Синтетичне середовище для кріоконсервування сперми баранів-плідників

Реферат: UA 97351 U UA 97351 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, зокрема до галузі вівчарства, удосконалення середовища для глибокого заморожування сперми баранів-плідників при використанні штучного осіменіння вівцематок, для якісного покращення поголів'я овець та створення нових високопродуктивних порід. Відомі такі середовища для розбавлення та кріоконсервування сперми баранів-плідників, як цитратно-жовткові, рафінозно-цитратно-жовткові, трис-глюкозо-жовткові (Salomon S., Maxwell W. М. С. Storage of ram semen. - Animal Reproduction Science. - V.62. - 2000. - P. 77-111). Недоліками існуючих середовищ є те, що всі вони не повною мірою забезпечують виживаність та запліднюючу здатність сперміїв баранів-плідників після глибокого заморожування, оскільки вони розраховані на коротший час зберігання сперми баранів за температури 16-18 °C та мають відносно високу вартість. У літературі наявні повідомлення про позитивний вплив бичачого сироваткового альбуміну (БСА) і відновленого глутатіону на зберігання біологічної повноцінності сперміїв тварин (О. Uysal, M. N. Bucak. Effects of oxidized glutathione, bovine serum albumin, cysteine and lycopene on the quality of frozen-thawed ram semen. - ACTA VET. BRNO. - 2007. - V. 76. - P. 383-390). Найбільш близьким по суті до середовища, що заявляється, є середовище, описане в Інструкції із штучного осіменіння овець і кіз (Мельник Ю.Ф. - К.: Аграрна наука, 2003). Спільні ознаки прототипу і середовища, що заявляється, є: вода дистильована - 100 мл, лактоза - 13 г, курячий жовток - 30 мл, трис-(оксиметил)-амінометан - 0,6 г, кислота лимонна - 0,3 г, гліцерин 9,0 мл, Спермосан-3-50 тис. О.Д. Недоліком прототипу є відсутність у його складі БСА та відновленого глутатіону, сполук, які проявляють позитивний вплив на біологічну повноцінність сперміїв плідників. Заявлене нами синтетичне середовище для кріоконсервування сперми баранів-плідників усуває недоліки прототипу, забезпечує більшу його універсальність та краще збереження реакції середовища за час зберігання сперми, а отже - його запліднюючої здатності при осіменінні вівцематок. В основу корисної моделі поставлено задачу створити ефективне, економічно вигідне, зручне в застосуванні середовище для розбавлення свіжоотриманої сперми баранів-плідників і кращого збереження її поза організмом і використання в подальшому для штучного осіменіння вівцематок з одержанням вищого відсотка запліднення, що, в свою чергу, зможе підвищити ефективність ведення вівчарства. Для досягнення технічного результату до складу середовища, яке містить воду дистильовану - 100 мл, лактозу - 13 г, курячий жовток - 30 мл, трис-(оксиметил)-амінометан - 0,6 г, кислоту лимонну - 0,3 г, гліцерин - 9,0 мл, Спермосан-3-50 тис. О.Д., додатково вводять БСА та відновлений глутатіон у певних співвідношеннях компонентів. Це середовище готується у два прийоми. Спочатку відважують 13 г лактози і розчиняють у 100 мл дистильованої води за температури 90 °C, а після охолодження до 40 °C у розчин вводять 30 мл жовтка. Ретельно перемішують за допомогою магнітного змішувача до отримання однорідної суспензії. Потім відміряють 100 мл цієї суспензії і розчиняють у ній послідовно Трис (0,6 г), кислоту лимонну (0,3 г), БСА (1,5 г), відновлений глутатіон (5 μМ) і останнім вводять гліцерин (9 мл). Ефективність середовища ґрунтується на оптимальному співвідношенні його складових. При проведенні патентно-інформаційного пошуку знайдено технічне рішення, в якому є ряд суттєвих ознак спільних із заявленим - середовище для розбавлення і зберігання сперми баранів згідно з інструкцією (Мельник Ю.Ф., 2003). Однак, вказаних суттєвих ознак недостатньо для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого середовища для кріоконсервування сперми баранів, не знайдено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію корисної моделі "новизна". У джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено відомостей про середовище для кріоконсервування сперми баранів, які б містили ознаки, що відрізняють заявлену корисну модель від прототипу з використанням компонентів в грамах на 100 мл дистильованої води: лактоза - 13 г, курячий жовток - 30 мл, трис-(оксиметил)-амінометан - 0,6 г, кислота лимонна - 0,3 г, гліцерин - 9,0 мл, Спермосан-3-50 тис. О.Д. Корисна модель може бути використана в селекційно-генетичних центрах і пунктах штучного осіменіння овець різних організаційно-правових норм, що здійснюють свою діяльність для виробництва високоякісної спермопродукції, фасування та її зберігання. Складові компоненти препарату забезпечують: 1 UA 97351 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1) лактоза - дисахарид, використовується як базова основа середовища як неелектроліт. Вона нейтралізує на сперміях шкідливу дію електролітів захищаючи їх від втрати електронного заряду, не допускаючи аглютинації; 2) курячий жовток - проявляє кріозахисну дію на спермії за здатністю лецитину проникати у клітину і знижувати точку плавлення ліпідів. Жовток на поверхні сперміїв утворює гідрофобну фазу, внаслідок якої сповільнюється осмотичний і дифузний обмін між середовищем і клітиною. Крім цього фосфоліпіди жовтка утворюють з плазматичною мембраною сперміїв іони та водні зв'язки; 3) трис-(оксиметил)-амінометан динатрієва сіль етилендіамін тетраоцтової кислоти, що стабілізує рН у спермі при еквілібрації, кріоконсервуванні та має антиокислювальний вплив на спермії; 4) кислота лимонна (Na цитрат - тринатрієва сіль лимонної кислоти) є природним буфером, який перешкоджає отруєнню сперміїв кислими продуктами, їх розпад та зменшує проникненість їх оболонки, а також послаблює дію антитіл в статевих шляхах вівцематок на спермії, виводить із сироватки сперми кальцій, вільні іони, які є шкідливими для сперміїв; 5) БСА - чинить протекторну дію на ферменти сперміїв, сприяє підвищенню активності деконсервованої сперми, виживаності сперміїв та зниження кількості патологічних форм сперміїв; 6) глутатіон - кофермент ряду оксидоредуктаз є пептидним коферментом. Функціональною групою його є SH-група цистеїну, здатна до зворотних окисно-відновних реакцій. Відновлена форма глутатіону підвищує активність сперміїв, збереженість акросом та зниження кількості патологічних форм; 7) гліцерин, як продукт гідролізу фосфогліцеринів, є енергетичним субстратом у процесах гліколізу. Він проявляє захисну дію, проникаючи всередину клітини, відіграючи роль протисольового буфера, який зв'язує частини вільної води, зміцнюючи мембрани клітин та оберігаючи їх від шкідливої дії води; 8) Спермосан-3 - антибактеріальний засіб для санації сперми тварин. Ефективність заявленого середовища, перевага його над прототипом, а також визначення оптимального співвідношення компонентів представлена в прикладах конкретного виконання корисної моделі - в дослідах із свіжоотриманою спермою баранів-плідників. Еякуляти відбирали від баранів УГКП у СФГ "Салдобош" Хустського району Закарпатської області. Для штучного осіменіння, відбирали клінічно здорових овець середньої вгодованості з ознаками охоти, яких осіменяли одноразово лапароскопічним методом. Ефективність середовища випробовувалась на 99 вівцематках у парувальний період, в тому числі спермою, замороженою в контрольному середовищі, - 52 голови, в удосконаленому - 47 вівцематок. Корисна модель ілюструється наступними прикладами: Приклад 1. Визначення якісних показників сперміїв баранів за додавання відновленого глутатіону (5 μМ) та БСА (1,5 г). Свіжоодержані еякуляти з активністю 80-90 % розбавляли 1:3 лактозо-жовтково-трисцитрато-гліцериновим середовищем (ЛЖТЦГС) з додаванням 5 μМ відновленого глутатіону та 1,5 мг БСА. У контролі сперму розбавляли тим самим середовищем без відновленого глутатіону та БСА. Згодом на обладнанні фірми "Minitub" паєти місткістю 0,25 мл заповнювали розбавленою спермою, поміщали у холодильник за температури 4 °C та еквілібрували протягом 3 годин, а потім утримували 20 хв над парами азоту (-120 °C) у спеціальній посудині. Після чого паєти фасували в касети й опускали в рідкий азот біосховища. На усіх етапах кріоконсервування визначали якісні показники сперміїв баранів. Встановлено, що за використання відновленого глутатіону та БСА активність сперміїв баранів після еквілібрації та розморожування була на 10,6 та 11,0 % вищою, ніж у контрольному середовищі (табл. 1). 2 UA 97351 U Таблиця 1 Вплив глутатіону та БСА у складі середовища для заморожування сперми баранів-плідників на якісні показники сперміїв. М±m, n=10 Показники Активність свіжоодержаних сперміїв, % Активність сперміїв після еквілібрації, % Активність деконсервованих сперміїв, % Стійкість сперміїв до заморожування, % Кількість деконсервованих сперміїв з ушкодженою акросомою, % Виживаність сперміїв, год. Показник абсолютного виживання, ум. од. контрольне (ЛЖТЦГ) 90,15±1,65 73,82±2,35 41,24±1,31 55,86±3,41 Середовище Дослідне (ЛЖТЦГ + 5 μМ глутатіону + 1,5 г БСА) " 90,15±1,65 84,46±1,52** 52,26±2,13*** 61,87±2,36 27,50±2,85 18,00±1,65* 7,10±0,48 13,24±0,96 8,80±0,47* 16,12±1,15* Примітка 1: у даній і наступній таблицях *р