Cпociб oдepжaння bitamih d3-е білкового комплексу

1. Спосіб одержання вітамін D3-E білкового комплексу, що передбачає попереднє очищення казеїну шляхом його розчинення в лузі та осадження оцтовою кислотою, змішування вітамін D3вмісного компонента з вітаміном Е та наступним розчиненням одержаної суміші в етанолі, розчи 3 окиснення. Препарат, одержаний у такий спосіб, використовувався тільки в якості кормової добавки для сільського господарства та мав недостатньо високу профілактичну й лікувальну ефективність тому його промисловий випуск був припинений. Відомий також спосіб одержання вітамін Б3білкового комплексу "ВІДЕЇН", вибраний за прототип, який передбачає попереднє очищення казеїну шляхом його розчинення в лузі та осадження оцтовою кислотою, грануляцію та сушіння, змішування вітамін D3-вмістного компонента з вітаміном Е у співвідношенні 1:1 та наступним розчиненням одержаної суміші в етанолі, розчинення попередньо очищеного казеїну в лузі, змішування обох розчинів і осадження цільового продукту оцтовою кислотою з наступним виділенням вітамін D3-E білкового комплексу [4]. У прототипі вітамін Е, який у співвідношенні 1:1 з вітаміном D3 використовується в препараті у якості антиоксиданту, не виконує функцію регулятора обміну вітаміну D3 в організмі, оскільки його кількість значно нижча за фізіологічну через низьку ємність зв'язування недоочищеного казеїну. Відомий спосіб очищення казеїну не забезпечує бажану ємність зв'язування вітамінів D3, E у складі комплексу, міцність зв'язків з амінокислотами та, як наслідок, недостатній термін зберігання препаратів, отриманих за цією технологією. Фільтрація розчину казеїну через бавовняну тканину не призводить до очищення цільового продукту від непатогенних бактерій, дріжджових грибків, що є необхідною умовою для фармацевтичних препаратів. В основу корисної моделі поставлене завдання вдосконалити промисловий спосіб отримання вітамін D3-E білкового комплексу та готової форми препарату, забезпечити підвищення ємності зв'язування вітамінів D3 та Е з казеїном та міцність цих зв'язків, збільшити термін зберігання вітамін D3-E вмістних препаратів у 2 рази, а також отримати бактеріально-очищену субстанцію. Задача, яка поставлена, вирішується тим, що у способі одержання вітамін D3-E білкового комплексу, що передбачає попереднє очищення казеїну шляхом його розчинення в лузі та осадження оцтовою кислотою, змішування вітамін D3вмістного компонента з вітаміном Е та наступним розчиненням одержаної суміші в етанолі, розчинення попередньо очищеного казеїну в лузі, змішування обох розчинів і осадження цільового продукту оцтовою кислотою з наступним виділенням вітамін D3-E білкового комплексу, відповідно до пропонованого винаходу після попереднього його очищення проводять фінішне очищення казеїну, для чого розчин попередньо очищеного казеїну в лузі пропускають через мембранний фільтр. У найбільш прийнятному виробничому технологічному циклі як мембранний фільтр використовують мікро- або ультрафільтраційні мембрани з розміром пор 0,05-0,4мкм. При цьому загальний час знаходження казеїну в лузі не повинен перевищувати трьох годин. Як вітамін D3-вмістний компонент можуть використовувати відехол або кристалічний вітамін D3 або його активні метаболіти. Введення у технологічний цикл операції фінішного очищення казеїну шляхом пропускання біл 47900 4 кового розчину через мембранний фільтр надають можливість не тільки звільнитися від механічних домішок, денатурованого білка, але й як було підтверджено дослідами змінюють амінокислотний склад білка (Табл.1). Таблиця 1 Амінокислотний склад казеїну до та після фінішного очищення Амінокислоти ЛІЗИН ГІСТИДИН АРГІНІН АСПАРАГІН ТРЕОНІН СЕРИН ГЛУТАМІН ПРОЛІН ГЛІЦИН АЛАНІН ЦИСТЕЇН ВАЛІН МЕТИОНІН ІЗОЛЕЙЦИН ЛЕЙЦИН ТИРОЗІН ФЕНІЛАЛАНІН До очищення, Після очищення, мг % мг % 6,53 6,45 2,21 2,19 2,67 3,06 7,08 7,09 4,27 4,45 5,56 5,44 23,56 23,45 10,37 10,79 1,72 1,75 2,75 2,77 0,23 0,11 4,49 4,62 1,64 1,60 3,96 3,75 13,49 13,70 4,91 5,08 4,57 4,59 Використання такого способу очищення білка призводить до зниження вмісту цистеїну на 50%, присутність якого, як відомо, стабілізує третичну структуру казеїну внаслідок утворення ковалентних зв'язків, що є однією з причин зменшення доступності центрів зв'язування щодо вітамінів D3, Е або інших жиророзчинних вітамінів. Такий спосіб очищення білка знижує вміст білковозв'язаних ліпідів: загальних ліпідів на 50%, фосфоліпідів на 60%, загального холестеролу на 70%, які конкурують з жиророзчинними вітамінами за центри зв'язування з білком. Ці два вищеназваних фактора підвищують ємність зв'язування вітамінів D3 й Е, внаслідок чого відсоток зв'язування вітаміну D3 дорівнює 100%, зростає можливість підвищення кількості введення вітаміну Е у білковий комплекс та терміну зберігання активних компонентів у препараті при кімнатній температурі не вище 22°С з 2,6 років практично до 5-й років ( див. Табл.2), у той час, як термін зберігання діючих інгредієнтів за способом, визначеним у прототипі, складає 2,5 роки, після чого спостерігається помітне зниження вмісту холекальциферолу та, як наслідок, його фізіологічної активності. Таблиця 2 Вміст D3 Вміст вітаміну Термін % знижен(МО) в одиЕ (МО) в одизберігання ня вмісту ниці готової ниці готової (роки) D3 продукції продукції 0 2000±35 100% 2,46±0,05 1 2050±45 100% 2,50±0,03 5 2 3 4 5 47900 2005±25 2000±30 2050±40 1800±40 100% 100% 100% 90% 2,40±0,01 2,39±0,02 2,49±0,02 2,45±0,03 У найбільш прийнятному варіанті використовують у якості мембранних фільтрів ультрафільтраційні або мікрофільтраційні мембрани з розміром пор 0,05-0,4мкм, наприклад, трекові мембрани з порами діаметром 0,1мкм та щільністю 300 млн. пор на 1см або спеціально розроблені для фармацевтичної промисловості та біотехнології фільтри РоlуРrо XL виробництва фірми CUNO FILTRATION S.A.S., Франція, з розміром пор 0,2мкм. При цьому забезпечується також очищення цільового продукту від непатогенних бактерій та дріжджових грибків (розмір бактерій, як відомо, знаходиться у межах 0,5-10мкм), що відповідає міжнародним вимогам (див. Табл.3). Таблиця 3 Препарат (казеїн) Казеїн після фільтрації через бавовняну тканину Казеїн після фільтрації через мембрану 0,4мкм. Казеїн після фільтрації через мембрану 0,2мкм. Непатогенні бак- Дріжджові гритерії бки 3700 60 200 10 40 0 Для підвищення ємності зв'язування експериментально встановлено що загальний (від попереднього очищення казеїну до утворення комплексу) час знаходження казеїну у лужному розчині (NaOH) не повинен перевищувати 3-х годин. Зростання часу знаходження білка у лужному розчині знижує ємність зв'язування більш ніж на 20%. Загальна схема пропонованого способу включає три основні етапи: - попереднє очищення казеїну; - фінішне очищення казеїну; - одержання вітамін D3-E білкового комплексу. I. Попереднє очищення казеїну. Реактор з мішалкою й нагрівачем заповнюють дистильованою водою при 40°С и додають лугу (гідроокис натрію) до кінцевої концентрації 0,2±0,05%, потім уводять казеїн до концентрації 33,5%, перемішують до повного розчинення протягом 20-30хв. при t 40°С. Фільтрують через два ша Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 ри бавовняної тканини. Осаджують казеїн у реакторі при працюючій мішалці протягом 1-2 хв. крижаною оцтовою кислотою до досягнення Ph 4,54,6. Після відстоювання протягом 10хв. осад фільтрують через бавовняну тканину, промивають 2-3 рази дистильованою водою. Отриманий осад зневоднюють, пропускають через сито 1,0-2,0мм і сушать у вакуум-сушильній шафі при температурі 45±1°С протягом 4-х годин. Вихід казеїну становить 80-90%. II. Фінішне очищення казеїну. У реакторі з мішалкою та нагрівачем попередньо очищений казеїн розчиняють у гідроокисі натрію до кінцевої концентрації 3-3,5%, перемішують до повного розчинення протягом 20-30хв. при t 40°С. (Технологічні операції після стадії осадження казеїну на етапі попереднього очищення до початку фінішного фільтрування для безперервного технологічного циклу виробництва можуть бути пропущені). Далі здійснюють фінішне фільтрування через промисловий мембранний фільтр з розміром пор 0,05-0,4мкм. Відфільтрований розчин придатний для одержання вітамінно-білкового комплексу. III. Одержання вітамін D3-E білкового комплексу. Відехол (комплекс вітаміну D3 з холестерином, що містить 50% холекаль-циферолу) або кристалічний вітамін D3 беруть із розрахунку 0,001250,0025кг вітаміну D3 на 1кг казеїну. Альфатокоферол ацетат (вітамін Е) беруть у кількості 0,005-0,1кг на 1кг казеїну. Вітаміни розчиняють в етанолі та додають розрахункову кількість оцтової кислоти (до Ph 4,5-4,6). Приготовлену вітамінну суміш уводять тонким струменем у реактор при працюючій мішалці і перемішують із очищеним казеїном протягом 1-2хв при температурі не вище 45°С. Суміш відстоюють, фільтрують. Осад промивають дистильованою водою до нейтрального значення Ph промивної води, зневоднюють віджиманням під вакуумом або центрифугуванням. Отриманий таким чином комплекс гранулюють через сито з діаметром отворів 1-2мм і сушать при температурі не вище 45°С при перемішуванні. Висушений препарат подрібнюють, просівають через сито з діаметром отворів 0,3мм. Джерела інформації: 1. NIH/ODS conference: vitamin D and Health in the 21-st century, Sept. 5-6, 2007. 2. AC CPCP №104990, кл. A61K38/01, A61K31/59, публ. 01.01.1957p. 3. Промышленный регламент №64-04-34-87, КПХО "Дарница", 1981р. 4. Патент України №828 на винахід, кл. А61К31/59, публ. 15.12.1993р. (прототип). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601