Спосіб одержання меланінових пігментів

Реферат: Спосіб одержання меланінових пігментів, який передбачає культивування штамів мікроміцетів на поживному середовищі, проведення гідролізу отриманої біомаси та промивання продукту, при якому культивування здійснюють протягом 14 діб при температурі 23-25 °C та зовнішньому гамма-опроміненні, де дозове навантаження складає 10-14 мГр/доб. на зразок, після цього проводять двоступеневу фільтрацію, дезінтеграцію рідким азотом, центрифугування, проведення лужного гідролізу біомаси, осадження отриманого екстракту концентрованою кислотою, розчинення отриманого осаду у лузі, діаліз проти дистильованої води та висушування отриманого продукту. UA 73184 U (12) UA 73184 U UA 73184 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіології, а саме до способів, що забезпечують одержання продуктів мікробіологічного синтезу, які використовуються у фармацевтичній промисловості. Зокрема, корисна модель стосується способу, який дозволяє підвищити ефективність продукції мікроміцетами меланінових пігментів при використанні умов іонізуючого опромінення низької інтенсивності. В результаті застосовування способу мікроскопічні гриби продукують меланінові пігменти з високою антиоксидантною активністю. Спосіб може знайти застосування для отримання меланіну при вирощуванні мікроміцетів з метою подальшого використання цих пігментів у фармацевтичній промисловості як радіопротекторів та високоефективних сорбентів для виводу радіонуклідів з організму. Як відомо, природні меланіни мають ряд захисних функцій та є перспективними для використання як основних активних речовин лікарських препаратів [Jacobson E.S., Hove E., Herschell S.E. Antioxidant function of melanin in black fungi //Infection and Immunity.-1995.-65, N 12. - P. 4944-4945; Наконечна А.А., Дранник Г.М., Кушко Л.Я. та ін. Клініко-імунологічна ефективність препарату Мікотон в комплексному лікуванні хронічних гепатитів // Імунологія та алергологія. - 1999. - № 4. -С 41-45; Барабой В.А. Біологічна роль і перспективи застосування меланінів //Фармацевтичний журнал. - 2003. - № 3. - С 47-55; Schweitzer AD, Revskaya E, Chu P, Pazo V, Friedman M, Nosanchuk JD, Cahill S, Frases S, Casadevall A, Dadachova E. Melanincovered nanoparticles for protection of bone marrow during radiation therapy of cancer // Int. J. Radiat. Oncol Biol. Phys. - 2010. - 78, № 5. - P. 1494-1502]. Було показано, що пігмент меланін має високу генопротекторну активність при гострій дії іонізуючої радіації в широкому інтервалі доз, але особливо ефективним є при хронічному опроміненні малими дозами [Гавриленко Н.В., Кукулянская Т.А., Новиков Д.А., Курченко В.П. Генопротекторные свойства меланиновых пигментов различного происхождения // Сб. тр. науч. конф., посвящ. 75-летию биол. фак. БГУ. - Минск, 1997. - С. 234-238]. Було встановлено, що меланін ефективно знижує частоту індукованих іонізуючою радіацією мутацій як у соматичних, так і у зародкових клітинах. Унікальною є здатність меланіну зменшувати майже до контрольного рівня частоту генетичних пошкоджень, що передаються з покоління в покоління і накопичуються в популяціях у вигляді "генетичного тягаря" [Моссэ И.Б., Жаворонков Л.П., Молофей В.П. и др. Разработка на основе меланина средства профилактики генетических и онтогенетических последствий облучения //Вестник ВОГиС.-2005. - Т. 9, № 4. С. 527-533.Дружина М.О., Пухова Г.Г., Бурлака А.П., Жданова Н.М., Сидорик Є.П. Процеси перешеного окислення в системі крові та їх корекція меланіном у тварин в зоні впливу аварії на Чорнобильській АЕС // Укр. радіол, журн .- 1994. - № 4. - С 271-273]. Біологічні функції меланінів обумовлені здатністю меланінових пігментів стабілізувати рівень окисно-відновного потенціалу в клітині за рахунок трьох можливих окисних станів хінонових залишків у молекулі меланіну: гідрохінон (повністю відновлений стан), семихінон (парамагнітний стабільний вільний радикал, окиснений стан) та хінон (продукт двоелектронного окиснення). Механізм радіозахисної дії меланінів полягає у тому, що речовини, які містять стабільні вільні радикали, здатні адсорбувати потенційно небезпечні неспарені електрони [Plonka P.M., Grabacka M. Melanin synthesis in microorganisms-biotechnological and medical aspects // Acta Biochim Pol.-2006.-53, № 3. - P. 429 ~ 443. Jacobson E.S. Pathogenic Roles for Fungal Melanins // Clin. Microbiol Rev.-2000.-13, № 4.- P. 708-717.J. При дослідженні можливості регуляторної дії меланіну гриба Cladosporium cladosporioides на процес перекисного окиснення в системі крові, викликаний опроміненням тварин малими дозами радіації у зоні впливу аварії на ЧАЕС, були отримані дані про регулюючий вплив меланіну на процеси перекисного окиснення, а також синхронізацію функціонування супероксиддисмутази та каталази. (М.О. Дружина, А.П.Бурлака, Є.П.Сидорик. Застосування меланіну грибного походження для регуляції генерації радикальної форми кисню в умовах тривалої дії іонізуючого опромінення низької потужності дози // Эксперим. Онкол.-2001.-23. -С. 181-182.) Досліджується можливість застосування наночастинок, покритих меланіном, для зниження радіотоксичності за дії радіоімунотерапії при онкозахворюваннях (A. D. Schweitzer, M.D., Е. Revskaya, P. Chu, V.Pazo, Matthew Friedman, J. D. Nosanchuk, S. Cahill, S. Frases, A. Casadevall, E. Dadachova. Melanin-covered nanoparticles for protection of bone marrow during radiation therapy of cancer //Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.-2010; 78, N 5.-P. 1494-1502.). Меланіни грибів нетоксичні і можуть бути отримані в промислових об'ємах для створення фармакологічних препаратів на їх основі. Проте на сьогоднішній день кількість фармакологічних препаратів на основі меланінів є дуже обмеженою. Є відомим спосіб одержання меланіну, який передбачає культивування штамів мікроміцетів, зокрема, Cladiosporium cladosporioid.es 396, у культуральному середовищі, кислотний гідроліз 1 UA 73184 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 біомаси вказаного гриба та промивання його гарячою водою до рН 5,7+-0,4 (UA44319, опубл. 15.02.2002, Бюл. № 2). Вказаний спосіб є вибраним авторами як прототип заявленої корисної моделі. Він забезпечує одержання високоочищених пігментів при зниженні кількості операцій, проте продуктивність описаного способу та якість одержаних пігментів є незадовільною. Задачею заявленої корисної моделі є підвищення ефективності способу за рахунок одержання пігментів з високою антиоксидантною активністю та підвищення продукційної здатності мікроміцетів. Поставлена задача вирішується шляхом розробки способу, який передбачає культивування мікроміцетів-продуцентів протягом 14 діб при температурі 23-25 °C та зовнішньому гаммаопроміненні, де дозове навантаження складає 10-14 мГр/доб. на зразок, отримання біомаси шляхом двоступеневої фільтрації, дезінтеграцію рідким азотом, центрифугування, проведення лужного гідролізу біомаси, осадження отриманого екстракту концентрованою кислотою, розчинення отриманого осаду у лузі, діаліз проти дистильованої води та висушування отриманого продукту. Таким чином, запропонований спосіб передбачає створення відповідних умов опромінення при рості грибів-продуцентів меланінових пігментів, що приводить до збільшення антиоксидантної ємності їх меланінів та підвищення загальної кількості утворених меланінових пігментів. Ще на початку двадцятого століття існували дані про чітку стимуляцію розвитку рослин при рентгенівському опроміненні або опроміненні еманацією радію насіння і проростків у малих дозах. В ряді досліджень з мікроскопічними грибами було показано стимулюючу дію малих доз випромінювання на ріст, розвиток та продукцію вторинних метаболітів. Це явище має велике значення, оскільки багато представників цього класу грибів є продуцентами цінних антибіотиків та інших біологічно активних речовин (Кузин A.M. Стимулирующее действие ионизирующего излучения на биологические процессы. Москва: Атомиздат, 1977.-131 с). Для мікроскопічних грибів не встановлено, який саме діапазон доз іонізуючого опромінення викликає гормезисні явища, проте відомо, що вони мають виражені радіоадаптивні властивості завдяки присутності в їх клітинних стінках меланінових пігментів. Деякі гриби під дією іонізуючого опромінення низької інтенсивності ростуть на поживному середовищі більш швидко у порівнянні з неопроміненими грибами та опроміненими грибами, позбавленими меланіну (Тугай Т.І. Вплив низьких доз іонізуючого випромінювання на накопичення меланінових пігментів та активність каталази і супероксиддисмутази у Cladosporium cladosporioides // Укр. біохім. журнал. - 2007.-79, № 6. - С 93-99.). Для опромінення мікроскопічних грибів була сконструйована модельна установка з площадкою, на якій потужність експозиційної дози становила 3,7 мР/год. За дозиметричною оцінкою поглинута доза за рахунок зовнішнього гамма-опромінення складала 0,9 мГр/доб. у розрахунку на масу грибного міцелію. Крім того, в результаті Комптонівського розсіювання гамма-квантів з енергією 662 кеВ в середовищі утворювався потік електронів з безперервним спектром з граничною енергією понад 500 кеВ. Дозове навантаження при цьому складало 10-14 мГр/доб. на зразок. Спосіб згідно із запропонованою корисною моделлю ілюструється приведеними нижче прикладами конкретної реалізації. Приклад 1. У досліді вивчали продукцію меланінових пігментів мікроміцетами Cladosporium cladosporioides та Aspergillus versicolor. Одержання меланінових пігментів проводили наступним чином. З метою накопичення грибної біомаси, проводили поверхневе культивування мікроміцетів на рідкому поживному середовищі Чапека. Як джерело вуглецю використовували глюкозу у концентрації 20 г/л. Культивування грибів проводили в умовах опромінення та без нього (контроль). Після 14-ти добового культивування при температурі 23-25 °C проводили розділення біомаси і культуральної рідини шляхом двоступеневої фільтрації. Перше (грубе) фільтрування здійснювали крізь капроновий фільтр, друге - через паперовий червоний фільтр. Відфільтровану біомасу дезінтегрували рідким азотом у фарфорових ступках з метою руйнування клітин. Від залишків клітин звільнялись шляхом центрифугуванням отриманого дезінтеграту при 8000 об/хв. Із осаду екстрагували пігменти загальноприйнятим для екстракції меланінів методом лужного гідролізу - розчином 2 % NaOH протягом 24 год. з коефіцієнтом розведення 1:10, як було описано раніше [Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Филимонова Т.В., Григорчук Е.А. 2 UA 73184 U 5 10 Меланиновые пигменты грибов Paecilomyces variotii и Aspergillius carbonarius//Прикл.биохим.микробиол.-2000.-36, № 2. -С. 153 - 159.]. Отриманий екстракт підкислювали до рН 2 концентрованою НС1 і утворений осад пігменту відокремлювали центрифугуванням при 6000 об/хв. протягом 15 хв. Таку процедуру повторювали двічі. Отриманий осад розчиняли в 2 % NaOH, після чого діалізували розчин пігменту проти дистильованої води, потім висушували до постійної ваги при 65 °C. Отриманий пігмент використовували для подальших досліджень його фізико-хімічних властивостей. У Таблиці 1 приведені результати, отримані при здійсненні запропонованого способу, при цьому як продуценти використовували ізоляти міксоміцетів Cladosporium cladosporioides 396, 4 та 10 та Aspergillus versicolor 432, 55 та 57. Таблиця 1 Ізоляти мікроміцетів Cladosporium cladosporoiodes 396 Cladosporium cladcsporoiodes 4 Cladosporium cladosporoiodes 10 Aspergillus versicolor 432 Aspergillus versicolor 55 Aspergillus versicolor 57 15 20 25 30 35 Вихід пігменту (% по відношенню до АСБ) Сумарне дозове навантаження 170 мГр (10-14 мГр/доб. на 0 зразок) 5,9±0,27 7,8±0,35 5,1±0,23 6,8±0,29 5,4±0,24 7,28±0,31 9,8±0,46 8,3±0,37 9,01±0,45 14,7±0,66 8,5±0,38 11,2±0,54 Приклад. 2. Рівень синтезу меланінових пігментів виражали відношенням ваги виділених пігментів до маси абсолютно сухої біомаси (АСБ), яку визначали ваговим методом при висушуванні до постійної маси при 65 °C. Антиоксидантну ємність меланінових пігментів у штамів мікроміцетів визначали з ∙+ ∙+ використанням АБТС радикалу. Радикал АБТС (АБТС ) одержували згідно з модифікованим методом Ре с соmр. [Re R., Pellegrini N., Proteggente, A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans С II Free Radical Biol. Medi. 1999. V. 26. № 9/10. P. 1231-1237.]. Антиоксидантну активність досліджуваних сполук визначали за допомогою спектрофотометру за зміною екстинції при довжині хвилі 734 нм протягом 3 хв. [Инструкция по определению антиоксидантного статуса набором фирмы Randox // Randox Laboratories Ltd., UK. 2000. p. 2-9.]. Досліджені пігменти не ∙+ мають оптичного поглинання при 734 нм, яке змінюється в процесі їх взаємодії з АБТС , що дозволяє коректно інтерпретувати отримані дані. Для аналізу та порівняння отриманих даних з даними літератури антиоксидантну ємність меланіну виражали у еквіваленті активності Тролоксу. Цю величину визначали як концентрацію розчину Тролоксу з такою антиоксидантною ємністю, яка є еквівалентною антиоксидантній ємності досліджуваної сполуки при концентрації 1 мМ. Як стандарт використовували Тролокс (синтетичний аналог вітаміну Е, 6-гідрокси-2,5,7,8тетраметилхроман-2-карбонова кислота; Aldrich, США). Для побудови калібрувальної кривої використовували розчин Тролоксу в інтервалі концентрацій від 0 до 10 мкМ у цитратному буфері при рН 3,75 та 4,25. Величина антиоксидантної ємності відображає здатність воденьдонуючих антиоксидантів відновлювати катіон-радикал АБТС. Антиоксидантну ємність досліджених препаратів меланіну виражали на 1 мг пігменту. При порівнянні антиоксидантної ємності меланінових пігментів, виділених з мікроміцетів, що зазнали опромінення в процесі культивування, було встановлено, що вона підвищувалася. У Таблиці 2 приведені результати стосовно антиоксидантної ємності досліджуваних штамів за умови опромінення та у випадку його відсутності. 3 UA 73184 U Таблиця 2 Ізоляти мікроміцетів Cladosporium cladosporoiod.es 396 Cladosporium cladosporoiodes 4 Cladosporium cladosporoiodes 10 Aspergillus versicolor 432 Aspergillus versicolor 55 Aspergillus versicolor 57 5 Антиоксидантна ємність АОЄ, Антиоксидантна ємність АОЄ, ммоль ТЕ/мг пігменту ммоль ТЕ/мг пігменту неопромінених штамів опромінених штамів 0,055±0,0031 0,305±0,014 0,292±0,013 0,402±0,017 0,278±0,012 0,361±0,016 0,027±0,001 0,204±0,009 0,231±0,011 0,153±0,007 0,201±0,009 0,300±0,013 Таким чином, запропонований спосіб, що передбачає опромінення мікроміцетів, які синтезують меланінові пігменти, приводить до суттєвого підвищення продуктивності синтезу пігментів та збільшення їх антиоксидантної активності. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 1. Спосіб одержання меланінових пігментів, який передбачає культивування штамів мікроміцетів на поживному середовищі, проведення гідролізу отриманої біомаси та промивання продукту, який відрізняється тим, що культивування здійснюють протягом 14 діб при температурі 23-25 °C та зовнішньому гамма-опроміненні, де дозове навантаження складає 1014 мГр/доб. на зразок, після цього проводять двоступеневу фільтрацію, дезінтеграцію рідким азотом, центрифугування, проведення лужного гідролізу біомаси, осадження отриманого екстракту концентрованою кислотою, розчинення отриманого осаду у лузі, діаліз проти дистильованої води та висушування отриманого продукту. 2. Спосіб за пунктом 1, який відрізняється тим, що поглинута доза гамма-опромінення складає 0,9 мГр/доб. у розрахунку на масу грибного міцелію. 3. Спосіб за будь-яким з пунктів 1 або 2, який відрізняється тим, що гранична енергія опромінення складає 500 кеВ. 4. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-3, який відрізняється тим, що потужність експозиційної дози становить 3,7 мР/год. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4