Пристрій для дослідження споживання кисню ізольованими мітохондріями, клітинами чи надклітинними структурами

Реферат: Пристрій для дослідження споживання кисню ізольованими мітохондріями, клітинами чи надклітинними структурами складається із термостатованої комірки з розміщеною у ній кюветою, кришки з отвором для внесення речовин, датчика споживання кисню, приладу для передачі сигналів із датчика на комп'ютер і мішалки. Кювета виготовлена у формі циліндра. Кришка має посередині додатковий отвір, через який проходить стержень, один кінець якого кріпиться до електродвигуна, а на другому - розміщений дволопатевий пропелер. UA 85943 U (54) ПРИСТРІЙ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ СПОЖИВАННЯ КИСНЮ ІЗОЛЬОВАНИМИ МІТОХОНДРІЯМИ, КЛІТИНАМИ ЧИ НАДКЛІТИННИМИ СТРУКТУРАМИ UA 85943 U UA 85943 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біології, а саме клітинної фізіології, і може бути використана для вивчення процесів мітохондріального чи клітинного дихання. Відомий пристрій для полярографічного дослідження дихання ізольованих мітохондрій [Chance, В. and Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization // J. Biol. Chem. - 1955. - Vol. 217. - P. 383-393]. Він складається з вібруючого кисневого електрода, розміщеного у термостатованій комірці, яка закривається кришкою з отвором, а також механічного самописця. Недоліком пристрою є запис експериментальних даних на папері з використанням механічного самописця, що обмежує точність і роздільну здатність при визначенні швидкості споживання кисню. Найближчим за технічною суттю - прототипом - є "Аппарат для регистрации потребления кислорода митохондриями или клетками" [патент RU 2225437. Красников Борис Фёдорович. Аппарат для регистрации потребления кислорода митохондриями или клетками]. Пристрій містить термостатовану комірку, всередині якої розміщена кювета у вигляді шестигранної призми, кришку з отвором для внесення проб і реагентів, датчик споживання кисню й електронний модуль для передачі сигналів з датчика на комп'ютер. Термостатована комірка також забезпечена датчиками, які дозволяють реєструвати додатково мембранний потенціал, концентрацію іонів кальцію і набрякання. Датчики мають форму зрізаного конуса і розташовані горизонтально в отворах стінки комірки перпендикулярно до граней кювети. Комірка додатково містить магнітну мішалку для забезпечення рівномірного розподілу мітохондрій або клітин та кисню упродовж експерименту. Винахід забезпечує збільшення кількості вимірюваних параметрів мітохондрій або клітин, отримання більш точної інформації у процесі медикобіологічних досліджень. Недоліком пристрою є використання магнітної мішалки, що веде до поступового зниження швидкості споживання кисню клітинами чи надклітинними структурами з часом, що, у свою чергу, утруднює вивчення ефектів біологічно активних речовин на клітинне дихання. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити пристрій для дослідження споживання кисню клітинами чи надклітинними структурами шляхом уведення мішалки пропелерного типу, що дасть змогу стабілізувати базальну швидкість споживання кисню й адекватно реєструвати впливи різних речовин на клітинне дихання. Поставлена задача вирішується так, що пристрій для дослідження споживання кисню мітохондріями, клітинами чи надклітинними структурами складається із термостатованої комірки з розміщеною у ній кюветою, кришки з отвором для внесення речовин, датчика споживання кисню, приладу для передачі сигналів з датчика на комп'ютер і мішалки, причому кювета виготовлена у формі циліндра, а кришка має посередині додатковий отвір, через який проходить стержень, один кінець якого кріпиться до електродвигуна, а на другому - розміщений дволопатевий пропелер. Корисна модель пояснюється кресленнями, де: на фіг. 1 зображена схема пристрою для дослідження споживання кисню мітохондріями, клітинами чи надклітинними структурами, де: 1 - камера з водою, сполучена з термостатом; 2 - кришка; 3 - отвір для внесення речовин; 4 - датчик споживання кисню; 5 - електродвигун; 6 - пропелер; на фіг. 2 - графік залежності швидкості споживання кисню інтактними ацинусами підшлункової залози від його вмісту у кюветі за різних способів перемішування суспензії, де: • - магнітною мішалкою,° - пропелерною мішалкою;  - статистично вірогідна різниця щодо даних за використання магнітної мішалки з Р0,05;  з Р0,01. на фіг. 3 - графік споживання кисню панкреатичними ацинусами підшлункової залози за впливу карбахоліну і використання магнітної мішалки, де:  КХ - момент внесення карбахоліну у кювету; 1 - суцільна лінія показує зниження вмісту кисню з часом, штрихова лінія відображає прогнозоване зниження вмісту кисню без внесення карбахоліну; 2 - товста лінія відображає розраховані миттєві швидкості дихання, тонка лінія відповідає середньому рівню швидкості дихання до внесення карбахоліну; на фіг. 4 - графік споживання кисню панкреатичними ацинусами підшлункової залози за впливу карбахоліну і використання пропелерної мішалки, де: 1 UA 85943 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60  КХ - момент внесення карбахоліну у кювету; 1 - суцільна лінія показує зниження вмісту кисню з часом, штрихова лінія відображає прогнозоване зниження вмісту кисню без внесення карбахоліну; 2 - товста лінія відображає розраховані миттєві швидкості дихання, тонка лінія відповідає середньому рівню швидкості дихання до внесення карбахоліну. У процесі дослідження споживання кисню мітохондріями, клітинами чи надклітинними структурами за відомим пристроєм магнітна мішалка розміщена на дні кювети. При її обертанні під дією магнітного поля відбувається тертя з дном кювети, що призводить до поступового руйнування мітохондрій, клітин чи надклітинних структур. Особливо швидко втрачають інтактність клітини та надклітинні структури. Це супроводжується значним зниженням швидкості дихання з часом. Авторами запропоновано застосувати пропелерну мішалку, яка не контактує з дном і стінками кювети. Це суттєво зменшує ушкодження клітин чи надклітинних структур і зниження швидкості їх дихання з часом. Пристрій (фіг. 1) складається з термостатованої комірки з розташованою у ній кюветою для дослідження біологічних суспензій, датчика споживання кисню, кришки з центральним отвором для розміщення пропелерної мішалки і боковим - для внесення речовин, а також приладу для передачі сигналів з датчика на комп'ютер. Пропелерна мішалка складається зі стержня з нержавіючої сталі або з довільного інертного матеріалу, один кінець якого кріпиться до електродвигуна, а інший - сполучений з дволопатевим пропелером із нержавіючої сталі. Переваги пристрою можна продемонструвати на такому прикладі. Досліджують споживання кисню суспензією ізольованих ацинусів підшлункової залози щурів, отриману способом Вільямса [Williams J. А., Korc M., Dormer R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini // Am. J. Physiol. - 1978. - Vol. 235. № 5. - P. 517-524]. Порівнюють результати, отримані за використання магнітної і пропелерної мішалок. За перемішування суспензії ацинусів магнітною мішалкою швидкість дихання упродовж певного часу (від 270 до 210 нмоль О2 у комірці) у трьох експериментах суттєво не змінюється (фіг. 2). Після цього настає перша фаза плавного зниження швидкості дихання, яка триває приблизно до 45 нмоль О2 у середовищі. У діапазоні 45-8 нмоль відбувається різке, практично до нуля, зниження швидкості дихання. Натомість, за використання пропелерної мішалки у п'яти експериментах перша фаза зниження швидкості дихання, яка триває приблизно до 60 нмоль О 2, є менш вираженою (фіг. 2), ніж за використання магнітної мішалки. Швидкість дихання у цій точці становить 87±4 % від початкової, а за використання магнітної мішалки - лише 62±3 %. Ця фаза в обох випадках є не стільки чутливою до вмісту О2 у полярографічній комірці, скільки залежить від засобу перемішування суспензії. Друга фаза - фаза різкого зниження швидкості дихання - є однаковою за використання обох типів мішалок і спричинена сповільненням дифузії кисню у клітини за низького його вмісту у комірці. За використання магнітної мішалки стимулятор клітинного дихання карбахолін у концентрації 1 мкмоль/л не впливав на швидкість споживання кисню у трьох експериментах принаймні упродовж 2-3 хв. Можливі пізніші ефекти карбахоліну виявити не вдається внаслідок зниження швидкості дихання суспензії ацинарних панкреацитів з часом. У інших п'ятнадцяти експериментах (результати типового експерименту представлені на фіг. 3) за дії карбахоліну у концентрації 10 мкмоль/л швидкість споживання кисню спочатку зростає - від 0,26±0,02 до 0,32±0,01 нмоль О2/(смлн. клітин), тобто на 23,44 % (Р0,001; фіг. 3). Після першої фази інтенсифікації, яка триває 33±3 с, настає фаза 2, яка характеризується зниженням швидкості дихання. У першу хвилину фази 2 спостерігають різке зменшення швидкості споживання кисню до 0,25±0,02 нмоль О2/(смлн клітин). Надалі у цьому досліді швидкість продовжує плавно знижуватися. За використання пропелерної мішалки карбахолін у концентрації 1 мкмоль/л підвищує швидкість дихання у середньому на 11,54 % для восьми експериментів (Р0,001). За внесення цього секретагога у вищій концентрації (10 мкмоль/л) реєструють початкову інтенсифікацію дихання у середньому на 20,14 % для дев'яти експериментів (Р0,001). У шести експериментах (результати типового експерименту представлені на фіг. 4) приблизно через 1 хв. спостерігається друга фаза дії карбахоліну, яка характеризується деяким зниженням його стимулюючого впливу на дихання. Однак у цьому випадку, на відміну від дослідів із магнітною мішалкою, швидкість дихання залишається вищою, ніж у контролі, на 11,51 % (Р0,001). У інших трьох експериментах друга фаза не виникає, тобто швидкість дихання суттєво не знижується. 2 UA 85943 U 5 Використання пропелерної мішалки дає змогу виявити ті ефекти карбахоліну, які маскуються поступовим зниженням інтенсивності дихання, спричиненим використанням магнітної мішалки. Запропонований пристрій дає змогу досягти поставленого технічного завдання, а саме стабілізувати базальну швидкість споживання кисню і адекватно реєструвати впливи різних речовин на клітинне дихання. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Пристрій для дослідження споживання кисню ізольованими мітохондріями, клітинами чи надклітинними структурами, який складається із термостатованої комірки з розміщеною у ній кюветою, кришки з отвором для внесення речовин, датчика споживання кисню, приладу для передачі сигналів із датчика на комп'ютер і мішалки, який відрізняється тим, що кювета виготовлена у формі циліндра, а кришка має посередині додатковий отвір, через який проходить стержень, один кінець якого кріпиться до електродвигуна, а на другому - розміщений дволопатевий пропелер. 3 UA 85943 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4