения станции, что влечет за собой затраты либо на сооружение временных коммуникаций, либо на транспортные средства. Цель настоящей разработки состояла в усовершенствовании способов биологической утилизации нефтяных загрязнений с целью их удешевления, практической применимости и экологической чистоты. Был предложен новый способ очистки с использованием пяти новых штаммов микроорганизмовдеструкторов нефтепродуктов - в сочетании с диаммофосом или хлористым натрием. В состав общества микроорганизмов входят продуценты, выделенные из пластовых вод Бондюжского нефтяного месторождения: Pseudomonas stutreri-367-1; Rhodococcus sp. 367-2, Rodococcus maris 367-5, Rhodococcus crythropotis 367-6, Yrrawia 367-3 в соотношении 1:1:1:1:0,25. Один грамм биопрепарата содержит от 1010 до 1013 клеток. Выбранное соотношение микроорганизмов в смеси является оптимальным, использование препарата с числом живых клеток 1010-10 13 в 1 г сухой биомассы наиболее эффективно. Присутствие в биопрепарате диаммофоса в количестве 0,007-0,05 массовых процентов или хлористого натрия в количестве 0,1-0,2 массовых процента обеспечивает поддержание активной жизнедеятельности микроорганизмов. Указанные штаммы депонированы в коллекции института микробиологии АН России. Предлагаемый способ очистки с использованием указанной смеси микроорганизмов позволяет добиться деструкции нефтепродуктов на 50% за 3-4 суток, при этом ассоциативная культура продемонстрировала более высокую нефгеокиеляющую активность, чем каждая монокультура. Доказательством служат результаты испытаний, которые проводились на сырой нефти Довбужинского месторождения с использованием 0,5% биомассы с титром 1 · 1011 в условиях периодического культивирования при концентрации сырой нефти 340 г/л и продолжительности опыта 3-4 суток, Результаты испытаний представлены в табл.1. Способ очистки воды и почвы от нефтезагрязнений с применением биокомпозиции не оказывает отрицательного воздействия на окружающую среду с эколого-гигиенической точки зрения. При испытаниях препаратов в модельных и натурных условиях было показано, что в течение 400 дней после внесения биопрепарата в загрязненной нефтью среде восстанавливается баланс фосфора и азота, нарушенного в результате загрязнения. Результаты испытаний представлены в табл 2. Микробиологический контроль бактериальной флоры очищаемых объектов не выявил каких-либо существенных изменений. Результаты испытаний приведены в табл.3. Таким образом, настоящее изобретение позволяет решить поставленную задачу эффективного очищения воды и почвы от нефтезагрязнений, не оказывая вредного влияния на окружающую среду, за счет применения биопрепарата, изготовленного технологичным способом из доступного сырья и материалов. Способ очистки с применением препарата не требует сложного оборудования, является экономичным. Свойства штаммов, входящих в состав ассоциации микроорганизмов с нефтеокисляющей способностью, представлены в табл.4. Получение биомассы, составляющей основу биопрепарата предусматривает использование доступного сырья и стандартного оборудования. Чистые культуры микроорганизмов выращивают на жидкой минеральной среде состава, об.%: NH4Cl - 0,04, КН2РО4 - 0,05, MgSO4 · 7Н2О - 0,02; MnSO4 - 0,002; CaCl2 - 0,001; ацетат аммония - 1,0; дрожжевой авголизат-0,1 с добавлением 2% очищенных жидких парафинов, вырабатываемых на установках типа "Парекс" (фр. н.к. 200°С - к.к 320°С) при 30°С в течение 3-7 суток. Титр культуры в посевном материале составляет не менее 1 · 1011-12 кл/мл. Посевной материал используют для засева инокулятора при соотношении ассоциативных культур 1:1:1:1:0,25. Инокуляцию проводят в 2 стадии и используют для засева производственного ферментера весь объем культуральной жидкости, полученной на 2-ой стадии инокуляции. Жидкую биомассу смеси микроорганизмов получают путем культивирования продуцента при температуре 30-32°С, рН - 6,5-7,0 на минеральной среде с 0,15% кукурузного экстракта и 2% жидких парафинов. Концентрация сухих веществ на конец ферментации составляет 6,0-7,0%. Сухую биомассу смеси микроорганизмов получают из культуральной жидкости после стандартизации хлористым натрием или двухзамещенным фосфатом аммония до концентрирования сухих веществ 8-10% путем распылительной сушки до влажности не выше 10%. Число жизнеспособных клеток в 1 г сухого препарата - не менее 1 · 1010-1,5 · 103. Пример 1, Получение биомассы неф-теокисляющих микроорганизмов осуществляли путем культивирования исходных штаммов в соотношении 1:1:1:1:0,25 на жидкой минеральной среде с кукурузным экстрактом и жидкими парафинами. Накопление биомассы проходило в ферментере при глубинном культивировании в условиях перемешивания и аэрации. Температура роста микроорганизмов 30-32°С. Полученную биомассу концентрировали и высушивали методом суховоздушного распыления при температуре на выходе 65°С, предварительно проводя стандартизацию с помощью хлористого натрия до концентрации сухих веществ 8-10%. Количество живых клеток, определяемое титрационным методом, составило 1,3 · 1011 на 1 г сухого препарата. Способ очистки почвы от нефтепродуктов в модельном опыте заключался в следующем. Полученный препарат с соотношением культур 0,5:1:1:1:0,25 в виде водной суспензии, содержащей 150 мг биомассы, 60 мг диаммофоса в 300 мл воды, однократно наносили на поверхность почвы (вес 3 кг, площадь поверхности 0,13 м2), В почву предварительно добавили нефть в количестве 60 мл и перемешали. В ходе обработки по мере высыхания почву увлажняли дехлорированной водопроводной водой. Отбор проб почв для анализа отбирали с интервалом 30 дней, за это время суммарное содержание всех фракций нефти снизилось на 45-47%, а через 90 дней на 54-55%. Процесс очистки почвы посредством применяемого препарата сопровождался отсутствием нарушения самоочищения как в отношении почвенных микроорганизмов, так и минеральных компонентов. Пример 2. Полученный по технологии примере 1, биопрепарат использовали для обработки поверхности модельного водоема с целью очистки от нефти, Поверхность двадцатилитрового водоема (площадь поверхности 411500 мм2 или 41 ,В см2), покрытую нефтяной пленкой толщиной 1 мм (обьем нефти 40 мл), обрабатывали пятнадцатью миллилитрами суспензии, включающей 100 мг биопрепарата и 25 мг диаммофоса. Нанесение суспензии осуществляли распылительным способом. На третий день в водоеме начал выпадать небольшой осадок, через 7 дней в пленке появились небольшие просветы, через 10 дней они увеличились, через 14 дней составили примерно 80% поверхности, через 25 дней -95%. Таким образом установлено в условиях обработки биопрепаратом воды снижение пленочной нефти с нарастанием водорастворимых фракций. Пример 3, Полученный по технологии примера 1 препарат с титром 2,5 · 1011 кл/г использовали в модельном опыте дли обработки поверхности ошвы, загрязненной нефтью. Соотношение штаммов, составляющих основу ассоциацию, находилось на уровне 0,25:0,7:1,2:0,7:0,25. Рабочий раствор готовили из препарата, включающего . биомассу нефтеокисляющих микроорганизмов и наполнитель в виде хлористого натрия, На поверхность почвы, предварительно смоченную водой, площадью 0,011 м2 наносили 25 мл нефти, перемешивали, а затем распылительно обрабатывали 10мл раствора препарата. Раствор содержал 1,0*108 кл/мл и 0,8% NaCI. Процесс деструкции длился два месяца при температуре 20-28°С и периодическом смачивании почвы водой. Контроль процесса биодеградации осуществляли через 25-30 дней по изменению концентрации нефтепродуктов в почве. Установлено, что в ходе очистки почвы препаратом нефтеокисляющих микроорганизмов обеспечивается деградация нефти. За 25-30 Дней содержание веществ, растворимых в гексане, снижается на 31428%. Через 60-65 дней снижение количества нефти в обработанной почве составляет 73-62%. Это является свидетельством эффективности действия препарата в присутствии NaCI на поверхности загрязненной нефтью почвы. Пример 7. Для очистки участка почвы площадью, 0,8 га с загрязнением нефтью 0,17 кг/м2 (общее количество нефти составило 1360 кг) использовали 7,0 м3 водной суспензии нефтеокисляющих микроорганизмов. Суспензию из высушенной биомассы и минеральных солей готовили так, что в 1 л ее содержалось 0,5 г биомассы с титром 1,2 · 1010 кл/г (соотношение ассоциативных культур выдерживалось а рамках 1:1:1:1:0,25) и 0,71 г диаммофоса. Загрязненную поверхность обрабатывали струйным нанесением приготовленного рабочего препарата. Отбор проб почв для анализа до и после обработки осуществляли с интервалом в 30 дней. По истечении этого срока деструкция нефтезагрязнений на обработанном участке составила 70-76%, в результате чего ранее пустой участок заселился характерной для данного региона растительностью. Пример 5. При аварийных выбросах нефти, разлива мазута концентрация загрязнений в почве и воде на отдельных участках иногда достигает десятков килограммов на 1 м поверхности. Моделирование жестких условий, а именно применение ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов для деструкции чистого мазута показало, что в аэрируемых условиях при температуре 30°С 10%-ная суспензия препарата (титр сухой биомассы 1,25 · 1011 кл/г в количестве 150 мл в присутствии 5% диаммонийфосфата в течение 7-10 суток переводит 200 г мазута в легкотекучую жидкость, хорошо смачивающую стенки стеклянной посуды и образует толстый, рыхлый придонный слой черно-коричневого цвета» представляющий собой биомассу препарата и продукты разложения Мазута. В стационарных условиях при температуре 14-18°С аналогичный эффект достигается за 2,5 месяца. Это является очередным доказательством огромного потенциала применяемого препарата в отношении его использования в чрезвычайных условиях.