Протипаразитарний препарат з імуностимулюючими властивостями

Протипаразитарний препарат з імуностимулюючими властивостями, що містить івермектин, 3 втичну дозу, що позитивно вплине на продукцію імунокомпетентних клітин, підсилить фагоцитарну активність і знизить приживлюваність паразитів. Допоміжні речовини (розчинник - етиловий спирт, комплексоутворювач - поліетиленгліколь, пролонгатор - полівінілпіролідон) будуть сприяти пролонгуванню дії препарату, що в кінцевому результаті призведе до підвищення ефективності та скорочення терміну лікування., що відповідає критерію "новизна". Приклад 1 Вивчення хімічної сумісності інгредієнтів препарату проводили методом плазмоводесорбційної часопролітної мас-спектрометрії. Після змішування компонентів всіх комбінацій, встановлена їх добра розчинність, що дозволила досягти однорідності кожного варіанту суміші. На мас-спектрі модельної суміші „аміксин+івермектин+допоміжні речовини", як в позитивних так і в негативних іонах, спостерігали декілька піків, які належали „Аміксину", а також характерний пік який належав івермектину. Після змішування всіх компонентів, зазначених в прописі комплексного препарату, отримали суміш яка була опромінена потоками негативних іонів. У результаті цього на здобутій спектрограмі чітко визначався івермектин у незміненому стані, а також один з характерних фрагментів „Аміксину". Таким чином, за результатами масспектрометрії оптимальною комбінацією комплексного препарату була визнана „івермектин +аміксин+ допоміжні речовини", яка була взята для подальших досліджень. Стабільність дослідних зразків препарату вивчали спостереженням за зміною в кольорі, консистенції, однорідність та на предмет розшаровування протягом 6 місяців. По закінченню строку спостереження проводили повторне виявлення інгредієнтів препарату методом мас-спектрометрії. Встановлено, що розроблена форма зберігає стабільні властивості впродовж 6 місяців (строк спостереження), що підтверджено наявністю характерних піків, що відповідали складовим препарату. За результатами проведених досліджень були відпрацьовані технологічні прийоми виготовлення препарату (розчинення івермектинового комплексу, підібрані допоміжні речовини та вивчена їх сумісність), які дозволили отримати стабільну форму ін'єкційного препарату. Приклад 2 Вивчення місцевої подразнюючої реакції на введення дослідних зразків препарату проводили вводячи експериментальний препарат з різним вмістом (0,5; 1,0; 1,5; 2%) івермектину підшкірно лабораторним щурам. При підшкірному введенні дослідних зразків препарату різної концентрації івермектину лабораторним щурам було встановлено, що ін'єкції не викликали больової реакції, ознак місцевого подразнення та запалення у тварин всіх дослідних груп. Під час повторного огляду місць введення через 7 діб, змін які б свідчили про наявність місцевого подразнення або запальної реакції не було 40190 4 зафіксовано. Всі тварини мали задовільний загальний стан. Приклад 3 Вивчення інсектицидної та акарицидної дії розробленого препарату in vitro проводили шляхом імпрегнації фільтрувального паперу робочими розчинами дослідних зразків препарату з різним вмістом діючої речовини в чашках Петрі, використовуючи блохів та кліщів роду Otodectes. Для цього на дно чашок поміщали фільтрувальний папір і піпеткою наносили по 15 крапель розчину відповідних концентрацій препарату, туди ж підсаджували по 10 дорослих бліх і витримували їх при температурі 37°С. Було сформовано сім груп. У перших чотирьох групах використовували дослідні зразки із івермектину з різним вмістом 0,5; 1,0; 1,5; 2%. Контролем служили комахи оброблені розчинником. Ефективність дози визначали за загибеллю ектопаразитів, яку викликала кожна з цих концентрацій. Повторність досліду - триразова. Облік результатів проводили за загибеллю комах через 24 та 48 годин, згідно методик ВООЗ (1972, 1974). Вивчення акарицидної дії розробленого препарату проводили за вищенаведеним методом, але в дрібних чашках Петрі з темним полем. Під час огляду чашок Петрі з блохами через 24 години було встановлено, що найменша кількість об'єктів (20%) загинула в чашках з 0,5%-вою концентрацією івермектину в препараті, а найбільша - в групах, де застосовували 2%-вий розчин івермектину з аміксином. Через 48 годин була зареєстрована 100% загибель комах в усіх групах крім тієї де бліх тримали при концентрації діючої речовини 0,5%. У контрольній групі, яка оброблялася розчинником, всі блохи залишилися живими (табл. 1). При вивченні акарицидної дії дослідного препарату аналогічними методами через 48 годин реєстрували 100% загибель кліщів. Як видно з таблиці, ефективність дії препарату на кліщів з 0,5%-вою концентрацією івермектину була 100%, в той час коли бліх загинуло 70%. Враховуючи отримані результати було вирішено в подальшій роботі використовувати композицію з 1% вмістом діючої речовини, як оптимальну, що викликала виражений інсектоакарицидний ефект, станом на другу добу. Приклад 4 Терапевтичну дозу та ефективність дії препарату визначали в досліді на собаках спонтанно заражених збудниками отодектозу, сифонаптерозу та токсокарозу. Перед початком досліду вивчали видовий склад та інтенсивність інвазій за допомогою копроовоскопічних та арахноентомологічних досліджень. З дослідних собак за принципом аналогів було сформовано шість груп тварин по три голови в кожній, яким в дослідних групах застосовували шляхом підшкірної ін'єкції зразки препарату в дозах 0,01см3/кг маси собаки (перша група), 0,02см3/кг (друга група), 0,03см3/кг (третя група), 0,04см3/кг (четверта група), 0,05см3/кг (п'ята група), а контрольній групі вводили фізіологічний розчин. Екстенс- та інтенсефективність визначали за загальноприйнятими паразитологічними методиками на 3, 7 та 14 добу після введення препарату. 5 В результаті мікроскопічного аналізу вушних зіскребків та гельмінтоовоскопічних аналізів проб фекалій, проведених до початку експерименту, була встановлена 100% екстенсивність інвазії гельмінтами роду Toxocara та кліщами роду Otodectes цуценят всіх дослідних та контрольної групи. Групи формували з однаковим рівнем інтенсивності інвазії. Ін'єкція препарату не викликала болісної реакції. На другу добу після введення препарату спостерігали масовий вихід мертвих гельмінтів з фекаліями цуценят всіх дослідних груп. Копроовоскопічними дослідженнями проведеними вже на 3-тю добу виявили високу екстенсефективність антгельмінтної дії препарату в третій (0,03мл/кг маси тіла), четвертій (0,04мл/кг) та п'ятій (0,05мл/кг) групах, яка становила 66% по кожній групі. При цьому виділення яєць Toxocara canis були на 97,8-97,9% менше в порівнянні з початком досліду, тоді як в контрольній групі кількість яєць залишалася на рівні початку досліду (табл. 2). Через 7 діб після дегельмінтизації цуценят препаратом у дозі 0,01мл/кг та 0,02мл/кг маси тіла кількість видалених яєць зменшувалася на 4 та 77%, відповідно, яка зростала на 14 добу. При введенні препарату в дозах від 0,03 до 0,05мл/кг маси тіла на 7 та 14 добу яєць в зразках фекалій не виявляли, що свідчило про 100%-ву ефективність дегельмінтизації. При визначенні оптимальної дози препарату встановлено, що застосування препарату в дозах від 0,03-0,05мл/кг маси забезпечувало 100% акарицидну дію вже на 5 добу після першого введення (табл. 3). В зіскребках з вушних раковин цуценят цих груп не було знайдено жодного кліща імагінальної або личиночної стадії розвитку. Але при мікроскопії зіскребків на всіх проміжках часу до семи діб знаходили яйця кліщів, це було пов'язано з тим, що препарат не діяв проти яєць кліщів, що потребувало повторного введення препарату через 7 діб, що на кінець досліду дозволило отримати 100%-ву інтенсефективність в цих групах. При застосуванні препарату в дозах 0,01, 0,02мл/кг інтенсефективність складала 61-70%. Паразитологічними дослідженнями було встановлено, що дворазове підшкірне введення з інтервалом 7 діб розробленого препарату в дозі 0,03см/кг маси тіла, що відповідало 0,3мг діючої речовини на 1кг маси тіла викликало 100%-ву загибель ектопаразитів та гельмінтів із класу нематод. Приклад 5 Вивчення ефективності біологічної дії розробленого комплексного антипаразитарного препарату на імунну систему та показники загальної резистентності організму проводили на цуценятах, Тварин за принципом аналогів було розділено на три групи по три голови в кожній. У першій дослідній групі було застосовано шляхом підшкірної ін'єкції 1% розчин діючої речовин (івермектину), у другій - розроблений комплексний препарат. Препарати вводили у дозі 0,03см3/кг. У контрольній групі підшкірно ін'єктували фізіологічний розчин у тій же дозі. 40190 6 Контроль ефективності дії препарату на організм тварин проводили шляхом спостереження за клінічним станом тварин та клініко-біохімічними показниками крові. Проби крові відбирали до введення препаратів та на 7,14 добу після ін'єкцій препаратів. Рівень гемоглобіну та кількість еритроцитів визначали фотоколориметричним методом на ФЕК-56, кількість лейкоцитів та лейкоцитарну формулу вираховували мікроскопічнім методом за допомогою світлового мікроскопу, активність лізоциму з'ясовували турбідіметричним методом з використанням сухого ацетонового порошку Micrococcus lysodecticus, перекисну резистентність еритроцитів - за Ягер (1968), АлАТ, АсАТ, загальний білірубін, лужну фосфатазу - з використанням наборів „Реагент". Вивчення впливу комплексного препарату на імунну систему тварин проводили визначенням субпопуляцій Т- і Влімфоцитів в реакції розеткоутворення за допомогою еритроцитарних діагностикумів для фенотипування Т- і В-лімфоцитів Анти-CD3, Анти-CD22 та циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) - за Гріневичем та Алфьоровим в крові тварин. Інтерфероногенні властивості препарату вивчали методом титрування плазми крові собак на культурі клітин з її зараженням тест-вірусом. Для цього культуру клітин Vero вирощували у 96лункових плоскодонних планшетах на живильному середовищі 199 з додаванням 5-10% сироватки ВРХ. Після утворення моношару і видалення середовища культивування, в лунки вносили зразки плазми розчинені середовищем Ігла. Після інкубації проби видаляли, а в лунки вносили вірус чуми м'ясоїдних в дозі 100 ТЦД50, який є чутливим до інтерферону. За титр інтерферону приймали останнє розведення зразка, яке забезпечувало 50% захист клітин Vero у порівнянні з 100% деструкцією клітин в контролі через 24-48 годин інкубації. Застосування комплексного антипаразитарного препарату викликало певні зміни клінічних та біохімічних показників проб крові собак. Так проби крові взяті до та на 7, 14 добу після введення дослідного препарату свідчили про незначну стимуляцію еритропоезу. Так, як видно з таблиці 1.1, кількість еритроцитів на 7-му добу збільшується у цуценят першої (на 55%) та другої (на 56%) груп. На 14-ту добу у тварин, яким був введений комплексний препарат цей показник збільшувався вже на 59% від початкового рівня, в той час, як тваринам, яким вводили 1% розчин івермектину кількість еритроцитів збільшувалася тільки на 30%. У цуценят контрольної групи цей показник був стабільним. Через 7 діб після введення комплексного препарату у собак спостерігався яскраво виражений лімфоцитоз. Подібних змін не спостерігали в інших групах, де відносний вміст лімфоцитів знаходився на рівні початкових показників впродовж усього досліду. Також в мазках крові дослідної групи тварин спостерігали одиничні базофіли. Появу незначної їх кількості в мазках крові можна розцінювати, в даному випадку, як позитивну зміну тому що крім участі в гемостазі та жировому метаболізмі базофіли приймають участь у відторгненні паразитів, 7 40190 зокрема Dirofilaria immitis. Біохімічні показники крові цуценят, яким застосовували новий комплексний препарат свідчать про те, що його застосування викликало позитивні зміни в їхніх організмах в порівнянні з групою де застосовували 1% розчин івермектину та з контрольною групою (табл. 4). Так стабільне зростання активності лізоциму (на 6% на 14-ту добу) в сироватці тварин цієї групи сприяло збільшенню захисних властивостей організму до бактеріальних захворювань. У тварин другої групи цей показник стабільно зменшувався, та в кінці досліду становив 44,6мкг/мл, що на 5% нижче за початковий рівень. Мав тенденцію до збільшення рівень циркулюючих імунних комплексів у крові цуценят першої групи, а як відомо ЦІК приймають участь в регуляції хемотаксичної спроможності та метаболічній активації нейтрофілів, що характеризує рівень імунної реактивності. Так на 14-ту добу їх кількість була максимальною. На відміну від першої групи у собак, які отримували івермектин вміст ЦІК на 14-ту добу зменшився на 20% від показника до введення препарату. У тварин контрольної групи цей показник майже не відрізнявся від попередніх впродовж усього досліду. Вивчаючи динаміку змін кількості субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів можна відмітити достовірне зростання відсоткового вмісту Т-лімфоцитів з 38,17% до 51,50% на 7-му добу після введення комплексного препарату, що можна розцінювати як свідчення імуностимулюючої дії нового препарату. В той же час введення 1% розчину івермектину викликало зменшення відсотку Т-лімфоцитів з 8 31,17% до 23,67% в цей самий термін. На 14-ту добу після введення препаратів цей показник набув початкових значень в крові собак обох дослідних груп. Достовірних змін вмісту Т-лімфоцитів у контрольній групі не відмічали. Коливання відсоткового вмісту В-лімфоцитів відбувалося в усіх дослідних групах одночасно, причому амплітуда цих коливань була майже однакова не залежно від введеного препарату. Це можна пояснити тим, що для зміни кількості Влімфоцитів необхідна участь патогенного фактору. У нашому досліді не передбачалось застосування інфекційних агентів, а незначний підйом концентрації В-лімфоцитів на 7-му добу після введення препаратів можна віднести на рахунок реакції на маніпуляцію. Однак одночасний підйом концентрації Т- і В-лімфоцитів, який спостерігається у тварин першої групи, є бажаним при формуванні імунної відповіді на будь яке інфекційне втручання. Відсутність інфекційного агента не дозволила виявити достовірних змін кількості інтерферону в крові дослідних тварин. Але знаючи, що основними продуцентами інтерферону в організмі є клітини ретикулоендотеліальної системи, макрофаги та Т-лімфоцити, можна припустити, що збільшення кількості однієї з груп вищезгаданих клітин у разі потреби (вірусна інфекція) призведе до збільшення синтезу інтерферону. Таким чином, запропонований протипаразитарний препарат активний проти кліщів, бліх, вош та гельмінтів із класу нематод, нетоксичний та не викликає імуносупресію і тим самим попереджує повторне зараження тварин. Таблиця 1 Протипаразитарний препарат з імуностимулюючими властивостями № п/п Концентрація івермектину, % 1 2 3 4 5 0,5%(n =10) 1,0% (n=10) 1,5% (n=10) 2,0% ( n =10) Контроль (n=10) Блохи 24 години 48 годин 20% 70% 40% 100% 60% 100% 60% 100% 0 0 Кліщі 24 години 20% 40% 40% 60% 0 48 годин 100% 100% 100% 100% 0 Таблиця 2 Протипаразитарний препарат з імуностимулюючими властивостями Термін спостереження Група 1 (n=3) 0,01мл/кг До введення препара15,67±3,89 ту Через 3 доби 13,67±3,19 Через 5 діб 13,67±3,56 Через 7 діб 15,0±3,94 Через 14 діб 15,24±3,84 Кількість яєць гельмінтів в 1 г фекалій, шт Група 2 Група 3 Група 4 Група 5 (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) 0,02мл/кг 0,03мл/кг 0,04мл/кг 0,05мл/кг Група 6 (n=3) контроль 14,33±3,49 15,0±3,54 15,33±3,89 16,0±3,54 15,0±4,24 9,67±0,82 3,0 ±1,87 3,33±2,04 7,21 ±3,02 0,33±0,41 0,67±0,41 0,33±0,41 0 0,33±0,41 0,33±0,41 0 0 0,33±0,41 0,67±0,82 0 0 19,67±6,10 16,1 ±5,79 15,33±5,02 16,24±6,12 9 40190 10 Таблиця 3 Протипаразитарний препарат з імуностимулюючими властивостями Група 1 (n=3) 0,01мл/кг Кількість кліщів в одному зіскрібку, шт Група 2 Група 3 Група 4 Група 5 (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) 0,02мл/кг 0,03мл/кг 0,04мл/кг 0,05мл/кг Група 6 (n=3) контроль До введення препарату 8,67±2,68 9,0±3,94 8,0 ± 3,08 9,0±3,08 Через 3 доби Через 5 діб Через 7 діб 7,0±2,12 3,63±1,24 4,0±1,41 1,67±1,47 0 1,0±0,71 9,67±3,27 13,0±1,87 15,3±1,47 Через 7 діб Інтенсефективність 3,33±1,47 61,6% 0 100% 16,0±1,83 Термін спостереження 9,0±4,42 8,0±2,12 Перше ведення препарату 5,67±2,86 3,0±1,87 1,33±1,08 3,62±1,32 0 0 3,0±1,22 1,0 ±0,00 0,67±0,82 Друге введення препарату 2,67± 1,63 0 0 70,3% 100% 100% Таблиця 4 Протипаразитарний препарат з імуностимулюючими властивостями Показники Гемоглобін. г/л Еритроцити млн/мкл Лейкоцити, тис/мкл Паличкоядерні. % Сегментоядерні, % Еозинофіли % Базофіли. % Моноцити, % Лімфоцити, % Група 1 Комплексний препарат n=3 Перший Через 7 Через 14 діб відбір діб 164,43± 0,23 222,50± 13,94 Група 2 Івермектин n=3 Перший Через 7 Через 14 відбір діб діб 168,77±13,43 163,27±1,51 Група 3 Фізіологічний розчин n=3 Перший Через 14 Через 7 діб відбір діб 221.33± 162,93±4,93 165,37±2,70 164,75±0,41 167,57±2,17 8,98 3,46±0,23 5,36±0,89 5,50±1,15 3.38±0,05 5,29± 1,05 4,42±1,28 3,48±0,07 3,45±0,02 3,46±0,01 9,07±1,77 10,50±0,49 8.87±0,33 9,27±0,47 6,70± 1,25 5,07±1,27 8,70±0,56 8,90±0,12 8,77±0,1 1.0±0,0 2,00±0,71 2,00±0.71 1,0±0,0 1,67± 0,41 2,67±0,41 1,0±0,0 1,33±0,41 1,33±0,41 54,67± 4,14 41,67±2,04 50.67±4,97 55,00±7,07 52,00± 5,61 52,00±2,83 54,67±3,49 53,67±0,41 55,00±3,24 1,33±0,41 2,00±0,71 4,33±1,08 1,33±0,41 2,33± 0,41 4,0 0±0,71 1,67±0,82 2,00±0,71 2,00±1,22 0 0 0 0 0 0 0 2,33±0,82 2,0±0.0 2,33±0,41 2,00±0,71 2,33±0,41 2,00±0,71 40,67±7.43 40.67±1,08 39,00±3,24 40,33±3,63 40,67±0,41 39,67±2,27 0 0.33±0,41 1,67±0,82 2,67±1,08 41,33± 3,63 51,33±2,48 3,00± 0,71 41,00± 5,10 11 40190 12 Таблиця 5 Протипаразитарний препарат з імуностимулюючими властивостями Показники Група 1 Комплексний препарат n=3 Перший Через 7 Через 14 відбір діб діб АлАТ, 0,22±0,01 0,47±0.09 ммоль/л АсАТ, 0,22±0,01 0,41±0,02 ммоль/л Лужна фо3195,6± 3376,67± сфатаза, 337,56 288,62 нмоль/л Лізоцим, 49,00±6.12 49,67±5,02 мкг/мл 0.117± 0,118± ЦІК, мг/мл 0,022 0,011 ПРЕ, % 42,97±2,02 43,70±1.66 Група 2 Івермектин n=3 Перший Через 7 Через14 відбір діб діб Група 3 Фізіологічний розчин n=3 Перший Через Через 14 відбір 7діб діб 0,60±0,14 0,37±0,04 0,46±0,10 0,61±0,14 0,35±0,02 0,36±0,03 0,36±0,03 0.64±0,09 0,22±0,01 0,41±0,04 0,65±0,10 0,26±0,03 0,27±0,04 0,24±0,05 3160,67± 298,68 3218,33± 120,63 3358,67± 480,26 3705,67± 277,76 3312,33± 230,87 3300,00± 112,19 33()3,67± 79,75 52.00±5,61 46,67±1,78 45,67±3.56 44,67±3,34 45,67±4,71 44,67±2,27 45,00±2,55 0.122± 0,130± 0,113± 0,103± 0,107± 0,113± 0,110± 0.015 0,071 0,011 0,011 0,004 0,004 0,007 43,50±1.56 42,17±0,69 42,80±0,60 42,73±0,60 42,10±2,16 42,27±1,03 42,03±1,56 Таблиця 6 Протипаразитарний препарат з імуностимулюючими властивостями Показники Група 1 Комплексний препарат Перший Через 7 Через 14 відбір діб діб Група 2 Івермектин n=3 Перший Через 7 Через 14 відбір діб діб Група 3 Фізіологічний розчин n=3 Перший Через 7 Через 14 відбір діб діб Тлімфоцити, 38,17±5,38 51,50±2,33 36,00±1,89 31,17±1,32 23,67±1,83 38,17±1,25 21,33±1,15 20,17±1,03 22,33±2,36 % Влімфоцити, 22,17±1,72 27,17±1,72 21,83±1,69 21,00±0,87 25,50±0,76 23,38±1,46 21,50±1,29 28,67±1,52 21,70±1,68 % Інтерферон 0,43±0,2 лог2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601