Спосіб експрес-діагностики сальмонельозу та генотипування salmonella enterica enteritidis та salmonella enterica typhimurium за допомогою мультиплексної плр

Реферат: Спосіб експрес-діагностики сальмонельозу та генотипування Salmonella enterica enteritidis та Salmonella enterica typhimurium за допомогою мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції включає відбір біоматеріалу, виділення ДНК, виявлення геномної ДНК мікроорганізмві роду Salmonella за допомогою праймерів з певною послідовністю нуклеотидів. Проводять ампліфікацію ділянок генів A, Sef A, flli C сальмонел. UA 85804 U (54) СПОСІБ ЕКСПРЕС-ДІАГНОСТИКИ САЛЬМОНЕЛЬОЗУ ТА ГЕНОТИПУВАННЯ SALMONELLA ENTERICA ENTERITIDIS ТА SALMONELLA ENTERICA TYPHIMURIUM ЗА ДОПОМОГОЮ МУЛЬТИПЛЕКСНОЇ ПЛР UA 85804 U UA 85804 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, зокрема до розробки молекулярногенетичних способів діагностики токсикоінфекцій, а саме сальмонельозів тварин та людини, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, а також до методів виявлення контамінації продуктів харчування тваринного походження збудниками сальмонельозів. Найбільш небезпечними представниками роду Salmonella є Salmonella enterica enteritidis та Salmonella enterica typhimurium. Існують відомі способи діагностики сальмонельозів - бактеріологічні, серологічні, біохімічні способи. Але ці способи потребують витрат великої кількості часу та праці на їх здійснення [Методические указания МУ 4.2.2723-10 "Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 13 августа 2010 г.). Найбільш близьким способом виявлення ДНК сальмонел за допомогою ПЛР є спосіб на основі ПЛР у реальному часі (Real-time ПЛР) [Способ определения микроорганизмов рода Salmonella. Заявка РФ: № 2008103308/13, від 28.01.2008]. Спосіб включає відбір біоматеріалу, виділення ДНК, виявлення геномної ДНК мікроорганізмів роду Salmonella за допомогою спеціально підібраних праймерів з наступними нуклеотидними послідовностями: • флуоресцентний зонд Цей спосіб є найближчим аналогом. Недоліком є те, що запропонований спосіб на основі Real-time ПЛР виявляє генетичний матеріал лише представників роду Salmonella spp. без ідентифікації видів та потребує великих грошових витрат на закупівлю, налаштування відповідного обладнання та придбання дорогих витратних матеріалів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб експрес-діагностики сальмонельозу та генотипування Salmonella enterica enteritidis та Salmonella enterica typhimurium за допомогою мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Поставлена задача вирішується тим, що включає відбір біоматеріалу, виділення ДНК, виявлення геномної ДНК мікроорганізмі роду Salmonella за допомогою праймерів з певною послідовністю нуклеотидів, згідно з корисною моделлю, проводять ампліфікацію ділянок генів A, Sef A, flli C сальмонел, як ПЛР-мішені, з використанням праймерів з наступною послідовністю олігонуклеотидів: при температурі відпалу 63 °C, синтезування продукту довжиною 299 п. н., 387 п. н., 433 п. н., щоб забезпечити ефективність способу. Спосіб виконують наступним чином. Для молекулярно-генетичних досліджень на наявність генетичного матеріалу сальмонел може бути відібраний наступний матеріал: кров, стабілізована 5 % розчином цитрату натрію або EDTA, зразки внутрішніх органів, яйце, біологічні рідини, зразки харчової продукції, змиви з приміщень та обладнання. Екстракцію загальної ДНК проводять за допомогою набору для екстракції загальної ДНК-Сорб-А або ДНК-Сорб-Б (Амплисенс, Москва, Росія), або аналогічного. Полімеразну ланцюгову реакцію проводять у ампліфікаторі при температурі відпалу 63 °C. Далі проводять розгін амплікону у 3 % агарозному гелі за допомогою електрофорезної камери при напрузі 120 V протягом 30-40 хвилин. Гель надалі розміщується на поверхні УФ трансілюмінатора та аналізується. Результат ПЛР фотографують. 1 UA 85804 U 5 10 15 20 25 Облік результатів. У негативному контрольному зразку (К-) смужки відсутні. Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору. У позитивних контрольних зразках (К+) виявляється одна смужка жовтогарячого кольору з розміром 387 пар нуклеотидів для Salmonella spp., 299 пар нуклеотидів для Salmonella enterica enteritidis та 433 пар нуклеотидів для Salmonella enterica typhimimum. Електрофореграма результатів ПЛР: M - Маркер молекулярної ваги 1-Salmonella enterica enteritidis 2-Salmonella enterica typhimurium К+ - позитивний контрольний зразок К- - негативний контрольний зразок Відсутність смужки жовтогарячо-червоного кольору на рівні позитивного контролю (К+) свідчить про відсутність генетичного матеріалу збудника сальмонельозу у аналізованій пробі. Наявність смужки, що відповідає за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю, свідчить про наявність генетичного матеріалу сальмонели відповідного виду. При недотриманні температурного режиму можуть з'являтися смужки слабкої інтенсивності на різних рівнях, відмінних від позитивного контролю. Якщо інтерпретація результатів ускладнена, рекомендується провести повторну ПЛР із залишками проби ДНК. Якщо специфічна смужка дуже низької інтенсивності (набагато нижче інтенсивності позитивного контролю) проводять повторну ПЛР. Коли такий результат повторюється, то його вважають сумнівним. Для уточнення результату необхідно повторне дослідження. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад № 1. Для випробування мультиплексної реакції щодо специфічності виявлення потрібного генетичного матеріалу було проведено дослідження. Із культур музейних штамів було виділено ДНК для постановки мультиплексної ПЛР за наступним списком: 30 2 UA 85804 U 1. S. Typhimurium; 2. S. Enteritidis; 3. S. Typhi; 4. S. Dublin; 5. S. Heidelberg; 6. S. Infantis; 7. S. Typhisuis; 8. S. Gallinarum Pullorum. 5 10 15 20 25 На фото електрофореграми у всіх пробах є смужка на рівні 387 п. н., що свідчить про чутливість реакції до 8 представників роду Salmonella. У першій пробі спостерігали дві смужки на рівні 387 п. н. та 433 п. н., що є характерним для виявлення генетичного матеріалу Salmonella enterica typhimurium (утворився специфічний амплікон для Salmonella spp. та Salmonella enterica typhimurium). У другій пробі чітко визначені дві смужки на рівні 387 та 299 п. н., що є характерним утворенням амплікону для Salmonella spp. та Salmonella enterica enteritidis. Приклад № 2. Проведено експеримент щодо виявлення аналітичної чуттєвості праймерів, які використовуються для постановки мультиплексної ПЛР. При використанні пари праймерів Salm 3_4 утворення продуктів ампліфікації спостерігалось для ДНК Salmonella Enteritidis до 5-го розведення та ДНК Salmonella Typhimurium до 6-го розведення, що відповідає аналітичній чуттєвості ПЛР 1 нг/мл для Salmonella enteritidis та 100 пг/мл для Salmonella Typhimurium. За умов використання пари праймерів Sent F_R утворення видимих після електрофорезу продуктів ампліфікації спостерігалось до 4-го розведення, що відповідало концентрації ДНК сальмонел 10 нг/мл. При використанні пари праймерів Styp F_R утворення видимих після електрофорезу продуктів ампліфікації спостерігалось до 6-го розведення, що складало концентрацію ДНК сальмонел 100 пг/мл. Таким чином була встановлена мінімальна концентрація ДНК, яка необхідна для ампліфікації з використанням пар праймерів Salm 3_4, Sent F_R, Styp F_R. Розведення з -1 концентрацією ДНК 100 пг/мл відповідає 0,3 аМ або 191 геномній одиниці у 1 мл дослідного матеріалу. Розроблено спосіб виявлення ДНК сальмонел та ідентифікації двох представників Salmonella enterica Enteritidis та Salmonella enterica Typhimurium за допомогою ПЛР, який може успішно використовуватись у практиці лабораторних досліджень. 30 Таблиця Спосіб виявлення сальмонел за допомогою полімеразної ланцюгової реакції № циклу 1 2 3 Температура 95 °C 95 °C 63 °C 72 °C 72 °C Час 2 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 2 хв. 3 Кількість циклів 1 40 1 UA 85804 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб експрес-діагностики сальмонельозу та генотипування Salmonella enterica enteritidis та Salmonella enterica typhimurium за допомогою мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, що включає відбір біоматеріалу, виділення ДНК, виявлення геномної ДНК мікроорганізмів роду Salmonella за допомогою праймерів з певною послідовністю нуклеотидів, який відрізняється тим, що проводять ампліфікацію ділянок генів A, Sef A, flli C сальмонел, як ПЛР-мішені, з використанням праймерів з наступною послідовністю олігонуклеотидів: при температурі відпалу 63 °C, синтезування продукту довжиною 299 п. н., 387 п. н., 433 п. н. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4