Комплексний регулятор росту та розвитку рослин

Комплексний регулятор росту та розвитку рослин на основі екстракту мікроскопічних грибів, що містить комплекс фітогормонів, який відрізняється тим, що як екстракт мікроскопічних грибів він містить спиртовий екстракт міцелію гриба Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38, а також додатково містить саліцилову кислоту, при цьому вміст вказаних компонентів становить: спиртовий екстракт міцелію до одержання гриба Chaetomium cochlioides розведення 9 11 Pallisser ВНИИСХМ №38 1:10 - 1:10 до одержання саліцилова кислота концентрації -5 -5 1х10 - 5х10 М. (19) UA (11) (21) a201002814 (22) 12.03.2010 (24) 10.08.2011 (46) 10.08.2011, Бюл.№ 15, 2011 р. (72) ДРАГОВОЗ ІГОР ВОЛОДИМИРОВИЧ, ЯВОРСЬКА ВІКТОРІЯ КАЗИМИРІВНА, НАДКЕРНИЧНИЙ СТАНІСЛАВ ПЕТРОВИЧ, КОПИЛОВ ЄВГЕНІЙ ПАВЛОВИЧ, НАДКЕРНИЧНА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА, КУРЧІЙ БОГДАН ОЛЕКСІЙОВИЧ, КАМЕНЧУК ОЛЬГА ПЕТРІВНА, ПАДАЛКО СВІТЛАНА ФЕДОРІВНА (73) ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, ІНСТИТУТ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК (56) UA A 68222, 15.07.2004 SU A 1736019, 27.11.1989 Доповнення № 3 до Переліку пестицидів та агрохімікатів, дозволених до використання в Україні, [онлайн] 22.12.1999 [знайдено 14.06.2011] Копилов Є.П. та ін. Вплив Сhaetomium cochliodes palliser 3250 на засвоєння макро- і мікроелементів рослинами сої та пшениці ярої [онлайн] 06.09.2009 [знайдено 14.06.2011] C2 2 95554 1 3 селекцією. При цьому комплексні регулятори росту та розвитку рослин, до складу яких входять продукти, отримані шляхом мікробіологічного синтезу, мають ряд переваг у порівнянні із такими, що отримані хімічними способами. Такі препарати, як правило, містять цілий спектр біологічно активних сполук, зокрема, фітогормонів, в оптимальних співвідношеннях, що дозволяє одержувати досить високий біологічний ефект. Крім того, такі регулятори росту рослин характеризуються м'яким впливом на рослини та є поліфункціональними за спектром фізіологічних ефектів на рослини. Слід враховувати також, що препарати, які створені на основі мікробіологічних продуктів, є більш дешевими за препарати, отримані хімічним шляхом, а також є більш бажаними з екологічної точки зору. Такі комплексні біологічно активні препарати стимулюють енергію проростання та проходження окремих етапів онтогенезу, прискорюють дозрівання плодів та овочів, забезпечують стійкість рослин до шкідників та інших стресових чинників довкілля. Синергетична дія речовин, які входять до складу таких препаратів, дозволяє досягти максимального результату при відносно низьких рівнях вмісту його окремих інгредієнтів. Є відомим препарат Гумісол, що являє собою комплекс гумінових кислот, вітамінів, макроелементів та гормонів ["Доповнення до переліку пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні", - Київ, 2004, С. 125]. Вказаний регулятор росту рослин підвищує врожайність пшениці, інших зернових культур та картоплі, проте його ефективність є недостатньо високою. В Україні широкого застосування набув комплексний регулятор росту Емістим С ["Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні", офіційне видання, 2008 рік, С. 248]. Вказаний регулятор росту використовується для підвищення енергії проростання та польової схожості насіння, зменшення ураження рослин коренеїдом, збільшення урожайності та цукристості коренеплодів. Його виробляють шляхом культивування мікроскопічних грибів-ендофітів з коріння лікарських рослин. Основними складовими препарату є комплекс фізіологічно активних речовин (фітогормонів цитокінінової природи, незначна кількість сполук ауксинового типу, насичених та ненасичених жирних кислот, амінокислот, вуглеводів та мікроелементів). Зазначений регулятор росту є найбільш близьким до запропонованого винаходу та вибраний авторами як прототип. Його недоліками є обмежений спектр і низький рівень фітогормонів, що негативно впливає на ефективність зазначеного регулятора стосовно впливу на фізіологічні процеси рослин. Крім того, різні партії Емістиму С дуже відрізняються за своїм складом, а отже, й за ефективністю дії на рослини [Романюк Н.Д. Фізіологічна активність регуляторів росту Івіну, Емістиму С та Агростимуліну. Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біол. наук, Львів, 1999] Задачею заявленого винаходу є підвищення біологічної ефективності дії регулятора росту та розвитку рослин на основі природної сировини. 95554 4 Вказана задача вирішується за рахунок створення комплексного регулятора росту та розвитку рослин, що включає спиртовий екстракт міцелію гриба Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38 та саліцилову кислоту, при наступному співвідношенні компонентів: спиртовий екстракт міцелію до одержання гриба Chaetomium cochlioides розведення 9 11 Pallisser ВНИИСХМ №38 1:10 -1:10 до одержання саліцилова кислота концентрації -5 -5 1×10 5×10 М. Застосування запропонованої композиції для передпосівної обробки насіння забезпечує значне підвищення урожайності сільськогосподарських культур. Підвищення ефективності впливу на рослини досягається за рахунок синергетичної дії компонентів, що входять до її складу: спиртового екстракту міцелію сапрофітного гриба-антагоніста Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38, що раніше був описаний як продуцент засобу біологічного захисту рослин від фітопатогенних грибів, та саліцилової кислоти. Зазначений штам був отриманий з поверхні листків рослини огірка. Для цього рослини огірків звільняли від ґрунту, промивали у струмені води 23 години та висушували на фільтрувальному папері. Потім їх розрізали на шматочки розміром 2-3 × 5-6 мм та поміщали у чашки Петрі на сусло-агар 3-4° за Балінгом зі стрептоміцином (50-100 мг на 1 л середовища). Чашки інкубували за температури 25-27 °C. Через 2 доби міцелій гриба, що утворився, пересівали на скошений сусло-агар. Штам ідентифікували згідно з визначником Кириленко Т.С. [Кириленко Т.С. Определитель почвенных сумчатых грибов. - К.: Наукова думка, 1978. 264 с.] та депонували у колекції грибів Всесоюзного науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології (зараз Державна наукова установа Всеросійський науково-дослідний інститут сільськогосподарської мікробіології Російської академії сільськогосподарських наук) під номером 38 для одержання препарату проти фітопатогенних грибів. Штам виявив антагоністичні властивості щодо багатьох фітопатогенних грибів, зокрема Acsochyta pisi Lib., Alternaria solani Sorauer, Bipolaris sorokiniana Shoem, Botrytis cinerea Pers., Colletotrichum lind emuthianum (Sacc.et Magn.Br.et cav.), Cercosporella herpotrichides Fron., Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., F. culmorum (Sm) Sacc, F. graminearum swade, F. oxysporum Schlecht. emend. Snyd. et Hans., F. oxysporum var. orthoceras (App et Hans., F.oxysporum var. orthoceras (App.et.Wr., Opholobolus graminis sacc, Phytophtora infer tans De Ваrу, Phomopsis leptostromiformis (Kühn) Bub.Rhizoctonia solani Kühn. [Надкерничный С.П., Охрименко Г.И., Иващенко Г.В. Антагонистические свойства Chaetomium cochlioides Pallisser по отношению к возбудителям болезней люпина. Мікробіол. журн., 1995, Т. 57. - №1. - С. 48-68]. Штам сапрофітного гриба Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38 характеризується наступними культуральними, морфологічними та фізіологічними властивостями. Культуральні ознаки: 5 Колонії на сусло-агарі швидко ростуть та досягають за 4-5 днів при 25-27 °C 40-50 мм у діаметрі, спочатку вони мають білий колір (д3 за шкалою кольорів А.С. Бондарцева [Бондарцев А.С. Шкала цветов. М.: Из-во Акад. наук СССР.-1954.-18с.], потім (через 8-10 днів) набувають оливковозеленого (з1) або (ж7) забарвлення. Текстура колонії спочатку пухнаста, а потім бархатиста, у міру утворення плодових тіл. Морфологічні властивості: Плодові тіла (перитеції) поверхневі, розміщені на міцелії, утворюються в значній кількості, круглі, овальні, 240,360 × 180300 мкм, темно-зелені (ж7) до темно-коричневих (д5) з відростками, у ніжній частині з ризоїдами. Верхівкові відростки двох типів: прямі знизу, з 3-5 вільними завитками зверху, товщина 4-5 мкм, шорсткі, коричневі (в7), коричнюваті, блідо-коричневі (в7+д3) з 3-6 завитками, товщина 3,0-3,5 мкм. Бокові відростки прямі, злегка хвилясті, основа товщиною 4,5-5,0 мкм, з перегородками, коричнюваті, на верхівці більш світлі. Сумки булавоподібні, містять вісім спор. Сумкоспори овальні до лимоноподібних, 8,5-10 × 6,57,0 мкм, коричневі до тютюново-бурого кольору (л7), на обох кінцях з маленьким вістрям. Фізіологічні ознаки: Гриб розвивається при рН 4,2-11,2 та 14-35 °C. Оптимальне значення рН середовища 6,4-7,2, температурний оптимум 25-28 °C. Відношення до джерел вуглецю: Найкращий ріст на середовищах з лактозою, глюкозою, сахарозою, мальтозою; добрий - на середовищах з фруктозою, ксилозою, рафінозою. Відношення до джерел азоту: Добре росте на середовищах з глутаміновою та аспарагіновою кислотами, валіном, виннокислим амонієм, азотнокислим калієм, азотнокислим амонієм, азотнокислим кальцієм, сірчанокислим амонієм. В ході експериментів по вивченню штаму було встановлено, що штам сапрофітного гриба Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38 здатний утворювати не тільки речовини з фунгіцидною активністю, а й фітогормони різних класів: індолілоцтову кислоту, гіберелову кислоту та 24епінобрасинолід. Зазначений комплекс біологічно активних сполук міститься у спиртовому екстракті міцелію та культуральному середовищі, одержаному при культивуванні вказаного штаму на рідкому поживному середовищі. До складу запропонованого комплексного препарату також входить саліцилова кислота. Саліцилова кислота, що являє собою ендогенну сполуку фенольної природи, є перспективною щодо практичного застосування у складі композиційних препаратів регуляторів росту. За даними літератури вона відіграє важливу роль у формуванні захисних реакцій рослинного організму. Зокрема, вона відіграє роль системних сигнальних молекул при формуванні захисних реакцій рослинними клітинами, результатом чого є набуття системної стійкості рослин до різних факторів довкілля. Також саліцилова кислота бере участь у підвищенні вмісту проліну та в активації МАР-кіназного каскаду, що має властивості антиоксиданту та прооксиданту. Було 95554 6 продемонстровано, що саліцилова кислота впливає на дихальні шляхи, а саме є індуктором альтернативної оксидази, сприяє відхиленню потоку електронів від цитохромного шляху та розриванню окисного фосфорилювання. Вважається, що захисна дія саліцилової кислоти пов'язана з її впливом на генерування активних форм кисню і активність антиоксидантних ферментів (супероксиддисмутази, пероксидази, каталази). Поєднане використання фітогормонів, що синтезуються штамом сапрофітного гриба Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38, у формі спиртового екстракту міцелію та саліцилової кислоти забезпечує одержання синергетичного ефекту стосовно стимуляції росту та розвитку рослин, що було підтверджено під час проведених експериментів. Даний винахід може бути проілюстрований приведеними нижче прикладами. Приклад 1. Вирощування штаму Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38, приготування екстракту міцелію та одержання препарату комплексного регулятора росту та розвитку рослин. Міцелій гриба вирощували 15-18 діб глибинно за температури +25 °C в рідкому ферментативному середовищі наступного складу: глюкоза - 20 г/л, соєве борошно - 12 г/л, дріжджовий автолізат 3,0 г/л, кукурудзяний екстракт - 3,0 мл/г, К2НРО4 0,3 г/л, СаСО3 - 4,5 г/л, рН - 6,8-7,0 [Білявська Л.О. Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук "Біосинтез антипаразитарних і фітостимулюючих речовин Streptomyces avermitilis УКМ АС - 2178, Київ, 2008]. Перед проведенням подальшої обробки визнача5 ли титр гриба. Він складав (3-4) × 10 колонієутворювальних одиниць (КУО) в 1 мл культурального середовища. Міцелій гриба відокремлювали від культурального середовища шляхом фільтрування через капрон і центрифугуванням при 3 тис. об/хв. протягом 20 хв. Наважку 50 г міцелію гриба екстрагували при використанні 96 %-ного етанолу в співвідношенні 1:1 на холоді протягом 1 доби. Препарат отримували в результаті центрифугування екстракту при 6 тис. об/хв. протягом 20 хв. Вихід - 60 мл. Суха маса міцелію гриба в середньому становила 12,5 % від вихідної кількості міцелію у наважці. Готовий препарат містив спиртовий екстракт міцелію гриба Chaetomium cochlioides Pallisser 911 ВНИИСХМ №38 у розведенні 1:10 1:10 та салі-5 -5 цилову кислоту у розведенні 1 × 10 - 5 × 10 . Для приготування запропонованого регулятора росту готували матковий розчин саліцилової кислоти з -3 концентрацією 10 М та спиртовий екстракт міце6 лію гриба у розведенні 1:10 . Так, наприклад, для одержання композиції регулятора росту, що міс9 тить спиртовий екстракт у розведенні 1:10 та са-5 ліцилову кислоту у концентрації 5 × 10 М використовували 5 мл маткового розчину саліцилової -3 кислоти (10 М) та 100 мкл спиртового екстракту 6 міцелію гриба у розведенні 1:10 . Доводили водою до 100 мл. Приклад 2. 7 95554 Визначення фітогормонального складу міцелію та культурального середовища С cochlioides ВНИИСХМ 38 при вирощуванні гриба на рідкому поживному середовищі. Для визначення фітогормонального складу культурального середовища гриба рідке середовище випарювали досуха в умовах вакууму. Брасиностероїди екстрагували тричі при використанні суміші метанол/ацетонітрил (1:1). Поєднували одержані екстракти та випаровували досуха при +45 °C в умовах вакууму. Гормональні сполуки з 8 міцелію гриба екстрагували 96 %-ним етиловим спиртом. Кількісне та якісне визначення речовин проводили методом ефективної хроматографії високого тиску (хроматограф "Aligent2000"), порівнюючи речовини з відповідними стандартами (Sigma). При цьому використовували колонку С18 (довжина 250 мм, діаметр 4 мм). Рухома фаза - ацетонітрил/вода (75:25). Результати визначення наведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Вміст регуляторів росту у міцелії та культуральному середовищі гриба Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38 (екстракцію проводили одночасно) Виявлені сполуки Індолілоцтова кислота Гіберелова кислота Холестерол Ергостерол 24-епібрасинолід Концентрація сполук у міцелії гриба, Концентрація сполуку культуральномкг/г абсолютно сухої маси му середовищі, мкг/мл 24,6±1,15 8,7±0,003 301,5±13,44 56,4±2,12 7,06±0,05 17,88±0,38 45,71±1,13 0,01098±0,0012 Приклад 3. Вплив запропонованого препарату на ростові параметри рослин Дослід проводили за лабораторних умов у відділі фізіології росту та розвитку рослин Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. При цьому показниками, які служили тестами були: середня вага одного проростка, середня вага одного кореня, середня вага однієї рослини (проросток + корінь). Досліди проводили з озимою пшеницею сорту Колумбія. Для цього насіння пророщували у чашках Петрі на фільтрувальному папері, змоченому запропонованими регуляторами росту рослин у різних розбавленнях. У досліді використовували варіанти: розбавлення культурального середовища C. cochliodes ВНИИСХМ 38 9 10 11 1:10 , 1:10 , 1:10 , комплексний регулятор росту та розвитку рослин (C. cochliodes ВНИИСХМ 38 9 -5 1:10 + саліцилова к-та 5 × 10 , C. cochliodes 10 -5 ВНИИСХМ 38 1:10 + саліцилова к-та 5 × 10 , C. 11 cochliodes ВНИИСХМ 38 1:10 + саліцилова к-та 5 -5 10 × 10 ,C. cochliodes ВНИИСХМ 38 1:10 + саліци-5 лова к-та 1 × 10 , C. cochliodes ВНИИСХМ 38 11 -5 1:10 + саліцилова к-та 1 × 10 ). Контролем служила вода. Дані стосовно впливу запропонованого комплексного регулятора росту на рослини озимої пшениці наведені у табл. 2. Таблиця 2 Вплив запропонованого препарату на ростову активність проростків озимої пшениці сорту Колумбія Середня К-ть про- Вага про- Середня Середня Вага коревага 1 росрослого ростків вага 1 % до вага 1 % до % до Варіант нів (фактилини (конасіння, (фактична), проростка, контролю кореня, контролю контролю чна), мг рінь + прошт. мг г г росток), г 31 2537 1674 Контроль, 31 2158 0,0840 100,0 1365 0,0594 100,0 0,143 100,0 вода 30 2257 1860 Препарат 30 2153 1771 9 Chaet. 1:10 26 2011 1562 + саліцилова 0,0886 105,4 0,0691 116,3 0,158 110,3 кислота, 30 2691 2020 -5 5×10 Препарат 30 2619 1859 10 Chaet.1:10 32 2786 1986 + саліцилова 0,0949 112,9 0,0700 117,9 0,165 115,3 кислота, 31 2539 2013 -5 5×10 9 95554 10 Продовження таблиці 2 Вплив запропонованого препарату на ростову активність проростків озимої пшениці сорту Колумбія Середня К-ть про- Вага про- Середня Середня Вага коревага 1 росрослого ростків вага 1 % до вага 1 % до % до Варіант нів (фактилини (конасіння, (фактична), проростка, контролю кореня, контролю контролю чна), мг рінь + прошт. мг г г росток), г Препарат 29 2134 1500 11 Chaet.1:10 22 1728 1451 + саліцилова 0,0830 98,9 0,0630 106,1 0,146 102,2 кислота, 28 2020 1475 -5 5×10 Препарат 21 1501 1401 10 Chaet.1:10 32 2447 1455 0,0825 98,2 0,0619 104,3 0,144 101,0 + саліцилова 25 1868 1377 -5 кислота, 10 Препарат 13 893 679 11 Chaet.1:10 32 2224 1300 0,0806 95,9 0,0590 99,3 0,140 97,6 + саліцилова 28 2216 1848 -5 кислота, 10 Приклад 5. Вивчення ефективності використання запропонованого регулятора як засобу стимулювання росту і розвитку рослин пшениці ярої та підвищення, урожайності культури Ефективність запропонованого комплексного регулятора росту та розвитку рослин вивчали за умов польового досліду на чорноземі вилугованому слабоглеюватому легкосуглинковому на лесі (дослідне поле Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН). Площа облікової ділянки - 15 2 м , повторність досліду 4-кратна. У досліді використовували сорт пшениці ярої Краса Полісся. Норма висіву насіння становила 5 млн. зерен на 1 га. Агротехніка вирощування загальноприйнята для зони Полісся. Мінеральні добрива вносили в дозі N45Р30К45. Дослід закладали за схемою: 1 - без внесення хімічних та мікробних препаратів (контроль); 2 - передпосівна обробка насіння Вітавак сом 200ФФ; 3 - передпосівна обробка насіння запропонованим комплексним регулятором росту (спиртовий екстракт C. cochliodes ВНИИСХМ 38 у 10 розведенні 1:10 + саліцилова кислота у концент-5 рації 5 × 10 М). Передпосівну обробку насіння пшениці ярої хімічним препаратом Вітаваксом 200 ФФ здійснювали з розрахунку 3 кг/т, запропонованим препаратом - 5 мл/т. При закладці і проведенні досліду та статистичній обробці експериментальних даних використовували методику Доспєхова Б.О. [Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с]. Результати польового досліду (Табл. 3) свідчать про високу ефективність застосування запропонованого комплексного регулятора росту на посівах пшениці ярої, де приріст урожаю становив 22,1 %. Таблиця 3 Вплив запропонованого регулятора росту та розвитку рослини на урожайність пшениці ярої сорту Краса Полісся (польовий дослід) Варіант досліду Урожай, ц/га 1 Без внесення хімічних і мікробних препаратів (контроль) Обробка насіння Вітаваксом 200ФФ Обробка насіння запропонованим регулятором ро10 сту та розвитку (C. cochliodes ВНИИСХМ 38 1:10 -5 + саліцилова к-та 5 × 10 М) HIP05 2 Аналіз структури урожаю пшениці ярої показав (Табл. 4), що передпосівна обробка насіння запропонованим комплекснимрегулятором росту рос Приріст урожаю ц/га % 3 4 41,1 44,5 3,4 8,3 50,2 9,1 22,1 2,0 лин позитивно впливали на такі елементи, як довжина колосу, кількість зерен у колосі, маса зерна в колосі та маса 1000 насінин. 11 95554 12 Таблиця 4 Структура врожаю пшениці ярої сорту Краса Полісся під впливом обробки комплексним регулятором росту згідно з винаходом (польовий дослід) Варіант досліду Без внесення хімічних і мікробних препаратів (контроль) Обробка насіння Вітаваксом 200ФФ Обробка насіння запропонованим регулятором росту та розвитку (C. 10 cochliodes ВНИИСХМ38 1:10 + -5 саліцилова к-та 5 × 10 М) Довжина колосу, Кількість зерен в Маса зерен з см колосі, шт. одного колосу,г 6,2±0,09 31,9±0,75 1,12±0,04 35,0±0,53 6,5±0,06 34,5±0,67 1,25±0,02 36,2±0,26 7,2±0,12 39,5±1,83 1,48±0,06 37,6±0,23 Таким чином, запропонований комплексний регулятор росту на основі екстракту міцелію гриба Chaetomium cochlioides Pallisser ВНИИСХМ №38 та саліцилової кислоти виявляє високу ефективність стосовно підвищення продуктивності рослин Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Маса 1000 насінин, г та може застосовуватися для збільшення врожайності культурних рослин. Додатковою перевагою запропонованого препарату є той факт, що він створений на основі природної сировини та є безпечним з екологічної точки зору. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601