Cпociб oдepжaння bitamih d3-е білкового комплексу та отриманий цим способом лікувально-профілактичний вітамінний препарат

1. Спосіб одержання вітамін D3-E білкового комплексу, що передбачає попереднє очищення казеїну шляхом його розчинення в лузі та осадження оцтовою кислотою, змішування вітамін D3вмістного компонента з вітаміном Е та наступним розчиненням одержаної суміші в етанолі, розчинення попередньо очищеного казеїну в лузі, змішування обох розчинів і осадження цільового продукту оцтовою кислотою з наступним виділенням вітамін D3-Е білкового комплексу, який відрізняється тим, що для реструктуризації амінокислотного та ліпідного складу казеїну після попереднього очищення проводять його фінішне очищення, для чого розчин попередньо очищеного казеїну в лузі пропускають через мембранний фільтр. 2. Спосіб одержання вітамін D3-Е білкового комплексу за п. 1, який відрізняється тим, що як мембранний фільтр використовують мікрофільтраційні або ультрафільтраційні мембрани з розміром пор 0,05-0,5 мкм. 3. Спосіб одержання вітамін D3-Е білкового комплексу за пп. 1-2, який відрізняється тим, що як 2 (19) 1 3 Винахід відноситься до хіміко-фармацевтичної промисловості, а саме, до виробництва жиророзчинних вітамінних препаратів, зокрема до способу отримання субстанцій та готових форм вітамінів D3 та Е. Світові вітамінологи вважають, що на даний час не існує іншої речовини для запобігання різних захворювань, яка б мала такий потужний вплив, як вітамін D3, що обґрунтовується його важливою протекторною дією щодо виникнення широкого кола захворювань в різні періоди життя [1]. Японські дослідники вивчали комплекси жиророзчинних вітамінів з альбуміном й показали високу стабільність (у 10-12 разів вищу) цих вітамінів навіть при дії сильних окисників. Білкові комплекси змінюють гідрофобність цих вітамінів, але не їх хімічну структуру. Білковий комплекс вітаміну D3 це подвійний захист вітаміну D3 від його окислювання в препараті, а також від негативної дії детергентів шлунково-кишкового тракту на вітамін, внаслідок чого підвищується ступінь забезпеченості організму його активними метаболітами і, як наслідок, зростає його профілактична та лікувальна ефективність. Відомий лабораторний спосіб одержання комплексу на основі жиророзчинних вітамінів і білка, де казеїн розчиняють у лузі, а вітаміни (наприклад, D2, D3, A, E) - в органічному розчиннику, в який попередньо вводять крижану оцтову кислоту. Після змішування отриманих розчинів осад, що випав, який являє собою вітамін-білковий комплекс, центрифугують, сушать та подрібнюють. Отримані таким чином комплекси містять до 2% вітамінів D2 і D3, до 6% вітаміну А та до 8% вітаміну Е [2]. Відомий також виробничий спосіб одержання вітамін D3-білкового препарату "Відеїн" для сільського господарства, де розчинений у лужному розчині казеїн змішують зі спиртовим концентратом вітаміну D3 [3]. Отриманий комплекс осаджують оцтовою кислотою, фільтрують, подрібнюють і сушать. Вихід вітаміну D3 становить 60-70%, активність 200000ME на 1г зберігається протягом 0,5 року. Однак, відомий спосіб має ряд недоліків: у якості активної речовини використовують спиртовий концентрат вітаміну D3, який містить близько 12% домішок у вигляді проміжних продуктів одержання вітаміну D 3, наприклад, 7дегідрохолестерол, люмістерол і ряд продуктів окиснення. Препарат, одержаний у такий спосіб, використовувався тільки в якості кормової добавки для сільського господарства та мав недостатньо високу профілактичну й лікувальну ефективність тому його промисловий випуск був припинений. Відомий також спосіб одержання вітамін D3білкового комплексу «ВІДЕЇН», вибраний за прототип, який передбачає попереднє очищення казеїну шляхом його розчинення в лузі та осадження оцтовою кислотою, грануляцію та сушіння, змішування вітамін О3-вмістного компонента з вітаміном Е у співвідношенні 1:1 та наступним розчиненням 91805 4 одержаної суміші в етанолі, розчинення попередньо очищеного казеїну в лузі, змішування обох розчинів і осадження цільового продукту оцтовою кислотою з наступним виділенням вітамін D3-E білкового комплексу [4]. У прототипі вітамін Е, який у співвідношенні 1:1 з вітаміном D3 використовується в препараті у якості антиоксиданту, не виконує функцію регулятора обміну вітаміну D3 в організмі, оскільки його кількість значно нижча за фізіологічну через низьку ємність зв'язування недоочищеного казеїну. Відомий спосіб очищення казеїну не забезпечує бажану ємність зв'язування вітамінів D3, E у складі комплексу, міцність зв'язків з амінокислотами та, як наслідок, недостатній термін зберігання препаратів, отриманих за цією технологією. Фільтрація розчину казеїну через бавовняну тканину не призводить до очищення цільового продукту від непатогенних бактерій, дріжджових грибків, що є необхідною умовою для фармацевтичних препаратів. В основу винаходу поставлено завдання вдосконалити промисловий спосіб отримання вітамін D3-E білкового комплексу та готової форми препарату, забезпечити підвищення ємності зв'язування вітамінів D3 та Е з казеїном та міцність цих зв'язків, збільшити термін зберігання вітамін D3-E вмістних препаратів у 2 рази, а також отримати бактеріально очищену субстанцію. Задача, яка поставлена, вирішується тим, що у способі одержання вітамін D3-E білкового комплексу, що передбачає попереднє очищення казеїну шляхом його розчинення в лузі та осадження оцтовою кислотою, змішування вітамін В3вмістного компонента з вітаміном Е та наступним розчиненням одержаної суміші в етанолі, розчинення попередньо очищеного казеїну в лузі, змішування обох розчинів і осадження цільового продукту оцтовою кислотою з наступним виділенням вітамін D3-E білкового комплексу, відповідно до пропонованого винаходу після попереднього його очищення Для реструктуризації амінокислотного та ліпідного складу казеїну проводять фінішне його очищення, для чого розчин попередньо очищеного казеїну в лузі пропускають через мембранний фільтр. У найбільш прийнятному виробничому технологічному циклі як мембранний фільтр використовують мікро- або ультрафільтраційні мембрани з розміром пор 0,05-0,4мкм. При цьому загальний час знаходження казеїну в лузі не повинен перевищувати трьох годин. Як вітамін D3вмістний компонент можуть використовувати відехол або кристалічний вітамін D3 або його активні метаболіти. Введення у технологічний цикл операції фінішного очищення казеїну шляхом пропускання білкового розчину через мембранний фільтр надають можливість не тільки звільнитися від механічних домішок, денатурованого білка, але й як було підтверджено дослідами змінюють амінокислотний склад білка (Табл. 1). 5 91805 Табл. 1. Амінокислотний склад казеїну до та після фінішного очищення Амінокислоти ЛІЗИН ГІСТИДИН АРГІНІН АСПАРАГІН ТРЕОНІН СЕРИН ГЛУТАМІН ПРОЛІН ГЛІЦИН АЛАНІН ЦИСТЕІН ВАЛІН МЕТИОНІН ІЗОЛЕЙЦИН ЛЕЙЦИН ТИРОЗІН ФЕНІЛАЛАНІН До очищення, Після очищенмг % ня, мг % 6,53 6,45 2,21 2,19 2,67 3,06 7,08 7,09 4,27 4,45 5,56 5,44 23,56 23,45 10,37 10,79 1,72 1,75 2,75 2,77 0,23 0,11 4,49 4,62 1,64 1,60 3,96 3,75 13,49 13,70 4,91 5,08 4,57 4,59 Використання такого способу очищення білка призводить до зниження вмісту цистеїну на 50%, присутність якого, як відомо, стабілізує третичну структуру казеїну внаслідок утворення ковалентних зв'язків, що є однією з причин зменшення доступності центрів зв'язування щодо вітамінів D3, Е або інших жиророзчинних вітамінів. Такий спосіб очищення білка знижує вміст білковозв'язаних ліпідів: загальних ліпідів на 50%, фосфоліпідів на 60%, загального холестеролу на 70%, які конкурують з жиророзчинними вітамінами за центри зв'язування з білком. Ці два вищеназваних фактора підвищують ємність зв'язування вітамінів D3 й Е, внаслідок чого відсоток зв'язування вітаміну D3 дорівнює 100%, зростає можливість підвищення кількості введення вітаміну Е у білковий комплекс та терміну зберігання активних компонентів у препараті при кімнатній температурі не вище 22°С з 2,6 років практично до 5-й років ( див. Табл. 2), у той час, як термін зберігання діючих інгредієнтів за способом, визначеним у прототипі складає 2,5 роки, після чого спостерігається помітне зниження вмісту холекальциферолу та, як наслідок, його фізіологічної активності. Табл. 2 Вміст D3 (MO) Термін % зниженв одиниці зберігання ня вмісту готової про(роки) D3 дукції 0 2000±35 100% 1 2050±45 100% 2 2005±25 100% 3 2000±30 100% 4 2050±40 100% 5 1800±40 90% Вміст вітаміну Е (МО) в одиниці готової продукції 2,46±0,05 2,50±0,03 2,40±0,01 2,39±0,02 2,49±0,02 2,45±0,03 6 У найбільш прийнятному варіанті використовують у якості мембранних фільтрів ультрафільтраційні або мікрофільтраційні мембрани з розміром пор 0,05-0,4мкм, наприклад, трекові мембрани з порами діаметром 0,1мкм та щільністю 300млн. пор на 1см2 або спеціально розроблені для фармацевтичної промисловості та біотехнології фільтри PolyPro XL виробництва фірми CUNO FILTRATION S.A.S., Франція, з розміром пор 0,2мкм. При цьому забезпечується також очищення цільового продукту від непатогенних бактерій та дріжджових грибків (розмір бактерій, як відомо, знаходиться у межах 0,5-10мкм), що відповідає міжнародним вимогам (див. Табл. 3). Табл. 3 Препарат Казеїн після фільтрації через бавовняну тканину Казеїн після фільтрації через мембрану 0,4мкм. Казеїн після фільтрації через мембрану 0,2мкм. Непатогенні Дріжджові бактерії грибки 3700 60 200 10 40 0 Для підвищення ємності зв'язування експериментально встановлено що загальний (від попереднього очищення казеїну до утворення комплексу) час знаходження білка у розчині NaOH не повинен перевищувати 3-х годин. Зростання часу знаходження білка у лужному розчині знижує ємність Зв'язування більш ніж на 20%. Загальна схема пропонованого способу включає три основні етапи: - попереднє очищення казеїну; - фінішне очищення казеїну; - одержання вітамін D3-E білкового комплексу. І. Попереднє очищення казеїну. Реактор з мішалкою й нагрівачем заповнюють дистильованою водою при 40°С і додають лугу (гідроокис натрію) до кінцевої концентрації 0,2±0,05%, потім уводять казеїн до концентрації 33,5%, перемішують до повного розчинення протягом 20-30хв. при t 40°С. Фільтрують через два шари бавовняної тканини. Осаджують казеїн у реакторі при працюючій мішалці протягом 1-2хв. крижаною оцтовою кислотою до досягнення Ph 4,5-4,6. Після відстоювання протягом 10хв. осад фільтрують через бавовняну тканину, промивають 2-3 рази дистильованою водою. Отриманий осад зневоднюють, пропускають через сито 1,0-2,0мм і сушать у вакуум-сушильній шафі при температурі 45±1°С протягом 4-х годин. Вихід казеїну становить 80-40%. ІІ. Фінішне очищення казеїну. У реакторі з мішалкою та нагрівачем попередньо очищений казеїн розчиняють у гідроокисі натрію до кінцевої концентрації 3-3,5%, перемішують до повного розчинення протягом 20-30хв. при t 40°С. (Технологічні операції після стадії осадження казеїну на етапі попереднього очищення до початку фінішного фільтрування для безперервного 7 технологічного циклу виробництва можуть бути пропущені). Далі здійснюють фінішне фільтрування через промисловий мембранний фільтр з розміром пор 0,05-0,4мкм. Відфільтрований розчин придатний для одержання вітамінно-білкового комплексу. III. Одержання вітамін D3-E білкового комплексу. Відехол (комплекс вітаміну D3 з холестерином, що містить 50% холекальциферолу) або кристалічний вітамін D3 беруть із розрахунку 0,001250,0025кг вітаміну D3 на 1кг казеїну. Альфатокоферол ацетат (вітамін Е) беруть у кількості 0,005-0,1кг. на 1кг казеїну. Вітаміни розчиняють в етанолі та додають розрахункову кількість оцтової кислоти (до Ph 4,5-4,6). Приготовлену вітамінну суміш уводять тонким струменем у реактор при працюючій мішалці і перемішують із очищеним казеїном протягом 1-2хв. при температурі не вище 45°С. Суміш відстоюють, фільтрують. Осад промивають дистильованою водою до нейтрального значення Ph промивної води, зневоднюють віджиманням під вакуумом або центрифугуванням. Отриманий таким чином комплекс гранулюють через сито з діаметром отворів 1-2мм і сушать при температурі не вище 45°С при перемішуванні. Висушений препарат подрібнюють, просівають через сито з діаметром отворів 0,3мм. З рівня техніки відомі лікувальнопрофілактичні вітамін D3-E препарати. Відомий, наприклад, вітамінно-мінеральний комплекс [5], друга препаративна форма якого включає вітаміни A, D3, Е, С, лікопін, бета-каротин та мінерали. Активні інгредієнти даного препарату мають невеликий термін зберігання та мають негативний вплив на фізіологічну дію кожного окремо. Наприклад, вітамін А інгібує обмін вітаміну D3 в організмі та, як наслідок, знижує його ефективність. Крім того, добова доза вітаміну D3 (120MO) у цьому препараті значно нижча рекомендованої на даний час (1000МО для дітей до 1-го року і 2000МО для дітей більш старшого віку та дорослих). Найбільш близьким технічним рішенням до винаходу, що заявляється, за своєю суттю та сукупністю суттєвих ознак є лікувальнопрофілактичний вітамінний препарат «Відеїн», склад таблеткової форми якого описаний у патенті України [5]. Відомий препарат містить вітаміни D3 та Е у співвідношенні 1:1 у комплексі з казеїном та наповнювач (полівінілпіролідон, кальцію стеарат, цукор). У прототипі вітамін Е, який зв'язаний у білковому комплексі з вітаміном D3 у співвідношенні 1:1, використовується в препараті у якості антиоксиданту, а не для його фізіологічної дії, тобто він не призначений для виконування функції обміну вітаміну D3 в організмі, оскільки його кількість значно нижча за фізіологічну. Недоліком відомого препарату є також недостатня ємність зв'язування вітамінів D3 та Е з казеїном та міцність цих зв'язків, що 91805 8 впливає на ефективність його лікувальної дії, а також і термін зберігання активних компонентів у препараті при кімнатній температурі та, як наслідок, низька ефективність лікувальної дії препарату. В основу винаходу поставлено завдання отримання ефективної форми препарату вітамін D3-E білкового комплексу з розширеним допуском концентрації вітаміну D3, вітаміну Е та додаткового введення інших форм наповнювачів та розріджувачів з метою розширення кола використання препарату та підвищення його профілактичного та лікувального ефекту. Завдання даного винаходу полягає в створенні комбінованого складу, що регулює метаболічні процеси, у вигляді твердої лікарської форми, яка зберігає стабільність протягом досить тривалого періоду (не менш 4-х років) і в якого відсутні побічні ефекти, обумовлені продуктами деструкції вітаміну D. Поставлене завдання вирішується тим, що у лікувально-профілактичному вітамінному препараті, що містить вітамін D3-E білковий комплекс, відповідно до пропонованого винаходу комплекс одержаний способом за пп. 1-2 при наступному співвідношенні компонентів (мас. %): вітамін D3 0,025-0,0625; вітамін Е - 0,05-2,0; казеїн 17-20; наповнювач - решта. Завдання вирішується також і тим, що у якості наповнювача препарат містить мікрокристалічну целюлозу та лактозу, глюкозу та/або цукор, універсальне зв'язуюче (для гранулювання наповнювача), переважно полівінілпіролідон, та змащувальну речовину, наприклад, стеарат магнію, або кальцію, або інші фармацевтично допустимі компоненти, наприклад, розріджувач та/або ароматизатор. Задача вирішується також і тим, що препарат виконаний у вигляді твердої разової форми, наприклад, капсули, таблетки або сипучого порошку, причому таблетка може мати плівкове покриття. Зазначені межі співвідношень активних інгредієнтів є найбільш прийнятні та не викликають токсичних проявів. Вихід за межі загального обсягу патентних домагань значно знижують ефективність препарату. Відомо, що ефективність лікувальнопрофілактичних препаратів вітаміну D3 визначається по рівню у сироватці крові 25OHD3 - першого метаболіту вітаміну D3, вміст якого для здорової людини повинен бути в межах 40-65нг/мл. Концентрація 25OHD3 залежить, по-перше, від того, який вітамін D використовується. Відомо, що при введенні рівної кількості ергокальциферолу (D2) і холекальциферолу (D3), вміст 25OHD3 у 2 рази вищий у другому випадку (Cannel M.D., 2008; NIH/ODS conference, 2007). По-друге, це залежить від того, в якій формі вводиться вітамін D3. Проведені дослідження свідчать, що найбільший рівень 25OHD3 відмічається при введенні вітаміну D3 у вигляді білкового комплексу (Табл. 4). 9 91805 10 Табл. 4 Вміст 25OHD3 у сироватці крові при введенні однакової кількості вітаміну D3 без та з вітаміном Е, М m, n=6 Вміст 25OHD3, нмоль л1 без вітаміну Е з вітаміном Е Досліджувані групи Вітамін D3: у розчині олії у формі CWS вітамін D3-E білковий комплекс 40,1±1,2 53,9±2,1 83,0±1,0 Позитивним чинником підвищення фізіологічної ефективності препарату є введення фізіологічних концентрацій вітаміну Е (табл. 4). Проведені експериментальні дослідження свідчать, що вітамін Е у комплексі з вітаміном D3 підвищує вміст 25OHD3 шляхом активації вітамін D3 25гідроксилаз, які регулюють перетворення вітаміну D3 на його перший активний метаболіт (Табл. 5). Табл. 5 Вплив різних співвідношень вітамінів D3, E на активність вітамін D3 25-гідроксилазних ферментів у гепатоцитах, М m, n=6 Досліджувані групи Вітамін D3 Вітамін D3 + 0,726 MO E Вітамін D3+1,452 MO E Вітамін D3 + 7,26 MO E Активність, % 100,0±1,0 240,0±2,0 292,0±3,0 110,0±1,8 З таблиці видно, що вітамін Е у дозах в 10 разів вище за фізіологічну негативно впливає на обмін вітаміну D3 в організмі. Тобто фізіологічні межі доз вітаміну Е активізують, а більш високі дози інгібують біологічну роль вітаміну D3 у регуляції мінерального обміну в різних тканинах та впливу на стан кісткової тканини. Дані біохімічних досліджень підтверджено результатами остеометрії і мікроскопії кісткової тканини. Визначено, що введення до складу препарату вітаміну Е суттєво поліпшує структурно 46,0±09 72,1±1,8 113,0±1,7 функціональний стан кісткової тканини, структуру та функцію епіфізарного хряща. Кількісні значення інгредієнтів, що входять до складу препарату складають (на 200мг разової дози препарату): вітамін D3 - 1000-5000 MO; вітамін Е - 0,1-4мг. Вітамін D3 може бути застосований також в інших фармацевтичних формах (наприклад, відехол - комплекс з холестеролом, кристалічна форма вітаміну D3, або у формі активних метаболітів вітаміну D3). Вітамін Е також може бути використаний у комплексі з білком або інших фармацевтичних формах. Препарат може містити відомі для спеціалістів фармацевтично допустимі наповнювачі, наприклад, глюкозу, целюлозу, цукор тощо. Препарат може також додатково містити фармацевтично допустимі розріджувачі або їх комбінації, ароматизатор (смаковий агент). Лікувальнопрофілактичний вітамінний препарат може бути виконаний у вигляді твердої разової форми, наприклад, капсули, таблетки або сипучого порошку, причому для захисту інгредієнтів композиції від впливу вологості, кисню, світла або небажаного зовнішнього вигляду таблетка може мати плівкове покриття. Термін «фармацевтично допустимі» відноситься до компонентів препарату, що придатні для введення в організм людини та не мають побічні ефекти, такі як токсичність, алергічна реакція тощо. Склад інгредієнтів лікувально-профілактичного вітамінного препарату з розрахунку на таблетку вагою 0,2г. наведений у Табл. 6: Табл. 6 № п/п 1 2 3 4 5 6 7 Мінімальне зна- Оптимальне зна- Максимальне значення чення чення 1000 МО 2000 МО 5000 МО Білковий Вітамін D3 комплекс Вітамін Е, г. 0,0001 0,002 0,004 (0,04г.) Очищений казеїн, г. 0,039875 0,03795 0,035975 Лактоза, г. 0,006 Целюлоза мікрокристалічна, г. 0,1122 Наповнювач решта решта Магнію стеарат, г. 0,0018 Полівінілпіролідон,г 0,04 Назва компонентів Кращий варіант складу містить вітамін D3-E білковий комплекс, полівінілпіролідон, стеарат магнію, целюлозу мікрокристалічну, лактозу при наступному співвідношенні компонентів з розрахунку на разову дозу таблетки масою 0,2г: вітамін D3 0,000050, вітамін Е - 0,002, казеїн - 0,038, полівіні лпіролідон - 0,004, стеарат магнію - 0,0018, целюлоза мікрокристалічна - 0,1122, лактоза - 0,006. Інгредієнти та їх кількісні значення, що наведені вище, повинні розглядатися, як ілюстративні та не повинні обмежувати обсяг заявлених прав. 11 91805 Вітамінний препарат готують (див. схему Фіг.1) викладеним нижче способом. Для одержання грануляту наповнювача суміш компонентів (целюлоза мікрокристалічна, лактоза, ароматизатори або інші фармацевтично допустимі компоненти) при постійному перемішуванні зволожують розчином полівінілпіролідону низькомолекулярним медичним. Отриману зволожену масу гранулюють через сито розміром 2,0-3,0мм та висушують на повітрі протягом 15-16 годин або у вакуумній сушильній шафі при температурі 40-50°С протягом 2-3 годин до залишкової вологи не більше 10%. Далі у змішувач завантажують гранулят наповнювача, вітамін D3-E білковий комплекс, змащувальну речовину і перемішують до одержання однорідної маси протягом 15-20хв., яку розфасовують у желатинові капсули або таблетують. Таблетування здійснюють на ро Комп’ютерна верстка М. Ломалова 12 торному таблетковому машинопресі РТМ-12. Одержані таблетки мають плоско-циліндричну форму діаметром 8±0,2мм і середньою масою 0,24±0,01г. Готові таблетки препарату розфасовують у контурні коміркові впакування по 10шт. Джерела інформації: 1. NIH/ODS conference: vitamin D and Health in the 21-st century, Sept. 5-6, 2007. 2. AC CPCP №104990, кл. А61K 38/01, A61K 31/59, публ. 01.01.1957p. 3. Промышленный регламент №64-04-34-87, КПХО «Дарница», 1981p. 4. Патент України №828 на винахід, кл. А61K 31/59, публ. 15.12.1993р. (прототип). 5. Патент Російської Федерації №2275192, кл. А61K 31/593, А61K 31/355, публ. 27.06.2006р. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601