Антитіло до egfl7 і способи його застосування

1. Антитіло проти домену 7, який подібний епідермальному фактору росту (EGFL7), яке продукується гібридомою, вибраною з групи, яка складається з: анти-EGFL7 muМab 4F11.1.8 (номер доступу АТСС РТА-7343), анти-EGFL7 muМab 10G9.1.6 (номер доступу АТСС РТА-7344), і антиEGFL7 muМab 18F7.1.8 (номер доступу АТСС РТА-7345). 2 (19) 1 3 6. Антитіло анти-EGFL7 за п. 5, де легкий ланцюг зазначеного антитіла містить послідовність: DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITY LHWYLQKPGQSPKLLTYKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHV?PLTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO: 3). 7. Антитіло анти-EGFL7 за п. 5, де важкий ланцюг зазначеного антитіла містить послідовність: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDYYMN SDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQK FKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGTTLTVSA (SEQ ID NO: 4). 8. Антитіло анти-EGFL7, що містить шість областей, які визначають комплементарність, антитіла 18F7.1.8, що продукується гібридомою клітинної лінії АТСС (РТА-7345). 9. Антитіло за будь-яким з пп. 1-8, де антитіло являє собою моноклональне антитіло. 10. Антитіло за будь-яким з пп. 1-9, де антитіло вибирається з групи, яка складається з химерного антитіла, гуманізованого антитіла, антитіла з дозрілою спорідненістю, антитіла людини і біспецифічного антитіла. 11. Антитіло за будь-яким з пп. 1-10, де антитіло являє собою фрагмент антитіла. 12. Фармацевтична композиція, що містить антитіло анти-EGFL7 за будь-яким з пп. 1-11. 13. Фармацевтична композиція за п. 12, яка додатково містить антиангіогенний агент. 14. Фармацевтична композиція за п. 13, де антиангіогенний агент вибирається з групи, яка складається з бевацизумабу і ранібізумабу. 15. Полінуклеотид, який кодує антитіло за будьяким з пп. 1-11. 16. Вектор, який містить полінуклеотид за п. 15. 17. Вектор за п. 16, де вектор являє собою вектор експресії. 18. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 16 або 17. 19. Клітина-хазяїн за п. 18, де клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину. 20. Клітина-хазяїн за п. 18, де клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину. 21. Клітина-хазяїн за п. 18, де клітина-хазяїн являє собою клітину ссавця. 22. Спосіб одержання антитіла анти-EGFL7, де зазначений спосіб включає (a) експресування вектора за п. 17 у відповідну клітину-хазяїна і (b) витягування антитіла. 23. Спосіб за п. 22, де клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину. 24. Спосіб за п. 22, де клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину. 25. Спосіб зменшення або інгібування ангіогенезу в суб'єкта, що має патологічний стан, пов'язаний з ангіогенезом, що включає введення суб'єкту ефективної кількості антитіла анти-EGFL7 за будь-яким з пп. 1-11 або фармацевтичної композиції за п. 12. Галузь техніки, до якої належить винахід 97360 4 26. Спосіб за п. 25, де патологічний стан являє собою неоплазму. 27. Спосіб за п. 26, де неоплазма являє собою карциному. 28. Спосіб за п. 25, де патологічний стан пов'язаний з очима. 29. Спосіб за п. 28, де патологічний стан являє собою інтраокулярне неоваскулярне захворювання. 30. Спосіб за будь-яким з пп. 25-27, який додатково включає введення суб'єкту антиангіогенного агента. 31. Спосіб за п. 30, де антиангіогенний агент являє собою антагоніст судинного ендотеліального фактора росту (VEGF). 32. Спосіб за п. 31, де антагоніст являє собою антитіло анти-VEGF. 33. Спосіб за п. 32, де антитіло анти-VEGF являє собою бевацизумаб. 34. Спосіб за п. 28 або 29, що додатково включає введення суб'єкту антиангіогенного агента. 35. Спосіб за п. 34, де антиангіогенний агент являє собою антагоніст судинного ендотеліального фактора росту (VEGF). 36. Спосіб за п. 35, де антагоніст являє собою антитіло анти-VEGF. 37. Спосіб за п. 36, де антитіло анти-VEGF являє собою ранібізумаб. 38. Спосіб за пп. 30-37, де антиангіогенний агент вводиться до або після введення антитіла антиEGFL7. 39. Спосіб за пп. 30-37, де антиангіогенний агент вводиться одночасно з антитілом анти-EGFL7. 40. Спосіб підвищення ефективності антиангіогенного агента в суб'єкта, що має патологічний стан, пов'язаний з ангіогенезом, що включає введення суб'єкту антитіла за будь-яким з пп. 1-11 або фармацевтичної композиції за п. 12 або 13. 41. Спосіб за п. 40, де патологічний стан являє собою неоплазму. 42. Спосіб за п. 41, де неоплазма являє собою карциному. 43. Спосіб за будь-яким з пп. 40-42, де антиангіогенний агент являє собою бевацизумаб. 44. Спосіб за будь-яким з пп. 40-43, який додатково включає в себе введення хіміотерапевтичного агента. 45. Спосіб за п. 40, де патологічний стан пов'язаний з очима. 46. Спосіб за п. 45, де патологічний стан являє собою інтраокулярне неоваскулярне захворювання. 47. Спосіб за п. 45 або 46, де антиангіогенний агент являє собою ранібізумаб. 48. Спосіб за пп. 45-47, що додатково включає в себе введення кортикостероїду. 49. Спосіб за пп. 45-47, що додатково включає в себе уведення фотодинамічної терапії. Даний винахід належить в цілому до композицій і способів, які є придатними для модулювання 5 розвитку судин. Конкретно, даний винахід належить до антитіл, що зв'язуються з поліпептидом домену 7, подібного до епідермального фактору росту (EGFL7). Даний винахід, крім того, належить до діагностики і лікування станів і захворювань, пов'язаних з ангіогенезом. Рівень техніки Розвиток перенесення за допомогою судин є фундаментальною вимогою для множини фізіологічних і патологічних процесів. Активно зростаючі тканини, такі як ембріони і пухлини, вимагають адекватної подачі крові. Вони задовольняють цю потребу за допомогою продукування проангіогенних факторів, що сприяють формуванню нових кровоносних судин за допомогою процесу, який називається ангіогенезом. Формування трубочок судин являє собою складну, але упорядковану біологічну подію, що включає в себе всі стадії, які йдуть далі, або багато які з них: а) ендотеліальні клітини (EC) проліферують з існуючих EC або диференціюються від прогеніторних клітин; b) EC мігрують і коалесціюють з формуванням тяжоподібних структур; с) потім судинні тяжі піддаються тубулогенезу з формуванням судин з центральним просвітом; d) існуючі тяжі або судини висилають відростки для формування вторинних судин; e) примітивне судинне сплетення піддається подальшій перебудові і переформуванню; і f) периендотеліальні клітини рекрутуються для оточення ендотеліальних трубочок, забезпечуючи обслуговуючі і модуляторні функції для судин; такі клітини містять у собі перицити для малих капілярів, клітини гладких м'язів для судин більшого розміру і клітини міокарда в серце. Hanahan, Science 277:48-50 (1997); Hogan & Kolodziej, Nat. Rev. Genet. 3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003). Зараз добре встановлено, що ангіогенез здійснюється при патогенезі різноманітних розладів. Вони містять у собі тверді пухлини і метастази, атеросклероз, ретролентальну фіброплазію, гемангіоми, хронічне запалення, інтраокулярні неоваскулярні захворювання, такі як проліферативні ретинопатії, наприклад, діабетична ретинопатія, вікова макулярна дегенерація (AMD), неоваскулярна глаукома, імунне відторгнення трансплантованої корнеальної тканини й інших тканин, ревматоїдний артрит і псоріаз. Folkman et al., J. Biol Chem. 267:10931-34 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); і Gamer Α., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner Α., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 16251710. У випадку росту пухлини, ангіогенез очевидно є критичним для переходу від гіперплазії до неоплазії, і для забезпечення живлення для росту і метастазування пухлини. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). Неоваскуляризація дає можливість пухлинним клітинам для одержання переваги в рості і проліферативній автономії, у порівнянні з нормальними клітинами. Пухлина звичайно починається як окрема аберантна клітина, що може проліферувати тільки до розміру в декілька кубічних міліметрів, через дистанцію до найближчого доступного капілярного русла, і вона може зали 97360 6 шатися 'пасивною' без подальшого росту і поширення протягом тривалого періоду часу. Деякі пухлинні клітини потім переключаються на ангіогенний фенотип з активуванням ендотеліальних клітин, які проліферують і дозрівають у вигляді нових капілярних кровоносних судин. Ці знову сформовані кровоносні судини не тільки уможливлюють безупинний ріст первинної пухлини, але також служать для поширення і реколонізації метастатичних пухлинних клітин. Відповідно, спостерігається кореляція між щільністю мікросудин у зрізах пухлини і виживаністю пацієнтів при раку грудей, а також при деяких інших пухлинах. Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991); Horak et al. Lancet 340:1120-24 (1992); Macchiarini et al. Lancet 340:145-46 (1992). Точні механізми, які контролюють ангіогенне переключення, як випливає, незрозумілі, але передбачається, що неоваскуляризація маси пухлини виникає в результаті загального балансу дії множини стимуляторів і інгібіторів ангіогенезу (Folkman, Nat. Med. 1(1):27-31 (1995)). Процес розвитку судин щільно регулюється. До даного часу, значна кількість молекул, в основному, секретованих факторів, які продукуються оточуючими клітинами, як показано, регулюють диференціацію, проліферацію, міграцію і коалесценцію ЕС у вигляді тяжоподібних структур. Наприклад, фактор васкулярного ендотеліального росту (VEGF) ідентифікований як ключовий фактор, втягненого в стимулювання ангіогенезу й в індукування проникності судин. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Виявлення того, що втрата навіть одного алеля VEGF приводить до летальності ембріона, показує незамінну роль, що відіграє цей фактор при розвитку і диференціюванні судинної системи. Крім того, VEGF, як показано, є ключовим медіатором неоваскуляризації, пов'язаної з пухлинами і інтраокулярними розладами. Ferrara et al., Endocr. Rev, вище. мРНК VEGF надекспресується в більшості досліджуваних пухлин людини. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:8691 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-35 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-34 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995). Також, рівні концентрації VEGF в очних рідинах сильно корелюють із присутністю активної проліферації кровоносних судин у пацієнтів з діабетичними й іншими пов'язаними з ішемією ретинопатіями. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994). Крім того, дослідження продемонстрували локалізацію VEGF у хороїдальних неоваскулярних мембранах у пацієнтів, підданих AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-68 (1996). Нейтралізуючі антитіла анти-VEGF придушують ріст різноманітних ліній клітин пухлин людини в голих мишей (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res. 56:4032-39 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-24 (1996)), а також інгібують інтраокулярний ангіогенез у моделей ішемічних ретинальних розладів (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). З цієї причини, моноклональні антитіла анти-VEGF або інші інгібі 7 тори дії VEGF є обіцяючими кандидатами для лікування пухлин і різних інтраокулярних неоваскулярних розладів. Такі антитіла описуються, наприклад, у ЕР 817648, опублікованому 14 січня 1998 року; і в заявках WO 98/45331 і WO 98/45332, обидві вони опубліковані 15 жовтня 1998 року. Одне з антитіл анти-VEGF, бевацизумаб, було схвалене FDA (адміністрація по лікарських засобах і харчових продуктах США) для використання в поєднанні з режимом хіміотерапії для лікування метастатичного раку товстої і прямої кишки (CRC). І ще бевацизумаб досліджується в множині здійснюваних клінічних досліджень для лікування різних проявів раку. Відомо, що позаклітинний матрикс (ЕСМ) відіграє важливу роль у процесі ангіогенезу. Madri, Transpl. Immunol. 5:179-83 (1997). EC оточені тимчасовим ЕСМ під час їхньої міграції, і вони прилипають до знову синтезованих базальних мембран судини після формування просвіту. На додаток до створення скелету під час морфогенезу капіляра, ЕСМ, як показано, здійснює комплексний локальний контроль функціонування ЕС. Наприклад, ЕСМ здатний регулювати приступність розчинних ангіогенних медіаторів для ЕС і конкретизувати природу і тип взаємодій з інтегрином і клітинну адгезію молекул. Передбачається також, що виживаність ЕС регулюється кооперацією між рецепторами фактора росту і інтегринами, що, у свою чергу, керуються композицією локального ЕСМ. Stupack & Cheresh, Oncogene 22:9022-29 (2003). Незважаючи на множину досягнень в галузі ангіогенезу, деякі зі стадій під час формування трубки судини як і раніше визначені погано. Особливо мало відомо щодо того, як регулюється тубулогенез - як судинні тяжі розвиваються, стаючи трубочками, і які фактори регулюють цей перехід. Маючи на увазі роль ангіогенезу в багатьох захворюваннях і розладах, є бажаним створення засобів зменшення або інгібування одного або декількох біологічних впливів, що викликають ці процеси. Є також бажаним створення засобів аналізу присутності патогенних поліпептидів у нормальних і хворобливих станах, і особливо, при раку. Існує також необхідність у композиціях і способах, що можуть підвищити ефективність існуючих терапевтичних підходів проти ангіогенезу. Суть винаходу Даний винахід частково ґрунтується на ідентифікації антитіл проти EGFL7 із властивостями, які показують, що вони є особливо корисними для терапії. В одному з аспектів, даний винахід надає антитіла, які продукуються гібридомами анти-EGFL7 mumab 4F 11.1.8, анти-EGFL7 mumab 10G9.1.6 і анти-EGFL7 mumab 18F7.1.8. В одному з аспектів, даний винахід надає антитіло анти-EGFL7, що містить одну або декілька комплементарно зумовлених областей (CDR), вибраних із групи, яка складається з: (а) послідовності 4F11 CDR-L1 KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5); (b) послідовності 4F11 CDR-L2 GASNLES (SEQ ID NO: 6); (c) послідовності 4F11 CDR-L3 QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7); (d) послідовності 4F11 CDR-H1 TYGMS (SEQ ID NO: 8); (e) послідо 97360 8 вності 4F11 CDR-H2 WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9); і (f) послідовності 4F11 CDR-H3 LGSSA (SEQ ID NO: 10). У деяких варіантах здійснення, легкий ланцюг зазначеного антитіла містить щонайменше одну щонайменше дві або всі три послідовності CDR, вибраних з: KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5), GASNLES (SEQ ID NO: 6), і QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7). У деяких варіантах здійснення, важкий ланцюг зазначеного антитіла містить щонайменше одну щонайменше дві або всі три послідовності CDR, вибраних з: TYGMS (SEQ ID NO: 8), WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9), і LGSSA (SEQ ID NO: 10). У деяких варіантах здійснення, легкий ланцюг зазначеного антитіла містить щонайменше одну щонайменше дві або всі три послідовності CDR, вибраних з: KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5), GASNLES (SEQ ID NO: 6), і QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7); і важкий ланцюг зазначеного антитіла містить щонайменше одну щонайменше дві або всі три послідовності CDR, вибраних з: TYGMS (SEQ ID NO: 8), WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9), і LGSSA (SEQ ID NO: 10). У деяких варіантах здійснення, легкий ланцюг антитіла містить послідовність: (SEQ ID NO: 1). GQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPK LLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1). У деяких варіантах здійснення, важкий ланцюг антитіла містить послідовність: (SEQ ID NO: 2). ETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMG WTNTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQIN NLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2). В одному з аспектів, даний винахід надає антитіло анти-EGFL7, що містить одну або декілька комплементарно зумовлених областей (CDR), вибраних із групи, яка складається з: (а) послідовності 10G9 CDR-L1 RSSQSLVIITNGITYLH (SEQ IDN O: 11); (b) послідовності 10G9 CDR-L2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 12); (с) послідовності 10G9 CDR-L3 SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13); (d) послідовності 10G9 CDR-H1 DYYMNSDYYMN (SEQ ID NO: 14); (e) послідовності 10G9 CDR-H2 DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15) і (f) послідовності 10G9 CDR-H3 ALGVFDY (SEQ ID NO: 16). У деяких варіантах здійснення, легкий ланцюг зазначеного антитіла містить щонайменше одну щонайменше дві або всі три послідовності CDR, вибраних з: RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11), KVSNRFS (SEQ ID NO: 12), і SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13). У деяких варіантах здійснення, важкий ланцюг зазначеного антитіла містить щонайменше одну щонайменше дві або всі три послідовності CDR, вибраних з: DYYMNSDYYMN (SEQ ID NO: 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15) і ALGVFDY (SEQ ID NO: 16). У деяких варіантах здійснення, легкий ланцюг зазначеного антитіла містить щонайменше одну щонайменше дві або всі три послідовності CDR, вибраних з: RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11), KVSNRFS (SEQ ID NO: 12), і SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13); і важкий ланцюг зазначеного антитіла містить що 9 найменше одну щонайменше дві або всі три послідовності CDR, вибраних з: DYYMNSDYYMN (SEQ ID NO: 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), і ALGVFDY (SEQ ID NO: 16). У деяких варіантах здійснення, легкий ланцюг антитіла містить послідовність: (SEQ ID NO: 3). GDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPK LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL?KISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO: 3). У деяких варіантах здійснення, важкий ланцюг антитіла містить послідовність: (SEQ ID NO: 4). ASVKISCKASGYTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGK SLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTA YMELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYADYWGQGTTLTVSA (SEQ ID NO: 4). У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає антитіла анти-EGFL7, які специфічно зв'язуються з поліпептидом, що містить одну з наступних послідовностей амінокислот: ССР, TIY і ACS. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає виділені антитіла, що зв'язуються з таким же епітопом EGFL7 людини, як і інші антитіла за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає виділені антитіла, що конкурують за зв'язування EGFL7 з іншими антитілами за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення, антитіло за даним винаходом являє собою моноклональне антитіло. У деяких варіантах здійснення, антитіло за даним винаходом являє собою химерне антитіло, гуманізоване антитіло, антитіло з дозрілою спорідненістю, антитіло людини або біспецифічне антитіло. У деяких варіантах здійснення, антитіло являє собою фрагмент антитіла. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає фармацевтичну композицію, що містить антитіло анти-EGFL7 за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція додатково містить антиангіогенний агент. У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент являє собою бевацизумаб або ранібізумаб. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає полінуклеотид, що кодує антитіло за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає вектори, що містять ці полінуклеотиди. У деяких варіантах здійснення, вектори являють собою вектори експресії. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає клітини-хазяї, включаючи прокаріотичні і еукаріотичні клітини (включаючи клітини ссавців), що містять такі вектори. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає спосіб одержання антитіла анти-EGFL7, що включає в себе (а) експресування вектора експресії у відповідній клітині-хазяїні і (b) витягання антитіла. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає спосіб зменшення або інгібування ангіогенезу в суб'єкта, що має патологічний стан, пов'язаний з ангіогенезом, що включає в себе введення суб'єкту ефективної кількості антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом або фармацевтичноїю композиції, що містить антитіло анти-EGFL7 за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення, патологічний стан являє собою неоплазму, наприклад, 97360 10 карциному. У деяких варіантах здійснення, патологічний стан, пов'язаний з оком, наприклад, являє собою інтраокулярне неоваскулярне захворювання. У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент уводиться суб'єкту на додаток до антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент являє собою антагоніст фактора васкулярного ендотеліального росту (VEGF), наприклад, антитіло антиVEGF (включаючи бевацизумаб і ранібізумаб). У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент уводиться до або після введення антитіла анти-EGFL7. У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент вводиться одночасно з антитілом анти-EGFL7. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає спосіб підвищення ефективності антиангіогенного агента в суб'єкта, що має патологічний стан, пов'язаний з ангіогенезом, що включає в себе введення суб'єкту антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом або фармацевтичної композиції, що містить антитіло анти-EGFL7 за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення, патологічний стан являє собою неоплазму, наприклад, карциному. У деяких варіантах здійснення, патологічний стан, пов'язаний з оком, наприклад, являє собою інтраокулярне неоваскулярне захворювання. У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент уводиться суб'єкту на додаток до антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент являє собою антагоніст фактора васкулярного ендотеліального росту (VEGF), наприклад, антитіло анти-VEGF (включаючи бевацизумаб і ранібізумаб). У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент уводиться до або після введення антитіла антиEGFL7. У деяких варіантах здійснення, антиангіогенний агент вводиться одночасно з антитілом анти-EGFL7. У деяких варіантах здійснення, застосовуються також інші засоби лікування, наприклад, кортикостероїди або фотодинамічна терапія. Короткий опис креслень Фіг. 1 показує послідовність амінокислот варіабельного домену легкого ланцюга Mab 4F11 (SEQ ID NO: 1) і HuKI (SEQ ID NO: 17). Фіг. 2 показує послідовність амінокислот варіабельного домену важкого ланцюга Mab 4F11 (SEQ ID NO: 2) і HuIII (SEQ ID NO: 18). Фіг. 3 показує послідовність амінокислот варіабельного домену легкого ланцюга Mab 10G9 (SEQ ID NO: 3) і HuKI (SEQ ID NO: 17). Фіг. 4 показує послідовність амінокислот варіабельного домену важкого ланцюга Mab 10G9 (SEQ ID NO: 4) і HuIII (SEQ ID NO: 18). Фіг. 5 ілюструє домени повнорозмірного EGFL7 і його зрізаних форм, використовуваних для картування сайтів зв'язування антитіла. Фіг. 6 показує об'єм пухлини in vivo у моделей Xenomouse, трансфікованих раком легень людини (NSCLC; НІ 299), протягом курсу лікування антитілами анти-VEGF і анти-EGFL7 за даним винаходом. Фіг. 7 показує виживаність у моделей Xenomouse, трансфікованих in vivo раком легень людини (NSCLC; H1299), протягом курсу лікування 11 антитілами анти-VEGF і анти-EGFL7 за даним винаходом. Фіг. 8 показує об'єм пухлини in vivo у моделей Xenomouse, трансфікованих раком грудей людини (MDA-MB231), протягом курсу лікування антитілами анти-VEGF і анти-EGFL7 за даним винаходом. Фіг. 9 показує об'єм пухлини in vivo у моделей Xenomouse, трансфікованих раком грудей людини (MDA-MB231), протягом курсу лікування антитілом анти-VEGF і анти-EGFL7 Mab 18F7 за даним винаходом. Докладний опис переважних варіантів здійснення Даний винахід надає антитіла анти-EGFL7, які є придатними для використання, наприклад, для лікування або запобігання хворобливих станів, пов'язаних з експресуванням і/або активністю EGFL7, наприклад, з підвищеним експресуванням і/або активністю або небажаним експресуванням і/або активністю. У деяких варіантах здійснення, антитіла за даним винаходом використовуються для лікування пухлини, раку і/або проліферативного розладу клітин. В іншому аспекті, антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом є придатними для використання як реагенти для детектування і/або виділення EGFL7, наприклад, для детектування EGFL7 у різних тканинах і типах клітин. Даний винахід додатково надає способи одержання антитіл анти-EGFL7, полінуклеотидів, що кодують антитіла анти-EGFL7, і клітин, що містять полінуклеотиди, що кодують антитіла анти-EGFL7. Загальні технології Технології і процедури, описувані або згадувані тут, як правило, добре зрозумілі і скрізь застосовуються з використанням звичайної методології фахівцями в даній галузі, такі, наприклад, як широко використовувані методології, описані в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); у серії METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL., and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)). Визначення "Виділене" антитіло являє собою таке, яке ідентифікується і виділяється і/або витягається з компонента його природно-навколишнього середовища. Забруднюючі компоненти його природнонавколишнього середовища являють собою матеріали, що можуть впливати негативно на діагностичні або терапевтичні застосування антитіла, і можуть містити в собіферменти, гормони й інші білкові або небілкові розчинні речовини. У деяких варіантах здійснення, антитіло буде очищатися (1) до одержання більш ніж 95% мас. антитіла, як визначається за допомогою методу Лаурі, а іноді, до більш ніж 99% мас, (2) до рівня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої послідовності амінокислот за до 97360 12 помогою використання секвенатора з обертовою чашкою, або (3) до гомогенності відповідно до аналізу SDS-PAGE при відновлюваних або невідновлюваних умовах, з використанням фарбування за допомогою кумасі блакитного або срібного фарбування. Виділене антитіло містить у собі антитіло in situ у рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного навколишнього середовища антитіла не буде присутній. Звичайно, однак, виділене антитіло буде виготовлюватися за допомогою щонайменше однієї стадії очищення. "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікується і відділяється щонайменше від однієї забруднюючої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно зв'язується в природному джерелі нуклеїнових кислот антитіла. Виділена молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в іншій формі або має параметри інші, ніж ті, з якими вона знаходиться в природі. З цієї причини виділені молекули нуклеїнових кислот відрізняються від молекули нуклеїнової кислоти, як вона існує в природних клітинах. Однак виділена молекула нуклеїнової кислоти містить у собі молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які звичайно експресують антитіло, де, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в хромосомальному положенні, відмінному від природних клітин. Терміни "залишок варіабельного домену, пронумерований згідно з Kabat" або "положення амінокислоти, пронумероване згідно з Kabat" і їхні варіації належать до системи нумерації, використовуваної для варіабельних доменів важких ланцюгів або варіабельних доменів легких ланцюгів компіляції антитіл у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). При використанні цієї системи нумерації, реальна лінійна послідовність амінокислот може містити меншу кількість амінокислот або додаткові амінокислоти, що відповідають скороченню або інсерції в FR або CDR варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може містити одну вставку амінокислоти (залишок 52а відповідно до Kabat) після залишку 52 Н2 і вставлені залишки (наприклад, залишки 82а, 82b, і 82с, тощо, відповідно до Kabat) після залишку 82 FR важкого ланцюга. Нумерація залишків згідно з Kabat може визначатися для даного антитіла за допомогою сполучення в областях гомології послідовності антитіла з "стандартною" послідовністю, пронумерованою по Kabat. Фраза "по суті подібні" або "по суті однакові", як тут використовується, означає досить високий рівень подібності між двома числовими значеннями (як правило, одне з них пов'язане з антитілом за даним винаходом, а інше пов'язане з еталонним/порівняльним антитілом) так що фахівець у даній галузі порахував би розходження між двома значеннями малим або таким, що не має біологічної і/або статистичної значимості в контексті біологічної характеристики, вимірюваної за допомогою зазначених значень (наприклад, значень Kd). Різниця між зазначеними двома значеннями, як пра 13 вило, є меншою, приблизно, ніж 50%, приблизно 40%, приблизно 30%, приблизно 20% або приблизно 10%, як функція значення для еталонного/порівняльного антитіла. "Спорідненість зв'язування", як правило, належить до міцності загальної суми нековалентних взаємодій між окремим сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і її партнером по зв'язуванню (наприклад, антигеном). Якщо не вказується іншого, як тут використовується, "спорідненість зв'язування" належить до власної спорідненості зв'язування, що відбиває взаємодію 1:1 між елементами пари, що зв'язується (наприклад, антитіла й антигену). Спорідненість молекули X до її партнера Υ може, як правило, бути представлена за допомогою константи дисоціації (Kd). Спорідненість може вимірятися за допомогою звичайних способів, відомих у даній галузі, включаючи ті, які описуються тут. Антитіла з малою спорідненістю, як правило, зв'язують антиген повільно і мають тенденцію до легкої дисоціації, у той час антитіла з високою спорідненістю, як правило, зв'язують антиген швидше і мають тенденцію до збереження зв'язку протягом більш тривалого часу. Різноманітні способи вимірюванняу спорідненості зв'язування відомі в даній галузі, і кожний з нихможе використовуватися для цілей даного винаходу. Конкретні ілюстративні варіанти здійснення описуються далі. В одному з варіантів здійснення, "Kd" або "значення Kd" відповідно до даного винаходу вимірюється за допомогою аналізу зв'язування радіоактивно міченого антигену (RIA), здійснюваного за допомогою версії Fab антитіла, що представляє інтерес, і його антигену, як описується за допомогою наступного аналізу, який вимірює спорідненість зв'язування в розчині Fab до антигену за допомогою зрівноважування Fab з мінімальною 125 концентрацією ( І)-міченого антигену в присутності ряду титрувань неміченого антигену, а потім захоплення зв'язаного антигену за допомогою планшета, покритого антитілом анти-Fab (Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-81 (1999)). Для встановлення умов для аналізу, планшети для мікротитрування (Dynex) покриваються протягом ночі 5 мкг/мл захоплюючого антитіла анти-Fab (Cappel Labs) у 50 мМ розчині карбонату натрію (рН 9,6), а потім блокуються за допомогою 2% (мас/об'єм) розчину сироваткового бичачого альбуміну в PBS протягом від двох до п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23°С). У планшеті без ад125 сорбенту (Nunc #269620), 100 пМ або 26 пМ [ І]антигену змішують з послідовними розведеннями Fab, що представляє інтерес (наприклад, відповідно до оцінок антитіла анти-VEGF, Fab-12, у Presta et al., Cancer Res. 57:4593-99 (1997)). Потім Fab, що представляють інтерес, інкубують протягом ночі; однак інкубування може продовжуватися протягом більш тривалого періоду (наприклад, 65 годин), щоб забезпечити досягнення рівноваги. Після цього суміші переносять на планшет для захоплення, для інкубування при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Потім розчин видаляють, і планшет промивають вісім разів 0,1% розчином Tween-20 у PBS. Потім план 97360 14 шети сушать, додають 150 мкл/ямка сцинтилянту (MicroScint-20; Packard), і планшети рахують на гамма-лічильнику Topcount (Packard) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного з Fab, що дають 20% або менше від максимального зв'язування, вибирають для використання в аналізах конкурентного зв'язування. Відповідно до іншого варіанта здійснення Kd або значення Kd вимірюють за допомогою аналізів з використанням поверхневого плазмонного резонансу, з використанням ВІАcore-2000 або BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С, за допомогою чипів з іммобілізованим антигеном СМ5, при ~10 одиницях відгуку (RU). Коротко, біосенсорні чипи з карбоксиметильованим декстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активують за допомогою N-етил-N'-(3диметиламінопропіл)карбодііміду гідрохлориду (EDC) і N-гідроксисукциніміду (NHS) відповідно до інструкцій виробника. Антиген розбавляють у 10 мМ розчину ацетату натрію, рН 4,8, як 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед інжекцією при швидкості потоку 5 мкл/хвилина, для досягнення приблизно 10 одиниць відгуку (RU) зв'язаного білка. Після інжекції антигену, інжектують 1M етанол аміну для блокування непрореагувавших груп. Для вимірювання кінетики, дворазове послідовне розведення Fab (від 0,78 нМ до 500 нМ) інжектують у PBS з 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°С, при швидкості потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (k on) і швидкості дисоціації (koff) обчислюють з використанням простої моделі зв'язування Лангмюра один до одного (BIAcore Evaluation Software version 3.2) за допомогою одночасної пригонки сенсограми асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) обчислюють як відношення koff/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Якщо швидкість асоціації пе6 -1 -1 ревищує 10 Μ сек , відповідно до аналізу з використанням поверхневого плазмонного резонансу, описаного вище, тоді швидкість асоціації може визначатися за допомогою використання методики гасіння флюоресценції, де вимірюють збільшення або зменшення інтенсивності випромінювання флюоресценції (збудження=295 нм; випромінювання=340 нм, смуговий фільтр, 16 нм) при 25°С для 20 нМ антитіла анти-антиген (форма Fab) у PBS, рН 7,2, у присутності збільшуваних концентрацій антигену, що вимірюють на спектрометрі, такому як спектрофотометр, із зупинкою потоку (Aviv Instruments) або спектрофотометр 8000series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) з червоною кюветою з перемішуванням. "Швидкість прямої реакції" або "швидкість асоціації" або "швидкість зв'язування", або "kon" відповідно до даного винаходу може також визначатися за допомогою тієї ж технології поверхневого плазмонного резонансу, описаної вище, з використанням ВІАcore-2000 або BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С, за допомогою чипів з іммобілізованим антигеном СМ5 при ~10 одиниць відгуку (RU). Коротко, біосенсорні чіпи з карбоксиметильованим декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активують за допомогою N-етил-N'-(3диметиламінопропіл)карбодііміду гідрохлориду (EDC) і N-гідроксисукциніміду(NHS) відповідно до 15 інструкцій виробників. Антиген розбавляють 10 мМ ацетату натрію, рН 4,8, при 5 мг/мл (~0,2 мкМ), перед інжекцією при швидкості потоку 5 мкл/хвилин для досягнення приблизно 10 одиниць відгуку (RU) зв'язаного білка. Після інжекції антигену, інжектують 1M етаноламіну для блокування непрореагувавших груп. Для вимірювань кінетики, дворазові послідовні розведення Fab (від 0,78 нМ до 500 нМ) інжектують у PBS з 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°С, при швидкості потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (kon) і швидкості дисоціації (koff) обчислюють з використанням простої моделі зв'язування Лангмюра один до одного (BIAcore Evaluation Software version 3.2) за допомогою одночасної підгонки сенсограм асоціації і дисоціації. Рівноважна константа дисоціації (Kd) обчислюється як відношення koff/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293:865-81 (1999). б -1 Однак, якщо швидкість асоціації перевищує 10 Μ -1 сек , відповідно до аналізу за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, описаного вище, тоді швидкість асоціації, як правило, визначається за допомогою використання методики гасіння флюоресценції, де вимірюють збільшення або зменшення інтенсивності випромінювання флюоресценції (збудження=295 нм; випромінювання=340 нм, смуговий фільтр, 16 нм) при 25°С для 20 нм антитіла анти-антиген (форма Fab) у PBS, рН 7,2, у присутності збільшуваних концентрацій антигену, які вимірюють на спектрометрі, такому як спектрофотометр, із системою зупинки потоку (Aviv Instruments), або спектрофотометр 8000series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) із перемішуваною кюветою. Термін "вектор", як тут використовується, призначений для згадування молекули нуклеїнової кислоти, здатної переносити іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. Один з типів вектора являє собою "плазміду", що належить до кругової петлі двониткової ДНК, з якою можуть лігуватися додаткові сегменти ДНК. Інший тип вектора являє собою фаговий вектор. Інший тип вектора являє собою вірусний вектор, де додаткові сегменти ДНК можуть лігуватися у вигляді вірусного геному. Визначені вектори здатні до автономної реплікації в клітині-хазяїні, у яку вони вводяться (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальне джерело реплікації, і епісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомальні вектори ссавців) можуть вбудовуватися в геном клітинихазяїна при введенні в клітину-хазяїна, і при цьому вони реплікуються разом з геномом хазяїна. Крім того, визначені вектори здатні направляти експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори згадуються тут як "рекомбінантні вектори експресії" (або просто, "рекомбінантні вектори"). Як правило, вектори експресії, використовувані в технологіях рекомбінантної ДНК, часто знаходяться у формі плазмід. У даному описі, "плазміда" і "вектор" можуть використовуватися взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найбільш часто використовувану форму вектора. "Полінуклеотид" або "нуклеїнова кислота", як тут використовуються взаємозамінно, належать до полімерів з нуклеотидів будь-якої довжини і міс 97360 16 тять у собі ДНК і РНК. Нуклеотиди можуть являти собою дезоксирибонуклеотиди, рибонуклеотиди, модифіковані нуклеотиди або основи, і/або їхні аналоги, або будь-який субстрат, що може включатися в полімер за допомогою ДНК або РНК полімерази або за допомогою реакції синтезу. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди і їхні аналоги. Якщо вона присутня, модифікація структури нуклеотидів може надаватися до або після зборки полімеру. Послідовність нуклеотидів може перериватися ненуклеотидними компонентами. Полінуклеотид може додатково модифікуватися після синтезу, наприклад, за допомогою кон'югування з міткою. Інші типи модифікацій містять у собі, наприклад, "кепування", заміщення одного або декількох існуючих у природі нуклеотидів аналогом, внутрішньонуклеотидні модифікації, такі, наприклад, як модифікації з незарядженими зв'язками (наприклад, метилфосфонати, складні фосфотриефіри, фосфоамідати, карбамати, тощо) і з зарядженими зв'язками (наприклад, фосфоротіоати, фосфородитіоати, тощо), заміщення, що містять бічні залишки, такі, наприклад, як білки (наприклад, нуклеази, токсини, антитіла, сигнальні пептиди, поло-L-лізин, тощо), заміщення інтеркаляторами (наприклад, акридин, псорален, тощо), заміщення, що містять хелатуючі агенти (наприклад, метали, радіоактивні метали, бор, окисні метали, тощо), заміщення, що містять алкілятори, заміщення з модифікованими зв'язками (наприклад, альфа аномерні нуклеїнові кислоти, тощо), а також немодифіковані форми полінуклеотиду (полінуклеотидів). Крім того, будь-які з гідроксильних груп, що звичайно є присутніми у цукрах, можуть замінятися, наприклад, фосфонатними групами, фосфатними групами, захищеними за допомогою стандартних захисних груп або активованими для одержання додаткових зв'язків з додатковими нуклеотидами, або можуть кон'югуватися з твердими або напівтвердими підкладками. Група ОН на 5' і 3' кінцях може бути фосфорильованою або заміщеною амінами або органічними залишками кепуючих груп з 1-20 атомів вуглецю. Інші гідроксили можуть також дериватизовуватися до стандартних захисних груп. Полінуклеотиди можуть також містити аналогічні форми рибозних або дезоксирибозних цукрів, що є, як правило, відомими в даній галузі, включаючи, наприклад, 2'-О-метил-, 2'-Оаліл, 2'-фтор- або 2'-азидо-рибозу, карбоциклічні аналоги цукрів, альфа-аномерні цукру, епімерні цукри, такі як арабіноза, ксилози або ліксози, піранозні цукри, фуранозні цукри, седогептулози, ациклічні аналоги й аналоги з основними нуклеозидами, такі як метилрибозид. Один або декілька зв'язків складних фосфодіефірів може замінятися альтернативними зв'язувальними групами. Ці альтернативні зв'язувальні групи містять у собі, але, не обмежуючи цим, варіанти здійснення, де фосфат заміняється P(O)S ("тіоат"), P(S)S ("дитіоат"), (O)NR2 ("амідат"), P(O)R, P(O)OR', CO або СН2 ("формацеталь"), у якому кожний з R або R' незалежно являє собою Η або заміщений або незаміщений алкіл (1-20 С), який необов'язково містить ефірний (-О-) зв'язок, арил, алкеніл, циклоалкіл, 17 циклоалкеніл або аральдил. Не всі зв'язки в полінуклеотиді повинні бути однаковими. Попередній опис належить до всіх полінуклеотидів, що згадуються тут, включаючи РНК і ДНК. "Олігонуклеотид", як тут використовується, як правило, належить до коротких, як правило, однониткових, як правило, синтетичних полінуклеотидів, що мають, як правило, але, необов'язково, менше, приблизно, ніж 200 нуклеотидів у довжину. Терміни "олігонуклеотид" і "полінуклеотид" не є взаємно виключаючими. Опис вище для полінуклеотидів є в такому ж ступені застосовним і цілком застосовним до олігонуклеотидів. Термін "EGFL7" (взаємозамінно зумовлений як "подібний до епедірмального фактору росту 7"), як тут використовується, належить, якщо тільки конкретно або контекстуально, не вказується іншого, до будь-якого нативного або варіантного (або нативного, або синтетичного) поліпептиду EGFL7, як описується, наприклад, у заявці WO 2005/117968, опис якої включається сюди у всій її повноті для всіх цілей. Термін "нативна послідовність" конкретно охоплює існуючі в природі зрізані або секретовані форми (наприклад, послідовність позаклітинного домену), що існують у природі варіантні форми (наприклад, альтернативно сплайсовані форми) і існуючі в природі алельні варіанти. Термін "EGFL7 дикого типу", як правило, належить до поліпептиду, що містить послідовність амінокислот існуючого в природі білка EGFL7. Термін "послідовність EGFL7 дикого типу" як правило, належить до послідовності амінокислот, що виявляється в існуючих у природі EGFL7. Терміни "антитіло" і "імуноглобулін", використовуються взаємозамінно в найширшому змісті і містять у собі моноклональні антитіла (наприклад, повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, багатовалентні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, остільки, оскільки вони виявляють бажану біологічну активність) і можуть також містити визначені фрагменти антитіл (як тут описується більш докладно). Антитіло може бути людським, гуманізованим і/або являти собою антитіло з дозрілим спорідненістю. Термін "варіабельний" належить до того факту, що визначені частини варіабельних доменів сильно розрізняються по послідовності для різних антитіл і використовуються при зв'язуванні і специфічності кожного конкретного антитіла до його конкретного антигену. Однак варіабельність не є рівномірно поширеною по варіабельних доменах антитіл. Вона концентрується в трьох сегментах, які називаються областями, що визначають комплементарність (CDR) або гіперваріабельними областями, у варіабельних доменах, як легких ланцюгів, так і важких ланцюгів. У більшому ступені частини, що зберігаються, варіабельних доменів називаються рамкою (FR). Варіабельні домени нативних важких і легких ланцюгів містять, кожний, по чотири FR області, здебільшого, які приймають -складчасту конфігурацію, що з'єднуються трьома CDR, що утворюють петлі, які з'єднують складчасту структуру, а в деяких випадках, що утворюють частину -складчастої структури. CDR 97360 18 у кожному ланцюзі утримуються разом, у тісній близькості за допомогою FR областей, і разом з CDR від іншого ланцюга, вносячи внесок в утворення сайта зв'язування антигену в антитіла (див. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константні домени не втягуються безпосередньо в зв'язування антитіла з антигеном, але демонструють різноманітні ефекторні функції, такі як участь антитіла в залежній від антитіла клітинній токсичності. Папаїновий гідроліз антитіл дає два ідентичних фрагменти зв'язування антигену, які називаються фрагментами "Fab", кожний, з одним сайтом зв'язування антигену, і залишковий фрагмент "Fc", найменування якого відбиває його здатність до легкої кристалізації. Обробка пепсином дає фрагмент F(ab')2, що має два сайги, які об'єднують антигени, і є як і раніше здатним до поперечного зв'язування антигенів. "Fv" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, що містить повний сайт розпізнавання і зв'язування антигену. У дволанцюжкових частинках Fv, ця область складається з димера варіабельних доменів одного важкого й одного легкого ланцюга в міцній, нековалентній асоціації. В одноланцюжкових частинках Fv, варіабельні домени одного важкого й одного легкого ланцюга можуть ковалентно зв'язуватися за допомогою гнучкого пептидного лінкера, так що легкий і важкий ланцюги можуть асоціюватися в "димерну" структуру, аналогічну структурі дволанцюжкових частинок Fv. У цій конфігурації здійснюється те, що три CDR кожного варіабельного домену взаємодіють з визначенням сайта зв'язування антигену на поверхні димера VH-VL. Колективно, шість CDR визначають специфічність антитіла при зв'язуванні антигену. Однак, навіть окремий варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три CDR, специфічних до антигену) має здатність розпізнавати і зв'язувати антиген, хоча і з більш низькою спорідненістю, ніж сайт зв'язування в цілому. Фрагмент Fab також містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (CH1) важкого ланцюга. Фрагменти Fab' відрізняються від фрагментів Fab додаванням декількох залишків на карбокси-кінці домену CH1 важкого ланцюга, що містить один або декілька цистеїнів із шарнірної області антитіла. Тут Fab'-SH являє собою позначення для Fab', у якому цистеїновий залишок (залишки) константних доменів несе вільну тіольну групу. Фрагменти F(ab')2 антитіла початково продукуються як пари фрагментів Fab', що мають шарнірні цистеїни між ними. Відомі також інші хімічні зв'язки фрагментів антитіл. "Легкі ланцюги" антитіл (імуноглобулінів) з будь-яких зчленованих частинок можуть бути приписані до одного з двох типів, що чітко розрізняються, які називаються каппа () і лямбда (), на основі послідовностей амінокислот їхніх константних доменів. У залежності від послідовності амінокислот константного домену їхніх важких ланцюгів, імуноглобуліни можуть бути приписані до різних класів. Існує п'ять головних класів імуноглобулінів: IgA, 19 IgD, IgE, IgG i IgM, і деякі з них можуть бути додатково розділені на підкласи (ізотипи), наприклад, lgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Константні домени важких ланцюгів, що відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються , , ,  і , відповідно. Структури субодиниць і тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі. "Фрагменти антитіла" містять тільки частину інтактного антитіла, де частина переважно зберігає щонайменше одну, переважно, більшість або усі функції, звичайно пов'язані з цією частиною, коли вона присутня в інтактному антитілі. Приклади фрагментів антитіл містять у собі фрагменти Fab, Fab', F(ab')2, і Fv; подвійні антитіла; лінійні антитіла; одноланцюжкові молекули антитіл і мультиспецифічні антитіла, сформовані з фрагментів антитіл. В одному з варіантів здійснення, фрагмент антитіла містить сайт зв'язування антигену інтактного антитіла й у такий спосіб зберігає здатність до зв'язування антигену. В іншому варіанті здійснення, фрагмент антитіла, наприклад, такий, який містить область Fc, зберігає щонайменше одну з біологічних функцій, зв'язуються звичайно з областю Fc, коли вона присутня в інтактному антитілі, таку як зв'язування FcRn, модулювання половинного часу життя антитіла, функція ADCC і комплементарне зв'язування. В одному з варіантів здійснення, фрагмент антитіла являє собою одновалентне антитіло, що має половинний час життя in vivo по суті подібний з інтактним антитілом. Наприклад, такий фрагмент антитіла може містити плече для зв'язування антигену, зв'язане з послідовністю Fc, здатною забезпечити стабільність фрагмента in vivo. Термін "гіперваріабельна область", "HVR" або "HV", коли тут використовуються, належить до областей варіабельного домену антитіла, що є гіперваріабельними в послідовності і/або утворюють структурно визначені петлі. Як правило, антитіла містять шість гіперваріабельних областей; три в VH (H1, Н2, H3), і три в VL (L1, L2, L3). Ряд трансдиференціювань гіперваріабельних областей використовується й охоплюється тут. Області, що визначають комплементарність (CDR) згідно з Kabat ґрунтуються на варіабельності послідовності і використовуються найчастіше (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia згадує, замість цього, положення структурних петель (Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987)). Гіперваріабельні області AbM являють собою деякий компроміс між CDR згідно з Kabat і структурними петлями згідно з Chothia, і використовуються програмним забезпеченням для моделювання антитіл Oxford Molecular's AbM. "Контактні" гіперваріабельні області ґрунтуються на аналізі доступних складних кристалічних структур. Гіперваріабельні області можуть містити "розширені гіперваріабельні області" у такий спосіб: 24-36 (L1), 46-56 (L2) і 89-97 (L3) у VL і 26-35 (H1), 49-65 або 50-65 (Н2) і 93-102 (H3) у VH. Залишки варіабельних доменів нумеруються відповідно до Kabat et al., вище, для кожного з цих визначень. 97360 20 Залишки "рамок" або "FR" являють собою залишки варіабельних доменів, інші, ніж залишки гіперваріабельних областей, як тут визначається. "Гуманізовані" форми антитіл не-людини (наприклад, мишей) являють собою химерні антитіла, що містять мінімальну послідовність, отриману з імуноглобуліну не-людини. Здебільшого, гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (антитіла реципієнта), у яких залишки з гіперваріабельної області реципієнта заміняються залишками з гіперваріабельної області видів нелюдини (донорні антитіла), наприклад, миші, щура, кролика або примата не-людини, які мають бажану специфічність, спорідненість і ємність. У деяких випадках, залишки області рамки (FR) імуноглобуліну людини заміняють відповідними залишками не-людини. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, що не виявляються в антитілі реципієнта або в антитілі донора. Ці модифікації робляться для додаткового обмеження робочих характеристик антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло буде містити по суті всі щонайменше з одного, а, як правило, двох варіабельних доменів, у яких усі або по суті всі гіперваріабельні петлі відповідають імуноглобуліну не-людини і всі або по суті всі FR відповідають послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло необов'язково буде також містити щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Fc), як правило, імуноглобуліну людини. Щодо додаткових деталей див. Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-29 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96 (1992). Див. також наступні оглядові статті і джерела, цитовані в них: Vaswani & Hamilton, Arm. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-15 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-38 (1995); Hurle & Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-33 (1994). "Химерні" антитіла (імуноглобуліни) мають частину важкого і/або легкого ланцюга, ідентичну або гомологічну відповідним послідовностям в антитілах, отриманих від конкретних видів або приналежних до конкретного класу або підкласу антитіл, у той час як частина ланцюга (ланцюгів), яка залишилася, є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, отриманих від інших видів або приналежних іншому класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, остільки, оскільки вони виявляють бажану біологічну активність (заявка на патент США № 4816567; і Morrison et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 81:68516855 (1984)). Гуманізоване антитіло, як тут використовується, являє собою підклас химерних антитіл. Фрагменти "одноланцюжкових Fv" або "scFv" антитіл містять домени VH і VL антитіла, де ці домени присутні в одному поліпептидному ланцюзі. Як правило, поліпептид scFv додатково містить поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, що дозволяє scFv формувати бажану структуру для зв'язування антигену. Щодо огляду по scFv див. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). 21 "Антиген" являє собою заданий антиген, з яким антитіло може селективно зв'язуватися. Цільовий антиген може являти собою поліпептид, вуглевод, нуклеїнову кислоту, ліпід, гаптен або іншу існуючу в природі або синтетичну сполуку. Як правило, цільовий антиген являє собою поліпептид. "Епітоп" являє собою частину антигену, з яким селективно зв'язується антитіло. Для поліпептидного антигену, епітоп, як правило, являє собою частину пептиду приблизно з 4-10 амінокислот. Термін "подвійні антитіла" належить до малих фрагментів антитіл із двома сайтами зв'язування антигенів, ці фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в один і той самий поліпептидний ланцюг (VH-VL). Якщо використовувати лінкер, який є занадто коротким, щоб уможливити спарювання між двома доменами на одному і тому ж ланцюзі, домени примушуються до спарювання з комплементарними доменами іншого ланцюга й утворюють два сайти зв'язування з антигенами. Подвійні антитіла описуються більш докладно, наприклад, у ЕР 404097; у заявці WO 93/11161 і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-48 (1993). "Антитіло людини" являє собою таке антитіло, що має послідовність амінокислот, яка відповідає послідовності антитіла, що продукується людиною, і/або виготовляється з використанням будь-якої з технологій для одержання антитіл людини, як тут описується. Це визначення антитіла людини конкретно виключає гуманізоване антитіло, що містить залишки зв'язування з антигеном не-людини. Антитіло "з дозрілою спорідненістю" являє собою антитіло з однією або декількома змінами в одному або декількох його CDR, що приводить до поліпшення спорідненості антитіла до антигену, у порівнянні з вихідним антитілом, що не має таку зміну (зміни). Переважні антитіла з дозрілою спорідненістю будуть мати наномолярну або навіть пікомолярну спорідненість до цільового антигену. Дозрілі для спорідненості антитіла одержують за допомогою процедур, відомих у даній галузі. Marks et al. Bio/Technology 10:779-83 (1992) описує дозрівання спорідненості за допомогою шафлінгу VH і VL доменів. Неупорядкований мутагенез CDR і/або рамкових залишків описується: Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-13 (1994); Schier et al. Gene 169:147-55 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-19 (1995); і Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-96 (1992). "Ефекторні функції" антитіла належать до його біологічних активностей, приписуваних області Fc (нативній області з послідовністю Fc або області Fc з варіантом послідовності амінокислот) антитіла, і вони змінюються з ізотипом антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла містять у собі: зв'язування C1q і комплемент-залежну цитотоксичність; зв'язування рецепторів Fc; антитілозалежну клітинно-зумовлену цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; негативну регуляцію поверхневих рецепторів клітини (наприклад, рецепторів В лімфоцитів) і активування В лімфоцитів. 97360 22 "Антитілозалежна клітинно-зумовлена цитотоксичність" або "ADCC" належить до форми цитотоксичності, при якій секретований Ig зв'язується з рецепторами Fc (FcR), які присутні на визначених цитотоксичних клітинах (наприклад, на клітинах природних кілерів (NK), нейтрофілах і макрофагах), вони дають можливість цим цитотоксичним ефекторним клітинам специфічно зв'язуватися з несучою антиген цільовою клітиною, а згодом знищувати цільову клітину за допомогою цитотоксинів. Антитіла утворюють "плече" цитотоксичних клітин і є абсолютно необхідними для такого знищення. Первинні клітини для опосередкування ADCC, клітини NK, експресують тільки FcRIII, у той час як моноцити експресують FcRI, FcRII і FcRIII. Експресування FcR на гематопоетичних клітинах приводиться в Таблиці 3 на сторінці 464, у Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Для оцінки активності ADCC молекули, що представляє інтерес, може здійснюватися аналіз ADCC in vitro, такий як описується в заявці на патент США № 5500362 або 5821337 або в заявці на патент США № 6737056, Presta. Корисні ефекторні клітини для таких аналізів містять у собі мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) і клітини природних кілерів (NK). Альтернативно, або на додаток до цього, активність при ADCC у молекул, що представляють інтерес, може оцінюватися in vivo, наприклад, на тваринній моделі, такій як, та, яка описується в Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-56 (1998). "Ефекторні клітини людини" являють собою лейкоцити, що експресують один або декілька Fc і здійснюють ефекторні функції. Переважно, клітини експресують щонайменше FcRIII і здійснюють ефекторну функцію ADCC. Приклади лейкоцитів людини, що медіюють ADCC, містять у собі мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС), клітини природних кілерів (NK), моноцити, цитотоксичні Τ лімфоцити і нейтрофіли; при цьому РВМС і клітини ΝΚ є переважними. Ефекторні клітини можуть виділятися з нативного джерела, наприклад, із крові. "Рецептор Fc" або "FcR" описує рецептор, який зв'язується з областю Fc антитіла. Переважний FcR являє собою FcR людини з нативною послідовністю. Крім того, переважний FcR являє собою такий, який зв'язується з антитілом IgG (гамма рецептором) і містить у собі рецептори підкласів FcRI, FcRII і FcRIII, включаючи алельні варіанти й альтернативно сплайсовані форми цих рецепторів. Рецептори FcRII містять у собі FcRIIA ("активуючий рецептор") і FcRIIB ("інгібуючий рецептор"), яка мають подібні послідовності амінокислот, які розрізняються в основному у своїх цитоплазматичних доменах. Активуючий рецептор FcRIIA містить мотив активування імунорецептора на основі тирозину (ІТАМ) у своєму цитоплазматичному домені. Інгібуючий рецептор FcRIIB містить мотив інгібування імунорецептора на основі тирозину (ІТІМ) у своєму цитоплазматичному домені, (див. огляд у М. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-34 (1997)). Fc обговорюються в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 23 і в de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Інші FcR, включаючи ті, які повинні бути ідентифіковані в майбутньому, охоплюються тут терміном "FcR". Термін також містить у собі неонатальний рецептор, FcRn, що є відповідальним за перенесення IgG від матері до зародка (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) і Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) і регулює гомеостаз імуноглобулінів. Заявка WO 00/42072 (Presta) описує варіанти антитіл з поліпшеним або зменшеним зв'язуванням FcR. Зміст цієї публікації конкретно включається сюди у вигляді посилання. Див., також, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Способи вимірювання зв'язування з FcRn відомі (див., наприклад, Ghetie and Ward Immunol. Today 18:592-8 (1997)). Зв'язування з FcRn людини in vivo і половинний час життя в сироватці поліпептидів з високою спорідненістю зв'язування з FcRn людини може аналізуватися, наприклад, на трансгенних мишах або на трансфікованих лініях клітин людини, які експресують FcRn людини, або на приматах, яким уводять поліпептиди варіантів Fc. "Комплемент-залежна цитотоксичність" або "CDC" належить до лізису цільової клітини в присутності комплементу. Активування класичного шляху комплементу ініціюється за допомогою зв'язування першого компонента системи комплементу (C1q) з антитілами (з відповідного підкласу), що зв'язуються з їхнім когнатним антигеном. Для оцінки активування комплементу, може здійснюватися аналіз CDC, наприклад, як описується в J. Immunol. Methods 202:163 (1996), Gazzano-Santoro et al. Варіанти поліпептидів зі зміненими послідовностями амінокислот області Fc і збільшеною або зменшеною здатністю до зв'язування C1q описуються в заявці на патент США №6194551В1 ів заявці WO 99/51642. Зміст цих патентних публікацій конкретно включається сюди у вигляді посилань. Див., також, Idusogie et al., J. Immunol. 164: 417884 (2000). "Блокуюче антитіло" або антитіло "антагоніст" являє собою таке антитіло, яке інгібує або зменшує біологічну активність антигену, з яким воно зв'язується. Переважні блокуючі антитіла або антитіла антагоністи по суті або повністю інгібують біологічну активність антигену. "Розлад" або "захворювання" являють собою будь-який стан, що може поліпшуватися від лікування за допомогою речовини/молекули або способу за даним винаходом. Воно містить у собі хронічні і гострі розлади або захворювання, включаючи в себе такі патологічні стани, які викликають схильність у ссавця до розглянутого розладу. Необмежуючі приклади розладів, що можуть лікуватися тут, містять у собі злоякісні і доброякісні пухлини; карциному, бластому і саркому. Терміни "клітинний проліферативний розлад" і "проліферативний розлад" належать до розладів, що пов'язані з деяким рівнем аномальної проліферації клітин. В одному з варіантів здійснення, клітинний проліферативний розлад являє собою рак. "Пухлина", як тут використовується, належить до будь-якого росту клітин новоутворення і їхніх 97360 24 проліферацій, або злоякісної або доброякісної, і до всіх предракових і ракових клітин і тканин. Терміни "рак", "раковий", "клітинний проліферативний розлад", "проліферативний розлад" і "пухлина" не є взаємовиключними при згадуванні тут. Терміни "рак" і "раковий" згадують або описують фізіологічний стан у ссавців, що, як правило, відрізняється нерегульованим ростом/проліферацією клітин. Приклади раку містять у собі, але, не обмежуючи цим, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкемію. Більш конкретні приклади таких ракових захворювань містять у собі сквамозно-клітинний рак, дрібноклітинний рак легень, рак гіпофіза, рак стравоходу, астроцитому, саркому м'яких тканин, недрібноклітинний рак легень, аденокарциному легень, сквамозну карциному легень, рак черевної порожнини, рак клітин печінки, рак шлунково-кишкових органів, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак грудей, рак товстої кишки, рак товстої і прямої кишки, ендометріальну карциному або карциному матки, карциному слинних залоз, рак нирок, рак печінки, рак простати, рак жіночих статевих органів, рак щитовидної залози, карциному печінки, рак мозку, ендометріальний рак, рак яєчка, холангіокарциному, карциному жовчного міхура, рак шлунку, меланому і різні типи раку голови і шиї. Дизрегуляція ангіогенезу може привести до того, що багато розладів можуть лікуватися за допомогою композицій і способів за даним винаходом. Ці розлади містять у собі стани, як не пов'язані з новоутвореннями, так і пов'язані з ними. Пов'язані з новоутвореннями стани містять у собі, але, не обмежуючи цим, ті які описуються вище. Не пов'язані з новоутвореннями розлади містять у собі, але, не обмежуючи цим, небажану або аберантну гіпертрофію, артрит, ревматоїдний артрит (RA), псоріаз, псоріатичні бляшки, саркоїдоз, атеросклероз, атеросклеротичні бляшки, діабетичні й інші проліферативні ретинопатії, включаючи передчасну ретинопатію, ретролентальну фіброплазію, неоваскулярну глаукому, вікову макулярну дегенерацію, діабетичний макулярний набряк, корнеальну неоваскуляризацію, неоваскуляризацію корнеального трансплантата, відторгнення корнеального трансплантата, ретинальну/хороїдальну неоваскуляризацію, неоваскуляризацію райдужного-рогівкового кута (рубеоз), окулярне неоваскулярне захворювання, судинний рестиноз, артеріовенозні мальформації (AVM), менінгіому, гемангіому, ангіофіброму, гіперплазію щитовидної залози (включаючи хворобу Граве), трансплантацію корнеальних і інших тканин, хронічне запалення, запалення легень, гостре ушкодження легень/ARDS, сепсис, первинну пульмонарну гіпертонію, злоякісні пульмонарні ефузії, набряк мозку (наприклад, пов'язаний з гострим інсультом/закритим ушкодженням голови/травмою), синовіальне запалення, утворення пануса при RA, осифікантний міозит, гіпертрофічне утворення кіст, остеоартрит (ОА), резистенті асцити, поліцистозне захворювання яєчників, ендометріоз, захворювання, асоційовані з проникненням рідин в об'єми (панкреатит, компартмент 25 синдром, опіки, захворювання шлунку), маткові фіброїди, передчасні пологи, хронічне запалення, таке як IBD (хвороба Крона і виразковий коліт), відторгнення пересадженої нирки, запальне захворювання шлунку, нефротичний синдром, небажаний або аберантний ріст маси тканин (не раковий), гемофільні суглоби, гіпертрофовані рубці, уповільнення росту волосся, синдром ОслераВебера, піогенну гранульому, ретролентальні фіброплазії, склеродерму, трахому, судинні адгезії, синовіт, дерматит, прееклампсію, асцити, перикардіальну ефузію (таку як пов'язана з перикардитом) і плевральну ефузію. Термін "виснажуючий" розлад (наприклад, виснажуючий синдром, кахеція, саркопенія) належить до розладу, що викликає небажану і/або нездорову втрату маси втрату або маси клітин тіла. У людей похилого віку, а також при СНІДі й у хворих раком, виснажуюче захворювання може приводити до небажаної втрати маси тіла, включаючи як жирові, так і такі, які не містять жиру відділи. Виснажуючі захворювання можуть бути результатом неадекватного прийому їжі і/або метаболічних змін, пов'язаних із хворобливими і/або віковими процесами. Хворі раком і хворі СНІДом, а також пацієнти після великого хірургічного втручання або які мають хронічні інфекції, імунологічні захворювання, гіпертироїдизм, хворобу Крона, психогенне захворювання, хронічну серцеву недостатність або яку-небудь серйозну травму, часто страждають від виснажуючого захворювання, що іноді також згадується як кахеція, метаболічний, а іноді, пов'язаний з прийомом їжі, розлад. Кахеція додатково відрізняється гіперметаболізмом і гіперкатаболізмом. Хоча терміни кахеція і виснажуюче захворювання часто використовуються взаємозамінно для згадування станів виснаження, є щонайменше один набір досліджень, що відрізняють кахецію від синдрому виснаження як утрати жирової маси, і зокрема, маси клітин тіла (Mayer, J. Nutr. 129 (IS Suppl.):256S-59S (1999)). Саркопенія, ще один такий розлад, що може впливати на літніх індивідуумів, як правило, характеризується втратою м'язової маси. Виснажуюче захворювання у кінцевій стадії, як описується вище, може розвитися в індивідуумів, що страждають або від кахеції, або від саркопенії. Як тут використовується, "лікування" належить до клінічного втручання в спробі змінити природний хід подій для індивідуума або клітини, яких лікують, і може здійснюватися або для профілактики, або в ході клінічної патології. Бажані ефекти лікування містять у собі запобігання появи або повторної появи захворювання, ослаблення симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків захворювання, зменшення швидкості розвитку захворювання, ослаблення або поліпшення стану захворювання і ремісію або поліпшення прогнозу. У деяких варіантах здійснення, антитіла за даним винаходом використовуються для продовження розвитку захворювання або розладу. "Індивідуум", "суб'єкт" або "пацієнт" являє собою хребетне, наприклад ссавця, включаючи зокрема людину. Ссавці містять у собі, але, не обме 97360 26 жуючи цим, людей, домашніх і сільськогосподарських тварин, і тварин із зоопарків, спортивних установ, або кімнатних тварин, таких як собаки, коня, кішки, корови, тощо. "Ефективна кількість" належить до кількості, ефективній при таких дозуваннях і протягом таких періодів часу, що необхідні для досягнення бажаного терапевтичного або профілактичного результату. "Терапевтично ефективна кількість" речовини/молекул за даним винаходом, агоніста або антагоніста, може змінюватися відповідно до таких факторів, як стан захворювання, вік, стать і маса індивідуума, і здатність речовини/молекули, агоніста або антагоніста, викликати бажану реакцію в індивідуума. Терапевтично ефективна кількість також являє собою таку, при якій будь-які токсичні або шкідливі впливи речовини/молекули, агоніста або антагоніста, переважуються терапевтично корисними впливами. "Профілактично ефективна кількість" належить до кількості, ефективній при таких дозуваннях і протягом таких періодів часу, що необхідні для досягнення бажаного профілактичного результату. Коли профілактична доза використовується для суб'єктів до захворювання або на його ранній стадії, профілактично ефективна кількість, як правило, але, необов'язково, буде меншою, ніж терапевтично ефективна кількість. Термін "цитотоксичний агент" як тут використовується, належить до речовини, яка інгібує або запобігає функціонуванню клітин і/або викликає руйнування клітин. Термін призначений для включення в нього радіоактивних ізотопів (наприклад, 211 131 125 90 186 188 153 212 32 At , I , I , Y , Re , Re , Sm , Ві , Ρ і радіоактивних ізотопів Lu), хіміотерапевтичних агентів, наприклад, метотрексату, адриаміцину, алкалоїдів вінка (вінкристину, вінбластину, етопозиду), доксорубіцину, мелфалану, мітоміцину С, хлорамбуцилу, даунорубіцину або інших інтеркалюючих агентів, ферментів і їх фрагментів, таких як нуклеотичні ферменти, антибіотики і токсини, такі як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їхні фрагменти і/або варіанти, і різноманітні протипухлинні або протиракові агенти, описані нижче. Інші цитотоксичні агенти описуються нижче. Туморицидний агент викликає руйнування клітин пухлини. "Хіміотерапевтичний агент" являє собою хімічну сполуку, придатну для використання при лікуванні раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів містять у собі алкілуючі агенти, такі як тіотепа і циклофосфамід CYTOXAN; алкілсульфонати, такі як бісульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбохон, метуредопа й уредопа; етиленаміни і метиламеламіни, що включають у себе альтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилоломеламін; ацетогеніни (зокрема, булатацин і булатацинон); дельта-9тетрагідроканабінол (дронабінол, MARINOL); бета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулінову кислоту; камптотецин (що включає в себе синтетич 27 ний аналог топотекану (HYCAMTIN), СРТ-11 (іринотекан, CAMPTOSAR), ацетилкаптотецин, скополектин і 9-амінокаптотецин); бріостатин; калістатин; СС-1065 (що включає в себе його синтетичні аналоги адозелезин, карзелезин і безелезин); подофілотоксин; подофілинову кислоту; теніпозид; криптофіцини (зокрема, криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (що включає в себе синтетичні аналоги, KW-2189 і СВ1-ТМ1); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктиїн; спонгістатин; азотні іприти, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфостамід, мехлоретамін, мехлоретамін оксид гідрохлорид, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урациловий іприт; нітрозоасечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімнустин; антибіотики, такі як енедиїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, зокрема, каліхеаміцин гамма II і каліхеаміцин омега II (див., наприклад, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)); динеміцин, що включає в себе динеміцин А; еспераміцин; а також неокарзиностатиновий хромофор і споріднені хромопротеїнові хромофори на основі антибіотика енедиїну), аклацитомізини, актиноміцин, атраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карминоміцин, карзинофілін, хромоміцин, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN доксорубіцин (що включає в себе морфоліно-доксорубіцин, ціаноморфолінодоксорубіцин, 2-піроліно-доксорубіцин і деоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенольну кислоту, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурину, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дідеоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, дромостанолон пропіонат, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; антиадренальні препарати, такі як аміноглютетимід, мітота, трилостан; поповнювач фолієвої кислоти, такі як фролінова кислота; ацеглатон; альдофосфамід глікозид; амінолевулинову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазихон; елфорнітин; еліптиній ацетат; епотилон; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лонідаїнін; майтанзиноїди, такі як майтансин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; 2-етилгідразид; прокарбазин; комплекс полісахаридів PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонову кислоту; триазихон; 2,2',2''-трихлортриетиламін; трихотени (зокрема, Т-2 токсин, верацурин А, роридин А і ангуїдин); уретан; віндезин (ELDISINE, 97360 28 FILDESIN); дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Аrа-С"); тіотепа; таксоїди, наприклад, TAXOL паклітаксел (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), який не містить Cremophor від ABRAXANE, препарат паклітакселу на основі наночастинок альбуміну (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) і доксетаксел TAXOTERE (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабін (GEMZAR); 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин (VELBAN); платину; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин (ONCOVIN); оксаліплатин; лейкововін; вінорельбін (NAVELBESIE); новантрон; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; ібандронат; інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; капецитабін (XELODA); фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої з речовин, зазначених вище; а також сполучення двох або більше з речовин, зазначених вище, такі як CHOP, абревіатура для сумісної терапії з циклофосфаміду, доксорубіцину, вінкристину, і преднізолону, і FOLFOX, абревіатура для режиму лікування за допомогою оксаліплатину (ELOXATIN), сумісного з 5-FU і лекововіном. Також включеними в це визначення є антигормональні агенти, що діють, регулюючи, зменшуючи, блокуючи або інгібуючи дії гормонів, що можуть сприяти росту раку, і часто присутні у формі системного або призначеного для організму в цілому лікування. Вони можуть являти собою гормони самі по собі. Приклади містять у собі антиестрогени і селективні модулятори рецепторів естрогенів (SERMs), що включають у себе, наприклад, тамоксифен (що включає в себе тамоксифен NOLVADEX), ралоксифен EVISTA, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і тореміфен FARESTON; антипрогестерони; негативні регулятори рецепторів естрогенів (ERD); агенти, що функціонують, придушуючи або виключаючи яєчники, наприклад, агоністи гормону, лютеїнізуючого релізинг-гормону (LHRH), такі як LUPRON і лейпролід ацетат ELIGARD, гозерелін ацетат, бузерелін ацетат і триптерелін; інші антиандрогени, такі як флютамід, нілютамід і бікалютамід; і інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, який регулює продукування естрогенів у надниркових залозах, такі як, наприклад, 4(5)-імідазоли, аміноглютетимід, мегестроол ацетат MEGASE, ексеместан AROMASIN, форместани, фадрозол, ворозол RJVISOR, летрозол FEMARA і анастрозол ARIMIDEX. На додаток до цього, таке визначення хіміотерапевтичних агентів містить у собі бісфосфонати, такі як клодронат (наприклад, BONEFOS або OSTAC), етидронат DIDROCAL, NE-58095, золендронову кислоту/золедронат ZOMETA, алендронат FOSAMAX, памідронат AREDIA, тилудронат SKELID або ризедронат ACTONEL; а також троксацитабін (аналог 1,3-діоксолан-нуклеозида 29 цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, зокрема такі, які інгібують експресію генів у шляхах передачі сигналів, що беруть участь у проліферації аберантних клітин, такі, наприклад, як РKС-альфа, Raf, H-Ras і рецептор епідермального фактора росту (EGF-R); вакцини, такі як вакцина THERATOPE і вакцини для генної терапії, наприклад, вакцина ALLOVECTIN, вакцина LEUVECTIN і вакцина VAXID; інгібітор топоізомерази 1 LURTOTECAN; ABARELIX rmRH; лапатиніб дитосилат (ЕrbВ-2 і низькомолекулярний подвійний інгібітор тирозинкінази EGFR, також відомий як GW572016); і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої сполуки, зазначеної вище. "Агент, інгібуючий ріст", коли тут використовується, належить до сполуки або композиціїї, що інгібує ріст клітин (таких як клітини, які експресують EGFL7) або in vitro, або in vivo. Таким чином, агент, інгібуючий ріст, може являти собою інгібітор, що значно знижує відсоток клітин (таких як клітини, які експресують EGFL7) у S-фазі. Приклади агентів, інгібуючих ріст, містять у собі агенти, що блокують розвиток клітинного циклу (у місці, іншому, ніж S-фаза), такі як агенти, що індукують припинення G1 і припинення М-фази. Класичні блокатори М-фази містять у собі алколоїди барвінку (вінкристин І вінбластин), таксани й інгібітори тоізомерази II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. Ті агенти, які призупиняють G1, також викликають попутно призупинення в S-фазі, наприклад, агенти, алкілуючі ДНК, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, мехлоретамін, цисплатин, метотрексат, 5фторурацил і аrа-С. Крім того, інформацію можна знайти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami el al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), зокрема, на p. 13. Таксани (паклітаксел і доцетаксел) являють собою протиракові лікарські засоби, обидва вони отримані з тисового дерева. Доцетаксел (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer), отриманий з європейського тису, є напівсинтетичним аналогом паклітакселу (TAXOL, Bristol-Myers Squibb). Паклітаксел і доцетаксел сприяють зборці мікротрубочок з тубулінових димерів і стабілізують мікротрубочки за допомогою запобігання деполімеризації, що приводить до інгібування мітозу в клітинах. "Доксорубіцин" являє собою антрацикліновий антибіотик. Повне хімічне найменування доксорубіцину являє собою (8S-цис)-10-[(3-аміно-2,3,6тридеокси-(-L-ліксо-гексапіранозил)окси]-7,8,9,10тетрагідро-6,8,11-тригідрокси-8-(гідроксіацетил)-1метокси-5,12-нафтацендіон. Термін "область поліпептиду, що містить Fc" належить до поліпептиду, такого як антитіло або імуноадгезин (див. визначення тут), що містить область Fc. С-кінцевий лізин (залишок 447 відповідно до системи нумерації ЄС) області Fc може бути вилучений, наприклад, під час очищення поліпептиду або за допомогою рекомбінантного одержання за допомогою генної інженерії нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид. Відповідно, компо 97360 30 зиція, яка містить поліпептид, що має область Fc відповідно до даного винаходу, може містити поліпептиди з K447, де всі K447 видаляються, або суміш поліпептидів із залишком K447 і без нього. Композиції за даним винаходом і способи їхнього одержання Даний винахід охоплює композиції, що включають у себе фармацевтичні композиції, які містять антитіло анти-EGFL7; і полінуклеотиди, які містять послідовності, що кодують антитіло антиEGFL7. Як тут використовується, композиції містять одне або декілька антитіл, що зв'язуються з EGFL7, і/або один або декілька полінуклеотидів, що містить послідовності, які кодують одне або декілька антитіл, що зв'язуються з EGFL7. Ці композиції можуть додатково містити відповідні носії, такі як фармацевтично прийнятні ексципієнти, що включають у себе буфери, які добре відомі в даній галузі. Даний винахід також охоплює варіанти здійснення виділеного антитіла і полінуклеотиду. Даний винахід також охоплює по суті чисте антитіло і варіанти здійснення полінуклеотидів. Антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом є переважно моноклональними. Також охопленими в рамках даного винаходу є фрагменти Fab, Fab', Fab'-SH і F(ab')2 антитіл анти-EGFL7, представлені тут. Ці фрагменти антитіла можуть створюватися за допомогою традиційних засобів, таких як ферментативний гідроліз, або можуть генеруватися за допомогою рекомбінантних технологій. Такі фрагменти антитіл можуть бути химерними або гуманізованими. Ці фрагменти є придатними для діагностичних і терапевтичних цілей, приведених нижче. Моноклональні антитіла одержують з популяцій по суті гомогенних антитіл, тобто, індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є ідентичними за винятком можливих існуючих у природі мутацій, що можуть бути присутніми у невеликих кількостях. Таким чином, прикметник "моноклональний" указує на характер антитіла, що не є сумішшю дискретних антитіл. Моноклональні антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом можуть бути отримані з використанням гібридомного способу, вперше описаного Kohler et al., Nature 256:495 (1975), або можуть бути отримані за допомогою способів рекомбінантної ДНК (заявка на патент США № 4816567). У гібридомному способі, миша або інша відповідна тварина хазяїн, така як хом'ячок, імунізується для одержання лімфоцитів, що продукують або можуть продукувати антитіла, що будуть специфічно зв'язуватися з білком, використовуваним для імунізації. Антитіла до EGFL7, як правило, виникають у тварин під дією множини підшкірних (sc) або внутрішньоочеревинних (ір) ін'єкцій EGFL7 і ад'юванта. EGFL7 можуть бути отримані з використанням способів, добре відомих у даній галузі, деякі з них додатково описуються тут. Наприклад, рекомбінантне продукування EGFL7 описується нижче. В одному з варіантів здійснення, тварини імунізуються за допомогою похідного EGFL7, що містить позаклітинний домен (ECD) EGFL7, злитий з частиною Fc важкого ланцюга імуноглобуліну. В одному з варіантів здійснення, тварини імунізу 31 ються за допомогою білка злиття EGFL7-lgG1. Тварини звичайно імунізуються проти імуногенних кон'югатів або похідних EGFL7 за допомогою монофосфорилліпіду А (МРL)/трегалоза дикриноміколяту (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT), і розчин уживають для інтрадермальної ін'єкції в множини місць. Через два тижні тварини піддаються повторній стимуляції. Через 714 днів у тварин відбирають кров і аналізують сироватку на титри анти-EGFL7. Тварин піддають повторній стимуляції до досягнення плато титрування. Альтернативно, лімфоцити можуть імунізуватися in vitro. Лімфоцити потім зливають із клітинами мієломи з використанням відповідного агента для злиття, такого як поліетиленгліколь, з формуванням гібридомних клітин (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Гібридомні клітини, отримані таким чином, висіваються і вирощуються у відповідному культурному середовищі, що переважно містить одну або декілька речовин, що інгібують ріст або виживаність не злитих, вихідних клітин мієломи. Наприклад, якщо у вихідних клітинах мієломи відсутній фермент гіпоксантин гуанін фосфорибозил трансфераза (HGPRT або HPRT), культурне середовище для гібридом, як правило, буде містити гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (середовище HAT), ці речовини запобігають ріст HGPRT-дефіцитних клітин. Переважні клітини мієломи являють собою такі клітини, що ефективно зливаються, підтримують на стабільно високому рівні продукування антитіла вибраними антитіло-продукуючими клітинами і є чутливими до середовища, такого як середовище HAT. Серед них, переважні лінії клітин мієломи являють собою лінії мієломи мишей, таких як ті, які отримані від пухлин мишей МОРС-21 і МРС-11, доступних від Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, і клітини SP-2 або X63Ag8-653, доступні від American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Лінії клітин мієломи людини і гетеромієломи миші-людини також описуються щодо продукування моноклональних антитіл людини (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Культурне середовище, у якій вирощують клітини гібридоми, оцінюється на продукування моноклональних антитіл, спрямованих проти EGFL7. Переважно, специфічність зв'язування моноклональних антитіл, які продукуються клітинами гібридоми, визначається за допомогою імунної преципітації або за допомогою аналізу зв'язування in vitro, такого як радіоімунологічний аналіз (RIA) або імуноадсорбційний аналіз на зв'язаному ферменті (ELISA). Спорідненість до зв'язування моноклонального антитіла може визначатися, наприклад, за допомогою аналізу Скатчарда, Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980). Після ідентифікації гібридомних клітин, що продукують антитіла з бажаною специфічністю, 97360 32 спорідненістю і/або активністю, клони можуть субклонуватися за допомогою процедур серійного розведення і вирощуватися за допомогою стандартних способів (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Відповідні культурні середовища для цієї мети містять у собі, наприклад, середовище DMEM або RPMI-1640. На додаток до цього, гібридомні клітини можуть вирощуватися in vivo як асцитні пухлини у тварин. Моноклональні антитіла, секретовані субклонами, відповідним чином виділяються з культурного середовища, асцитної рідини або сироватки за допомогою звичайних процедур очищення імуноглобулінів, таких наприклад, як сорбент білок ASepharose, гідроксилапатитна хроматографія, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія. Антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом можуть бути отримані з використанням комбінаторних бібліотек для скринінгу клонів синтетичних антитіл з бажаною активністю або активностями. У принципі, клони синтетичних антитіл вибираються за допомогою бібліотек скринінгу фагів, що містять фаг, що виявляє різні фрагменти варіабельних областей антитіла (Fv), злитого з білком покриття фага. Такі бібліотеки фагів сортуються за допомогою афінної хроматографії щодо бажаного антигену. Клони, які експресують фрагменти Fv, здатні зв'язувати бажаний антиген, адсорбуються на антигені й у такий спосіб відділяються від клонів, що не зв'язуються, у бібліотеці. Клони, що зв'язуються, потім елююються з антигену і можуть додатково збагачуватися за допомогою додаткових циклів адсорбції/елюювання стосовно антигену. Деякі антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом можуть бути отримані за допомогою конструювання процедури скринінгу відповідного антигену для вибору клону фага, що представляє інтерес, з наступним конструюванням повнорозмірного клону антитіла анти-EGFL7 з використанням послідовностей Fv від клону фага, що представляє інтерес, і відповідних послідовностей константної області (Fc), описаних у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Домен зв'язування з антигеном в антитіла формується з двох варіабельних (V) областей приблизно з 110 амінокислот, по одній з легкого (VL) і важкого (VH) ланцюгів, обидва являють собою три гіперваріабельні петлі або області, що визначають комплементарність (CDR). Варіабельні домени можуть функціонально виявлятися на фазі, або як одноланцюжкові фрагменти Fv (scFv), у яких VH і VL ковалентно зв'язуються через короткий, гнучкий пептид, або як фрагменти Fab, у яких вони злиті, кожен, з константним доменом і взаємодіють нековалентно, як описується в Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433-55 (1994). Як тут використовується, scFv, що кодують клони фагів і Fab, що кодують клони фагів, колективно згадуються як "клони фагів Fv " або "клони Fv". Популяції генів VH і VL можуть клонуватися окремо за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR) і рекомбінувати випадковим чином у 33 бібліотеках фагів, у яких потім може вироблятися пошук клонів, що зв'язують антиген, як описується в Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433-55 (1994). Бібліотеки з імунізованих джерел дають антитіла з високою спорідненістю до імуногену без виконання вимоги конструювання гібридом. Альтернативно, наївна популяція може клонуватися для створення єдиного джерела антитіл людини для невласних антигенів і власних антигенів без якої-небудь імунізації, як описує Griffiths et al., EMBO J. 12: 725-34 (1993). Нарешті, наївні бібліотеки можуть також бути отримані синтетично за допомогою клонування сегментів V-генів, які не перебудувалися, від стовбурових клітин, і використання праймерів PCR, що містять випадкову послідовність, для кодування дуже варіабельних областей CDR3 і одержання перебудови in vitro, як описується Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381-88 (1992). Нитковидний фаг використовується для виявлення фрагментів антитіл за допомогою злиття з мінорним білком покриття рІII. Фрагменти антитіл можуть бути виявлені як одноланцюжкові фрагменти Fv, у яких домени VH і VL зв'язуються на одному і тому ж поліпептидному ланцюзі за допомогою гнучкого поліпептидного спейсера, наприклад, як описується в Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581597 (1991), або як фрагменти Fab, у яких один ланцюг зливається з pill, a інший секретується в периплазму бактеріальної клітини-хазяїна, де збирає структуру білків покриття Fab, що стає видна на поверхні фага, за допомогою заміщення деяких білків покриття дикого типу, наприклад, як описується в Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 19:4133-37 (1991). Як правило, нуклеїнові кислоти, що кодують фрагменти генів антитіла, одержують з імунних клітин, зібраних у людей або тварин. Якщо бажаною є бібліотека, зрушена убік клонів анти-EGFL7, суб'єкт імунізується за допомогою EGFL7 для генерування реакцій антитіл, і клітини селезінки і/або циркулюючі В лімфоцити або інші лімфоцити периферичної крові (PBL) витягаються для конструювання бібліотеки. У переважному варіанті здійснення, бібліотека фрагментів генів антитіл людини, зміщена убік клонів EGFL7 анти-людини, виходить за допомогою генерування реакції антитіл EGFL7 анти-людини у трансгенних мишах, що несуть матрицю генів функціональних імуноглобулінів людини (і в якій відсутня система продукування функціональних ендогенних антитіл), так що імунізація EGFL7 приводить до появи В лімфоцитів, які продукують антитіла людини проти EGFL7. Генерування трансгенних мишей, які продукують антитіла людини, описується нижче. Додаткове збагачення популяційклітин, що реагують на анти-EGFL7, може бути отримане за допомогою використання відповідної процедури скринінгу для виділення В лімфоцитів, які експресують зв'язане з мембраною антитіло, специфічне до EGFL7, наприклад, за допомогою поділу клітин за допомогою афінної хроматографії на EGFL7 або адсорбції клітин на міченому флюорохромом EGFL7, з наступним проточним сортуванням активованих клітин (FACS). 97360 34 Альтернативно, використання клітин селезінки і/або В лімфоцитів, або інших PBL від імунізованого донора дає переважну репрезентацію можливої популяції антитіл, а також уможливлює конструювання бібліотеки антитіл з використанням видів тварин (людини або не-людини), у яких EGFL7 не є антигенним. Для бібліотек, що включають у себе конструювання генів антитіл in vitro, стовбурові клітини збираються в суб'єкта для одержання нуклеїнових кислот, що кодують сегменти генів антитіл, які не перебудувалися. Імунні клітини, що представляють інтерес, можуть бути отримані від різноманітних видів тварин, таких як людина, миша, щур, зайцеподібні, вовки, псові, котячі, свині, жуйні, коні і птахи, тощо. Нуклеїнові кислоти, які кодують сегменти варіабельних генів антитіл (включаючи сегменти VH і VL), витягаються з клітин, що представляють інтерес, і ампліфікуються. У випадку перебудованих бібліотек генів VH і VL, бажана ДНК може бути отримана за допомогою виділення геномної ДНК або мРНК із лімфоцитів, з наступною полімеразною ланцюговою реакцією (PCR) із праймерами, що узгоджуються з 5' і 3' кінцями перебудованих генів VH і VL, як описується в Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-37 (1989), тим самим, одержуючи різні популяції V генів для експресування. V гени можуть ампліфікуватися за допомогою цДНК і геномної ДНК, за допомогою зворотних праймерів на 5' кінці екзону, що кодує зрілий Vдомен, і прямих праймерів, що базуються в Jсегменті, як описується в Orlandi et al. (1989) і в Ward et al., Nature 341:544-46 (1989). Однак для ампліфікування за допомогою цДНК, зворотні праймери також можуть базуватися в лідерному екзоні, як описується в Jones et al., Biotechnol. 9:88-89 (1991), а прямі праймери, у константній області, як описується в Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989). Для доведення до максимуму комплементарності, дегенерація може бути включена в праймери, як описується в Orlandi et al. (1989) або Sastry et al. (1989). Переважно, розмаїтість бібліотеки доводиться до максимуму за допомогою використання праймерів PCR, спрямованих на кожне сімейство V-генів для ампліфікування всіх доступних розташувань VH і VL, які присутні у зразку нуклеїнової кислоти імунної клітини, наприклад, як описується в способі Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991), або як описується в способі Orum et al., Nucl. Acids Res. 21:4491-4498 (1993). Для клонування ампліфікованої ДНК у вектор експресії, рідкі сайти рестрикції можуть вводитися в праймер PCR як тег на одному кінці, як описується в Orlandi et al. (1989), або за допомогою додаткового ампліфікування PCR із праймером з тегом, як описується в Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991). Популяції синтетично перебудованих V генів можуть бути отримані in vitro із сегментів V генів. Більшість сегментів VH-генів людини клоновані і секвеновані (як повідомляється в Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776-98 (1992)), і картовані (як повідомляється в Matsuda et al., Nature Genet. 3:88-94 (1993); ці клоновані сегменти (включаючи всі головні конформації петлі H1 і Н2) можуть використо 35 вуватися для генерування різноманітних популяцій VH генів з PCR праймерами, що кодують петлі H3 з різними послідовностями і довжинами, як описується в Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:38188 (1992). Популяції VH можуть також бути отримані з усією розмаїтістю послідовностей, сфальцьованих у довгій петлі H3 однієї довжини, як описується в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4457-61 (1992). Сегменти V і V людини клоновані і секвеновані (як повідомляється в Williams & Winter, Eur. J. Immunol. 23:1456-61 (1993)) і можуть використовуватися для одержання популяцій синтетичних легких ланцюгів. Популяції синтетичних V генів, на основі діапазону складок VH і VL, і довжин L3 і H3, будуть кодувати антитіла зі значною структурною розмаїтістю. Після ампліфікації ДНК, що кодують V-ген, сегменти гермлайн V-гена можуть перебудовуватися in vitro відповідно до способів Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381-88 (1992). Популяції фрагментів антитіл можуть конструюватися за допомогою об'єднання разом популяцій VH і VL генів декількома шляхами. Кожна популяція може створюватися в різних векторах, і вектори рекомбінують in vitro, наприклад, як описується в Hogrefe et al., Gene 128:119-26 (1993), або in vivo за допомогою комбінаторної інфекції, наприклад, системи Іох, описаної в Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-66 (1993). Підхід з рекомбінацією in vivo використовує дволанцюжкову природу фрагментів Fab для подолання межі розміру бібліотеки, що накладається ефективністю трансформування Е.coli. Наївні популяції VH і VL клонуються окремо, один у фагемід, а інший - у фаговий вектор. Потім ці дві бібліотеки поєднуються за допомогою інфікування фагом бактерії, яка містить фагемід, так що кожна клітина містить інше сполучення, і розмір бібліотеки обмежується 12 тільки кількістю присутніх клітин (приблизно 10 клонів). Сигнали обох векторів містять рекомбінації in vivo, так що гени VH і VL рекомбінують у єдиний реплікон і спільно упаковуються у віріони фагів. Ці потужні бібліотеки дають великі кількості -1 різноманітних антитіл з гарною спорідненістю (Kd -8 приблизно 10 М). Альтернативно, популяції можуть клонуватися послідовно в той самий вектор, наприклад, як описується в Barbas et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:7978-82 (1991), або збиратися разом за допомогою PCR, а потім клонуватися, наприклад, як описується в Clackson et al., Nature 352:624-28 (1991). Зборка за допомогою PCR може також використовуватися для сполуки VH і VL ДНК із ДНК, що кодує гнучкий пептидний спейсер, з формуванням одноланцюжкових популяцій Fv (scFv). Ще в одній технології, "клітинна зборка за допомогою PCR" використовується для об'єднання генів VH і VL усередині лімфоцитів за допомогою PCR, а потім клонування популяцій зв'язаних генів, як описується в Emblazon et al., Nucl. Acids Res. 20:3831-37 (1992). Антитіла, які продукуються наївними бібліотеками (або природними, або синтетичними), можуть -1 б мати помірну спорідненість (Kd від приблизно 10 7 -1 до 10 Μ ), але дозрівання спорідненості може 97360 36 також копіюватися in vitro за допомогою конструювання і повторного вибору з вторинних бібліотек, як описується в Winter et al. (1994), вище. Наприклад, мутація може уводитися випадковим чином in vitro за допомогою використання помилковонаправленої полімерази (як повідомляється в Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)) у способі Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-96 (1992) або в способі Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-80 (1992). На додаток до цього, дозрівання спорідненості може здійснюватися за допомогою випадкових мутацій однієї або декількох CDR, наприклад, з використанням PCR із праймерами, що несуть випадкову послідовність, яка розширює CDR, що представляє інтерес, в вибраних індивідуальних клонах Fv і скринінгу клонів з більш високою спорідненістю. Заявка WO 96/07754 (опублікована 14 березня 1996 року) описує спосіб індукування мутагенезу в комплементарно зумовленій області легкого ланцюга імуноглобуліну для створення бібліотеки генів легких ланцюгів. Інший ефективний підхід полягає в рекомбінації доменів VH або VL, вибраних за допомогою фагового дисплея, з популяціями існуючих у природі варіантів домену V, отриманих від неімунізованих донорів, і скринінгу на більш високу спорідненість у декількох заходах решафлінгу ланцюга, як описується в Marks et al., Biotechnol. 10:779-83 (1992). Це технологія уможливлює продукування антитіл і фраг-9 ментів антитіл зі спорідненістю в діапазоні 10 М. Послідовність нуклеїнових кислот, що кодує EGFL7, може конструюватися з використанням послідовності амінокислот бажаної області EGFL7. Альтернативно, може використовуватися послідовність цДНК (або її фрагменти). Додаткові послідовності EGFL7 додатково описуються, наприклад, у NM_022963 і Хіе et al., Cytokine 11:729-35 (1999). ДНК, що кодують EGFL7, можуть бути отримані за допомогою різних способів, відомих у даній галузі. Ці способи містять у собі, але, не обмежуючи цим, хімічний синтез за допомогою кожного зі способів, описаних у Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 28:716-34 (1989), таких як способи зі складним триефіром, фосфітом, фосфорамідитом і Н-фосфонатом. В одному з варіантів здійснення, кодони, яким віддається перевага експресуючими клітинами-хазяїнами, використовуються для конструювання ДНК, що кодує EGFL7. Альтернативно, ДНК, що кодує EGFL7, може виділятися з геномної бібліотеки або бібліотеки цДНК. Після конструювання молекули ДНК, яка кодує EGFL7, молекула ДНК функціонально з'єднується з контрольною послідовністю експресії у векторі експресії, такому як плазміда, де контрольна послідовність розпізнається в клітині-хазяїні, трансформованої за допомогою вектора. Як правило, вектори плазмід містять послідовності реплікації і контролю, що одержують від видів, сумісних із клітиною-хазяїном. Вектор звичайно несе сайт реплікації, а також послідовності, які кодують білки, що здатні забезпечувати фенотипічну селекцію в трансформованих клітинах. Відповідні вектори для експресії в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах-хазяях, відомі в даній галузі і деякі з них додатково описуються тут. Можуть використовува 37 тися еукаріотичні організми, такі як дріжджі, або клітини, отримані від багатоклітинних організмів, таких як ссавці. Необов'язково, ДНК, що кодує EGFL7, функціонально з'єднується із секреторної лідерної послідовністю, що приводить до секреції продукту експресії клітин-хазяїнів у культурному середовищі. Приклади секреторних лідерних послідовностей містять у собі stll, екотин, lam, герпес GD, Ірр, лужну фосфатазу, інвертазу й альфа фактор. Також придатною для використання тут є лідерна послідовність з 36 амінокислот білка A (Abrahmsen et al., EMBO J. 4:3901 (1985)). Клітини-хазяїни трансфікуються і переважно трансформуються за допомогою описаних вище векторів експресії або клонування за даним винаходом і культивуються в звичайних поживних середовищах, модифікованих відповідним чином, для індукування промоторів, селекції трансформантів, або ампліфікації генів, що кодують бажані послідовності. Трансфекція належить до поглинання вектора експресії клітиною-хазяїном, незалежно від того, чи експресуються насправді кодуючі послідовності або ні. Численні способи трансфікування відомі фахівцям у даній галузі, наприклад, преципітація за допомогою СаРО4 і електропороутворення. Успішна трансфекція, як правило, спостерігається, коли здійснюється будь-яка індикація функціонування цього вектора усередині клітини-хазяїна. Методи трансфікування добре відомі в даній галузі, і деякі з них додатково описуються тут. Трансформація означає введення ДНК в організм так, що ДНК є реплікованою, або як екстрахромосомальний елемент, або за допомогою хромосомального інтегранту. У залежності від використовуваної клітини-хазяїна, трансформування здійснюється з використанням стандартних технологій, що відповідають таким клітинам. Способи трансформування добре відомі в даній галузі, і деякі з них додатково описуються тут. Прокаріотичні клітини-хазяїни, використовувані для продукування EGFL7, можуть культивуватися, як описується, у цілому, у Sambrook et al., вище. Клітини-хазяїни ссавців, використовувані для продукування EGFL7, можуть культивуватися в різноманітних середовищах, що добре відомі в даній галузі, і деякі з який описуються тут. Клітини-хазяїни, що згадуються в даному описі, охоплюють як клітини в культурі in vitro, так і клітини, що знаходяться усередині тваринихазяїна. Очищення EGFL7 може здійснюватися з використанням способів, відомих у даній галузі. Очищені EGFL7 можуть приєднуватися до відповідної матриці, такої як агарозні кульки, акриламідні кульки, скляні кульки, целюлоза, різні акрилові співполімери, гідроксил метакрилатні гелі, поліакрилові і поліметакрилові співполімери, нейлон, нейтральні й іонні носії, тощо, для використання при поділі за допомогою афінної хроматографії клонів фагових дисплеїв. Прикріплення білка EGFL7 до матриці може здійснюватися за допомогою способів, описаних у Meth. Enzymol. vol. 44 97360 38 (1976). Повсюдно використовувана технологія для прикріплення білкових лігандів до полісахаридних матриць, наприклад, агарози, декстрану або целюлози, містить у собі активування носія за допомогою ціаноген галогенідів і наступне зв'язування первинних аліфатичних або ароматичних амінів пептидних лігандів з активованою матрицею. Альтернативно, EGFL7 може використовуватися для покриття ямок адсорбційних планшетів, експресуватися в клітинах-хазяях, зафіксованих на адсорбційних планшетах, або використовуватися при сортуванні клітин, або кон'югуватися з біотином для захоплення за допомогою кульок, покритих стрептавідином, або використовуватися в будь-якому іншому способі, відомому в даній галузі для пенінга бібліотек фагових дисплеїв. Зразки бібліотек фагів приводяться в контакт з іммобілізованою EGFL7 при умовах, придатних для зв'язування щонайменше частині частинок фагів з адсорбентом. Звичайно, умови, що включають у себе рН, іонну силу, температуру тощо, вибираються з копіюванням фізіологічних умов. Фаги, зв'язані з твердою фазою, промиваються, а потім елююються за допомогою кислоти, наприклад, як описується в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:7978-82 (1991), або лугу, наприклад, як описується в Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991), або за допомогою конкурування з антигеном EGFL7, наприклад, у процедурі, подібній до способу конкурування антигенів Clackson et al., Nature 352:624-28 (1991). Фаги можуть збагачуватися в 20-1000-раз за одну стадію селекції. Крім того, збагачені фаги можуть вирощуватися в бактеріальній культурі і піддаватися додатковим заходам селекції. Ефективність селекції залежить від багатьох факторів, включаючи кінетику дисоціації під час промивання, або від того або можуть множину фрагментів антитіл на одному фазі одночасно з'єднуватися з антигеном. Антитіла зі швидкою кінетикою дисоціації (і зі слабкою спорідненістю зв'язування) можуть утримуватися за допомогою використання коротких промивань, багатовалентного фагового дисплея і високої щільності покриття з антигену у твердій фазі. Висока щільність не тільки стабілізує фаг під час багатовалентних взаємодій, але і сприяє повторному зв'язуванню з дисоціюючим фагом. Селекція антитіл з повільною кінетикою дисоціації (і з гарною спорідненістю зв'язування) може прискорюватися за допомогою використання тривалих промивань і одновалентного фагового дисплея, як описується в Bass et al., Proteins 8:309-14 (1990) і в заявці WO 92/09690, і низкою щільності покриття антигену, як описується в Marks et al., Biotechnol. 10:779-83 (1992). Є можливою селекція антитіл фагів з різною спорідненістю, навіть якщо спорідненість розрізняється мало, до EGFL7. Однак, випадкова мутація вибраного антитіла (наприклад, як робиться в деяких з технологій дозрівання спорідненості, описаних вище), імовірно, дасть множину мутантів, що здебільшого зв'язується з антигеном, і деякі з них з більш високою спорідненістю. При обмеженні кількості EGFL7, рідкі фаги з високою спорідненістю будуть відсіватися в конкуренції. Для утримання 39 всіх мутантів з більш високою спорідненістю, фаги можуть інкубуватися разом з надлишком біотинільованих EGFL7, але при концентрації біотинільованих EGFL7 з більш низькою молярністю, ніж цільова молярна спорідненість для EGFL7. Фаги з високою спорідненістю зв'язування можуть потім захоплюватися за допомогою покритих стрептавідином парамагнітних кульок. Такий "рівноважне захоплення" уможливлює селекцію антитіл, відповідно до їхньої спорідненості зв'язування, з чутливістю, що уможливлює виділення мутантних клонів усього лише зі спорідненістю, у два рази більшим, з великого надлишку фагів з більш низькою спорідненістю. Умови, використовувані для промивання фагів, зв'язаних із твердою фазою, можуть також підбиратися для дискримінації на основі кінетики дисоціації. Клони анти-EGFL7 можуть також вибиратися по активності. ДНК, що кодує моноклональні антитіла, отримані з гібридом, або клони фагового дисплея Fv за даним винаходом легко виділяється і секвенується з використанням звичайних процедур (наприклад, за допомогою використання олігонуклеотидних праймерів, сконструйованих для специфічної ампліфікації областей кодування важких і легких ланцюгів, що представляють інтерес, з матриці ДНК гібридоми або фага). Після виділення, ДНК може міститися у вектори експресії, що потім трансфікуються в клітини-хазяїни, такі як клітини Е.coli, клітини COS мавп, клітини яєчників китайського хом'ячка (СНО) або клітини мієломи, що в іншому випадку не продукують білків імуноглобулінів, для одержання синтезу бажаних моноклональних антитіл у рекомбінантних клітинах-хазяях. Оглядові статті по рекомбінантній експресії в бактеріях ДНК, що кодує антитіла, містять у собі Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol 5: 256 (1993) і Plilckthun, Immunol. Rev. 130:151 (1992). ДНК, які кодують клони Fv за даним винаходом, можуть поєднуватися з відомими послідовностями ДНК, які кодують константні області важких ланцюгів і/або легких ланцюгів (наприклад, що відповідають послідовності ДНК можуть бути отримані згідно з Kabat et al., вище), для формування клонів, що кодують повну або часткову довжину важких і/або легких ланцюгів. Буде зрозуміло, що константні області будь-якого ізотипу можуть використовуватися для цієї мети, включаючи константні області IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, і що такі константні області можуть бути отримані від будь-якої людини або видів тварин. Клон Fv, отриманий від варіабельного домену ДНК одного виду тварини (такого як людини), а потім злитої з константною областю ДНК інших видів тварин, з утворенням кодуючої послідовності (послідовностей) для "гібридної" повнорозмірного важкого ланцюга і/або легкого ланцюга включається у визначення "химерного" і "гібридного" антитіла, як тут використовується. У переважному варіанті здійснення, клон Fv, отриманий від варіабельної ДНК людини, зливається з константною областю ДНК людини, з формуванням кодуючої послідовності (послідовностей) для усіх важких і/або легких ланцюгів з повною або частковою довжиною для людини. 97360 40 ДНК, що кодує антитіло анти-EGFL7, отримана з гібридоми за даним винаходом, також може модифікуватися, наприклад, за допомогою заміщення кодуючої послідовності для константних важких і легких ланцюгів для людини замість гомологічних послідовностей мишей, отриманих із клону гібридоми (наприклад, як у способі Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55 (1984)). ДНК, що кодує антитіло, отримане з гібридоми або клону Fv, або його фрагмент, може додатково модифікуватися шляхом ковалентного приєднання до кодуючої послідовності імуноглобуліну усієї кодуючої послідовності або її частини, для поліпептиду, відмінного від імуноглобуліну. Таким чином, одержують "химерні" або "гібридні" антитіла, що мають специфічність зв'язування отриманих від клону Fv або клону гібридоми антитіл за даним винаходом. Фрагменти антитіл Даний винахід охоплює фрагменти антитіл. У визначених обставинах маються переваги використання фрагментів антитіл, замість цілих антитіл. Менший розмір фрагментів уможливлює швидке виведення і може привести до поліпшення доступу до твердих пухлин. Різні технології розроблені для продукування фрагментів антитіла. Традиційно ці фрагменти одержують за допомогою протеолітичного гідролізу антитіл (див., наприклад, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 24:107-17 (1992); і Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Однак ці фрагменти сьогодні можуть продукуватися безпосередньо рекомбінантними клітинами-хазяїнами. Усі фрагменти Fab, Fv і ScFv антитіла можуть експресуватися і секретуватися з Е.coli, роблячи, таким чином, можливим просте продукування великих кількостей цих фрагментів. Фрагменти антитіл можуть виділятися з фагових бібліотек антитіл, обговорюваних вище. Альтернативно, фрагменти Fab'SH можуть безпосередньо витягатися з Е.coli і хімічно зв'язуватися з формуванням фрагментів F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-67 (1992)). Відповідно до іншого підходу, фрагменти F(ab')2 можуть виділятися безпосередньо з культури рекомбінантних клітин-хазяїнів. Фрагмент Fab і F(ab')2 зі збільшеним половинним часом життя in vivo, що містить залишки епітопів зв'язування рецепторів реутилізації, описується в заявці на патент США № 5869046. Інші технології для продукування фрагментів антитіла будуть зрозумілі фахівцю в даній галузі. В інших варіантах здійснення, вибране антитіло являє собою одноланцюжковий фрагмент Fv (scFv). Див. заявку WO 93/16185; заявки на патенти США №№ 5571894; і 5587458. Fv і sFv являють собою єдині частинки з об'єднанням інтактних сайтів, що не містять константних областей; таким чином, вони є придатними для зменшення неспецифічного зв'язування при використанні in vivo. Білки злиття sFv можуть конструюватися для одержання ефекторного білка злиття, або на аміно, або на карбокси-кінці sFv. Див. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, W.H. Freeman and Company (1992). Фрагмент антитіла також може являти собою "лінійне антитіло", як описується, наприклад, у заявці на патент США № 41 5641870. Такі лінійні фрагменти антитіла можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. Гуманізовані антитіла Даний винахід охоплює гуманізовані антитіла. Різні способи гуманізації антитіл не-людини відомі в даній галузі. Наприклад, гуманізоване антитіло може мати один або декілька залишків амінокислот, введених у нього з джерела, що являє собою не-людинy. Ці залишки амінокислот не-людини часто згадуються як "імпортні" залишки, що звичайно беруться від "імпортного" варіабельного домену. Гуманізація може здійснюватися власне кажучи, випливаючи способу Winter і співробітників (Jones et al., Nature 321:522-25; Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988); Verhoeyen et al.. Science 239:1534-36 (1988)), за допомогою заміщення послідовностями гіперваріабельної області відповідних послідовностей в антитілі людини. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла являють собою химерні антитіла (заявка на патент США № 4816567), у яких по суті менше ніж інтактний варіабельний домен людини заміщається відповідною послідовністю від видів не-людини. На практиці, гуманізовані антитіла являють собою, як правило, антитіла людини, з деякими залишками гіперваріабельної області і, можливо, деякими залишками FR, заміщеними залишками з аналогічних сайтів антитіл гризунів. Вибір варіабельних доменів людини, як легких, так і важких, які повинні використовуватися при одержанні гуманізованих антитіл, є дуже важливим для зменшення антигенності. Відповідно до так званого способу "найпереважного підгону", послідовність варіабельного домену антитіла гризуна екранується в порівнянні з усією бібліотекою відомих послідовностей варіабельних доменів людини. Послідовність людини, що ближче усіх до послідовності гризуна, приймається потім як рамка людини для гуманізованого антитіла (Sims et al., J. Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Інший спосіб використовує конкретну рамку, отриману від консенсусної послідовності всіх антитіл людини для конкретної підгрупи легких або важких ланцюгів. Така ж рамка може використовуватися для декількох різних гуманізованих антитіл (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)). Є важливим, крім того, щоб антитіла гуманізувались зі збереженням високої спорідненості до антигену й інших сприятливих біологічних властивостей. Для досягнення цієї мети, відповідно до одним зі способів, гуманізовані антитіла виготовляють за допомогою способу аналізу вихідних послідовностей і різних концептуальних гуманізованих продуктів з використанням тривимірних моделей вихідних і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів є широко доступними і добре знайомі фахівцям у даній галузі. Доступні комп'ютерні програми, що ілюструють і відображають можливі тривимірні конформаційні структури вибраних кандидатів у імуноглобулінові послідовності. Їхній перегляд уможливлює аналіз ймовірної ролі залишків при функціонуванні кандидатів у імуноглобулінові послідовності, тобто, 97360 42 аналіз залишків, що впливають на здатність кандидата в імуноглобуліни до зв'язування його антигену. Таким чином, залишки FR можуть вибиратися і поєднуватися з послідовностей реципієнта й імпортних послідовностей, так що досягаються бажані характеристики антитіла, такі як підвищена спорідненість до цільового антигену (антигенам). Як правило, залишки гіперваріабельних областей є безпосередньо і найбільше істотно втягненими у вплив на зв'язування антигену. Антитіла людини Антитіла людини анти-EGFL7 за даним винаходом можуть конструюватися за допомогою об'єднання послідовності (послідовностей) варіабельного домену клону Fv, вибраної з отриманих від людини бібліотек фагових дисплеїв з відомою послідовністю (послідовностями), і константного домену людини, як описується вище. Альтернативно, моноклональні антитіла людини анти-EGFL7 за даним винаходом можуть бути отримані за допомогою гібридомного способу. Лінії клітин мієломи людини і гетеромієломи миші-людини для продукування моноклональних антитіл людини описуються, наприклад, у Kozbor J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); і Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991). Сьогодні можливе одержання трансгенних тварин (наприклад, мишей), що здатні, при імунізації, продукувати повну популяцію антитіл людини у відсутності продукування ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, описувалося, що гомозиготна делеція з'єднувальної області важкого ланцюга гена антитіла (JH) у химерних і гермлайн мутантних мишей приводить до повного інгібування продукування ендогенного антитіла. Перенесення матриці гермлайн генів імуноглобулінів людини в таких гермлайн мутантних мишей буде приводити до продукування антитіл людини при провокуванні антигеном. Див., наприклад, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255 (1993); Braggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993). Шафлінг генів також може використовуватися для одержання антитіл людини з антитіл нелюдини, наприклад, гризуна, де антитіло людини має подібна спорідненість і специфічність з вихідним антитілом не-людини. Відповідно до цього способу, який називається також "імпринтінг епітопу", варіабельна область або важкого, або легкого ланцюга фрагмента антитіла людини-не-людини, отриманого за допомогою технологій фагового дисплея, як описується вище, заміняється за допомогою популяції генів V домену людини, створюючи популяцію химер scFv або Fab, ланцюг нелюдини/ланцюг людини. Селекція за допомогою антигену приводить до виділення химерних scFv або Fab ланцюг не-людини/ланцюг людини, де ланцюг людини відновлює сайт зв'язування з антигеном, зруйнований при видаленні відповідного ланцюга не-людини в первинному клоні фагового дисплея, тобто епітоп визначає (відпечатує) вибір партнера ланцюга людини. Коли цей процес повторюється для заміни ланцюга людину-не 43 людини, що залишилася, виходить антитіло людини (див. публікацію РСТ заявки WO 93/06213, опубліковану 1 квітня 1993 року). На відміну від традиційної гуманізації антитіл людину-не-людини за допомогою імплантації CDR, ця технологія створює цілком людські антитіла, що не мають залишків FR або CDR нелюдського походження. Біспецифічні антитіла Біспецифічні антитіла являють собою моноклональні антитіла, переважно, антитіла людини або гуманізовані антитіла, що мають специфічність зв'язування щонайменше до двох різних антигенів. У даному випадку, одна зі специфічностей зв'язування призначена для EGFL7, а інша - для будь-якого іншого антигену. Зразкові біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами білка EGFL7. Біспецифічні антитіла можуть також використовуватися для локалізації цитотоксичних агентів у клітинах, що експресують EGFL7. Ці антитіла мають плече зв'язування для EGFL7 і плече, що зв'язує цитотоксичний агент (наприклад, сапорин, анти-інтерферон-, алколоїд барвінку, ланцюг А рицину, метотрексат або гаптен з радіоактивним ізотопом). Біспецифічні антитіла можуть бути отримані у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл (наприклад, біспецифічні антитіла F(ab')2). Способи одержання біспецифічних антитіл відомі в даній галузі. Традиційно, рекомбінантне одержання біспецифічних антитіл ґрунтується на спільній експресії двох пар важкий ланцюг:легкий ланцюг імуноглобуліну, де два важких ланцюги мають різні специфічності (Milstein & Cuello, Nature 305:537 (1983)). Завдяки випадковому асортименту важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, ці гібридоми (квадроми) дають потенційну суміш з 10 різних молекул антитіл, з яких тільки одна має правильну біспецифічну структуру. Очищення правильної молекули, що звичайно здійснюється за допомогою стадій афінної хроматографії, є скоріше трудомісткої, і вихід продуктів низький. Подібні процедури описуються в заявці WO 93/08829, опублікованої 13 травня, 1993 року, і в Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991). Відповідно до інших і більш переважних підходів, варіабельні домени антитіл з бажаними специфічностями зв'язування (сайтами об'єднання антитіло-антиген) зливаються з послідовностями константних доменів імуноглобулінів. Злиття переважне здійснюється за допомогою константного домену важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить щонайменше частина шарнірної області, областей СН2 і СH3. Переважно мати першу константну область важкого ланцюга (CH1), що містить сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга, який присутній щонайменше в одному зі злиттів. ДНК, що кодують злиття важких ланцюгів імуноглобуліну і, якщо це бажано, легкого ланцюга імуноглобуліну, вставляються в окремі вектори експресії і спільно трансфікуються у відповідний організм хазяїн. Це забезпечує велику гнучкість при підборі взаємних пропорцій трьох поліпептидних фрагментів у варіантах здійснення, коли нерівні відносини трьох поліпептидних ланцюгів, використовуваних при конструюванні, дають 97360 44 оптимальні виходи. Однак є можливою вставка кодуючих послідовностей для двох або для всіх трьох поліпептидних ланцюгів в один вектор експресії, коли експресування щонайменше двох поліпептидних ланцюгів при однакових відношеннях дає в результаті високий вихід, або коли відношення не мають особливого значення. У деяких варіантах здійснення цього підходу, біспецифічні антитіла складаються з важкого ланцюга гібридного імуноглобуліну з першою специфічністю зв'язування в одному плечі, і з парою важкий ланцюг - легкий ланцюг гібридного імуноглобуліну (яка забезпечує другу специфічність зв'язування) в іншому плечі. Виявлено, що ця асиметрична структура полегшує відділення бажаного біспецифічної сполуки від небажаних сполучень ланцюгів імуноглобулінів, оскільки присутність легкого ланцюга імуноглобуліну тільки в одній половині біспецифічної молекули забезпечує зручний спосіб розділення. Цей підхід описується в заявці WO 94/04690. Щодо додаткових деталей генерування біспецифічних антитіл див., наприклад, Suresh et al., Meth. Enzymol. 121:210 (1986). Відповідно до іншого підходу, область контакту між парою молекул антитіл може бути отримана за допомогою генної інженерії для доведення до максимуму відсотка гетеродимерів, що витягаються з рекомбінантної культури клітин. Переважна область контакту містить щонайменше частина домену СH3 з константного домену антитіла. У цьому способі, одна або декілька бічних ланцюгів малих амінокислот з області контакту молекули першого антитіла заміняються бічними ланцюгами більшого розміру (наприклад, тирозину або триптофану). Компенсаторні "порожнини" розміру, ідентичного або подібного до великого бічного ланцюга (ланцюгів), створюються в області контакту молекули другого антитіла за допомогою заміни великих бічних ланцюгів амінокислот меншими (наприклад, аланіном або треоніном). Це створює механізм збільшення виходу гетеродимерів у порівнянні з іншими небажаними кінцевими продуктами, такими як гомодимери. Біспецифічні антитіла містять у собі поперечно зв'язані або "гетерокон'юговані" антитіла. Наприклад, одне з антитіл у гетерокон'югаті може бути зв'язане з авідином, інше з біотином. Такі антитіла були, наприклад, запропоновані для націлювання клітин імунної системи на небажані клітини (заявка на патент США № 4676980) і для лікування ВИЧ інфекції (заявки WO 91/00360 і WO 92/00373). Гетерокон'юговані антитіла можуть бути отримані з використанням будь-яких звичайних способів поперечного зв'язування. Придатні для використання агенти для поперечного зв'язування добре відомі в даній галузі й описуються в заявці на патент США № 4676980, разом із поруч технологій поперечного зв'язування. Технології генерування біспецифічних антитіл із фрагментів антитіл також описуються в літературі. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути отримані з використанням хімічних зв'язків. Brennan et al., Science 229:81 (1985) описують процедуру, де інтактні антитіла протеолітично розщеплюються з генеруванням фрагментів F(ab')2. 45 Ці фрагменти відновлюються в присутності дитіолового комплексоутворюючого агента арсеніту натрію для стабілізації віцинальних дитіолів і запобігання утворенню внутрішньомолекулярних дисульфідів. Генеровані фрагменти Fab' потім перетворюються в тіонітробензоатні (TNB) похідні. Після цього похідні Fab'-TNB перетворюються потім назад у Fab'-тіол за допомогою відновлення за допомогою меркаптоетиламіну і змішуються з еквімолярною кількістю іншого похідного Fab'-TNB з формуванням біспецифічних антитіл. Отримані біспецифічні антитіла можуть використовуватися як агенти для селективної іммобілізації ферментів. Недавній прогрес зробив можливим безпосереднє витягання фрагментів Fab'-SH з Е.coli, що можуть хімічно зв'язуватися з утворенням біспецифічних антитіл. Shalaby et al., J. Exp. Med 175:217-25 (1992) описує одержання молекули повністю гуманізованого біспецифічного антитіла F(ab')2. Кожен фрагмент Fab' окремо секретується з Е.coli і піддається спрямованому хімічному зв'язуванню in vitro з формуванням біспецифічного антитіла. Біспецифічне антитіло, сформоване таким чином, здатне зв'язувати клітини, надекспресуючі рецептор HER2 і нормальні Τ лімфоцити людини, а також запускати літичну активність цитотоксичних лімфоцитів людини проти цільових пухлин грудей людини. Різні технології одержання і виділення біспецифічних фрагментів антитіл безпосередньо з рекомбінантної культури клітин також описуються. Наприклад, біспецифічні антитіла одержують з використанням лейцинової «застібки». Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-53 (1992). Пептиди лейцинової «застібки» з білків Fos і Jun зв'язуються з частинами Fab' двох різних антитіл за допомогою злиття генів. Гомодимери антитіл відновлюються в шарнірній області з формуванням мономерів, а потім повторно окисляються з формуванням гетеродимерів антитіл. Цей спосіб може також використовуватися для одержання гомодимерів антитіл. Технологія "діабоді", описана Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:644448 (1993), дає альтернативний механізм для одержання біспецифічних фрагментів антитіл. Фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) за допомогою лінкера, який занадто короткий, щоб уможливити спарювання між двома доменами в одному і тому ж ланцюзі. Відповідно, домени VH і VL одного фрагмента примушуються до спарювання з комплементарними VL і VH доменами іншого фрагмента, тим самим формуючи два сайти зв'язування з антигеном. Інша стратегія одержання біспецифічних фрагментів антитіла за допомогою використання одноланцюжкових димерів Fv (sFv) також описується. Див. Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Також розглядаються антитіла, що мають більше двох валентностей. Наприклад, можуть бути отримані триспецифічні антитіла. Tutt et al. J. Immunol. 147:60(1991). Багатовалентні антитіла Багатовалентне антитіло може бути інтерналізоване (і/або катаболізоване) швидше, ніж двова 97360 46 лентне антитіло, клітиною, яка експресує антиген, з яким зв'язуються антитіла. Антитіла за даним винаходом можуть являти собою багатовалентні антитіла (які не належать до класу IgM) із трьома або більше сайтами зв'язування антигену (наприклад, чотиривалентні антитіла), що можуть легко бути отримані за допомогою рекомбінантної експресії нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептидні ланцюги антитіла. Багатовалентне антитіло може містити домен димеризації і три або більше сайтів зв'язування антигену. Переважний домен димеризації містить область Fc або шарнірну область (або складається з неї). У цьому сценарії, антитіло буде містити область Fc і три або більше сайтів зв'язування антигену, аміно-кінцевих стосовно області Fc. Переважне багатовалентне антитіло тут містить із трьох до приблизно восьми, але переважно чотири сайти зв'язування антигену (або складається з них). Багатовалентне антитіло містить щонайменше один поліпептидний ланцюг (а переважно два поліпептидних ланцюги), де поліпептидний ланцюг (ланцюги) містить два або більше варіабельних доменів. Наприклад, поліпептидний ланцюг (ланцюги) може містити VDl-(X1)nVD2-(X2)n-Fc, де VD1 являє собою перший варіабельний домен, VD2 являє собою другий варіабельний домен, Fc являє собою один поліпептидний ланцюг з області Fc, X1 і Х2 представляють амінокислоту або поліпептид, і n дорівнює 0 або 1. Наприклад, поліпептидний ланцюг (ланцюги) може містити: VH-CH1-гнучкий лінкер-VH-CH1-ланцюг області Fc; або VH-CH1-VH-CH1-ланцюг області Fc. Багатовалентне антитіло тут переважне додатково містить щонайменше два (а переважно чотири) поліпептиди варіабельного домену легкого ланцюга. Багатовалентне антитіло тут може, наприклад, містити від приблизно двох до приблизно восьми поліпептидів варіабельного домену легкого ланцюга. Поліпептиди варіабельного домену легкого ланцюга, розглянуті тут, містять варіабельний домен легкого ланцюга і, необов'язково, додатково містять домен CL. Варіанти антитіл У деяких варіантах здійснення розглядається модифікація (модифікації) послідовностей амінокислот антитіл, описаних тут. Наприклад, може бути бажаним поліпшення спорідненості зв'язування і/або інших біологічних властивості антитіла. Варіанти послідовностей амінокислот антитіла одержують за допомогою уведення відповідних змін нуклеотидів у нуклеїнову кислоту або антитіла за допомогою синтезу пептидів. Такі модифікації містять у собі, наприклад, делеції і/або інсерції, і/або заміщення залишків у послідовностях амінокислот антитіла. Будь-яке сполучення делецій, інсерцій і заміщень здійснюється для одержання кінцевого продукту, за умови, що кінцевий продукт має бажані характеристики. Зміни амінокислот можуть вводитися в послідовність амінокислот розглянутого антитіла в той час, коли виходить послідовність. Корисний спосіб ідентифікації визначених або залишків областей антитіла, що являють собою переважні положення для мутагенезу, називається "аланіновий скануючий мутагенез", як описується в 47 Cunningham & Wells, Science 244:1081-85 (1989). Тут залишок або група цільових залишків ідентифікується (наприклад, заряджені залишки, такі як arg, asp, his, lys i glu) і заміняється нейтральними або негативно зарядженими амінокислотами (найбільш переважно, аланіном або поліаланіном) для здійснення взаємодії амінокислот з антигеном. Ті положення амінокислот, що демонструють функціональну чутливість до заміщень, потім поліпшуються за допомогою введення додаткових або інших варіантів на сайтах заміщення або замість них. Таким чином, хоча сайт для уведення варіації послідовності амінокислот є заданим, природа мутації сама по собі не повинна бути заданою. Наприклад, для аналізу параметрів мутації на даному сайті, здійснюють аіа сканування або випадковий мутагенез на цільовому кодоні або області, і експресовані імуноглобуліни екрануються на бажану активність. Інсерції послідовності амінокислот містять у собі аміно- і/або карбоксил-кінцеві злиття, що знаходяться в діапазоні довжин від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також інсерції усередині послідовності одного або множини залишків амінокислот. Приклади кінцевих інсерцій містять у собі антитіло з N-кінцевим метіонільним залишком або антитіло, злите з цитотоксичним поліпептидом. Інші інсерційні варіанти молекул антитіла містять у собі злиття за допомогою N- або С-кінця антитіла з ферментом (наприклад, ADEPT) або поліпептидом, що збільшує половинний час життя в сироватці для антитіла. Інший тип варіанта амінокислот антитіла змінює вихідний паттерн глікозилювання антитіла. Така зміна містить у собі делецію одного або декількох вуглеводних залишків, що знаходяться в антитілі, і/або додавання одного або декількох сайтів глікозилювання, що не присутні в антитілі. Глікозилювання поліпептидів, як правило, є або N-зв'язаним, або О-зв'язаним. N-зв'язане глікозилювання належить до приєднання вуглеводного залишку до бічного ланцюга аспарагінового залишку. Трипептидні послідовності аспарагін-хсерин і аспарагін-х-треонін, де X являє собою будь-яку амінокислоту за винятком проліну, являють собою розпізнавальні послідовності для ферментативного приєднання вуглеводного залишку до аспарагінового бічного ланцюга. Таким чином, присутність будь-якої з цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. О-зв'язане глікозилювання належить до приєднання одного з цукрів Nацетилгалоктозаміну, галоктози або ксилози до гідрокси аміно кислоти, найчастіше, до серину або треоніну, хоча 5-гідроксипролін або 5гідроксилизин також можуть використовуватися. Додавання сайтів глікозилювання до антитіла зручно здійснювати за допомогою зміни послідовності амінокислот, так щоб вона містила одну або декілька з описаних вище трипептидних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозилювання). Зміна може також здійснюватися за допомогою додавання, або заміщення з їхньою допомогою, одного або декількох серинових або треонінових 97360 48 залишків до послідовності вихідного антитіла (для О-зв'язаних сайтів глікозилювання). Коли антитіло містить область Fc, вуглевод, приєднаний до неї, може бути змінений. Наприклад, антитіла зі зрілою вуглеводною структурою, у якій відсутня фукоза, приєднана до області Fc антитіла, описуються в заявці на патент США № 2003/0157108 (Presta, L.). Див. також заявку США № 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Антитіла з біссекторним N-ацетилглюкозаміном (GlcNAc) у вуглеводі, приєднаному до області Fc антитіла, згадуються в заявці WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. і в заявці на патент США № 6602684, Umafia et al. Про антитіла щонайменше з одним галактозним залишком в олігосахариді, приєднаному до області Fc антитіла, повідомляється в заявці WO 97/30087, Patel et al. Див, також, заявку WO 98/58964 (Raju, S.) і заявку WO99/22764 (Raju, S.) щодо антитіл зі зміненим вуглеводом, приєднаним до їхньої області Fc. Див. також заявку на патент США № 2005/0123546 (Umana et al.) щодо молекул, що зв'язуються з антигеном, з модифікованим глікозилюванням. Переважний варіант глікозилювання тут містить у собі область Fc, де вуглеводнева структура, приєднана до області Fc, не містить фукози. Такі варіанти мають поліпшену функцію ADCC. Необов'язково, область Fc додатково містить одне або декілька заміщень амінокислот у ній, що додатково поліпшує ADCC, наприклад, заміщення в положеннях 298, 333 і/або 334 області Fc (нумерація залишків згідно з EU). Приклади публікацій, що належать до "дефукозильованих" або "фукозадефіцитних" антитіл, містять у собі: заявку на патент США № 2003/0157108; заявку WO 2000/61739; заявку WO 2001/29246; заявку на патент США № 2003/0115614; заявку на патент США № 2002/0164328; заявку на патент США № 2004/0093621; заявку на патент США № 2004/0132140; заявку на патент США № 2004/0110704; заявку на патент США № 2004/0110282; заявку на патент США № 2004/0109865; заявку WO 2003/085119; заявку WO 2003/084570; заявку WO 2005/035586; заявку WO 2005/035778; заявку WO 2005/053742; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-49 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Приклади ліній клітин, які продукують дефукозильовані антитіла, містять у собі клітини Lee 13 СНО з дефіцитом фукозилювання білків (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-45 (1986); заявку на патент США № 2003/0157108 A1, Presta, L; і заявку WO 2004/056312 A1, Adams et al., зокрема, у Прикладі 11), і лінії нокаутованих клітин, таких як мають ген альфа-1,6-фукозилтрансферази, нокаутовані клітини СНО FUT8 (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)). Інший тип варіанта являє собою варіант із заміщенням амінокислот. Ці варіанти мають щонайменше один залишок амінокислоти в молекулі антитіла, замінений іншим залишком. Сайти, що представляють найбільший інтерес для заміщуючого мутагенезу містять у собі гіперваріабельні області, але зміни FR також розглядаються. Консервативні заміщення показані в Таблиці 1 під за 49 97360 головком "переважні заміщення". Якщо такі заміщення приводять до змін біологічної активності, тоді більш істотні зміни, позначені "зразкові замі 50 щення" у Таблиці 1, або як додатково описується нижче в посиланні на класи амінокислот, можуть уводитися, а продукти піддаються скринінгу. Таблиця 1 Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (С) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) IIe (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Зразкові заміщення Val; Leu; IIe Lys; Gln; Asn Gln; His; Asp, Lys; Arg Glu; Asn Ser; Ala Asn; Glu Asp; Gln Ala Asn; Gln; Lys; Arg Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин Норлейцин; Не; Val; Met; Ala; Phe Arg; Gln; Asn Leu; Phe; lle Trp; Leu; Val; lle; Ala; Tyr Ala Thr Val; Ser Tyr; Phe Trp; Phe; Thr; Ser IIe; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин Істотні модифікації біологічних властивостей антитіла виходять за допомогою вибору заміщень, що значно відрізняються по своїх впливах на підтримку (а) структури поліпептидного основного ланцюга в області заміщення, наприклад, у вигляді конформації або складок спіралей, (b) або заряду гідрофобності молекули на цільовому сайті, або (с) об'єму бічного ланцюга. Існуючі в природі залишки поділяються на групи на основі їхніх загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислотні: asp, glu; (4) основні: his, lys, arg; (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: gly, pro; і (6) ароматичні: trp, tyr, phe. Неконсервативні заміщення будуть містити заміну елемента з одного з цих класів на інший клас. Одні з типів заміщуючого варіанта містить заміщення одного або декількох залишків гіперваріабельної області вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого антитіла або антитіла людини). Як правило, отриманий варіант (варіанти), вибраний для подальшої розробки, буде мати поліпшені біологічні властивості в порівнянні з вихідним антитілом, з яких вони генеруються. Зручний спосіб генерування таких заміщуючих варіантів містить у собі дозрівання спорідненості з використанням фагового дисплея. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельної області (наприклад, 6-7 сайтів) мутують з генеруванням усіх можливих заміщень амінокислот на кожному сайті. Антитіла, генеровані таким чином, проявляються з ниткоподібних час Переважні заміщення Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu lle Arg Leu Tyr Ala Thr Ser Tyr Phe Leu тинок фагів, як злиття з продуктом гена III M13, упакованого усередині кожної частинки. Варіанти, які проявляються з допомогою фагів, потім екрануються на їхню біологічну активність (наприклад, спорідненість зв'язування), як тут описується. Для ідентифікації кандидатів на модифікацію серед сайтів гіперваріабельної області, може здійснюватися мутагенез з аланіновим скануванням для ідентифікації залишків гіперваріабельної області, що вносить значний внесок у зв'язування антигену. Альтернативно, або на додаток до цього, може бути корисним аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту між антитілом і антигеном. Такі контактні залишки і сусідні залишки є кандидатами на заміщення відповідно до технологій, розроблених тут. Після того як такі варіанти генеруються, панель варіантів піддається скринінгу, як тут описується, і антитіла з чудовими властивостями при одному або декількох релевантних аналізах можуть бути вибрані для подальшої розробки. Молекули нуклеїнових кислот, які кодують варіанти послідовностей амінокислот антитіла, одержують за допомогою різноманітних способів, відомих у даній галузі. Ці способи містять у собі, але, не обмежуючи цим, виділення з природного джерела (у випадку існуючих у природі варіантів послідовностей амінокислот) або приготування за допомогою опосередковуваного олігонуклеотидами (або сайт-направленого) мутагенезу, PCR мутагенезу і касетного мутагенезу отриманого раніше варіанта або неваріантної версії антитіла. Може бути бажаним введення однієї або декількох модифікацій амінокислот в області Fc поліпептидів імуноглобуліну за даним винаходом, тим самим генеруючи варіант області Fc. Варіант об 51 ласті Fc може містити послідовність області Fc людини (наприклад, область Fc lgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 людини), що містить модифікацію амінокислот (наприклад, заміщення) в одному або декількох положеннях амінокислот, включаючи положення шарнірного цистеїну. Відповідно до даного опису і концепцій, відомих в даній галузі, передбачається, що в деяких варіантах здійснення, антитіло, використовуване в способах за даним винаходом, може містити одну або декілька змін, у порівнянні з еквівалентним антитілом дикого типу, наприклад, в області Fc. Ці антитіла, проте, повинні зберігати по суті такі ж характеристики, необхідні для терапевтичного застосування, у порівнянні з їх еквівалентом дикого типу. Наприклад, вважається, що визначені зміни можуть здійснюватися в області Fc, що повинно привести до зміни (тобто, або підвищення, або зниження) зв'язування C1q і/або комплементзалежної цитотоксичності (CDC), наприклад, як описується в заявці WO 99/51642. Див. також Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); заявку на патент США № 5648260; заявку на патент США № 5624821 і заявку WO94/29351, щодо інших прикладів варіантів області Fc. Заявка WO 00/42072 (Presta) і заявка WO 2004/056312 (Lowman) описують варіанти антитіла з підвищеним або зниженим зв'язуванням з Fc. Зміст цих патентних публікацій конкретно включається сюди у вигляді посилань. Див., також, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001). Антитіла з підвищеними половинними часами життя і поліпшеним зв'язуванням з неонатальним рецептором Fc (FcRn), що відповідає за перенесення IgG від матері до ембріона (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) і Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описані в заявці на патент США № 2005/0014934А1 (Hinton et al.). Ці антитіла містять область Fc з одним або декількома заміщеннями в ній, що поліпшують зв'язування області Fc з FcRn. Поліпептидні варіанти зі зміненими послідовностями амінокислот області Fc і підвищеною або зниженою здатністю до зв'язування C1q описуються в заявці на патент США № 6194551В1, у заявці WO99/51642. Зміст цих патентних публікацій конкретно включаються сюди у вигляді посилань. Див., також, Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-84 (2000). Похідні антитіл Антитіла за даним винаходом можуть додатково модифікуватися, щоб вони містили додаткові небілкові залишки, які відомі в даній галузі і є легкодоступними. Переважно, залишки, придатні для дериватизації антитіла, являють собою водорозчинні полімери. Необмежувальні приклади водорозчинних полімерів містять у собі, але, не обмежуючи цим, поліетиленгліколь (PEG), співполімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилену/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або неупорядковані співполімери) і декстран або полі(нвінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколю, співполімери поліпропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксіетиловані поліоли (на 97360 52 приклад, гліцерин), полівініловий спирт і їхні суміші. Поліетиленгліколь пропіональдегід може мати переваги при виробництві, завдяки його стабільності у воді. Полімер може мати будь-яку молекулярну масу і може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кількість полімерів, приєднаних до антитіла, може змінюватися, і якщо приєднується більше одного полімеру, вони можуть являти собою однакові або різні молекули. Як правило, кількість і/або тип полімерів, використовуваних для дериватизації, може визначатися на основі розумінь, що включають у себе, але, не обмежуючи цим, конкретні властивості або функції антитіла, що повинні поліпшуватися, чи буде похідне антитіла використовуватися в терапії за певних умов, тощо. Скринінг антитіл з бажаними властивостями Антитіла за даним винаходом зв'язують EGFL7, і в деяких варіантах здійснення, можуть модулювати один або декілька аспектів ефектів, пов'язаних з EGFL7, включаючи, але, не обмежуючи цим, руйнування будь-якого біологічно релевантного біологічного шляху EGFL7 і/або лікування і/або запобігання появи пухлини, проліферативного клітинного розладу або раку; і/або лікування або запобігання розладу, пов'язаного з експресуванням і/або активністю EGFL7 (такого як підвищеного експресування і/або підвищеної активності EGFL7). Наприклад, антитіла за даним винаходом можуть екрануватися на їхню здатність до блокування адгезії клітин HUVEC і EGFL7 i міграції HUVEC на планшетах, покритих білком EGFL7, як тут описується. Очищені антитіла можуть додатково характеризуватися за допомогою ряду аналізів, включаючи, але, не обмежуючи цим, N-кінцеве секвенування, аналіз амінокислот, неденатуруючу ексклюзійну високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ), мас-спектрометрію, іонообмінну хроматографію і папаїновий гідроліз. У визначених варіантах здійснення даного винаходу, антитіла, які продукуються тут, аналізуються на їхню біологічну активність. У деяких варіантах здійснення, антитіла за даним винаходом досліджуються на їхню активність при зв'язуванні антигену. Аналізи зв'язування антигену, що відомі в даній галузі і можуть використовуватися тут, містять у собі, але, не обмежуючи цим, будь-які аналізи прямого або конкурентного зв'язування з використанням таких технологій, як вестерн-блот, радіоімунологічні аналізи, ELISA (імуносорбентний аналіз за допомогою зв'язаного ферменту), імунні "сендвіч" аналізи, аналізи імунопреципитації, флюоресцентні імунні аналізи й імунні аналізи за допомогою білка А. Ілюстративні аналізи зв'язування антигенів приводяться нижче в розділі Приклади. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає антитіло анти-EGFL7, що конкурує з антитілом, яке містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 3, і варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 4, за зв'язування EGFL7. Такі конкурентні антитіла можуть бути 53 отримані за допомогою скринінгу супернатантів гібридоми анти-EGFL7 на зв'язування з іммобілізованим EGFL7 при конкуренції з міченим антитілом, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 3, і варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 4. Такі конкурентні антитіла містять у собі антитіла, які розпізнають епітоп EGFL7, що є таким же, як епітоп EGFL7, розпізнаваний антитілом, або перекривається з ним. Супернатант гібридоми, що містить конкурентне антитіло, буде зменшувати кількість зв'язаного, міченого антитіла, детектованого в розглянутій суміші з конкурентним зв'язуванням, у порівнянні з кількістю зв'язаного міченого антитіла, детектованого в контрольній суміші зі зв'язуванням, що містить ірелевантне антитіло (або що не містить нічого). Будь-які аналізи конкурентного зв'язування, описані тут, є придатними для використання в зазначеній вище процедурі. Антитіла анти-EGFL7 за даним винаходом, що володіють властивостями, описаними тут, можуть бути отримані за допомогою скринінгу клонів гібридоми анти-EGFL7 на бажані властивості за допомогою будь-якого звичайного способу. Наприклад, якщо є бажаним моноклональне антитіло анти-EGFL7, що конкурує або не конкурує за зв'язування EGFL7 з антитілом, яке містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 3, і варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 4, антитіло-кандидат може досліджуватися в аналізі конкурентного зв'язування. Конкурентні аналізи добре відомі в даній галузі. Інші функціональні аналізи для визначення інгібіторної здатності антитіла анти-EGFL7 відомі в даній галузі, деякі з них ілюструються тут. У деяких варіантах здійснення, даний винахід передбачає змінені антитіла, що мають деякі, але не всі ефекторні функції, які роблять їх бажаними кандидатами для множини застосувань, у яких є важливим половинний час життя антитіла in vivo, а деякі ефекторні функції (такі як комплементи і ADCC) є необов'язковими або шкідливими. У деяких варіантах здійснення, активності Fc отриманого імуноглобуліну виміряються, щоб бути упевненим, що підтримуються тільки бажані властивості. Аналізи цитотоксичності in vitro і/або in vivo можуть здійснюватися для підтвердження зменшення/збідніння активностей CDC і/або ADCC. Наприклад, можуть здійснюватися аналізи зв'язування рецептора Fc (FcR), щоб бути упевненим, що в антитіла немає зв'язування FcR (отже, імовірно, відсутня активність ADCC), але воно зберігає здатність до зв'язування FcRn. Первинні клітини для опосередкування ADCC, клітини NK експресують тільки FcRIII, у той час як моноцити експресують FcRI, FcRII і FcRIII. Експресія Fc у гематопоетичних клітинах приводиться в Таблиці 3 на сторінці 464 Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Приклад аналізу in vitro для оцінки активності ADCC молекули, що представляє інтерес, описується в заявці на патент 97360 54 США № 5500362 або 5821337. Ефекторні клітини, придатних для таких аналізів, містять у собі мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) і клітини природних кілерів (NK). Альтернативно, або на додаток до цього, активність ADCC молекули, що представляє інтерес, може оцінюватися in vivo, наприклад, на тваринній моделі, такій як та, яка описується в Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Аналізи зв'язування C1q також можуть здійснюватися для підтвердження того, що антитіло не здатне зв'язувати C1q і, отже, воно не має активності CDC. Для оцінки активування комплементу може здійснюватися аналіз CDC, наприклад, як описується в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Meth. 202:163 (1996). Визначення зв'язування FcRn і виведення/половинного часу життя також можуть здійснюватися in vivo з використанням способів, відомих у даній галузі. У деяких варіантах здійснення, даний винахід надає змінені антитіла, що мають підвищені ефекторні функції і/або збільшений половинний час життя. Вектори, клітини-хазяїни і рекомбінантні способи Для рекомбінантного продукування антитіла за даним винаходом, нуклеїнова кислота, що кодує його, виділяється і вставляється в реплікований вектор для подальшого клонування (ампліфікації ДНК) або для експресування. ДНК, що кодує антитіло, легко виділяється і секвенується з використанням звичайних процедур (наприклад, за допомогою використання олігонуклеотидних зондів, що здатні специфічно зв'язувати гени, які кодують важкі і легкі ланцюги антитіла). Доступна множина векторів. Вибір вектора частково залежить від клітини-хазяїна, що повинна використовуватися. Як правило, переважні клітини-хазяїни мають або прокаріотичне, або еукаріотичне походження (як правило, від ссавців). Буде ясно, що константні області будь-якого ізотипу можуть використовуватися для цієї мети, включаючи константні області IgG, IgM, IgA, IgD і IgE, і, що такі константні області можуть бути отримані від людини або будь-яких видів тварин. а. генерування антитіл з використанням прокаріотичних клітин-хазяїнів: i. Конструювання вектора Полінуклеотидні послідовності, які кодують поліпептидні компоненти антитіла за даним винаходом, можуть бути отримані з використанням стандартних рекомбінантних технологій. Бажані полінуклеотидні послідовності можуть виділятися і секвенуватися з клітин, які продукують антитіла, таких як клітини гібридоми. Альтернативно, полінуклеотиди можуть синтезуватися з використанням технологій синтезатора нуклеотидів або PCR. Після одержання, послідовності, що кодують поліпептиди, вставляються в рекомбінантний вектор, здатний реплікувати і експресувати гетерологічні полінуклеотиди в прокаріотичних хазяях. Множина векторів, які є доступними і відомими в даній галузі, може використовуватися для цілей даного винаходу. Вибір відповідного вектора буде залежати в основному від розміру нуклеїнових кислот, що повинні вставлятися у вектор, і від конкретної клі 55 тини-хазяїна, яка повинна трансформуватися за допомогою вектора. Кожен вектор містить різні компоненти, у залежності від його функції (ампліфікації або експресування гетерологічного полінуклеотиду, або як того, так і іншого) і від його сумісності з конкретною клітиною-хазяїном, у якій він знаходиться. Компоненти вектора, як правило, містять у собі, але, не обмежуючи цим: джерело реплікування, маркерний ген селекції, промотор, сайт зв'язування рибосом (RBS), сигнальну послідовність, вставку гетерологічної нуклеїнової кислоти і послідовність закінчення транскрипції. Як правило, вектори плазміди, які містять реплікон і контрольні послідовності, що одержують з видів, сумісних із клітиною-хазяїном, використовуються в зв'язку з цими хазяїнами. Вектор звичайно несе сайт реплікації, а також маркують послідовності, які здатні забезпечити фенотипічну селекцію в клітинах, що трансформуються. Наприклад, Е.coli звичайно трансформується з використанням pBR322, плазміди, отриманої від видів Е.coli. pBR322 містить гени, що кодують стійкість до ампіциліну (Amp) і тетрацикліну (Tet), і в такий спосіб забезпечує прості засоби для ідентифікації трансформованих клітин. pBR322, її похідні або інші мікробні плазміди або бактеріофаги можуть також містити промотори або модифікуватися так, щоб вони містили промотори, що можуть використовуватися організмом мікроба для експресування ендогенних білків. Приклади похідних pBR322, використовуваних для експресії конкретних антитіл, докладно описані в Carter et al., заявці на патент США № 5648237. На додаток до цього, фагові вектори, що містять реплікон і контрольні послідовності, які сумісні з мікроорганізмом хазяїном, можуть використовуватися як трансформуючі вектори в сполученні з цими хазяїнами. Наприклад, бактеріофаг, такий як GΕΜ-11 може використовуватися при одержанні рекомбінантного вектора, що може використовуватися для перетворення чутливих клітинхазяїнів, таких як LE392 Е.coli. Вектор експресії за даним винаходом може містити дві або більше пар промотор-цистрон, що кодують кожний з поліпептидних компонентів. Промотор являє собою нетрансльовану регуляторну послідовність, розташовану перед (5') цистроном, що модулює її експресію. Прокаріотичні промотори, як правило, попадають у два класи, індуковані і конститутивні. Індукований промотор являє собою промотор, що ініціює збільшення рівнів транскрипції цистрону під його контролем у відповідь на зміни в стані культури, наприклад, присутність або відсутність живлення або зміну температури. Велика кількість промоторів, розпізнаваних різноманітними потенційними клітинами-хазяїнами, добре відома. Вибраний промотор може функціонально зв'язуватися з ДНК цистрону, що кодує легкий або важкий ланцюг, за допомогою видалення промотору з джерела ДНК за допомогою гідролізу ферменту рестрикції і вставки виділеної промоторної послідовності у вектор за даним винаходом. Як нативна промоторна послідовність, так і множина гетерологічних промоторів можуть 97360 56 використовуватися для прямої ампліфікації і/або експресії цільових генів. У деяких варіантах здійснення, використовуються гетерологічні промотори, оскільки вони, як правило, уможливлюють велику транскрипцію і більш високі виходи експресованого цільового гена в порівнянні з нативним цільовим поліпептидним промотором. Промотори, придатні для використання разом із прокаріотичними хазяїнами, містять у собі промоторні системи на основі промотору pho, галактамази і лактози, промоторну систему на основі триптофану (trp) і гібридні промотори, такі як промотор tac або trc. Однак інші промотори, які є функціональними в бактеріях (такі як інші відомі бактеріальні або фагові промотори) також є придатними для використання. Їх нуклеотидні послідовності опубліковані, що дає можливість фахівцю в даній галузі функціонально лігувати їх з цистронами, що кодують цільові легкі і важкі ланцюги (Siebenlist et al., Cell 20:269 (1980)), з використанням лінкерів або адапторів для одержання будьяких необхідних сайтів рестрикції. В одному з аспектів даного винаходу, кожен цистрон у рекомбінантному векторі містить компонент сигнальної послідовності секреції, що направляє транслокацію експресованих поліпептидів по мембрані. Як правило, сигнальна послідовність може являти собою компонент вектора або може являти собою частину ДНК цільового поліпептиду, що вставляється у вектор. Сигнальна послідовність, вибрана для мети даного винаходу, повинна бути такою, яка розпізнається і процесується (тобто, розщеплюється за допомогою сигнальної петидази) клітиною-хазяїном. Для прокаріотичних клітин-хазяїнів, що не розпізнають і не процесують сигнальні послідовності, нативні для гетерологічних поліпептидів, сигнальна послідовність заміщається прокаріотичною сигнальною послідовністю, вибраною, наприклад, із групи, яка складається з лужної фосфатази, пеніцилінази, Ірр або термічно стабільних лідерів на основі ентеротоксину II (STII), Lam, Pho, Pel, Omp і МВР. В одному з варіантів здійснення даного винаходу, сигнальні послідовності, використовувані в обох цистронах системи експресії, являють собою сигнальні послідовності STII або їхні варіанти. В іншому аспекті, продукування імуноглобулінів відповідно до даного винаходу може здійснюватися в цитоплазмі клітини-хазяїна, і з цієї причини воно не вимагає присутності сигнальних послідовностей секреції в кожному цистроні. У цьому зв'язку, легкі і важкі ланцюги імуноглобуліну експресуються, складаються і збираються з утворенням функціональних імуноглобулінів у цитоплазмі. Визначені штами хазяїнів (наприклад, штами E.coli trx') забезпечують у цитоплазмі умови, що є сприятливими для формування дисульфідних зв'язків, тим самим роблячи можливим відповідне складання і зборку експресованих субодиниць білка. Proba & Pluckthun, Gene 159:203 (1995). Прокаріотичні клітини-хазяїни, придатні для експресування антитіл за даним винаходом, містять у собі Archaebacteria і Eubacteria, такі як грамнегативні або грампозитивні організми. Приклади 57 придатних для використання бактерій містять у собі Escherichia (наприклад, E.coli), Bacilli (наприклад, B.subtilis), Enterobacteria, види Pseudomonas (наприклад, P.aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla або Paracoccus. У деяких варіантах здійснення, використовуються грамнегативні клітини. У деяких варіантах здійснення, клітини Е.coli використовуються як хазяї для даного винаходу. Приклади штамів Е.coli містять у собі штам W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) і його похідні, включаючи штам 33D3, що має генотип W3110 fhuA (ДtonА) ptr3 lac Iq lас8 οmpΤΑ (nmpc-fep) deg41 kan (заявка на патент США № 5639635). Інші штами і їхні похідні, такі як Е.coli 294 (АТСС 31,446), Е.coli В, Е.coli  1776 (ATCC 31,537) і Е.coli RV308 (АТСС 31,608) також є придатними. Ці приклади є скоріше ілюстративними, ніж обмежуючими. Способи конструювання похідних будь-якої з розглянутих вище бактерій, що мають визначені генотипи, відомі в даній галузі й описуються, наприклад, у Bass et al., Proteins 8:309-14 (1990). Як правило, необхідно вибирати відповідні бактерії, приймаючи в увагу реплікованість реплікону в клітинах бактерій. Наприклад, види Е.coli, Serratia або Salmonella можуть відповідним чином використовуватися як хазяї, коли добре відомі плазміди, такі як pBR322, pBR325, pACYC177, або pKN410, використовуються для одержання реплікону. Як правило, клітинахазяїн повинна секретувати мінімальні кількості протеолітичних ферментів, і бажано, щоб додаткові інгібітори протеази включалися в клітинну культуру. іі. Продукування антитіл Клітини-хазяїни трансформуються за допомогою описаних вище векторів експресії і культивуються в звичайних поживних середовищах, модифікованих відповідним чином для індукування промоторів, селекції трансформантів або ампліфікації генів, що кодують бажані послідовності. Засоби трансформації вводять ДНК у прокаріотичного хазяїна, так що ДНК може реплікуватися, або як екстрахромосомальний елемент, або за допомогою хромосомального інтегранту. У залежності від використовуваної клітини-хазяїна, трансформування здійснюється з використанням стандартних технологій, що відповідають таким клітинам. Обробка кальцієм з використанням хлориду кальцію, як правило, використовується для бактеріальних клітин, що містять достатні бар'єри клітинних стінок. Інший спосіб трансформування використовує поліетиленгліколь/ДМСО. Ще одна використовувана технологія являє собою електропорацію. Прокаріотичні клітини, використовувані для одержання поліпептидів за даним винаходом, вирощуються в середовищах, відомих у даній галузі і придатних для культивування вибраних клітинхазяїнів. Приклади відповідних середовищ включають у бульйон Луріа (LB) плюс необхідні поживні добавки. У деяких варіантах здійснення, середовища також містять агент селекції, вибраний на 97360 58 основі конструкції вектора експресії, щоб селективно давати можливість для росту прокаріотичних клітин, що містять вектор експресії. Наприклад, ампіцилін додають у середовища для росту клітин, які експресують ген, стійкий до ампіциліну. Будь-які необхідні добавки, крім джерел вуглецю, азоту і неорганічних фосфатів, також можуть включатися при відповідній концентрації, що вводяться по одній або як суміш з іншою добавкою або середовищем, таким як комплексне джерело азоту. Необов'язково, середовище для культивування може містити один або декілька відновлювальних агентів, вибраних із групи, яка складається з глютатіону, цистеїну, цистаміну, тіогліколюту, дитіоеритритолу і дитіотреїтолу. Прокаріотичні клітини-хазяїни культивують при відповідних температурах. Для росту Е.coli, наприклад, як правило, використовують температуру в межах від приблизно 20°С до приблизно 39°С, як правило, від приблизно 25°С до приблизно 37°С, наприклад, приблизно 30°С. рН середовища може являти собою будь-який рН, що знаходиться в межах від приблизно 5 до приблизно 9, він залежить в основному від організму-хазяїна. Для Е.coli, рН складає, як правило, від приблизно 6,8 до приблизно 7,4, а, як правило, приблизно, 7,0. Якщо у векторі експресії за даним винаходом використовується індукований промотор, експресія білка індукується при умовах, придатних для активування промотору. В одному з аспектів даного винаходу, промотори pho використовують для контролю транскрипції поліпептидів. Відповідно, трансформованія клітини-хазяїни культивують у середовищі з обмеженням фосфатного субстрату для індукування. Середовище з обмеженням фосфатного субстрату являє собою, як правило, середовище C.R.A.P (див., наприклад, Simmons et al., J. Immunol. Meth. 263:133-47 (2002)). Можуть використовуватися різноманітні інші індуктори, відповідно до використовуваного конструкта вектора, як відомо в даній галузі. В одному з варіантів здійснення, експресовані поліпептиди за даним винаходом секретуються в периплазмі клітин-хазяїнів і витягаються з неї. Витягання білків, як правило, містить у собі руйнування мікроорганізму, як правило, за допомогою таких засобів як осмотичний шок, озвучування або лізис. Після руйнування клітин, залишки клітин або цільні клітини можуть видалятися за допомогою центрифугування або фільтрування. Білки можуть додатково очищатися, наприклад, за допомогою афінної хроматографії на смолі. Альтернативно, білки можуть переноситися в культурні середовища і виділятися з них. Клітини можуть віддалятися з культури, і супернатант культури фільтрується і концентрується для подальшого очищення отриманих білків. Експресовані поліпептиди можуть додатково виділятися й ідентифікуватися з використанням відомих способів, таких як електрофорез на поліакриламідному гелі (PAGE) і аналіз вестерн-блот. В одному з аспектів даного винаходу, одержання антитіл здійснюється у великих кількостях за допомогою способу ферментування. Різні промислові завантажувальні процедури ферменту 59 вання є доступними для одержання рекомбінантних білків. Промислові ферментери мають ємність щонайменше 1000 літрів, переважно, ємність від приблизно 1000 до 100000 літрів. Ці ферментери використовують перемішуючі лопаті для розподілу кисню і поживних речовин, зокрема, глюкози (звичайного джерела вуглецю/енергії). Ферментування малого масштабу, як правило, належить до ферментування у ферментері, що має ємність не більше приблизно 100 літрів по об'єму, і вона може знаходитися в межах від приблизно 1 літра до приблизно 100 літрів. У способі ферментування, індукування експресії білків, як правило, ініціюється після того, як клітини вирощуються при відповідних умовах до одержання бажаної щільності, наприклад, до значення OD550 приблизно 180-220, на цій стадії клітини знаходяться в ранній стаціонарній фазі. Можуть використовуватися різноманітні індуктори, відповідно до використовуваного конструкта вектора, як відомо в даній галузі й описується вище. Клітини можуть вирощуватися протягом більш коротких періодів перед індукуванням. Клітини звичайно індукуються приблизно протягом 12-50 годин, хоча може використовуватися більш тривалий або більш короткий час індукування. Для поліпшення промислового виходу і якості поліпептидів за даним винаходом, можуть модифікуватися різні умови ферментування. Наприклад, для поліпшення правильної зборки і складання секретованих поліпептидів антитіла, можуть використовуватися додаткові вектори, що здійснюють надекспресію білків шаперонів, таких як білки Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD і/або DsbG) або FkpA (пептидилпроліл цис, транс ізомераза із шаперонною активністю) для спільного трансформування прокаріотичних клітин-хазяїнів. Білки шаперони, як продемонстровано, полегшують правильне складання і розчинність гетерологічних білків, вироблених у бактеріальних клітинах-хазяях. Chen et al., J. Biol Chem. 274:19601-05 (1999); Georgiou et al., заявка на патент США № 6083715; Georgiou et al., заявка на патент США № 6027888; Bothmann & Pluckthun, J. Biol Chem. 275:17100-05 (2000); Ramm & Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17106-13 (2000); Arie et al., Molec. Microbiol. 39:199-210 (2001). Для зведення до мінімуму протеолізу експресованих гетерологічних білків (особливо, тих, які є протеолітично чутливими), певні штами хазяїнів, дефіцитних відносно протеолітичних ферментів, можуть використовуватися для даного винаходу. Наприклад, штами клітин-хазяїнів можуть модифікуватися для здійснення генетичної мутації (мутацій) у генах, що кодують відомі бактеріальні протеази, такі як Протеаза III, OmpT, DegP, Tsp, Протеаза І, Протеаза Мі, Протеаза V, Протеаза VI і їхнього сполучення. Деякі протеаза-дефіцитні штами Е.coli є доступними й описуються, наприклад, у Joly et al. (1998), вище; Georgiou et al., у заявці на патент США № 5264365; Georgiou et al., у заявці на патент США № 5508192; Нага et al., Microbial Drug Resistance 2:63-72 (1996). В одному з варіантів здійснення, штами Е.coli, дефіцитні відносно протеолітичних ферментів і 97360 60 трансформовані за допомогою плазмід, що здійснюють надекспресію одного або декількох білків шаперонів, використовують як клітини-хазяїни для системи експресії за даним винаходом. iiі. Очищення антитіл Можуть використовуватися стандартні способи очищення білків, відомі в даній галузі. Наступні процедури являють собою приклади відповідних процедур очищення: фракціонування на імуноафінних або іонообмінних колонках, преципітація в етанолі, ВЕРХ з оберненою фазою, хроматографія на силікагелі або на катіонообмінній смолі, такій як DEAE, хроматофокусування, SDS-PAGE, амонійсульфатна преципітація, і гель-фільтрація з використанням, наприклад, Sephadex G-75. В одному з аспектів, білок А, іммобілізований на твердій фазі, використовується для імунноафінного очищення продуктів повнорозмірних антитіл за даним винаходом. Білок А являє собою білок клітинної стінки з молекулярною масою 41 кДа з Staphylococcus aureas, що зв'язується з високою спорідненістю з областю Fc антитіл. Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983). Тверда фаза, на якій іммобілізується білок А, переважно являє собою колонку, що містить поверхню скла або окису кремнію, більш переважно, скляну колонку з контрольованими розмірами пор або колонку з кремнієвої кислоти. У деяких застосуваннях, колонку покривають реагентом, таким як гліцерин, у спробі запобігти неспецифічній адгезії домішок. Як першу стадію очищення, препарат, отриманий з культури клітин, як описується вище, наноситься на тверду фазу з іммобілізованим білком А, щоб уможливити специфічне зв'язування антитіла, що представляє інтерес, з білком А. Потім тверду фазу промивають для видалення домішок, неспецифічно зв'язаних із твердою фазою. Нарешті, антитіло, що представляє інтерес, витягається з твердої фази за допомогою елюювання. b. Генерування антитіл з використанням еукаріотичних клітин-хазяїнів: Компоненти вектора, як правило, містять у собі, але, не обмежуючи цим, один або декілька з наступних компонентів: сигнальну послідовність, джерело реплікації, один або декілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор і послідовність переривання транскрипції. (і) Компонент сигнальної послідовності Вектор для використання в еукаріотичній клітині-хазяїні може також містити сигнальну послідовність або інший поліпептид, що має специфічний сайт розщеплення на N-кінці зрілого білка або поліпептиду, що представляє інтерес. Гетерологічна сигнальна послідовність, яка вибирається переважно, являє собою послідовність, яка розпізнається і процесується (тобто, розщеплюється під дією сигнальної петидази) клітиною-хазяїном. При експресії в клітинах ссавців, є доступними сигнальні послідовності ссавців, а також вірусні секреторні лідери, наприклад, сигнал gD від простого герпеса. ДНК для такої попередньої області лігується в рамці зчитування з ДНК, що кодує антитіло. (іі) Джерело реплікації