Спосіб прогнозування негативного впливу наночасток срібла на організм

Спосіб прогнозування негативного впливу 3 копічних дисперсій, що пов'язано з фізикохімічними особливостями поведінки речовин у високодисперсній формі, а також з постульованою здатністю наночасток безперешкодно проникати через біологічні бар'єри організму. Вважається, що наносрібло є довгостроковим джерелом іонів срібла, з чим пов'язують небезпеку його шкідливого впливу на довкілля [21]. Під час різних технологічних операцій синтезу наносрібла існує реальна можливість його надходження в організм інгаляційним шляхом. Наявні в літературі дані наукових досліджень переконливо свідчать про більш високу біологічну активність наночасток срібла порівняно з металевим сріблом та про необхідність дослідження його впливу на рівні експресії генів ключових регуляторних факторів, що контролюють процеси метаболізму. Проблема прогнозування токсичної дії наносрібла ускладнюється тим, що ще не встановлені високочутливі молекулярно-генетичні біомаркери, які б давали змогу попередити негативний вплив наночасток срібла при низьких його концентраціях. Прототипом до способу прогнозування нанотоксичності є спосіб оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалів на основі методу ДНКкомет. Суть способу полягає в проведенні електрофорезу в мікрогелях для детекції пошкоджень ДНК в окремих клітинах. Міграція ДНК до аноду тим більше, чим більше розривів містить ДНК [22]. Але даний спосіб не дає можливості проведення простого морфологічного аналізу пошкоджень ДНК та їх параметричної оцінки. Значна частина пошкоджень ДНК, що виявляються методом ДНК-комет, не може бути ідентифікована у результаті репарації ДНК. Спостерігається варіабельність результатів дослідження, що пов'язана з процесом підготовки препаратів і аналізом зображень. Задачею корисної моделі є вдосконалення способу прогнозування негативного впливу наночасток, виявлення можливих молекулярних механізмів впливу наносрібла на живі організми для попередження негативних наслідків дії наносрібла на працівників та населення в цілому при різних технологіях виробництва та використанні наночасток срібла. Технічний результат, який одержують в результаті вирішення задачі, полягає у встановленні змін експресії циркадіальних генів Per1, Clock та BMall у життєво важливих органах щурів (печінці, легенях, нирках та серці), що може слугувати важливим чутливим показником дії на організм наночасток срібла. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, який включає введення наночасток срібла та їх дослідження в біологічних об'єктах згідно корисної моделі після введення наночасток срібла виділяють тотальні РНК із печінки, легень, серця, та нирок щурів з подальшим проведенням полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК (кДНК), виявляють зміни експресії циркадіальних генів Per1, Clock та BMall і за змінами рівнів експресії прогнозують негативний вплив наночасток срібла на організм та ймовірність патологічних 54569 4 станів. Спосіб здійснюється наступним чином: Тотальні РНК виділяють із печінки, легень, серця, нирок та сім'яників щурів з допомогою реагенту Трізол (Trizol; Invitrogen, USA) згідно протоколу виробника. Осаджують РНК рівним об'ємом 2пропанолу. Осади РНК промивають двічі 75% етанолом і розчиняють у воді, що не містить домішок рибонуклеаз. Експресію мРНК Per1, Clock та BMall досліджують методом полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК (кДНК), отриманих шляхом зворотної транскрипції матричних РНК, а також методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції (у реальному часі). Тотальну РНК із різних органів щурів використовують як матрицю для синтезу кДНК з допомогою оліго(dТ) праймера та SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, США) згідно протоколу виробника. Для ампліфікації кДНК Per1, Clock та BMall використовують HotStarTaq Master Mix Kit (QIAGEN, Німеччина), специфічні для цих генів щурів пари праймерів та "MasterCycler Personal" ("Eppendorf", Німеччина). Для ампліфікації кДНК Per1 використовують такі праймери: прямий -5’TCTCTTCTCAGAACTGGATG-3' та зворотний 5’GGAAGCCTCTCATTAGACTGC-3', нуклеотидні послідовності яких відповідають залишкам нуклеотидів 3699-3718 та 3983-3963, відповідно, в мРНК Per1 щура (GenBank номер NM_001034125). Для ампліфікації кДНК Clock використовують прямий (5’-TGCACAGTCAGATGCTAGTG-3') та зворотний (5’-TGATCCACAAGATCAGATGG-3') праймери. Нуклеотидні залишки цих праймерів відповідають залишкам нуклеотидів 264-283 та 792-772 в послідовності мРНК Clock щура (GenBank номер NM_021856). Для ампліфікації кДНК BMall застосовують прямий (5’-TGACCCTCATGGAAGGTTAG3') та зворотний (5’-AATCCATCTGCTGCCCTGAG3’) праймери, нуклеотидні залишки яких відповідають залишкам нуклеотидів 753-772 та 1042-1061 в послідовності мРНК BMall щура (GenBank номер NM_024362). Ці пари праймерів використовуються також для ампліфікації Per1, Clock та BMall при дослідженні їх експресії методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції. Для контролю кількості аналізуємої РНК досліджують експресію мРНК -актину. Експресія кожної смуги кДНК казеїнкінази-1 □ та Реr2 порівнювалася з експресією мРНК -актину. Продукти ампліфікації аналізують електрофорезом в 2% агарозному гелі, забарвлюючи кДНК бромистим етидієм. Кількісну полімеразну ланцюгову реакцію проводять на "Stratagene Mx 3000P cycler", використовуючи „SYBRGreen Mix", США. Аналіз результатів кількісної полімеразної ланцюгової реакції виконують за допомогою спеціальної комп'ютерної програми „Differential expression calculator", а статистичну обробку результатів в Excel програмі. Різницю між двома середніми величинами вважається достовірною при значенні р < 0,05. Приклад конкретного виконання запропонованого способу: У досліджені використовували наночастки срі 5 бла у матриці NaCl, одержані методом електронно-променевого випаровування у вакуумі в лабораторії №84 Міжнародного центру електроннопроменевих технологій Інституту електрозварювання ім. Є.О. Патона. Методом електронної мікроскопії встановили, що частки срібла мають переважно сферичну форму і розміри 28-30нм. Наночастки срібла вводили тваринам інтратрахеально у кількості 0,05мг/кг маси тіла одноразово і досліджували експресію циркадіальних генів Per1, Clock та BMall у печінці, легенях, сім'яниках, нирках та серці щурів через 1, 3 та 14 днів. На фіг. 1, 2, 3 і 4 показано вплив наночасток срібла на експресію мРНК Per1, Clock та BMall у різних органах щурів, які досліджували методом полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК, отриманих зворотною транскрипцією РНК. 0 контрольні тварини. 1, 3 та 14 - дні після введення щурам наночасток срібла. Для контролю кількості мРНК Per1, Clock та BMall у печінці, легенях та сім'яниках досліджували експресію мРНК -актину. Проводили аналіз впливу наночасток срібла на експресію мРНК Per1, Clock та BMall у різних органах щурів методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції (у реальному часі), яку досліджували через 1, 3 та 14 днів після введення тваринам наночасток срібла (фіг. 5, 6, 7). Експресію мРНК мРНК Per1, Clock та BMall нормалізували по експресії мРНК -актину і виражали у процентах від контролю (100%). Спостерігали виражену дію наночасток срібла на експресію циркадіальних генів у таких життєво важливих органах як печінка, легені, сім'яники, нирки та серце, але по-різному, тканиноспецифічно, що може бути одним із факторів порушення сигнальних каскадів у клітинах цих органів та розвитку патологічних станів. Отримані результати вказували на те, що наночастки срібла, впливаючи на центральні ланцюги системи регуляції обміну речовин, можуть порушувати метаболізм у клітинах організму, що це може відбуватися шляхом впливу наночасток срібла на експресію ряду циркадіальних генів, які контролюють протікання важливих метаболічних процесів в організмі. Таким чином, запропонований спосіб прогнозування негативного впливу наносрібла шляхом визначення змін у експресії циркадіальних генів Per1, Clock та BMall у життєво важливих органах щурів є достатньо чутливим, інформативним та зручним у виконанні. Спосіб був апробований у відділі молекулярної біології Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України та на кафедрі гігієни праці і професійних хвороб Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, що дозволяє рекомендувати його для широкого впровадження. Джерела інформації: 1. Gonze D., Goldbeter A. Orcadian rhythms and molecular noise. Chaos, 2006; 16(2): 026110 (1-11). 2. Tsinkalovsky О., Smaaland R., Rosenlund В., Sothern R.B., Hirt A., Steine S., Badiee A., Abrahamsen J.F., Eiken H.G., Laerum O.D. Circadian variations in clock gene expression of human bone marrow CD34+ cells. Journal of Biological Rhythms, 2007; 22(2): 140-150. 54569 6 3. Teboul M., Barrat-Petit M.A., Li X.M., Claustrat В., Formento J.L., Delaunay F., Levi F., Milano G. Atypical patterns of circadian clock gene expression in human peripheral blood mononuclear cells. Journal of Molecular Medicine, 2005; 83(9): 693-699. 4. Kovac J., Husse J., Oster H. A time to fast, a time to feast: the crosstalk between metabolism and the circadian clock. Molecules and Cells, 2009; 28(2): 75-80. 5. Turek F.W., Joshu C, Kohsaka A., Lin E., Ivanova G., McDearmon E., Laposky A., Losee-Olson S., Easton A., Jensen D.R., Eckel R.H., Takahashi J.S., Bass J. Obesity and metabolic syndrome in circadian Clock mutant mice. Science, 2005; 308(5724): 1043-1045. 6. Rudic R.D., McNamara P., Curtis A.M., Boston R.C., Panda S., Hogenesch J.B., Fitzgerald G.A. BMAL1 and CLOCK, two essential components of the circadian clock, are involved in glucose homeostasis. PLoS Biology, 2004; 2(11): E377. 7. Oishi K., Shirai H., Ishida N. CLOCK is involved in the circadian transactivation of peroxisome-proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) in mice. Biochemical Journal, 2005; 386(3): 575-581. 8. Lee H., Chen R., Lee Y., Yoo S., Lee С. Essential roles of CKIdelta and CKIepsilon in the mammalian circadian clock. Proceeding National Academy of Sciences U.S.A., 2009; 106(50): 2135921364. 9. Winter S.L., Bosnoyan-Collins L., Pinnaduwage D., Andrulis I.L. Expression of the circadian clock genes Per1 and Per2 in sporadic and familial breast tumors. Neoplasia, 2007; 9(10): 797800. 10. Zhu Y., Stevens R.G., Hoffman A.E., Fitzgerald L.M., Kwon E.M., Ostrander E.A., Davis S., Zheng Т., Stanford J.L. Testing the circadian gene hypothesis in prostate cancer: a population-based case-control study. Cancer Research, 2009; 69(24): 9315-9322. 11. You S., Wood P.A., Xiong Y., Kobayashi M., Du-Quiton J., Hrushesky W.J. Daily coordination of cancer growth and circadian clock gene expression. Breast Cancer Research and Treatment, 2005; 91(1): 47-60. 12. Taniguchi H., Fernandez A.F., Setien F., Ropero S., Ballestar E., Villanueva A., Yamamoto H., Imai K., Shinomura Y., Esteller M. Epigenetic inactivation of the circadian clock gene BMAL1 in hematologic malignancies. Cancer Research, 2009; 69(21): 8447-8454. 13. Chen S.T., Choo K.B., Hou M.F., Yeh K.T., Kuo S.J., Chang J.G. Deregulated expression of the PER1, PER2 and PER3 genes in breast cancers. Carcinogenesis, 2005; 26(7): 1241-1246. 14. Sato Т.К., Yamada R.G., Ukai H., Baggs J.E., Miraglia L.J., Kobayashi T.J., Welsh D.K., Kay S.A., Ueda H.R., Hogenesch J.B. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics, 2006; 38(3): 312-319. 15. Chen R., Schirmer A., Lee Y., Lee H., Kumar V., Yoo S. H., Takahashi J. S., Lee C. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. 7 Molecular Cell, 2009; 36(3): 417-430. 16. Sato Т.К., Yamada R.G., Ukai H., Baggs J.E., Miraglia L.J., Kobayashi T.J., Welsh D.K., Kay S.A., Ueda H.R., Hogenesch J.B. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics, 2006; 38(3): 312-319. 17. Motzkus D., Loumi S., Cadenas C., Vinson C., Forssmann W.G., Maronde E. Activation of human period-1 by PKA or CLOCK/BMAL1 is conferred by separate signal transduction pathways. Chronobiology International, 2007; 24(5): 783-792. 18. Pfeffer M., Muller С.М., Mordel J., Meissl H., Ansari N., Deller Т., Korf H.W., von Gall C. The mammalian molecular clockwork controls rhythmic expression of its own input pathway components. Journal of Neurosciences, 2009; 29(19): 6114-6123. 19. Sasaki M., Yoshitane H., Du N.H., Okano Т., 54569 8 Fukada Y. Preferential inhibition of BMAL2-CLOCK activity by PER2 reemphasizes its negative role and a positive role of BMAL2 in the circadian transcription. The Journal of Biological Chemistry, 2009; 284(37): 25149-25159. 20. Гусев А.И. Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии. - М: ФИЗМАТЛИТ, 2007. - 416 с. 21. Naomi Lubick. Nanosilver toxicity: ions, nanoparticlesor both? // Environ. Sci. Technol. - 2008, 42 (23), p 8617. 22. Патент на корисну модель МПК (2009) G01N33/00 G01N33/48 Спосіб оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалів / С.М. Дибкова, О.В. Годовський, М.Є. Романько, Т.Г. Грузіна, З.Р. Ульберг, В.О. Ушкалов, A.M. Головко // Заявл. 10.09.2009; Опубл. 25.03.2010, Бюл. № 6. - 4 с. 9 54569 10 11 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 54569 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601