Спосіб застосування тест-системи скринінгових досліджень по виявленню модифікаторів мутагенезу

Реферат: Спосіб застосування тест-системи для скринінгових досліджень по виявленню модифікаторів мутагенезу включає цитогенетичне дослідження модифікуючого впливу щодо дії модельних мутагенів: діоксидину, тіофосфаміду та мітоміцину С в Аllium-тесті, причому при використанні тест-системи враховують цитогенетичні ефекти модифікації пошкоджень, індукованих мутагенами з різними механізмами дії, різною мутагенною ефективністю (з визначеними коефіцієнтами мутагенної ефективності) та при різних рівнях індукованого мутагенезу. UA 86598 U (12) UA 86598 U UA 86598 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до генотоксикології, і може бути використана для виявлення модифікаторів мутагенезу та визначення якісних і кількісних критеріїв їх ефективності. Актуальність розробки полягає в тому, що запропонована схема використання модельних мутагенів найбільш повно відображає картину мутагенного впливу на організм, а визначені криві доза-ефект та коефіцієнти мутагенної ефективності дозволяють адекватно оцінити ефективність модифікуючого впливу. На сьогодні відомі та продовжують розроблятися системи пошуку сполук з антимутагенними властивостями. Для скринінгових досліджень може бути використаний будь який відомий тест на мутагенність [1-3]. Класичним методом для дослідження токсичного і мутагенного впливу на живі об'єкти є тест на клітинах кореневої меристеми цибулі (Аllium-тест). Важливою перевагою цього методу цитогенетичного моніторингу є хороша кореляція його результатів з результатами, одержаними на інших тест-системах [4]. Однією з головних умов таких досліджень є використання як модельного мутагену добре вивченої в генетичному плані сполуки з відомим механізмом пошкоджуючої дії [1-3]. В дослідах на рослинах найбільш частіше використовують модельні мутагени -нітрозометилсечовину (НМС) або етилметансульфонат [5, 6]. Широкий спектр дії НМС пояснюють тим, що цей агент вступає в реакції не тільки алкілування, але й нітрозування і карбомоїлування. Разом з тим, механізм дії цього агента дотепер залишається не повністю з'ясованим [цит. за 5]. Накопичений досвід вказує на недостатність використання при скринінгу модифікаторів мутагенезу лише одного модельного мутагену, оскільки це не дозволяє дослідити особливості модифікуючого впливу при різних механізмах індукованого мутагенезу. В патенті "Способ антимутагенного воздействия на организм", RU 2145869, 27.02.2000 для дослідження антимутагенних властивостей пропонується використовувати модельні мутагени діоксидин (прооксидантний) та циклофосфан (алкілувальний) в цитогенетичному тесті на клітинах кісткового мозку мишей [7]. Недоліками зазначеного методу є відсутність калібрувальних кривих цитогенетичних ефектів модельних мутагенів в даному тесті, неможливість порівняння їх мутагенної ефективності за коефіцієнтом мутагенної ефективності (визначеним на основі теоретичних моделей залежностей концентрація-ефект) та недостатньо широкий спектр механізмів мутагенної дії. В основу корисної моделі поставлено завдання створення більш оптимізованої тест-системи для скринінгу речовин, здатних модифікувати цитогенетичні ефекти мутагенів, шляхом застосування відомих мутагенів за новим призначенням. Поставлене завдання вирішується тим, що розроблена схема включає використання трьох мутагенів з різними механізмами дії та мутагенною ефективністю. Як прооксидант з кластогенними властивостями в експериментах використовували відомий генератор вільних радикалів - діоксидин. Репарація пошкоджень ДНК, індукованих діоксидином та гамма-опроміненням подібні, тому діоксидин відносять до мутагенів у-типу [9]. Високою мутагенною активністю володіють сполуки, здатні переносити на молекулу алкільні групи, викликаючи перебудови хромосом. Проте, механізми їх дії можуть відрізнятись. Тому як модельні нами було вибрано ще два алкілувальних мутагени. Перший - тіофосфамід, механізм дії якого полягає в алкілуванні основ ДНК (одна молекула реагує з основою одного з ланцюгів ДНК). Поряд з алкілувальною, показана й незначна прооксидантна активність тіофосфаміду [цит. за 9]. Механізм дії іншого вибраного алкілувального мутагену - мітоміцину С, обумовлений тим, що його молекула здатна реагувати одночасно з двома ланцюгами ДНК, що призводить до зшивок ДНК-ДНК та порушення процесів реплікації [10]. Таким чином, вибрана схема модельних мутагенів дозволяє враховувати більш широкий спектр механізмів мутагенного впливу на організм. В якості тест-системи пропонується Аllium-тест. Нами були побудовані калібрувальні криві залежності "концентрація - кластогенний ефект" для діоксидину, тіофосфаміду та мітоміцину С. Визначені теоретичні моделі, що описують ці залежності, відповідно до яких обчислено коефіцієнти мутагенної ефективності вказаних мутагенів. Відповідно до величин цих коефіцієнтів (Кмут) мутагенна ефективність збільшується в ряду: діоксидин (К мут = 0,005), тіофосфамід (Кмут = 0,232), мітоміцин С (Кмут = 1,094). Відповідно до методичних рекомендацій по виявленню хімічних модифікаторів мутагенезу і канцерогенезу [3], для скринінгових досліджень пропонується використовувати концентрації модельних мутагенів, які індукують  20 % аберантих клітин. За результатами наших досліджень в Аllium-тесті вони становлять: для діоксидину - 20 мг/л, для тіофосфаміду - 1 мг/л, для мітоміцину С - 0,025 мг/л. Разом з тим, запропонована корисна модель може бути використана при дослідженні залежності модифікуючого впливу від рівня індукованого мутагенезу. Для цього використовують концентрації модельних мутагенів, які були визначені нами в Аllium-тесті, здатних індукувати той чи інший рівень аберантних клітин (таблиця 1). 1 UA 86598 U Таблиця 1 Калібрувальні криві цитогенетичної дії модельних мутагенів в Allium-тесті Модельний мутаген діоксидин тіофосфамід мітоміцин С 5 10 15 20 25 Рівень індукованого мутагенезу, % аберантних клітин  10  20  40 Концентрація модельного мутагену 0,5 мг/л 10 мг/л 20 мг/л 100 мг/л 0,1 мг/л 0,2 мг/л 1 мг/л 5 мг/л 0,001 мг/л 0,005 мг/л 0,025 мг/л 0,05 мг/л 5 Таким чином, запропонована схема дає можливість більш адекватно оцінити модифікуючий вплив щодо цитогенетичних ефектів мутагенів з різними механізмами дії, різною мутагенною ефективністю та при різному рівні індукованого мутагенезу. Заявлена корисна модель здійснюється таким чином - в Аllium-тесті визначають цитогенетичні ефекти роздільної та поєднаної дії мутагенів та модифікатора. Для цього насіння цибулі Allium сера L. протягом 72 годин пророщують в чашках Петрі на зволоженому експериментальними розчинами фільтровальному папері в термостаті при температурі +25 °C. Для цитогенетичного аналізу відразу після завершення експозиції насіння з експериментальними розчинами (корінці довжиною 5-12 мм) фіксують у фіксаторі Кларка (етиловий спирт та оцтова кислота у співвідношенні 3:1). Матеріал витримують у фіксаторі при температурі +4 °C не менше 2-х годин. Для мікроскопічного аналізу готують тимчасові давлені препарати пофарбовані ацетоорсеїном. Проводять мікроскопічне вивчення меристематичної зони корінців, визначають частоту аберантних ана-телофаз (ЧАА). На основі отриманих даних роблять висновок про наявність/відсутність модифікуючого впливу та його залежність від механізму цитогенетичного пошкодження, ефективності мутагену та рівня індукованого мутагенезу. Модифікуючий вплив оцінюють за редукційним фактором (РФ): РФ = ((Мут + Мод) / Мут) ▪100 %, де Мут + Мод - частота аберантних ана-телофаз при сумісній дії мутагену та модифікатора; Мут - частота аберантних ана-телофаз при дії мутагену. Вищезазначене підтверджується наступними прикладами: Приклад 1. В Аllium-тесті досліджували модифікуючий вплив гумату натрію щодо цитогенетичних пошкоджень, індукованих модельними мутагенами. Результати досліджень представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Модифікуючий вплив гумату натрію на частоту аберантних ана-телофаз, індукованих мітоміцином С, тіофосфамідом та діоксидином Концентрація Мутаген, (концентрація, гумату натрію, мг/л) мг/л 0 0 мітоміцин С, 0,025 мг/л мітоміцин С, 0,025 мг/л тіофосфамід, 1 мг/л тіофосфамід, 1 мг/л діоксидин, 20 мг/л діоксидин, 20 мг/л 30 0 100 0 100 0 100 0 100 Всього анафаз, n Аберантних анафаз, n 1903 2388 1460 668 994 850 24414 2166 37 47 320 55 212 109 578 246 Частота аберантних анателофаз ЧАА ± Sp, % 1,94±0,09 1,97±0,21 21,92±1,08 8,23±1,06 21,33±1,30 12,82±1,15 23,94±1,21 11,36±0,47 РФ, % 62,45 39,90 52,55 Як видно з таблиці 2, в усіх випадках спостерігається вірогідне (р < 0,01) зменшення кластогенних ефектів досліджених мутагенів під впливом гумату натрію. Хоча мутагенна ефективність діоксидину, тіофосфаміду та мітоміцину С суттєво відрізняється (коефіцієнти мутагенної ефективності дорівнюють 0,005, 0,232 та 1,094 відповідно), зменшення частоти аберантних клітин при дії гумату натрію відбувається в межах 40-60 % (52,55 %, 39,90 % та 62 % відповідно). Разом з тим, більший антимутагенний ефект модифікатора щодо дії мутагену 2 UA 86598 U 5 з найбільшою ефективністю дозволяє припустити наявність десмутагенних властивостей гумату натрію. Приклад 2. В Аllium-тесті досліджували модифікуючий вплив гумату натрію щодо цитогенетичних пошкоджень при різних рівнях індукованого діоксидином мутагенезу. Результати досліджень представлені в таблиці 3. Таблиця 3 Модифікуючий вплив гумату натрію (100 мг/л) на частоту аберантних ана-телофаз при різних рівнях індукованого діоксидином мутагенезу Діоксидин концентрація, мг/л 10 20 40 100 10 15 20 25 30 35 40 Мутагенний ефект, ЧAA±Sp, % 12,30±1,05 23,94±1,21 29,55±1,55 39,73±2,03 Антимутагенний ефект гумату натрію, ЧАА ± Sp, % 5,94±0,74 11,36±0,47 17,92±1,43 29,42±1,73 РФ, % 51,71 52,55 39,36 25,95 Як видно з таблиці 3, при рівнях мутагенезу, індукованих діоксидином, що становлять 12,30±1,05 % та 23,94±1,21 % аберантних клітин відповідно, антимутагенний ефект гумату натрію однаковий. Проте, при подальшому збільшенні рівня індукованого діоксидином мутагенезу до 30 % та 40 % аберантних клітин, антимутагенний ефект гумату натрію зменшується. Таким чином, антимутагенний ефект гумату натрію, щодо цитогенетичних ефектів діоксидину не залежить від рівня індукованого мутагенезу в діапазоні до 20 % аберантних клітин і зменшується при подальшому збільшенні мутагенного навантаження. Джерела інформації: 1. Бочков Н.П. Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами / Н.П. Бочков [и др.] // Химико-фармацевтический журнал.-1992. - № 9-10. - С. 42-46. 2. Семенов В.В., Студенцова И.А. Количественные и качественные критерии оценки эффективности антимутагенов в эксперименте / В.В.Семенов, И.А Студенцова // Вестник РАМН.-1998. - № 3. - С. 16-20. 3. Методические рекомендации по экспериментальному выявлению химических модификаторов мутагенеза и канцерогенеза [Текст] /Научно-исследовательский институт общей и коммунальной гигиены им. А.Н. Сысина. - Москва, 1986.-10 с. 4. Застосування рослинних тест-систем для оцінки комбінованої дії факторів різної природи. Методичні рекомендації / Д.М. Гродзинський, Ю.В. Шиліна, Н.К. Куцоконь [та ін.]. - Київ: Фітосоціоцентр, 2006. - 60 с. 5. Усатов А.В., машкина Е.В., Гуськов Е.П. Влияние окислительного стресса на мутагенез у подсолнечника Helianthus annuus L., индуцированный нитрозометилмочевиной // Генетика. 2005. - Т. 41, № 1. - С. 63-70. 6. Антимутагенные, антикластогенные и антирадикальные свойства нейротропных средств, используемых в комплексной терапии детского церебрального паралича / Д.Д. Гайнетдинова, В.В. Семенов, Д.В. Айзатулина, М.Ф. Исмагилов // Неврологический вестник - 2009 - Т. XLI, вып. 1 - С. 30-35. 7. Орещенко А.В., Дурнев А.Д., Кулакова А.В. Способ антимутагенного воздействия на организм. Патент РФ. № 2145869. - Класс(ы) патента: А61K38/05, С07K5/075; дата публикации: 27.02.2000. 9. Середенин С.Б. Разработка фармакологических средств защиты генетических структур на основе изучения клеточных механизмов индукции мутаций / С.Б. Середенин, А.Д. Дурнев // Клеточные механизмы реализации фармакологического эффекта. - М., 1990. - С. 273-296. 10. Beretta G. Mitomicin С. Pharmacology and Clinical Uses / G. Beretta, G. Cartei, T. Giraldi. Turin: Minerva Medica Publishers. - 1990. - 180 p. 3 UA 86598 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб застосування тест-системи для скринінгових досліджень по виявленню модифікаторів мутагенезу, що включає цитогенетичне дослідження модифікуючого впливу щодо дії модельних мутагенів: діоксидину, тіофосфаміду та мітоміцину С в Аllium-тесті, який відрізняється тим, що при використанні тест-системи враховують цитогенетичні ефекти модифікації пошкоджень, індукованих мутагенами з різними механізмами дії, різною мутагенною ефективністю (з визначеними коефіцієнтами мутагенної ефективності) та при різних рівнях індукованого мутагенезу. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4