Спосіб визначення рівня гетерозиготності в українських лускатої і рамчастої порід коропа

Реферат: Спосіб визначення рівня гетерозиготності в українських лускатої і рамчастої порід коропа включає відбір біологічного матеріалу, його генетико-біохімічне дослідження та обчислення. Для дослідження використовують кров із хвостової вени українських лускатої і рамчастої порід коропа, після центрифугування якої проводять електрофоретичне розділення білків та ферменту за використання вертикального поліакриламідного електрофорезу в 9 %-му гелі. Після гістохімічного фарбування одночасно на одній гелевій пластині виявляють електрофоретичні варіанти локусу EST і білкових спектрів TF і ALB та фіксують їх цифровою камерою. Далі після генотипування електрофоретичних зон підраховують кількість гетерозиготних особин за кожним локусом та розраховують частоту алельних варіантів локусів TF, ALB, EST. UA 86929 U (12) UA 86929 U UA 86929 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до селекційно-племінної роботи в рибництві, зокрема до способів визначення рівня гетерозиготності, і може бути використана при підборі пар плідників для отримання якісного ремонтно-маточного матеріалу українських лускатої і рамчастої порід коропа в умовах повносистемних ставових господарств. Найпоширенішим об'єктом ставового рибництва України є короп (Cyprinus carpio L.). Одним із основних завдань сучасного рибництва, в тому числі коропівництва, є забезпечення рибогосподарських підприємств необхідною кількістю якісного племінного матеріалу [1]. Особливу увагу слід надавати збереженню оптимального балансу між гомо- і гетерозиготністю племінного стада, а також підтриманню стабільності та однорідності їхніх показників задля раціонального використання та удосконалення порід, спрямованих на підвищення продуктивних якостей при товарному та індустріальному розведенні. Середня гетерозиготність є параметром генетичної різноманітності і показує, яку частку в популяції складають особини, гетерозиготні за досліджуваними маркерами, з усередненням цього параметра за кількістю використаних маркерів [2]. Розв'язання багатьох проблем у рибництві тісно пов'язане з використанням адекватних методів оцінки генетичної мінливості та ступеня консолідованості ліній та порід коропових риб. Ефективність методів, значною мірою, залежить від рівня інформативності використаних підходів, маркерних систем, стабільності відтворення маркерів, доступності і простоти використаних методів. Адекватна оцінка, комплексний підхід, використаний у наших дослідженнях, а також визначення оптимального рівня різноманітності популяцій коропа забезпечують раціональний підхід до їхнього використання у селекційному процесі. В даний час особливої актуальності набувають задачі пошуку нових підходів удосконалення існуючих порід тварин, в умовах сучасного ведення рибництва, які повинні охоплювати і високий потенціал продуктивності і пристосованість до промислових технологій. Це пояснюється збільшенням ролі селекції, яка спрямовано змінює ознаки і властивості тварин. Застосування селекційних програм схрещування і гібридизації є одним з методів підвищення генетичного потенціалу продуктивності риб. На сьогодні найбільш актуальною задачею є розроблення елементів геномної селекції в рибництві, що включає практичні аспекти генетичного моніторингу. Одна з основних задач генетичного моніторингу - це підтримка в стадах генетичного різноманіття, що є необхідною умовою для селекційної роботи. Вирішення цих задач потребує як узагальнення світового досвіду, так і проведення спеціальних досліджень за використання генетичних маркерів риб [3]. Відомі способи виявлення і розрахунку рівня гетерозиготності у сільськогосподарських видів [Глазко В. И. Генетика изоферментов животных и растений / В. И. Глазко, И. А. Созинов. - К.: Урожай, 1993. - 528 с; Nei M. Molecular population genetics and evolution. - Amsterdam: NorthHolland. Publ. Сотр., 1975. - 360 p.; Животовский Л.А. Статистические методы анализа частот генов в природных популяциях // Итоги науки и техники. Общая генетика. - М., 1983. - Т. 8. - С. 78-79.; Животовский Л. А. Популяционная биометрия. - М.: Наука, 1991.-272 с; Nei M., Roychoudhury A.K. Sampling variances of heterozygosity and genetic distance // Genetics.-1974. Vol. 76. - P. 379-390.]. Недоліками вищевказаних способів є обмеження щодо біологічних об'єктів, складність виявлення ізоферментних форм та затратність постановки реакцій. В основу корисної моделі поставлена задача - розроблення способу визначення рівня гетерозиготності в українських лускатої і рамчастої порід коропа. Поставлена задача вирішується шляхом прижиттєвого визначення рівня гетерозиготності за 3-ма генетико-біохімічними системами завдяки аналізу розподілу частоти алельних варіантів білків (локуси TF, ALB) і ферменту (локус EST) крові коропів за використання вертикального поліакриламідного електрофорезу, що дає можливість визначити гетерогенність популяцій українських лускатих і рамчастих коропів, не допускати зниження рівня виживання та спрямовувати селекційно-племінну роботу. Передбачені заявленим способом технологічні нововведення в процесі визначення рівня гетерозиготності в українських лускатої і рамчастої порід коропа в Україні застосовано вперше. Вони суттєво прискорюють селекційний процес у коропівництві та забезпечують підвищення рівня виживання та збереження найбільш життєздатного племінного матеріалу українських порід коропа. Даний спосіб дає можливість визначити гетерогенність популяцій українських лускатих і рамчастих коропів та спрямовувати селекційно-племінну роботу. Запропонований спосіб відрізняється від відомих прототипів за низкою важливих організаційно-технологічних ознак, зокрема таких, як видоспецифічність об'єктів досліджень (лускаті і рамчасті коропи), власна модифікація методики проведення електрофоретичного розділення білків та ферменту крові, специфіка генотипування алельних варіантів локусів, інший кількісний склад генетико-біохімічних систем. 1 UA 86929 U 5 10 15 Особливого значення запропонований спосіб може набувати в процесі удосконалення племінної роботи та визначення рівня гетерозиготності із включенням у дослідження більшої кількості генетичних маркерів. Спосіб здійснюється наступним чином. В умовах господарств проводили відбір зразків крові з хвостової вени лускатих і рамчастих коропів у пластикові пробірки типу Eppendorf з розчином гепарину (25 МО на 1 мл крові). В лабораторних умовах центрифугували гепаринізовану кров при 3 тис. об./хв. протягом 10 хв. і відбирали плазму в окремі пробірки. Зразки плазми зберігали при -20 °C. Проводили електрофоретичне розділення білків за використання вертикального поліакриламідного електрофорезу в 9 % гелі. Після закінчення часу розгонки на одній гелевій пластині методом гістохімічного фарбування виявляли електрофоретичні варіанти ферментного локусу EST та білкових спектрів TF і ALB, які фіксували цифровою камерою. Проводили генотипування електрофоретичних зон, підраховували кількість гетерозиготних особин за кожним локусом, розраховували частоту алельних варіантів локусів TF, ALB, EST. Частоту алеля визначали згідно з формулою: 2d  h , 2n де p - частота алеля, d - кількість гомозиготних генотипів, h - кількість гетерозиготних генотипів, n - кількість особин у вибірці. p 20 Розраховується рівень очікуваної і фактичної гетерозиготності за кожним локусом, а також рівень середньої гетерозиготності за формулами: Рівень фактичної гетерозиготності для кожного типу маркерів обчислювали за формулою: Hobs  N0 / n , де N0 - кількість гетерозигот, n - кількість особин у вибірці. Рівень очікуваної гетерозиготності для кожного типу маркерів обчислювали за формулою: n 25 Hexp  1  q 2 1 , i 1 30 35 де qi - частота і-го алеля, n - кількість алелів у локусі. Ефективність і достатня виробнича придатність заявленого способу підтверджені прикладом його конкретного практичного використання. ПРИКЛАД. Заявлений спосіб визначення рівня гетерозиготності у коропів українських лускатої і рамчастої порід перевірено в умовах повносистемного ставового господарства ДП СГЦР "Поділля", розташованого в с. Меджибіж Летичівського району Хмельницької області. Проведено аналіз генетичної структури коропів українських лускатої і рамчастої порід за генетико-біохімічними системами: трансферин (TF), альбумін (ALB), естераза (EST, К.Ф.3.1.1.1). Для дослідження генетичної структури було відібрано кров у особин коропів з ремонтноматочного стада (по 75 особин лускатих і рамчастих). Проведено електрофоретичне розділення білків і ферменту плазми крові за використання вертикального поліакриламідного електрофорезу в 9 %-му гелі з наступним гістохімічним фарбуванням і генотипуванням алелів досліджуваних локусів. Виконаний розрахунок алельних частот подано у таблиці 1. Таблиця 1 Частота алелів генетико-біохімічних систем у коропів українських порід Локуси TFA В C1, C2 D ALB A В ESTV S Український лускатий короп 0,053 0,073 0,560 0,240 0,073 0,435 0,565 0,546 0,454 40 2 Український рамчастий короп 0,067 0,107 0,673 0,120 0,033 0,490 0,510 0,507 0,493 UA 86929 U 5 Проведено розрахунок рівня гетерозиготності генетико-біохімічних маркерів у лускатих і рамчастих коропів. Рівень гетерозиготності, який виявили, є вищим від очікуваного у обох порід коропа за локусом ALB (табл. 2). Відмічається перевага фактичного рівня середньої гетерозиготності за досліджуваними локусами: в української лускатої породи коропа він становив 0,635 проти очікуваного 0,538; в української рамчастої породи фактичний рівень гетерозиготності становив 0,609 проти очікуваного 0,509 (табл. 2). Таблиця 2 Рівень гетерозиготності за генетико-біохімічними системами в українських порід коропа Локус Н TF Hobs Hexp 0,600 0,619 Hobs Hехр 0,427 0,519 EST ALB Українська луската порода 0,539 0,766 0,499 0,495 Українська рамчаста порода 0,693 0,706 0,503 0,505 Hсередня 0,635 0,538 0,609 0,509 Примітка: Нехр - очікувана гетерозиготність, Hobs- фактична гетерозиготність 10 15 20 25 Одержані результати свідчать про відносно стабільний гетерозиготний стан досліджуваних популяцій (українська луската порода - 63,5 %, українська рамчаста порода - 60,9 %). Отже, заявлений нами спосіб дозволяє отримати об'єктивні результати та використовувати їх в науковій і практичній роботі, орієнтованій на удосконалення селекційно-племінної роботи у коропівництві. Джерела інформації: 1. Організація селекційно-племінної роботи в рибництві / [Гринжевський М. В., Шерман І. М., Грициняк І. І. та ін.]; під ред. М. В. Гринжевського, І. М. Шермана. - К.: "Рибка моя", 2006. - 352 с.). 2. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. - М.: ИКЦ "Академкнига", 2003.-429 с. 3. Грициняк І. І. Актуальні завдання генетичних досліджень у рибному господарстві / І. І. Грициняк, С. І. Тарасюк // Оптимальне використання, збереження і відтворення водних живих ресурсів - нагальні завдання товаровиробників рибопродукції та наукових установ рибної галузі: матеріали науково-практичного семінару, 12 червня 2009 р. під час виставки "FishExpo-2009". К.: НТУУ "КІП", 2010. - С. 96-108. 4. Глазко В. И. Генетика изоферментов животных и растений / В. И. Глазко, И. А. Созинов. К.: Урожай, 1993. - 528. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 40 Спосіб визначення рівня гетерозиготності в українських лускатої і рамчастої порід коропа, що включає відбір біологічного матеріалу, його генетико-біохімічне дослідження та обчислення, який відрізняється тим, що для дослідження використовують кров із хвостової вени українських лускатої і рамчастої порід коропа, після центрифугування якої проводять електрофоретичне розділення білків та ферменту за використання вертикального поліакриламідного електрофорезу в 9 %-му гелі, після гістохімічного фарбування одночасно на одній гелевій пластині виявляють електрофоретичні варіанти локусу EST і білкових спектрів TF і ALB та фіксують їх цифровою камерою, далі після генотипування електрофоретичних зон підраховують кількість гетерозиготних особин за кожним локусом та розраховують частоту алельних варіантів локусів TF, ALB, EST, причому використовують наступні формули: визначення частоти алеля: 2d  h , 2n де p - частота алеля, d - кількість гомозиготних генотипів, h - кількість гетерозиготних генотипів, n - кількість особин у вибірці; p 45 визначення фактичної гетерозиготності для кожного типу маркерів: 3 UA 86929 U Hobs  N0 / n , де N 0 - кількість гетерозигот, n - кількість особин у вибірці; визначення очікуваної гетерозиготності для кожного типу маркерів: n Hexp  1  q 2 1 , i 1 5 де qi - частота і-го алеля, n - кількість алелів у локусі. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4