Імуногенна композиція

1. Імуногенна композиція, що включає капсулярний полісахарид типу 5 та/або 8 або олігосахарид S. aureus, де капсулярний полісахарид типу 5 або олігосахарид є на 30-100 % О-ацетильованим, та включає стафілококовий білок або його фрагмент, що являє собою білок, який зв'язує екстрацелюлярний компонент, вибраний з групи, яка складається з ламінінового рецептора, зв'язувального білка SitC/MntC/слини, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nпази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР. 2. Імуногенна композиція, що включає капсулярний полісахарид типу 5 та/або 8 або олігосахарид S. aureus, де капсулярний полісахарид типу 8 або олігосахарид є на 30-100 % О-ацетильованим, та включає стафілококовий білок або його фрагмент, що являє собою білок, який зв'язує екстрацелюлярний компонент, вибраний з групи, яка складається з ламінінового рецептора, зв'язувального білка SitC/MntC/слини, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, UA (21) a200810922 (22) 29.03.2007 (24) 10.02.2012 (86) PCT/EP2007/053057, 29.03.2007 (31) 0606416.6 60/787,249 60/787,587 (32) 30.03.2006 30.03.2006 30.03.2006 (33) GB US US (46) 10.02.2012, Бюл.№ 3, 2012 р. (72) ДЕНОЕЛЬ ФІЛІПП, BE, ПОЛМАН ЯН, BE (73) ҐЛАКСОСМІТКЛАЙН БАЙОЛОДЖІКАЛЗ С.А., BE (56) US2002031528 A1, 17.05.1998. WO03061558 A2, 31.07.2003. WO2005000346 A, 06.01.2005. WO2006065553 A, 22.06.2006. WO2006032472 A, 30.03.2006. WO0056360 A, 28.09.2000. FATTOM A I ET AL: "Antigenic determinants of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharide vaccines" INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY. WASHINGTON, US, vol. 66, no. 10, October 1998 (1998-10), pages 4588-4592. FATTOM A I ET AL: "Development of StaphVAX(TM), a polysaccharide conjugate vaccine against S. aureus infection: from the lab bench to phase III clinical trials" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 22, no. 7, 17 February 2004 (2004-02-17), pages 880-887. MOREAU M ET AL: "STRUCTURE OF THE TYPE 5 CAPSULAR POLYSACCHARIDE OF STAPHYLOCOCCUS-AUREUS" CARBOHYDRATE RESEARCH, vol. 201, no. 2, 1990, pages 285-298. JONES C: "Revised structures for the capsular polysaccharides from Staphylococcus aureus Types 5 and 8, components of novel glycoconjugate vaccines" CARBOHYDRATE RESEARCH, ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHING COMPANY. AMSTERDAM, NL, vol. 340, no. 6, 2 May 2005 (2005-05-02), pages 1097-1106. 2 (19) 1 3 97359 4 FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nпази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР. 3. Імуногенна композиція згідно з пунктом 2, в якій капсулярний полісахарид типу 5 або олігосахарид є на 30-100 % О-ацетильованим. 4. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 1-3, що включає стафілококовий PNAG. 5. Імуногенна композиція згідно з пунктом 4, де PNAG є менше ніж на 40 % N-ацетильованим. 6. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 1-5, що додатково включає капсулярний полісахарид типу І та/або типу II та/або типу III або олігосахарид S. epidermidis. 7. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 1-6, що додатково включає антиген 336 S. aureus. 8. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 1-7, що додатково включає стафілококовий білок або його фрагмент. 9. Імуногенна композиція згідно з пунктом 8, що включає 2 або більше стафілококових білки, вибраних з принаймні 2 різних груп, вибраних з: а) - принаймні одного стафілококового білка, що зв'язує екстрацелюлярний компонент, або його фрагмента, вибраного з групи, яка складається з ламінінового рецептора, зв'язувального білка SitC/MntC/слини EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nпази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP1, SSP-2, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР; b) - принаймні одного стафілококового білкатранспортера або його фрагмента, вибраного з групи, яка складається з імунодомінантного АВС транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, Mg2+ транспортера, HarA, SitC та Ni АВС транспортера; c) - принаймні одного стафілококового регулятора вірулентності, токсину або його фрагмента, вибраного з групи, яка складається з альфа-токсину (НІа), мутанту альфа-токсину H35R, білка, що активує РНК III (RAP). 10. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 1-9, в якій стафілококовий полісахарид є кон'югованим з білком носія. 11. Імуногенна композиція згідно з будь-яким з пунктів 4-10, в якій PNAG є кон'югованим з білком носія. 12. Імуногенна композиція згідно з пунктом 10 або 11, де білок носія включає стафілококовий білок або його фрагмент, вибраний з групи, яка складається з ламінінового рецептора, зв'язувального білка SitC/MntC/слини, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nпази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig, MAP, імунодомінантного АВС транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, Mg2+ транспортера, SitC та Ni АВС транспортера, альфа-токсину (НІа), мутанту альфа-токсину H35R та білка, що активує РНК III (RAP). 13. Імуногенна композиція згідно з пунктом 10 або 11, в якій білок носія є вибраним з групи, що включає токсоїд правця, дифтерійний токсоїд, CRM197, білок D Haemophilus influenzae, екзопротеїн A Pseudomonas aeruginosa, пневмококовий псевдолізин та альфа-токсоїд. 14. Імуногенна композиція згідно з пунктами 1-13, де ефективна імунна відповідь генерується як проти S. aureus, так і проти S. epidermidis. 15. Вакцина, що включає імуногенну композицію згідно з пунктами 1-14 та фармацевтично прийнятний наповнювач. 16. Спосіб одержання вакцини, що включає етап змішування антигенів з утворенням імуногенної композиції згідно з пунктами 1-14 та додання фармацевтично прийнятного наповнювача. 17. Спосіб кон'югації капсулярного полісахариду типу 5 або 8 або олігосахариду S. aureus, що включає наступні етапи: a) розчинення капсулярного полісахариду типу 5 або 8 або олігосахариду у воді або у фізіологічному розчині; b) додання агента ціанілування (наприклад, CDAP) з утворенням активованого полісахариду або олігосахариду; c) додання білка носія так, що аміногрупи реагують з активованим полісахаридом з утворенням ковалентного зв'язку ізосечовини. 18. Спосіб згідно з пунктом 17, де капсулярний полісахарид або олігосахарид типу 5 є на 30-100 % О-ацетильованим. Галузь винаходу Даний винахід відноситься до галузі стафілококових імуногенних композицій та вакцин, до їх виробництва та застосування таких композицій у медицині. Зокрема, він відноситься до вакцинних композицій, що включають полісахариди типу 5 та/або 8 з S. aureus, в яких ступінь Оацетилування складає від 30 до 100%. Забезпечуються також способи лікування або запобігання стафілококових інфекцій при використанні таких вакцин. Передумови створення винаходу Кількість осіб, що входять до складу групи з набутою інфекцією та групи з клінічно набутою інфекцією, підвищилася за останні роки, при цьому почастішали випадки застосування внутрішньосудинних пристроїв. Клінічно набуті (набуті у лікарні, нозокоміальні) інфекції є основною причиною захворюваності та смертності, зокрема, у США, де вони зачіпають більше 2 мільйонів пацієнтів щорічно. Після проведення різноманітних досліджень було встановлено, що приблизно 6 процентів пацієнтів у США набувають інфекції під час їх перебування у лікарні. Економічні збитки у США були оці 5 нені у 1992 році як такі, що перевищують 4,5 мільярди доларів США (Emori та Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428). Найчастіше зустрічаються інфекції сечового тракту (UTI - 33% інфекцій), після цього йде пневмонія (15,5%), інфекції у місці хірургічного втручання (14,8%) та первинні інфекції кровообігу (13%) Emori та Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428). Staphylococcus aureus, коагулаза-негативний стафілокок (головним чином, Staphylococcus epidermidis), enterococcus spp, Esherichia coli та Pseudomonas aeruginosa є основними нозокоміальними патогенами. Хоча ці патогени спричинюють майже однакову кількість інфекцій, тяжкість розладів, що вони можуть викликати, поєднана з частотою стійких до антибіотиків ізолятів, зсувають цей баланс у бік S. aureus та S. epidermidis як найбільш важливих нозокоміальних патогенів. Staphylococcus aureus являє собою найбільш загальну причину нозокоміальних інфекцій із значним ступенем захворюваності та смертності (Romero-Vivas та ін. 1995, Infect. Dis. 21; 1417). Він є причиною деякої кількості випадків остеомієліту, ендокардиту, септичного артриту, пневмонії, абсцесу та синдрому токсичного шоку. S. epidermidis являє собою нормальний шкірний симбіонт (коменсал), який також є важливим опортуністичним патогеном, що відповідає за інфекції, які передаються за допомогою імплантованих медичних пристроїв, інфекції у місцях хірургічного втручання. Медичні пристрої, інфіковані S. epidermidis, включають серцеві електронні стимулятори серця, шунти для забезпечення відтоку спинномозкової рідини, катетери для постійного перитонеального діалізу, ортопедичні пристрої та штучні серцеві клапани. Інфекції S. aureus та S. epidermidis лікуються при використанні антибіотиків, при цьому вибір залишається за пеніциліном, у той час як ванкоміцин використовується для стійких до метациліну ізолятів. Процент стафілококових штамів, які демонструють широкий спектр резистентності до антибіотиків, значною мірою виріс з 80-их років 20 століття (Panlilo та ін. 1992, Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), що складає загрозу для ефективної антимікробної терапії. На доповнення до цього, недавня поява резистентних до ванкоміцину штамів S. aureus викликало побоювання, що з'являться та поширяться резистентні до метициліну штами S. aureus, для яких не існує ефективного способу терапії. Було досліджено альтернативний підхід використання антитіл проти стафілококових антигенів у пасивній імунотерапії. Розробляються терапії, що втягують введення поліклональної сироватки (WO 00/15238, WO 00/12132), а також способи лікування при використанні моноклонального антитіла проти ліпотейхоєвої кислоти (WO 98/57994). Альтернативний підхід може використовуватися для активної вакцинації для одержання імунної відповіді проти стафілококу. Були ідентифіковані деякі кандидати на включення до складу вакцини як вакцинних компонентів. Такі включають білок, що зв'язує фібронектин (US5840846), МНС II аналог (US5648240), білок, що зв'язує фібриноген 97359 6 (US6008341), GehD (US 2002/0169288), білок, що зв'язує колаген (US6288214), SdrF, SdrG та SdrH (WO 00/12689), мутантні SEA та SEB екзотоксини (WO 00/02523) та білок, який зв'язує вітронектин вагою 52 кДа (WO 01/60852). Було секвеновано геном S. aureus та було ідентифіковано багато кодуючих послідовностей (ЕР786519, WO02/094868). Те ж саме стосується S. epidermidis (WO 01/34809). Як вдосконалення цього підходу, інші вчені ідентифікували білки, що впізнаються гіперімунною сироваткою пацієнтів, що страждають на стафілококову інфекцію (WO01/98499, WO 02/059148). Перше покоління вакцин, націлених проти S. aureus або проти екзопротеїнів, які вони виробляють, мало обмежений успіх (Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162). Продовжує існувати необхідність у розробці ефективних вакцин, направлених проти стафілококових інфекцій. Опис фігур Фігура 1 - Поліпептидні послідовності білків для включення в імуногенну композицію. Таблиця 1 забезпечує інформацію, де кожний білок представлений своїм номером послідовності SEQ ID. Фігура 2 - Нуклеотидні послідовності, що кодують білки для включення в імуногенну композицію. Таблиця 1 забезпечує інформацію, де кожний білок кодується послідовністю с певним номером SEQ ID. Фігура 3 - Очищення альфа-токсину при нативних умовах. Панель А показує забарвлений за Кумассі SDS-PAGE зразків, одержаних під час очищення альфа-токсину. Смуга 1 - маркери молекулярної ваги, смуга 2 - розчинна фракція, що містить понадекспресований альфа-токсин, смуга 3 - потік, що пройшов через Ni-NTA колонку, смуга 4 - фракції, елюйовані за допомогою 10% буфера В, смуга 5 - фракції, елюйовані за допомогою 20% буфера В, смуга 6 - фракції, елюйовані за допомогою 30% буфера В, смуга 7 - фракції, елюйовані за допомогою 50% буфера В, смуга 8 - фракції, елюйовані за допомогою 75% буфера В, смуга 9 та 10 - фракції, елюйовані за допомогою 100% буфера В, смуга 11 - бактерії у момент часу Т=0 перед індукцією, смуга 12 - бактерії у момент часу Т=4 години після індукції, смуга 13 - клітинний лізат, смуга 14 - розчинна фракція, смуга 15 - нерозчинна фракція. Панель В показує забарвлений за Кумассі SDS-PAGE 10, 5, 2 та 1 мкл очищеного альфа-токсину. Фігура 4 - Очищення SdrC в умовах денатурації. Панель А показує забарвлений за Кумассі SDS-PAGE зразків, одержаних під час очищення альфа-токсину. Смуга Μ - маркери молекулярної ваги, смуга Start - супернатант, утворений з нерозчинної фракції, що містить понадекспресований SdrC, смуга FT1 - потік, що пройшов через Ni-NTA колонку, смуга С - фракції, елюйовані за допомогою промивного буфера С, смуга D -фракції, елюйовані за допомогою буфера D, смуга Ε - фракції, елюйовані за допомогою буфера Е. Панель В показує забарвлений за Кумассі SDS-PAGE 1, 2, 5 та 10 мкл очищеного SdrC. 7 Фігура 5 - результати ELISA для антисироватки проти стафілококових білків на планшетах, покритих очищеними білками. Мишиний пул pre - результат при використанні поєднаної сироватки, одержаної з мишей перед інокуляцією. Мишиний пул post III - результат при використанні поєднаної сироватки, одержаної з мишей після імунізації. Кролячий пул pre - результат при використанні поєднаної сироватки, одержаної з кролів перед інокуляцією. Кролячий пул post III - результат при використанні поєднаної сироватки, одержаної з кролів після імунізації. ВІснегативний контроль. Фігура 6 - результати ЕLISА для мишиної антисироватки, що виробляється проти стафілококових білків у планшетах, покритих вбитими стафілококами. Панель А використовує планшети, покриті цільними вбитими клітинами S. aureus серотипу 5. Панель В використовує планшети, покриті цільними вбитими клітинами S. aureus серотипу 8. Панель С використовує планшети, покриті цільними вбитими клітинами S. epidermidis. Лінія, помічена значками квадратів, показує результат ELISA, одержаний при використанні антисироватки з мишей, тричі імунізованих вказаним стафілококовим білком. Лінія, помічена значками ромбів, показує результат ELISA для мишиної сироватки до імунізації. Фігура 7 - результат ELISA для кролячої антисироватки, що виробляється проти стафілококових білків у планшетах, покритих вбитими стафілококами. Панель А використовує планшети, покриті цільними вбитими клітинами S. aureus серотипу 5. Панель В використовує планшети, покриті цільними вбитими клітинами S. aureus серотипу 8. Панель С використовує планшети, покриті цільними вбитими клітинами S. epidermidis. Лінія, помічена значками квадратів, показує результат ELISA, одержаний при використанні антисироватки з кролів, тричі імунізованих вказаним стафілококовим білком (за винятком HarА, де проводили тільки одну імунізацію). Лінія, помічена значками ромбів, показує результат ELISA для кролячої сироватки до імунізації. Детальний опис Даний винахід розкриває імуногенні композиції, які включають по лісахариди типу 5 та/або 8 S. aureus, де капсулярні полісахариди типу 5 та/або типу 8 або олігосахариди є на 30%-100% Оацетилованими. В окремих втіленнях імуногенна композиція згідно з винаходом додатково включає PNAG або стафілококовий(і) білок(білки). PNAG є висококонсервативним серед Грам-позитивних бактерій та забезпечує захист проти широкого спектру бактерій, у той час, як полісахариди типу 5 та 8 є потужними імуногенами, що викликають імунну відповідь проти більшості штамів S. aureus, що є найбільш загальною причиною нозокоміальної інфекції. Полісахариди Імуногенні композиції згідно з винаходом включають PNAG та полісахариди типу 5 та 8 з S. 97359 8 aureus, один з яких або обидва є на 30%-100% Оацетилованими. Полі N-ацетилований глюкозамін (PNAG) PNAG являє собою полісахаридний внутрішньоклітинний адгезин та складається з полімеру (16)-зв'язаного глюкозаміну, необов'язково заміщеного Ν-ацетильними та/або О-сукцинільними компонентами. Цей полісахарид є присутнім як у S. aureus, так і в S. epidermidis, та може бути ізольований з обох джерел (Joyce та ін. 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira-Litran та ін. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Наприклад, PNAG може бути ізольований із штаму MN8m S. aureus (WO 04/43407). Одержання dPNAG є описаним у WO 04/43405. Полісахарид, раніше відомий як полі-Nсукциніл--(16)-глюкозамін (PNSG) був недавно показаний як такий, що не має очікуваної структури, оскільки ідентифікація N-сукцинілування була неправильною (Maira-Litran та ін. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Таким чином, полісахарид, який раніше був відомий як PNSG та який зараз ідентифікований як такий, що є PNAG, також охоплюється терміном PNAG. PNAG може мати різні розміри, що варіюють від такого, що є більшим за 400 кДа, до розміру від 75 до 400 кДа, та до такого від 10 до 75 кДа та до олігосахаридів, що складаються з 30 повторюваних одиниць (-(16)-зв'язаний глюкозамін, необов'язково заміщений N-ацетильними та/або Осукцинільними компонентами). Будь-який розмір PNAG полісахариду або олігосахариду може використовуватися в імуногенній композиції згідно з винаходом, наприклад, може використовуватися розмір більше 40 кДа. Калібрування за розмірами може бути досягнуте за допомогою способу, відомого в області техніки, наприклад, шляхом мікропсевдозрідження, обробки ультразвуком або хімічним розщепленням (WO 03/53462, ЕР497524, ЕР497525). Границі розмірів для PNAG складають, наприклад, 40-400 кДа, 50-350 кДа, 40-300 кДа, 60-300 кДа, 50-250 кДа та 60-200 кДа. PNAG може мати різну ступінь ацетилування завдяки заміні аміногруп на ацетат. PNAG, одержаний in vitro, майже повністю є заміщеним на аміногрупах (95-100%). Альтернативно, може використовуватися деацетилований PNAG, що має ступінь Nацетилування меншу за 50%, 40%, 30%, 20%, 10% або 5%. Застосування деацетилованого PNAG дозволяє здійснювати опсонічне знищення Грампозитивних бактерій, необов'язково S. aureus та/або S. epidermidis (WO 04/43405). В одному втіленні PNAG має розмір від 40 кДа до 300 кДа та є деацетилованим так, що менше, ніж 50%, 40%, 30%, 20%, 10% або 5% аміногруп є N ацетилованими. В одному втіленні PNAG не є Осукцинілованим або є О-сукцинілованим менше, ніж 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 або 0,1% залишків. Термін деацетилований PNAG (dPNAG) відноситься до PNAG полісахариду або олігосахариду, в якому менше, ніж 50%, 40%, 30%, 20%, 10% або 5% аміногруп є ацетилованими. 9 Як використовується в даній заявці, термін PNAG охоплює як ацетиловані, так і деацетиловані форми сахариду. В одному втіленні PNAG є деацетилованим з утворенням dPNAG шляхом хімічної обробки нативного полісахариду. Наприклад, нативний PNAG обробляють основним розчином, так, що значення рН збільшується до такого, що є вищим за 10. Наприклад, PNAG обробляють за допомогою 0,1-5M, 0,2-4M, 0,3-3M, 0,5-2M, 0,75-1,5M або 1M NaOH, KОН або NH4OH. Обробка триває принаймні 10 або 30 хвилин, або 1, 2, 3, 4, 5,10, 15 або 20 годин при температурі 20-100, 25-80, 30-60 або 30-50 або 35-45°С. dPNAG може бути одержаний, як описано в WO 04/43405. В одному втіленні полісахарид(и), що входить(ять) до складу імуногенної композиції згідно з винаходом, є кон'югованими з білком носія, як описано нижче або, альтернативно, є некон'югованими. Полісахариди типу 5 та типу 8 S. aureus Більшість штамів S. aureus, що спричинюють інфекцію у людини, містять або полісахариди типу 5 або типу 8. Приблизно 60% людських штамів є такими типу 8 та приблизно 30% є такими типу 5. Структури полісахаридних капсулярних антигенів типу 5 та типу 8 є описаними у Moreau та ін. Carbohydrate Res. 201; 285 (1990) та Fournierra ін. Infect. Immun. 45; 87 (1984). Обидва вони мають FucNAcp у своїй повторюваній одиниці, а також ManNAcA, що може використовуватися для введення сульфгідрильної групи. Нещодавно (Jones Carbohydrate Research 340, 1097-1106 (2005)) ЯМР спектроскопія виправила структури капсулярних сахаридів на наступні: Типу 5 4)--D-ManNAcA-(14)--L-FucNAc(3OAc)(13)--D-FucNAc-(1 Типу 8 3) -D-ManNAcA(4OAc)-(13)--LFucNAc(13)--D-FucNAc(1 Полісахариди можуть бути екстраговані з прийнятного штаму S. aureus при використанні способів, добре відомих спеціалістові в даній галузі техніки, наприклад, так, як описано в US6294177 або Infection and Immunity (1990) 58(7); 2367. Наприклад, АТСС 12902 представляє собою штам S. aureus типу 5, а АТСС 12605 є штамом S. aureus типу 8. Полісахариди є такими нативного розміру або, альтернативно, можуть бути каліброваними, наприклад, шляхом мікропсевдозрідження, обробки ультразвуком або шляхом хімічної обробки. Винахід також охоплює олігосахариди, які мають походження від полісахаридів типу 5 та 8 з S. aureus. Капсулярний полісахарид типу 5 та/або 8 або олігосахариди, що входять до складу імуногенної композиції згідно з винаходом, є Оацетилованими. В одному втіленні ступінь Оацетилування капсулярного полісахарид типу 5 або олігосахариду складає 10-100%, 20-100%, 30100%, 40-100%, 50-100%. 60-100%, 70-100%, 80100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% або 8090%. В одному втіленні ступінь О-ацетилування капсулярного полісахариду типу 8 або олігосаха 97359 10 риду складає 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40100%, 50-100%. 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% або 80-90%. В одному втіленні ступінь О-ацетилування капсулярних полісахаридів типу 5 та типу 8 або олігосахаридів складає 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50100%. 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 5090%, 60-90%, 70-90% або 80-90%. Ступінь О-ацетилування полісахариду або олігосахариду може бути визначена будь-яким способом, відомим в області техніки, наприклад, за допомогою протонної ЯМР (Lemercinier та Jones 1996, Carbohydrate Resarch 296; 83-96, Jones та Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical analysis 30; 1233-1247, WO 05/033148 або WO 00/56357). Додатковий використовуваний спосіб є таким, як описано в (1949) J. ВіоІ. Chem. 180; 249261. Групи О-ацетилу можуть бути видалені шляхом гідролізу, наприклад, шляхом обробки основою, такою, як безводний гідразин (Konadu та ін. 1994; Infect. Immun. 62; 5048-5054) або обробкою 0,1N NaOH протягом 1-8 годин. Для того, щоб підтримати високі рівні О-ацетилування на полісахариді типу 5 та/або 8 або олігосахариді, мінімізують обробки, які будуть приводити до гідролізу Оацетильних груп. Наприклад, мінімізують обробку при екстремальних крайніх значеннях рН. Полісахариди типу 5 та 8, що входять до складу імуногенної композиції згідно з винаходом, є необов'язково кон'югованими з білком носія, як описано нижче, або, альтернативно, є некон'югованими. Імуногенні композиції згідно з винаходом, альтернативно, містять полісахарид або типу 5, або типу 8. Антиген 336 S. aureus В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає антиген 336 S. aureus, описаний в US6294177. Антиген 336 включає -зв'язаний гексозамін, не містить О-ацетильних груп та специфічно зв'язується з антитілами до S. aureus типу 336, що є депонованим під номером АТСС 55804. В одному втіленні антиген 336 являє собою полісахарид, який має або нативний розмір, або, альтернативно, може бути калібрований за розміром, наприклад, шляхом мікропсевдозрідження, ультразвукової обробки або за допомогою хімічної обробки. Винахід також охоплює олігосахариди, які походять від антигену 336. Антиген 336, коли є включеним до складу імуногенної композиції згідно з винаходом, є необов'язково кон'югованим з білком носія, як описано нижче, або, альтернативно, є некон'югованим. Полісахариди типу І, II та III S. epidermidis Штами АТСС-31432, SE-360 та SE-10 S. epidermidis відрізняються трьома різними капсулярними типами, І, II та III, відповідно (Ichiman та Yoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229). Капсулярні полісахариди, виділені з кожного серотипу S. epidermidis, складають полісахариди типу І, II та III. Полісахариди можуть бути виділені декількома способами, включаючи спосіб, описаний в 11 US4197290, або як описано у Ichiman та ін. 1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176. В одному втіленні винаходу імуногенна композиція включає полісахариди типу І та/або II, та/або III, або олігосахариди S. epidermidis. Полісахариди є такими нативного розміру або, альтернативно, можуть бути калібровані за розміром, наприклад, шляхом мікропсевдозрідження, ультразвукової обробки або хімічного розщеплення. Винахід також охоплює олігосахариди, виділені із штaмів S. epidermidis. Ці полісахариди є некон'югованими або є необов'язково кон'югованими так, як описано нижче. Кон'югація полісахаридів До проблем, асоційованих з використанням полісахаридів у вакцинації, відноситься факт, що полісахариди per se є слабкими імуногенами. Стратегії, які були розроблені для подолання цієї відсутності імуногенності, включають зв'язування полісахариду з великими білками носіями, які забезпечують неспецифічну допомогу Т-клітин. В одному втіленні полісахариди, що використовуються в даному винаходу, є зв'язаними з білком носія, що забезпечує неспецифічну допомогу Тклітин. Приклади таких носіїв, що можуть використовуватися для зв'язування із полісахаридними або олігосахаридними імуногенами, включають токсоїди дифтерії та правця (DT, DT Crm197 та ТТ), гемоціанін лімфи равлика (KLH), екзопротеїн A Pseudomonas aeruginosa (rEPA) та очищену білкову похідну туберкуліну (PPD), білок D з Haemophilus influenzae, пневмолізин або фрагменти будь-якого з описаних вище білків. Фрагменти, прийнятні для застосування, включають фрагменти, що охоплюють Т-хелперні епітопи. Зокрема, фрагмент білка D буде необов'язково містити Nтермінальну третину білка. Білок D являє собою білок, що зв'язує IgD з Haemophilus influenzae (ЕР 0594610 В1). Альтернативний білок носія для застосування в імуногенній композиції згідно з винаходом являє собою одиничний стафілококовий білок або його фрагмент, або злитий білок, що включає принаймні або точно 1, 2, 3 або 4 або більше стафілококових білків або їх фрагментів, приведених у розділі, що представлений нижче. Новий білок носія, що може бути особливо бажаним для застосування у контексті стафілококової вакцини, являє собою стафілококовий альфатоксоїд. Нативна форма може бути кон'югованою з полісахаридом, оскільки процес кон'югації знижує токсичність. Необов'язково генетичного знешкоджений альфа-токсин, такий, як варіанти His35Leu або His35Arg, використовується як носій, оскільки залишкова токсичність є нижчою. Альтернативно, альфа-токсин хімічно знешкоджують шляхом обробки перехреснозв'язуючим реагентом, формальдегідом або глутаральдегідом. Генетично знешкоджений альфа-токсин необов'язково хімічно знешкоджують, необов'язково шляхом обробки перехреснозв'язуючим реагентом, формальдегідом або глутаральдегідом для додаткового зниження токсичності. Полісахариди можуть зв'язуватися з білком(білками) носія при використанні будь-якого 97359 12 способу (наприклад, за Likhite, патент США 4,372,945, Armor та ін., патент США 4,474,757, WO та Jennings та ін., патент США 4,356,170). Необов'язково, проводять CDAP кон'югацію (див. WO95/08348). При використанні CDAP ціанілувальний реагент 1-ціанодиметиламінопіридиній тетрафторборат (CDAP) необов'язково використовується для синтезу полісахарид-білкових кон'югатів. Реакція ціанілування може проводитися при відносно м'яких умовах, що дозволяє уникнути гідролізу чутливих до лугів полісахаридів. Цей синтез дозволяє проводити безпосереднє зв'язування з білком носія. Полісахарид може бути розчинений у воді або у сольовому розчині. CDAP може бути розчинений в ацетонітрилі та додаватися безпосередньо до розчину полісахариду. CDAP реагує з гідроксильними групами полісахариду з утворенням ціанатного естеру. Після етапу активації додають білок носія. Аміногрупи лізину реагують з активованим полісахаридом з утворенням ковалентного зв'язку ізосечовини. Після реакції злиття додають великий надлишок гліцину для погашення залишкових активованих функціональних груп. Потім продукт пропускають через гелеву проникну колонку для видалення білка носія, що не прореагував, та залишкових реагентів. Білки Імуногенна композиція згідно з винаходом необов'язково додатково включає стафілококовий білок, наприклад, білок S. aureus або S. epidermidis. Деякі втілення винаходу містять білки як S. aureus, так і S. epidermidis. Імуногенні композиції згідно з винаходом включають ізольований білок, який включає амінокислотну послідовність, яка має принаймні 85% ідентичності, необов'язково принаймні 90% ідентичності, принаймні 95% ідентичності, принаймні 97-99% або повну ідентичність з будь-якою з послідовностей, представлених на Фігурі 1. Де білок специфічно згадується в даному описі, то це є необов'язково посилання на нативний або рекомбінантний білок, білок повної довжини або необов'язково зрілий білок, в якому будь-яка сигнальна послідовність була видалена. Білок може бути ізольований безпосередньо із стафілококового штаму або може бути одержаний при використанні методик рекомбінантної ДНК. Імуногенні білка можуть бути введені в імуногенну композицію згідно з винаходом. Такі представляють собою фрагменти, що включають принаймні 10 амінокислот, принаймні 20 амінокислот, принаймні 30 амінокислот, принаймні 40 амінокислот, принаймні 50 амінокислот або принаймні 100 амінокислот, узятих послідовно з амінокислотної послідовності білка. Крім того, такі імуногенні фрагменти є типово імунологічно реактивними з антитілами, утвореними проти стафілококових білків або з антитілами, які виробляються хазяйським організмом ссавця у відповідь на стафілококову інфекцію, або містять епітопи Т-клітин. В одному втіленні імуногенні фрагменти також включають фрагменти, які при введенні в ефективній дозі, (або самостійно, або як гаптен, зв'язаний з носієм), викликають про 13 97359 тективну імунну відповідь проти стафілококової інфекції, при цьому необов'язково вона є протективною стосовно інфекції S. aureus та/або S. epidermidis. Такі імуногенні фрагменти можуть включати, наприклад, білок, в якому є відсутньою N-термінальна лідерна послідовність, та/або трансмембранний домен, та/або С-термінальний якірний домен. В одному втіленні імуногенний фрагмент згідно з винаходом включає суттєво увесь білок або екстрацелюлярний домен білка, який має принаймні 85%, 90%, 95%, 97% або 99% ідентичності з послідовністю, вибраною з таких на Фігурі 1, по всій довжині послідовності фрагменту. В одному втіленні імуногенні композиції згідно з винаходом можуть містити злиті білки стафілококових білків або фрагменти стафілококових білків. Такі злиті білки можуть бути одержані рекомбінантно та можуть включати одну частину принаймні 2, 3, 4, 5 або 6 стафілококових білків, наприклад, комбінації стафілококових білків, приведені нижче. Альтернативно, злитий білок може включати численні частини принаймні 2, 3, 4 або 5 стафілококових білків. Такі можуть поєднувати різні стафілококові білки або їх фрагменти у тому самому білку. Альтернативно, винахід також включає злиті білки стафілококових білків або їх фрагментів у вигляді злитого білка з гетерологічними послідовностями, такими, як провайдер епітопів Т-клітин або мітки для очищення, наприклад: -галактозидаза, глутатіон-8-трансфераза, зелені флуоресцентні білки (GFP), епітопні мітки, такі, як FLAG, myc мітку, по 14 лігістидин, або білки поверхні вірусів, таких, як гемаглютинін вірусу грипу, або бактеріальні білки, такі, як токсоїд правця, дифтерійний токсоїд, CRM197. Злитий білок може бути присутнім в імуногенній композиції згідно з винаходом у вигляді вільного білка або він може являти собою білок носія, зв'язаний із сахаридом. Білки В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом додатково включає один або більше білків, згаданих нижче, або їх імуногенні фрагменти. Багато білків потрапляють до категорій білків, що зв'язують екстрацелюлярні компоненти, транспортних білків або токсинів та регуляторів вірулентності. Імуногенна композиція згідно з винаходом необов'язково додатково включає стафілококовий білок, що зв'язує екстрацелюлярний (позаклітинний) компонент, або стафілококовий транспортний білок, або стафілококовий токсин, або регулятор вірулентності. Імуногенна композиція згідно з винаходом необов'язково включає принаймні або точно 1, 2, 3, 4, 5 або 6 стафілококових білків. Таблиця 1 Приведена нижче Таблиця представляє номери SEQ ID бажаних амінокислотних послідовностей та послідовностей ДНК, що знайдені на Фігурі 1 та Фігурі 2, відповідно. SA позначає послідовність S. aureus, a SE позначає послідовність S. epidermidis. Таблиця 1 Назва Імунодомінантний ABC транспортер SA SE Ламініновий рецептор SA SE Секреторний антиген A SsaA SA1 SA2 SE SitC SA SE IsaA/PisA (IssA) SA SE EbhA/В SA EbhA SA EbhB SE EbhA SE EbhB Помічник акумуляції pro Aap SA SE Білок III, що активує РНК RAP SA SE Білкова послідовність Послідовність ДНК SEQ ID 1 SEQ ID 2 SEQ ID 34 SEQ ID 35 SEQ ID 3 SEQ ID 4 SEQ ID 36 SEQ ID 37 SEQ ID 5 SEQ ID 6 SEQ ID 7 SEQ ID 38 SEQ ID 39 SEQ ID 40 SEQ ID 8 SEQ ID 9 SEQ ID 41 SEQ ID 42 SEQ ID 10 SEQ ID 11 SEQ ID 43 SEQ ID 44 SEQ ID 12 SEQ ID 13 SEQ ID 14 SEQ ID 15 SEQ ID 45 SEQ ID 46 SEQ ID 47 SEQ ID 48 SEQ ID 16 SEQ ID 17 SEQ ID 49 SEQ ID 50 SEQ ID 18 SEQ ID 19 SEQ ID 51 SEQ ID 52 15 97359 16 Продовження таблиці 1 1 FIG/SdrG SA SE Білок, що зв'язує еластин, EbpS SA SE Екстрацелюлярний білок EFB альфа-токсин SA SBI SA IsdA SA IsdB SA SdrC SA ClfA SA FnbA SA ClfB SA Коагулаза SA FnbB SA MAPSA HarA SA Аутолізин глюкозамінідаза SA Аутолізин амідаза SA Ebh фрагмент SA Аутолізин Ant SA SdrC SA MRPII SA SdrG SA SdrE SA SdrD SA SasF SA Білки, що зв'язують екстрацелюлярний компонент Білки, що зв'язують екстрацелюлярний компонент, являють собою білки, які зв'язують хазяйські екстрацелюлярні компоненти. Термін включає, але без обмеженая адгезини. Приклади білків, що зв'язують екстрацелюлярний компонент, включають ламініновий рецептор (Naidu та ін. J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177), зв'язуючий білок SitC/MntC/слина (US5801234, Wiltshire та Foster Infec. Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams та ін. Infect. Immun. 2002, 70; 6805), EbhB, білок, що зв'язує еластин (EbpS) (Park та ін. 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt та Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347), SBI (Zhang та ін. FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211), аутолізин (Rupp та ін. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), ClfA (US6008341, McDevitt та ін. Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea та ін. Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea та ін. Microbiology, 2000, 146; 1535), ліпазу GehD (US2002/0169288), SasA (Roche та ін. Microbiology, 2003, 149; 643), SasC (Roche та ін. Microbiology 2003, 149; 643), SasK (Roche та ін. Microbiology 2003, 149; 643), FnbA (Flock та ін. Mol. Microbiol. 1994, 12; 599, US6054572), FnbB (WO 97/14799, Booth та ін. 2001 Infec. Immun. 69; 345), білок, що зв'язує колаген Сnа (Visai та ін. 2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (WO 99/27109), SdrD (WO 99/27109), SdrE (WO 99/27109), FbpA 2 3 SEQ ID 20 SEQ ID 21 SEQ ID 53 SEQ ID 54 SEQ ID 22 SEQ ID 23 SEQ ID 24 SEQ ID 25 SEQ ID 26 SEQ ID 27 SEQ ID 28 SEQ ID 29 SEQ ID 30 SEQ ID 31 SEQ ID 32 SEQ ID 33 SEQ ID 67 SEQ ID 68 SEQ ID 69 SEQ ID 70 SEQ ID 71 SEQ ID 72 SEQ ID 73 SEQ ID 74 SEQ ID 75 SEQ ID 76 SEQ ID 87 SEQ ID 89 SEQ ID 91 SEQ ID 55 SEQ ID 56 SEQ ID 57 SEQ ID 58 SEQ ID 59 SEQ ID 60 SEQ ID 61 SEQ ID 62 SEQ ID 63 SEQ ID 64 SEQ ID 65 SEQ ID 66 SEQ ID 77 SEQ ID 78 SEQ ID 79 SEQ ID 80 SEQ ID 81 SEQ ID 82 SEQ ID 83 SEQ ID 84 SEQ ID 85 SEQ ID 86 SEQ ID 88 SEQ ID 90 SEQ ID 92 (Phonimdaeng та ін. 1988 J. Gen Microbiol. 134; 75), Nразу (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA (Lonenz та ін. FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang та ін. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain та Hermann th symposium on Staph Denmark 14-17 2000), SSP-1 (Veenstra та ін. 1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra та ін. 1996, J. Bacteriol. 178; 537), білок, що зв'язує гепарин, розміром 17 кДа HBP (Fallgren та ін. 2001, J. Med. Microbiol. 50; 547), білок, що зв'язує вітронектин (Li та ін. 2001, Curr. Microbiol. 42; 361), білок, що зв'язує фібриноген, коагулазу, Fig (WO 97/48727) та MAP (US5648240) SitC/MntC/слина зв'язуючий білок Такий являє собою ABC білок транспортера, який є гомологічним адгезину PsaA у S. pneumoniae. Це високо імуногенний ліпопротеїн вагою 32 кДа, який є розподіленим у бактеріальній клітинній стінці (Cockayne та ін. Infect. Immun. 1998 66; 3767). Він експресується в S. aureus та S. epidermidis у вигляді ліпопротеїну вагою 32 кДа. Гомолог вагою 40 кДа є присутнім в S. hominis. В S. epidermidis він являє собою компонент залізорегульованого оперону. Він демонструє значну гомологію з обома адгезинами, включаючи FimA Streptococcus parasanguis, та з ліпопротеїнами родини ABC транспортерів з доведеною або передбачуваною функцією транспорту металічного заліза. Таким чином, SitC включається як білок, що 17 97359 18 зв'язує екстра целюлярний компонент, та як транспортер для іонів металу. Білок, що зв'язує слину, є описаним в US5,801,234 і також являє собою форму SitC та може бути включеним в імуногенну композицію згідно з винаходом. ClfA та ClfB Обидва ці білки володіють активністю зв'язування фібриногену та ініціюють S. aureus з утворенням скупчень у присутності плазми. Вони містять LPXTG мотив, що є характерним для білків, асоційованих з клітинною стінкою. ClfA є описаним в US6008341, a ClfB є описаним в WO 99/27109. Коагулаза (FbpA) Коагулаза (FbpA) являє собою білок, що зв'язує фібриноген, який ініціює S. aureus з утворенням скупчень у присутності плазми. Вона є описаною у посиланнях до Coagulase: Phonimdaeng та ін. (J. Gen. Microbio. 1988, 134:75-83), Phonimdaeng та ін. (Mol Microbiol 1990; 4:393-404), Cheung та ін. (Infect Immun 1995; 63:1914-1920) та Shopsin та ін. (J. Clin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456). В одному втіленні фрагменти для включення в імуногенну композицію згідно з винаходом включають зрілий білок, в якому було видалено сигнальний пептид (амінокислоти від 27 до С-термінального кінця). Коагулаза має три різні домени: амінокислоти 59-297, які утворюють ділянку подвійної спіралі, амінокислоти 326-505, які являють собою ділянку, багату на пролін та гліцин, та С-термінальний домен, що складається з амінокислот 506-645, що має бета-складчасту конформацію. Кожний з цих доменів являє собою фрагмент, який може бути введений в імуногенну композицію згідно з винаходом. SdrG Цей білок є описаним в WO 00/12689. SdrG був виявлений у коагулаза-негативних стафілококах і являє собою асоційований з клітинною стінкою білок, що містить послідовність LPXTG. SdrG містить сигнальний пептид (амінокислоти 1-51), ділянку, яка включає сайти зв'язування фібриногену та колагену (амінокислоти 51-825), два CnaВ домени (амінокислоти 627-698 та 738-809), SD повторювану ділянку (амінокислоти 825-1000) та якірний домен (амінокислоти 1009-1056). В одному втіленні фрагменти SdrG включають поліпептиди, в яких було видалено сигнальний пептид, та/або SD повтори та якірний домен. Такі включають поліпептиди, що містять або складаються з амінокислот 50-825, амінокислот 50-633, амінокислот 50-597 (SEQ ID NO 2 WO 03/76470), амінокислот 273-597 (SEQ ID NO 4 WO 03/76470), амінокислот 273-577 (SEQ ID NO 6 WO 03/76470) амінокислот 1-549, амінокислот 219-549, амінокислот 225-549, амінокислот 219-528, амінокислот 225-528 послідовності SEQ ID NO: 70, 20 або 21. Необов'язково, SdrG поліпептид, що має послідовність, яка є принаймні на 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% або 100% гомологічною послідовності SEQ ID NO: 70, 20 або 21, є введеним в імуногенну композицію згідно з винаходом. Композиції згідно з винаходом необов'язково включають фрагмент SdrG поліпептидів, описаних вище. В одному втіленні фрагменти мають делетований сигнальний пептид та/або SD повторюваний домен та/або якірний домен. Наприклад, послідовності, що відповідають амінокислотам 1-713, 1549, 225-549, 225-529, 24-717, 1-707, 1-690, 1-680, 1-670, 1-660, 1-650, 1-640, 1-630, 1-620, 1-610, 1600, 34-707, 44-697, 36-689 послідовності SEQ ID 70, або послідовності, які є на 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентичними послідовності SEQ ID 70, 20 або 21. В одному втіленні фрагменти з делетованим сигнальним пептидом мають метіоніновий залишок на N-термінальному кінці фрагменту для забезпечення правильної трансляції. В одному втіленні фрагмент має наступну послідовність: ЕbhА та ЕbhВ EbhA та EbhB являють собою білки, що експресуються як в S. aureus, так і в S. epidermidis (Clarke та Foster Infect. Immun. 2002, 70; 6680, Williams та ін. Infect. Immun 2002, 20; 6805) та зв'язують фібронектин. Оскільки фібронектин є важ 19 97359 20 ливим компонентом екстрацелюлярного матриксу, то EbhA та EbhB виконують важливу функцію у прикріпленні стафілококу до екстрацелюлярного матриксу хазяїна. Ebh білки є великими білками, що мають молекулярну вагу 1,1 мегадальтон. Є бажаним використовувати фрагмент Ebh білка замість повної послідовності завдяки легкості одержання та рецептування. Центральна ділянка білка містить не повні повтори, які включають сайти зв'язування фібронектину. Фрагменти, які містять один або більше повторюваних доменів, описаних нижче, є фрагментами, прийнятними для введення в імуногенну композицію згідно з винаходом. Ebh білки містять одиниці неповних повторів, які включають 127 амінокислот у довжину, які характеризуються вмістом консенсусної послідовності: Де '.' означає будь-яку амінокислоту, а '.{10}' означає будь-які 10 амінокислот та І/V позначає альтернативні вибори амінокислот. З посиланням на послідовність, розкриту у Kuroda та ін. (2001) Lancet 357; 1225-1240, та Таблицю 2, повторювані послідовності у межах Ebh білків можуть бути легко дедуковані. В одному втіленні фрагменти, що входять до складу імуногенної композиції згідно з винаходом, включають білки, які містять один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять або більше, ніж 10 з 127 амінокислотних повторюваних одиниць. Такі фрагменти можуть складатися з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше повторів амінокислотної повторюваної ділянки, що складається зі 127 амінокислот, або можуть складатися з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше повторів з додатковими амінокислотними залишками, які є присутніми як на одному, так і на обох кінцях фрагменту. Необов'язково, коли фрагмент являє собою Н2 поліпептид, що має розмір 44 кДа та охоплює три повтори (амінокислоти 3202-3595), як описано у Clarke та ін. Infection and Immunity 70, 6680-6687, 2002. Такі фрагменти будуть необов'язково здатними зв'язуватися з фібронектином та/або викликати утворення антитіл, що є реактивними проти цільного білка Ebh. Ebh білки є здатними до зв'язування з фібронектином. В одному втіленні фрагменти цих поліпептидних послідовностей зберігають здатність до зв'язування з фібронектином. Зв'язування з фібронектином може бути оцінене при використанні ELISA, як описано Clarke та ін. (Infection and Immunity 70; 6680-6687 2002). В одному втіленні фрагмент є таким, що включає епітоп В-клітини або Т-хелперної клітини, наприклад, такі фрагменти/пептиди, як ті, що описані у Таблицях 3 та 4. Таблиця 2 Повторювані послідовності у послідовності повної довжини Ebh. Послідовність повної довжини Ebh є розкритою у Kuroda та ін. (2001) Lancet 357; 1225-1240. Наступна Таблиця показує амінокислотні залишки, на яких починається та закінчується 127 амінокислотні повтори у межах послідовності повної довжини. Таблиця 2 Повторювані послідовності у послідовності повної довжини Ebh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Початок 3204 3331 3457 3583 3709 3835 3961 4200 4326 4452 4578 4704 4830 4956 5082 5208 5334 5460 5585 5711 5837 5963 6089 6215 6341 6467 Кінець 3330 3457 3583 3709 3835 3961 4087 4326 4452 4578 4704 4830 4956 5082 5208 5334 5460 5586 5711 5837 5963 6089 6215 6341 6467 6593 21 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 97359 6593 6719 6845 6971 7097 7223 7349 7475 7601 7727 7852 7978 8104 6719 6845 6971 7097 7223 7349 7475 7601 7727 7853 7978 8104 8230 22 40 41 42 43 44 8230 8356 8482 8604 8858 8356 8482 8608 8730 8984 Таблиця 3 Передбачення В-клітинних епітопів для 127 амінокислотних повторів: Послідовність повної довжини є розкритою у Kuroda та ін. (2001) Lancet 357; 1225-1240. Kuroda та ін. (2001) Lancet 357; 1225-1240. Один з цих повторів, що визначається амінокислотами 32043331 послідовності повної довжини, був вибраний для здійснення передбачення епітопів: Таблиця 3 Передбачення В-клітинних епітопів для 127 амінокислотних повторів Початок 5 14 21 42 66 100 117 Кінець 10 19 33 51 74 112 123 Послідовність TVNQKA KSTBA DGQQNLQRAKTEA DLNQAQKNAL DIKQTTQSL ADTNKKNDYNNAY DIINGNA Старт 3208 3217 3224 3245 3269 3303 3320 Стоп 3213 3222 3236 3254 3277 3315 3326 Колонки "Початок" та "Кінець" представляють положення передбачених В-клітинних епітопів у 127 аміноксилотних повторах Колонки "Старт" та "Стоп" представляють положення передбачених В-клітинних епітопів у послідовності Ebh повної довжини Таблиця4 Прогнозування епітопу Т-хелперних клітин в Ebh: Послідовність повної довжини є розкритою у базі даних TrEMBL, послідовність має позначення Q8NWQ6. Один з цих повторів, що визначається амінокислотами 3204-3331 послідовності повної довжини, був вибраний для здійснення прогнозування епітопів: Таблиця 4 Прогнозування епітопу Т-хелперних клітин в Ebh Положення повтора 1 3 6 26 37 43 51 55 61 64 Послідовність епітопа MDVNTVNQK VNTVNQKAA VNQKAASVK LQRAKTEAT ITHASDLNQ LNQAQKNAL LTQQVNSAQ VNSAQNVHA VHAVNDIKQ VNDIKQTTQ Положення послідовності 3204 3206 3209 3229 3240 3246 3254 3258 3264 3267 23 97359 24 Продовження таблиці 4 1 67 74 78 81 85 91 92 97 98 108 112 118 119 2 3 3270 3277 3281 3284 3288 3294 3295 3301 3302 3311 3315 3321 3322 IKQTTQSLN LNTAMTGLK MTGLKRGVA LKRGVANHN VANHNQWQ WQSDNYVN VQSDNYVNA YVNADTNKK VNADTNKKN YNNAYNHAN YNHANDIIN IINGNAQHP INGNAQHPV Колонка "Положення повтору" представляє положення передбачених епітопів Т-клітин у повторі Колонка "Положення послідовності" представляє положення передбачених епітопів Т-клітин у послідовності повної довжини Фрагменти білків згідно з винаходом можуть використовуватися для одержання відповідного поліпептиду повної довжини за допомогою пептидного синтезу та, таким чином, можуть використовуватися як проміжні сполуки для одержання білків повної довжини згідно з винаходом. В одному втіленні використовуються варіанти, в яких заміщені, делеговані або додані декілька, 510, 1-5, 1-3, 1-2 або 1 амінокислот в будь-якій комбінації. Білок, який зв'язує еластин (EbpS) EbpS являє собою білок, що містить 486 амінокислот, з молекулярною вагою 83 кДа. Він асоціюється з цитоплазматичною мембраною S. aureus та має три гідрофобні ділянки, які утримують білок на мембрані (Downer та ін. 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Parket тa ін. 1996, J. Biol. Chem. 271; 15803). Дві ділянки між амінокислотами 1-205 та 343486 є поверхневими білками, які розміщені на зовнішній поверхні цитоплазматичної мембрани. Домен EbpS, що зв'язує ліганд, розміщується між залишками 14-34 на N-термінальному кінці (Park та ін. 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845). В одному втіленні фрагмент, що є включеним в імуногенну композицію згідно з винаходом, є фрагментом, який розміщується на поверхні та містить ділянку, яка зв'язує еластин (амінокислоти 1-205). Необов'язково, фрагменти не містять повної відкритої петлі, але будуть містити ділянку, що зв'язує еластин (амінокислоти 14-34). Альтернативний фрагмент, що може використовуватися, містить амінокислоти, які утворюють другу петлю, яка розміщується на поверхні (амінокислоти 343-486). Альтернативні фрагменти, що містять на 1, 2, 5, 10, 20, 50 амінокислот менше на одному або обох кінцях, також є можливими. Ламінінові рецептори Ламініновий рецептор S. aureus грає важливу роль у патогенності. Характерною рисою інфекції є інвазія у кров'яне русло, що дозволяє поширювати метастатичне формування абсцесу. Інвазія у кров'яне русло вимагає здатності проникати із судин у тканини через васкулярну основну мембрану. Це досягається за рахунок зв'язування з ламініном через ламініновий рецептор (Lopes та ін. Science 1985, 229; 275). Ламінінові рецептори розміщені на поверхні та є присутніми у багатьох штамах стафілококів, включаючи S. aureus та S. epidermidis. SBI Sbi є другим IgG зв'язуючим білком на доповнення до білка А, він експресується у більшості штамів S. aureus (Zhang та ін. 1998, Microbiology 144; 985). N-термінальний кінець послідовності Sbi має типову сигнальну послідовність із сайтом розщеплення після амінокислоти 29. Таким чином, фрагмент Sbi, який може використовуватися в імуногенній композиції згідно з винаходом, починається на амінокислотних залишках 30, 31, 32 або 33 та продовжується до С-термінального кінця Sbi, наприклад, послідовності SEQ ID NO: 26. IgG зв'язуючий домен Sbi було ідентифіковано як ділянку у напрямку N-термінального кінця білка з амінокислотами 41-92. Цей домен є гомологічним IgG зв'язуючим доменам білка А. Мінімальний IgG зв'язуючий домен Sbi містить наступну послідовність: * - позначає амінокислоти, які є подібними між IgG зв'язуючими доменами В одному втіленні фрагмент Sbi, що входить до складу імуногенної композиції згідно з винахо дом, містить IgG зв'язуючий домен. Цей фрагмент містить консенсусну послідовність для IgG зв'язу 25 ючого домену, позначену *, як показано у послідовності, приведеній вище. Необов'язково, фрагмент містить або складається з повної послідовності, показаної вище. Необов'язково, фрагмент містить або складається з амінокислот 30-92, 33-92, 30-94, 33-94, 30-146, 33-146, 30-150, 33-150, 30-160, 33160, 33-170, 33-180, 33-190, 33-200, 33-205 або 33210 Sbi, наприклад, послідовності SEQ ID NO:26. Фрагмент може містити 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 амінокислотні заміни із приведених вище послідовностей. Фрагменти можуть містити численні повтори (2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 або 10) IgG зв'язуючого домену. EFB-FIB Fib являє собою 19 кДа білок, що зв'язує фібріноген, який секретується у позаклітинне середовище S. aureus. Він продукується усіма проаналізованими ізолятами S. aureus (Wastfelt та Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347). S. aureus фіксується у присутності фібриногену та зв'язується з поверхнями, вкритими фібриногеном. Ця здатність сприяє стафілококовій колонізації катетерів та ендотеліальних клітин. Fib містить сигнальну послідовність на Nтермінальному кінці білка з передбачуваним сайтом розщеплення, що приблизно знаходиться на амінокислоті 30. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає або складається з послідовності зрілого білка (від приблизно 30 амінокислоти до С-термінального кінця білка). Fbe - EfB/FIG Fbe являє собою білок, що зв'язує фібриноген, який виявлений у багатьох ізолятах S. epidermidis та має передбачену молекулярну вагу 119 кДа (Nilsson та ін. 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Його послідовність є близькою до такої фактора злипання S. aureus (ClfA). Антитіла проти Fbe можуть блокувати зв'язування S. epidermidis з планшетами, вкритими фібріногеном, та катетерами (Реі та Flock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52). Fbe має передбачену сигнальну послідовність із сайтом розщеплення між амінокислотами 51 та 52. Таким чином, потенційний фрагмент Fbe містить зрілу форму Fbe, що розміщується від амінокислоти 52 до С-термінального кінця (амінокислота 1092). Домен Fbe від амінокислоти 52 до амінокислоти 825 є відповідальним за зв'язування фібриногену. В одному втіленні фрагмент Fbe складається або містить амінокислоти 52-825. Ділянка між амінокислотами 373 та 516 Fbe виявляє найбільшу консервативність між Fbe та ClfA. В одному втіленні фрагмент містить амінокислоти 373-516 Fbe. Амінокислоти 825-1041 Fbe включають ділянку з високою повторюваністю, що складається з тандемно повторюваних залишків аспарагінової кислоти та серину. IsaA/PisA IsaA являє собою білок вагою 29 кДа, що є також відомим як PisA, він був продемонстрований як імунодомінантний стафілококовий білок при сепсисі у пацієнтів у лікарні (Lorenz тa ін. 2000, FEMS Immunol. Med. Microb. 29; 145). 97359 26 Перші 29 амінокислот послідовності IsaA, як передбачається, являють собою сигнальну послідовність. В одному втіленні фрагмент IsaA, що входить до складу імуногенної композиції згідно з винаходом, містить амінокислотні залишки, що розміщені на 30 залишків вперед стосовно кінця кодованої послідовності. Білок, що зв'язує фібронектин Білок А, що зв'язує фібронектин, містить декілька доменів, що є втягненими у зв'язування фібронектину (WO 94/18327). Вони називаються D1, D2, D3 та D4. В одному втіленні фрагменти фібронектизв'язуючого білка А або В включають або складаються з D1, D2, D3, D4, D1-D2, D2-D3, D3D4, D1-D3, D2-D4 або D1-D4. Білок, що зв'язує фібронектин, містить 36 амінокислот сигнальної послідовності. Наприклад: VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIWGMGQDKEAA Необов'язково, зрілий білок, що не містить цієї сигнальної послідовності, входить до складу імуногеної композиції згідно з винаходом. Білки-транспортери Клітинна стінка Грам-позитивних бактерій діє як бар'єр, який запобігає вільній дифузії метаболітів у бактерію. Родина білків органічно керує проходженням основних поживних речовин у бактерію та, таким чином, є суттєвою для життєздатності бактерії. Термін білки-транспортери охоплює білки, які є втягненими у початковий етап зв'язування з метаболітами, такими, як залізо, а також ті, що є втягненими у фактичний транспорт метаболіту у бактерію. Молекулярне залізо є суттєвим кофактором для росту бактерій. Сидерофори, що секретуються, зв'язують вільне залізо, яке потім захоплюється бактеріальними поверхневими рецепторами, які доставляють залізо для транспорту через цитоплазматичну мембрану. Захоплення заліза є важливим для утворення інфекції людини, оскільки встановлення імунної відповіді проти цього класу білків приводить до втрати життєздатності стафілококу. Приклади білків-транспортерів включають імунодомінантний ABC транспортер (Burnie та ін. 2000 Infect. Imun. 68; 3200), IsdA (Mazmanian та ін. 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian та ін. 2002 PNAS 99; 2293), IsdC (WO 06/59247), Mg2+ транспортер, SitC (Wiltshire та Foster 2001 Infect. Immun. 69; 5198) та Ni ABC транспортер. Імунодомінантний ABC транспортер Імунодомінантний ABC транспортер є високо консервативним білком, який може бути здатним до створення імунної відповіді, яка є перехресно протективною стосовно різних штамів стафілококів (Меі та ін. 1997, Mol. Microbiol. 26; 399). Антитіла проти цього білка були виявлені у пацієнтів з септисемією (Burnie та ін. 2000, Infect. Immun. 68; 3200). Необов'язкові фрагменти ABC транспортера будуть включати пептиди DRHFLN, GNYD, RRYPF, KTTLLK, GVTTSLS, VDWLR, RGFL, KIKVYVGNYDFWYQS, TVIWSHDRHFLYNNV та/або TETFLRGFLGRMLFS, оскільки ці послідов 27 ності містять епітопи, які впізнаються імунною системою людини. IsdA-lsdB Isd гени (регульована залізом поверхнева детермінанта) S. aureus кодують білки, які відповідають за зв'язування гемоглобіну та проходження залізного гема у цитоплазму, де заліза діє як основна поживна речовина. IsdA та IsdB розміщуються на клітинній стінці стафілококів. IsdA, як виявилося, розміщується на поверхні бактерії, оскільки він є чутливим до перетравлювання за допомогою протеїнази К. IsdB перетравлюється частково, що дає змогу передбачити, що він розміщується на поверхні бактерії (Mazmanian та ін. 2003 Science 299; 906). Обидва білки IsdA та IsdB мають вагу 29 кДа та є такими, що зв'язують гем. Їх експресія регулюється доступністю заліза через Fur репресор. Їх експресія буде високою під час інфекції у хазяїна, коли концентрація заліза буде низькою. Вони є також відомими як FrpA та FrpB (Morrissey та ін. 2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA та FrpB є основними поверхневими білками з високим зарядом. Вони були продемонстровані як такі, що забезпечують основний внесок в адгезію до пластика. В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає фрагмент IsdA та/або IsdB, що є описаним в WO 01/98499 або WO 03/11899. Токсини та регулятори вірулентності Члени цієї родини білків включають токсин, такий, як альфа-токсин, гемолізин, ентеротоксин В та TSST-1, а також білки, що регулюють продукцію токсинів, таких, як RAP. Альфа-токсин (НІа) Альфа-токсин є важливою детермінантою вірулентності, що виробляється більшістю штамів S. aureus. Він являє собою пороутвоюючий токсин з гемолітичною активністю. Антитіла проти альфатоксину були продемонстровані як такі, що нейтралізують детермінанту та летальні ефекти альфа-токсину у тваринних моделях (Adlam та ін. 1977 Infect. Immun. 17; 250). Людські тромбоцити, ендотеліальні клітини та мононуклеарні клітини є чутливими до ефектів альфа-токсину. Висока токсичність альфа-токсину вимагає, щоб він був знешкоджений перед використанням як імуногену. Це може бути досягнуто за допомогою хімічної обробки, наприклад, шляхом обробки формальдегідом, глутаральдегідом або іншими перехресно зв'язуючими реагентами або шляхом хімічної кон'югації їх з бактеріальними полісахаридами, як описано нижче. Додатковий шлях усунення токсичності полягає у введенні точкових мутацій, які видаляють токсичність при збереженні антигенності токсину. Введення точкової мутації в амінокислотному положенні 35 альфа-токсину, де гістидиновий залишок заміщується лейциновим залишком, приводить до видалення токсичності при збереженні імуногенності (Menzies та Kernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). Гістидин у положенні 35 виявився критичним для власної ізомеризації, що є необ 97359 28 хідною для утворення пор, а мутація цього залишку приводить до втрати токсичності. При введенні в імуногенні композиції згідно з винаходом альфа-токсин необов'язково знешкоджують шляхом мутації His35, наприклад, шляхом заміни His35 Leu або Arg. В альтернативному втіленні альфа-токсин знешкоджують шляхом кон'югації з іншими компонентами імуногенної композиції, наприклад, капсулярними полісахаридами або PNAG, необов'язково з полісахаридом S. aureus типу 5 та/або полісахаридом S. aureus типу 8 та/або PNAG. Білок III, що активує РНК (RAP) RAP сам по собі не є токсином, але є регулятором експресії факторів вірулентності. RAP виробляється та секретується стафілококом. Він активує agr регуляторну систему інших стафілококів та активує експресію та подальше вивільнення факторів вірулентності, таких, як гемолізин, ентеротоксин В та TSST-1. Інші імунодомінантні білки Білок, асоційований з акумуляцією (Аар) Аар являє собою білок з вагою 140 кДа, який є суттєвим для акумуляції штамів S. epidermidis на поверхнях (Hussain та ін. Infect. Immun. 1997, 65; 519). Штами, які експресують цей білок, продукують значно більші кількості біоплівки, оскільки Аар виявляється втягненим в утворення біоплівки. Антитіла проти Аар є здатними інгібувати утворення біоплівки та інгібувати акумуляцію S. epidermidis. Стафілококовий секреторний антиген SsaA SsaA є високо імуногенним білком масою 30 кДа, який був виявлений як у S. aureus, так і у S. epidermidis (Lang та ін. 2000 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29; 213). Його експресія при ендокардиті дає змогу передбачити вірулентну роль, специфічну для патогенезу інфекційного захворювання. SsaA містить N-термінальну лідерну послідовність та сигнальний сайт розщеплення пептидазою. За лідерним пептидом йде гідрофобна ділянка, що містить приблизно 100 амінокислот від залишка 30 до залишка 130. Необов'язковий фрагмент SsaA, введений в імуногенну композицію згідно з винаходом, складається із зрілого (від амінокислоти 27 до Стермінального кінця або від амінокислоти 30 до Стермінального кінця). Додаткові необов'язкові фрагменти містять гідрофільну ділянку SsaA від амінокислоти 30 до амінокислоти 130. Комбінації Стафілококова інфекція і проходить у своєму розвитку кілька різних стадій. Наприклад, цикл життя стафілококу передбачає симбіотичну колонізацію, ініціацію інфекції при забезпеченні доступу до прилеглих тканин або кров'яного русла, розмноження в анаеробних умовах в крові, взаємодію між вірулентними детермінантами S. aureus та механізмами захисту хазяїна, а також індукцію ускладнень, включаючи ендокардит, виникнення метастатичного абсцесу та септичного синдрому. Різноманітні молекули на поверхні бактерії будуть втягненими у різні етапи інфекційного циклу. Шляхом націлювання імунної відповіді проти комбінації окремих антигенів, втягнених у різні процеси ста 29 філококової інфекції, піддаються впливу численні аспекти стафілококової функції, та це може приводити до хорошої вакцинної ефективності. Зокрема, комбінація певних антигенів з різних класів, деякі з яких є втягненими в адгезію до хазяйських клітин, деякі втягненими у захоплення заліза або інші транспортні функції, деякі є токсинами або регуляторами вірулентності та імунодомінантними генами, можуть викликати імунну відповідь, яка захищає проти численних стадій інфекції. Деякі комбінації антигенів є особливо ефективними при індукції імунної відповіді. Ця імунна відповіді може бути виміряна або в ході аналізів на тваринній моделі у прикладах та/або при використанні опсонофагоцитарного аналізу, як описано у прикладах. Не маючи на меті обмежуватися будьякою теорією, такі ефективні комбінації антигенів, як передбачається, є здатними забезпечувати ряд характеристик імунної відповіді на антигенну комбінацію, Антигени самі по собі звичайно розміщуються на поверхні клітин стафілококів, вони мають тенденцію бути консервативними, але також мають тенденцію не бути присутніми у достатній кількості на поверхні клітини для оптимальної бактерицидної відповіді, що має місце при використанні антитіл, утворених проти одного антигену. Поєднання антигенів згідно з винаходом може приводити до створення бажаної комбінації антитіл, які взаємодіють з клітиною стафілокока поза критичним пороговим значенням. При цьому критичному рівні достатня кількість антитіл задовільної якості зв'язується з поверхнею бактерії для того, щоб забезпечити ефективне знищення або за допомогою комплементу, або шляхом нейтралізації бактерії. Цей процес може піддаватися вимірюванню або на тваринній моделі контрольного зараження, або шляхом аналізу опсонізації, як описано у прикладах. Бажані імуногенні композиції згідно з винаходом включають багато білків, вибраних принаймні з двох різних категорій білків, що володіють різними функціями у стафілококів. Приклади таких категорій білків являють собою екстрацелюлярні зв'язувальні білки, білки-транспортери, такі, як білки захоплення заліза, токсини або регулятори вірулентності та інші імунодомінантні білки. У бажаному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом додатково включає кількість білків, рівну або більшу, ніж 2, 3, 4, 5 або 6, вибраних з 2, 3 або 4 різних груп, вибраних з: - Групи а) білків, що зв'язують екстрацелюлярний компонент; - Групи b) білків-транспортерів; - Групи с) токсинів або регуляторів вірулентності - Групи d) структурних білків. У бажаному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом додатково включає кількість білків, рівну або більшу, ніж 2, 3, 4, 5 або 6, вибраних з 2, 3 або 4 з наступних груп: - групи а) - принаймні одного стафілококового білка, що зв'язує екстрацелюлярний компонент, або його фрагменту, вибраного з групи, яка складається з ламінінового рецептора, 97359 30 SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, ліпази GehD, SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР; - групи b) - принаймні одного стафілококового білка-транспортера або його фрагменту, вибраного з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, Mg2+ транспортера, HarA, Site та Ni ABC транспортера; - групи с) - принаймні одного стафілококового регулятора вірулентності, токсину або його фрагменту, вибраного з групи, яка складається з альфа-токсину (НІа), мутанту альфа-токсину H35R, білка III, що активує РНК (RAP); - групи d) - принаймні одного стафілококового структурного білка або його імуногенного фрагменту, вибраного з групи, яка складається з MRPII та аутолізину. У бажаному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом включає кількість білків, рівну або більшу, ніж 2, 3, 4, 5 або 6, вибраних з 2 або 3 з наступних груп: - групи а) - принаймні одного стафілококового білка, що зв'язує екстрацелюлярний компонент, або його фрагменту, вибраного з групи, яка складається з ламінінового рецептора, SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, ліпази GehD, SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР; - групи b) - принаймні одного стафілококового білка-транспортера або його фрагменту, вибраного з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, Mg2+ транспортера, HarA, Site та Ni ABC транспортера; групи с) - принаймні одного стафілококового регулятора вірулентності, токсину або його фрагменту, вибраного з групи, яка складається з альфа-токсину (НІа), мутанту альфа-токсину H35R, білка III, що активує РНК (RAP). У бажаному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом містить принаймні один білок, вибраний з групи а), та додатковий білок, вибраний з групи b) та/або групи с). У додатковому втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом містить принаймні один антиген, вибраний з групи b), та додатковий білок, вибраний з групи с) та/або групи а). У додатковому втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом містить принаймні один антиген, вибраний з групи с), та додатковий білок, вибраний з групи а) та/або групи b). Необов'язкова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає ламініновий рецептор та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспор 31 тера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Аар та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SitC та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Аар та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає EbhA та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Аар та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає EbhB та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає EbpS та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає EFB(FIB) тa 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SBI та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає аутолізин та 1,2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфатоксину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає ClfA та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, 97359 32 мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SdrC та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SdrD та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SdrE та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SdrG та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SdrH та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SasF та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає ліпазу GehD та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфатоксину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SasF та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, 33 мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає FnbA та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає FnbB та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає Cna та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає ClfB та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає FbpA та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає Npaзy та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає IsaA/PisA та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SsaA та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, 97359 34 мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає ЕРВ та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SSP-1 та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SSP-2 та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає НРВ та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає білок, що зв'язує вітронектин, та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає білок, що зв'язує фібриноген, та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає коагулазу та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає Fig та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутан 35 та альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає МАР та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з імунодомінантного ABC транспортера, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, Mg2+ транспортера, SitC, Ni ABC транспортера, альфа-токсину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає імунодомінантний ABC транспортер та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з ламінінового рецептора, SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfA, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig, MAP, альфа-токсину, мутанта альфатоксину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає IsdA та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з ламінінового рецептора, SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfA, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig, MAP, альфатоксину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає IsdB та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з ламінінового рецептора, SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfA, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig, MAP, альфатоксину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає SitC та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з ламінінового рецептора, SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfA, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig, MAP, альфатоксину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає альфа-токсин та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з 97359 36 групи, яка складається з ламінінового рецептора, SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfA, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig, MAP, альфатоксину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає варіант альфатоксину H35L або H35R та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з ламінінового рецептора, SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfA, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig, MAP, альфа-токсину, мутанта альфатоксину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає RAP та 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових антигенів, вибраних з групи, яка складається з ламінінового рецептора, SitC/MntC/слина зв'язувального білка, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолізину, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, ліпази GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfA, ClfB, FbpA, Nрази, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig, MAP, альфатоксину, мутанта альфа-токсину H35L або H35R, RAP, Aap та SsaA. Додаткова комбінація білків в імуногенній композиції згідно з винаходом включає IsdA та IsdB; IsdA та ClfA; IsdA та ClfB; IsdA та SdrC; IsdA та SdrD; IsdA та SdrE; IsdA та SdrG; IsdA та SasF; lsdB та ClfA; IsdB та ClfB; IsdB та SdrC; IsdB та SdrD; IsdB та SdrE; IsdB та SdrG; IsdB та SasF; ClfA та ClfB; ClfA та SdrC; ClfA та SdrD; ClfA та SdrE; ClfA та SasF; ClfB та SdrC; ClfB та SdrD; ClfB та SdrE; ClfB та SasF; SdrC та SdrD; SdrC та SdrE; SdrC та SasF; SdrD та SdrE; SdrD та SasF; SdrE та SasF. В описаних вище та нижче комбінаціях вказані білки можуть необов'язково бути присутніми в імуногенній композиції згідно з винаходом як фрагмент або як злиті білки, як описано вище. Комбінації трьох білків В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом додатково включає три білкові компоненти у комбінації з альфа-токсином, білком, що зв'язує екстрацелюлярний компонент (наприклад, адгезином) та білком-транспортером (наприклад білком, що зв'язує залізо). У такій комбінації альфа-токсин може бути хімічно знешкоджений або генетично знешкоджений шляхом введення точкової(их) мутації(ій), наприклад His35Leu точкової мутації. Альфа-токсин є присутнім у вигляді вільного білка або, альтернативно, є кон'югованим з полісахаридом або PNAG компонентом імуногенної композиції. 37 Приклади комбінацій включають: Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та білок, що зв'язує екстрацелюлярний компонент, вибраний з групи, яка складається ламінінового рецептора, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, аутолізину, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nрази, SSP-1, SSP-2, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdB та білок, що зв'язує екстрацелюлярний компонент, вибраний з групи, яка складається ламінінового рецептора, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, аутолізину, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nрази, SSP-1, SSP-2, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та адгезин, вибраний з групи, яка складається з ламінінового рецептора, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, аутолізину, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nрази, SSP-1, SSP-2, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdB та адгезин, вибраний з групи, яка складається з вибраний з групи, яка складається з ламінінового рецептора, EbhA, EbhB, білка, що зв'язує еластин (EbpS), EFB (FIB), ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, аутолізину, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Nрази, SSP-1, SSP-2, білка, що зв'язує вітронектин, білка, що зв'язує фібриноген, коагулази, Fig та МАР. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та ламініновий рецептор. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та EbhA. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та EbhB. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та EbpS. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та EFB (FIB). Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та SdrG. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та ClfA. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та ClfB. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та FnbA. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та коагулазу. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та Fig. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та SdrH. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та SdrC. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та SdrD. 97359 38 Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та SdrE. Імуногенну композицію, що включає альфатоксин, IsdA та МАР. Імуногенну композицію, що включає IsaA тa Sbi. Імуногенну композицію, що включає IsaA тa IsdB. Імуногенну композицію, що включає IsaA та IsdA. Імуногенну композицію, що включає IsaA та SdrC. Імуногенну композицію, що включає IsaA та Ebh або його фрагмент, як описано вище. Імуногенну композицію, що включає Sbi та SdrC. Імуногенну композицію, що включає Sbi та Ebh або його фрагмент, як описано вище. Імуногенну композицію згідно з винаходом, що включає IsaA, Sbi або SdrC. Відбір антигенів, експресованих у різних клональних лініях Аналіз частоти зустрічальності факторів вірулентності стосовно структури популяції Staphylococcus aureus показав варіабельну присутність генів вірулентності у природній популяції S. aureus. Серед клінічних ізолятів Staphylococcus aureus принаймні п'ять клональних ліній були продемонстровані як переважні (Booth та ін., 2001 Infect Immun. 69(1):345-52). Альфа-гемолізин (hla), білок, що зв'язує фібронектин A (fnbA) та фактор злипання А (elfA) були продемонстровані як такі, що є присутніми у більшості ізолятів, незважаючи на відсутність ідентичності ліній, що дає змогу передбачити важливу роль цих білків у виживанні S. aureus (Booth та ін., 2001 Infect Immun. 69(1):34552). Крім того, згідно з Peacock та ін. 2002 розподіл fnbA, elfA, коагулази, spa, map, pvl (лейкоцидину Пантона-Велентайна), hlg (гамма-токсину), альфатоксину та іса виявився незв'язаними із клональною структурою, що лежить в основі, це дає змогу передбачити значний горизонтальний перенос цих генів. На противагу до цього, інші гени вірулентності, такі, як білка, що зв'язує фібронектин В (fnbB), бета-гемолізину (hlb), білка, що зв'язує колаген (сnа), TSST-1 (tst) та гена резистентності до метициліну (mесА) є в значній мірі асоційованими зі специфічними лініями (Booth та ін., 2001 Infect Immun. 69(l):345-52). Подібно до цього, Peacock та ін. 2002 (infect Immun. 70(9):4987-96) показали, що розподіл ентеротоксинів, tst, ексфолатинів (eta та etb), бета- та дельта-токсинів, sdr генів (sdrD, sdrE та bbp), cna, ebpS та efb у межах популяції є у високому ступені пов'язаним з клональними комплексами, що походять від MLST. MLST дані не забезпечують підтвердження того факту, що штами, які відповідають за нозокоміальне захворювання, представляють собою субпопуляцію, відмінну від тих штамів, які спричинюють побутове захворювання, або штамів, виділених від безсимптомних носіїв (Feil та ін., 2003 J Bacteriol. 185(11):3307-16). 39 В одному втіленні імуногенні композиції згідно з винаходом є ефективними проти стафілококів різних клональних ліній. В одному втіленні імуногенна композиція включає 1, 2, 3, 4 або принаймні 1 білок, що експресується у більшості стафілококових ізолятів. Приклади таких білків включають альфа-гемолізин (hlа), білок А, що зв'язує фібронектин (fnbA) та фактор злипання A (clfA), коагулазу, spa, map, pvl (лейкоцидин Пантона-Велентайна), hlg (гамматоксин), іса, імунодомінантний ABC транспортер, RAP, аутолізин (Rupp та ін. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), ламінінові рецептори, SitC, IsaA/PisA, SPOIIIE (), SsaA, EbpS, SasF (Roche та ін. 2003, Microbiology 149; 643), EFB(FIB), SBI, ClfB, IsdA, IsdB, FnbB, Nразу, EBP, сиалозв'язувальний білок II Боне, IsaB/PisB (Lorenz та ін. FEMS Immuno. Med. Microb. 2000, 29; 145), SasH (Roche та ін. 2003, Microbiology 149; 643), MRPI, SasD (Roche та ін. 2003, Microbiology 149; 643), SasH (Roche та ін. 2003, Microbiology 149; 643), попередник ауреолізину (AUR)/Sepp1 та новітній аутолізин. В альтернативному втіленні 2 або або більше білків, які експресуються у різних наборах клональних штамів, вводяться в імуногенну композицію згідно з винаходом. Необов'язково, комбінація антигенів буде дозволяти генерувати імунну відповідь, що є ефективною проти багатьох клональних штамів, або проти усіх клональних штамів. Наприклад, комбінації включають FnbB та бетагемолізин, FnbB та Cna, FnbB та TSST-1, FnbB та mecA, FnbB та SdrD, FnbB та SdrF, FnbB та EbpS, FnbB та Efb, бета-гемолізин та Cna, бетагемолізин та TSST-1, бета-гемолізин та mecA, бета-гемолізин та SdrD, бета-гемолізин та SdrF, бета-гемолізин та EbpS, бета-гемолізин та Efb, Cna та TSST-1, Cna та mecA, Cna та SdrD, Cna та SdrF, Cna та EbpS, Cna та Efb, TSST-1 та mecA, TSST-1 та SdrD, TSST-1 та SdrF, TSST-1 та EbpS, TssT-1 та Efb, MecA та SdrD, МесА та SdrF, MecA та EbpS, MecA та Efb, SdrD та SdrF, SdrD та EbpS, SdeD та Efb, SdrF та EbpS, SdrF та Efb, та EbpS та Efb. Комбінації, описані вище, можуть бути поєднані з додатковими компонентами, описаними вище. Захист проти S. aureus та S. epidermidis В одному втіленні винаходу імуногенна композиція забезпечує ефективний імунний захист проти більше, ніж один штам стафілококу, наприклад, як проти штамів S. aureus, так і S. epidermidis. Наприклад, протективна імунна відповідь генерується проти серотипів типу 5 та 8 S. aureus. Одне застосування імуногенної композиції згідно з винаходом полягає у запобіганні нозокоміальної (внутрішньолікарняної) інфекції, наприклад, у вибраних хірургічних пацієнтів, шляхом інокуляції перед лікуванням у лікарні. На цьому етапі важко точно передбачити, впливу якого штаму стафілококу буде піддаватися пацієнт. Таким чином, є бажаним інокулювати його вакциною, що є здатною генерувати ефективну імунну відповідь проти різних штамів стафілококу. Ефективна імунна відповідь визначається як імунна відповідь, що забезпечує значний захист при контрольному зараженні мишиної моделі або у 97359 40 опсонофагоцитарному аналізі, як описано у прикладах. Значний захист при контрольному зараженні мишиної моделі, наприклад, є таким Прикладу 5, що визначається як підвищення значення LD50 у порівнянні з мишами, інокульованими носієм, принаймні на 10%, 20%, 50%, 100% або 200%. Значний захист у моделі контрольного зараження бавовникових хом'яків, наприклад, такий Прикладу 8, визначається як зниження значення LоgКУО/ніздря принаймні на 10%, 20%, 50%, 70% або 90%. Присутність опсонізуючих антитіл, як відомо, корелює із захистом, таким чином, значний ступінь захисту свідчить про зниження числа бактерій принаймні на 10%, 20%, 50%, 70% або 90% в опсонофагоцитарному аналізі, наприклад, у такому Прикладу 7. Деякі білки, включаючи імунодомінантний ABC транспортер, білок III, що аткивує РНК, ламінінові рецептори, SitC, IsaA/PisA, SsaA, EbhA/EbhB, EbpS та Аар є високо консервативними між S. aureus та S. epidermidis, Приклад 8 показує, що IsaA, ClfA, IsdB, SdrG, HarA, FnbpA та Sbi можуть генерувати перехресно реактивну імунну відповідь (наприклад, перехресно реактивну між принаймні одним штамом S. aureus та принаймні одним штамом S. epidermidis). PIA є також високо консервативним між S. aureus та S. epidermidis. Таким чином, в одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом буде включати PNAG та полісахариди типу 5 та 8, а також один, два, три або чотири вказані вище білки. Вакцини В одному втіленні імуногенна композиція згідно з винаходом змішується з фармацевтично прийнятним наповнювачем, та необов'язково з ад'ювантом з утворенням вакцини. Вакцини згідно з даним винаходом можуть містити ад'ювант, зокрема, коли призначені для застосування у популяції людей похилого віку, але також і для застосування у популяції немовлят. Прийнятні ад'юванти включають солі алюмінію, такі, як гель гідроокису алюмінію або фосфат алюмінію або галуни, але можуть також бути представлені кальцієм, магнієм, залізом або цинком або можуть бути нерозчинною суспензією ацилованого тирозину або ацилованих цукрів, катіонно або аніонно дериватизованими сахаридами, або поліфосфазенами. Є бажаним, коли ад'ювант є вибраним як такий, що є переважним індуктором відповіді ТН1 типу. Такі високі рівні цитокінів Тh1-типу мають тенденцію до сприятливої індукції опосередкованих клітинами відповідей на даний антиген, у той час, як високі рівні цитокінів Th2-типу мають тенденцію до сприятливої індукції гуморальних імунних відповідей на антиген. Відмінність імунної відповіді Th1 та Th2-типу не є абсолютною. На практиці індивідуум буде підтримувати імунну відповідь, яка описується як така, що є переважно Th1 або переважно Th2. Проте часто є зручним розглядати родини цитокінів стосовно того, як вони описані у мишачих CD4 +ve клонах Т-клітин Mosmann та Coffman (Mosmann, T.R. та Coffman, R.L. (1989)) TH1 та ТН2 клітини: різні моделі секреції цитокінів приво 41 дять до різних функціональних властивостей. (Annual Review of Immunology, 7, p. 145-173). Традиційно відповіді Th1-типу є асоційованими з продукцією INF-y та IL-2 цитокінів Т-лімфоцитами. Інші цитокіни, що часто безпосередньо асоціюються з імунними відповідями Th1-типу, не продукуються Т-клітинами, такими, як IL-12. На відміну від цього відповіді Тh2-типу асоціюються із секрецією IL4, IL5, IL-6, IL-10. Прийнятні ад'ювантні системи, які сприяють переважній Th1 відповіді, включають: монофосфорил ліпід А або його похідні, зокрема, 3-де-О-ацилований монофосфорил ліпід A (3DMPL) (для його приготування див. GB 2220211 А); та комбінацію монофосфорил ліпіду А, бажано 3де-О-ацилований монофосфорил ліпід А, або разом із сіллю алюмінію (наприклад, фосфатом алюмінію або гідроксидом алюмінію) або з емульсією олію-у-воді. У таких комбінаціях антиген та 3D-MPL містяться у тих самих окремих структурах, що дозволяє проводити більш ефективну доставку антигенних та імуностимуляторних сигналів. Дослідження показали, що 3D-MPL є здатним до додаткового підвищення імуногенності адсорбованого на алюмінію антигену [Thoelen та ін. Vaccine (1998) 16:708-14; EP689454-B1]. Поліпшена система втягує комбінацію монофосфорил ліпіду А та похідної сапоніну, зокрема, комбінацію QS21 та 3D-MPL, як розкрито в WO 94/00153, або менш реактогенну композицію, де QS21 пригнічується холестерином, як розкрито в WO 96/33739. Зокрема, потужна ад'ювантна композиція, яка включає QS21, 3D-MPL та токоферол в емульсії масло-у-воді, описується у WO 95/17210. В одному втіленні імуногенна композиція додатково включає сапонін, який може являти собою QS21. Композиція може також включати емульсію масло-у-воді та токоферол (WO 95/17210). Олігонуклеотиди, що містять неметилований CpG (WO 96/02555), та інші імуномодуляторні олігонуклеотиди (WO0226757 та WO03507822) є також бажаними індукторами ТН1 відповіді та є прийнятними для застосування уданому винаході. Особливими ад'ювантами є ті, що вибрані з групи солей металів, емульсій масло-у-воді, агоністів Toll-подібних рецепторів, (зокрема, агоніст Toll-подібного рецептора 2, агоніст Toll-подібного рецептора 3, агоніст Toll-подібного рецептора 4, агоніст Toll-подібного рецептора 7, агоніст Tollподібного рецептора 8 та агоніст Toll-подібного рецептора 9), сапонінів та їх комбінацій. Ад'ювант, що може використовуватися з вакцинними композиціями згідно з винаходом, являють собою блеби або препарати везикул зовнішньої мембрани з Грам-негативних бактеріальних штамів, такі, як описані у WO02/09746, зокрема, блеби N. meningitidis. Ад'ювантні властивості блебів можуть бути поліпшені шляхом збереження LOS (ліпополісахаридів) на їх поверхні (наприклад, за допомогою екстракції при використанні низьких концентрацій детергенту [наприклад, 0-0,1% дезоксихолат]). LOS можуть бути знешкоджені шляхом msbB(-) або htrB(-) мутацій, що обговорюються у WO02/09746. Ад'ювантні властивості можуть бути також поліпшені шляхом збереження PorВ (та необов'язково шляхом видалення PorА) з менінгоко 97359 42 кових блебів. Ад'ювантні властивості можуть також бути поліпшені шляхом вкорочення структури зовнішнього каркасного сахариду LOS на менінгококових блебах, наприклад за допомогою IgtB(-) мутації, що обговорюється у WO2004/014417. Альтернативно, згадані вище LOS (наприклад, ізольовані з msbB(-) та/або IgtB(-) штаму) можуть бути очищені та використані як ад'ювант у композиціях згідно з винаходом. Додатковий ад'ювант, який може використовуватися з композиціями згідно з винаходом, може бути вибраним з групи: сапонін, ліпід А або його похідні, імуностимуляторний олігонуклеотид, алкілглюкозамінідфосфат, емульсія масло-у-воді або їх комбінації. Додатковий бажаний ад'ювант являє собою сіль металу у комбінації з іншим ад'ювантом. Є бажаним, коли ад'ювант є агоністом Tollподібного рецептора, зокрема, агоністом Tollподібного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 або 9, або сапонін, зокрема, Qs21. Також є бажаним, коли ад'ювантна система включає два або більше ад'юванти з приведеного вище списку. Зокрема, комбінації бажано містять сапоніновий (зокрема, Qs21) ад'ювант та/або агоніст Toll-подібного рецептора 9, такий, як CpG, що містить імуностимуляторний олігонуклеотид. Інші переважні комбінації включають сапонін (зокрема, QS21) та агоніст Tollподібного рецептора 4, такий, як монофосфорил ліпід А або його 3-деациловану похідну, 3D-MPL або сапонін (зокрема, QS21) та ліганд Tollподібного рецептора 4, такий, як алкілглюкозамінідфосфат. Зокрема, бажаними ад'ювантами є комбінації 3D-MPL та QS21 (ЕР 0671948 В1), емульсії маслоу-воді, що включають 3D-MPL та QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414) або 3D-MPL, рецептований з іншими носіями (ЕР 0689454 В1). інші бажані ад'ювантні системи включають комбінацію 3DMPL, QS21 та CpG олігонуклеотиду, як описано в US6558670, US6544518. В одному втіленні ад'ювант являє собою (або включає) ліганд Toll-подібного рецептора (TLR) 4, бажано агоніст, такий, як похідна ліпіду А, зокрема, монофосфорил ліпід А, або більш бажано 3деацилований монофосфорил ліпід A (3D-MPL). 3D-MPL є доступним від GlaxoSmithKline Biologicals North America та в першу чергу поліпшує CD4+ Т-клітинні відповіді з IFN-g (Th1) фенотипом. Він може бути одержаний згідно зі способами, розкритими в GB 2 220 211 А. Хімічно це є сумішшю 3-деацилованого монофосфорил ліпіду А з 3, 4, 5 або 6 ацилованими ланцюгами. Бажано використовувати у композиціях згідно з даним винаходом маленькі частинки 3D-MPL. Маленькі частинки 3D-MPL мають такий розмір частинок, що вони можуть стерильно фільтруватися через фільтр 0,22 мкм. Такі препарати є описаними у міжнародній патентній заявці WO 94/21292. Синтетичні похідні ліпіду А є відомими та, як передбачається, є TLR 4 агоністами. Такі включають, але без обмеження: ОМ174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(R)-3додеканоїлокситетра-деканоїламіно]-4-офосфоно--D-глюкопіранозил]-2-[(R)-3 43 гідрокситетрадеканоїламіно]--Dглюкопіранозилдигідрофосфат), (WO 95/14026) ОМ 294 DP (3S,9R)-3-[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-5-аза9(R)-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10діол,1,10-біс(дигідроофосфат) (WO99/64301 та WO 00/0462 ) ОМ 197 МР-Ас DP (3S,9R)-3-[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-5-аза9-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10діол, -дигідроофосфат 10-(6-аміногексаноат) (WO 01/46127) Інші TLR4 ліганди, які можуть використовуватися, являють собою алкілглюкозамінідфосфати (AGP), такі, як ті, що розкриті в WO9850399 або US6303347 (способи для одержання AGP є також розкритими) або фармацевтично прийнятні солі AGP, як розкрито в US6764840. Деякі AGP є TLR4 агоністами, та деякі є TLR4 антагоністами. Обидва, як передбачається, є корисними як ад'юванти. Інший бажаний імуностимулятор для застосування в даному винаході являє собою Quil А та його похідні. Quil А є препаратом сапоніну, ізольованим з південноамериканського дерева Quilaja Saponaria Molina, та був вперше описаний як такий, що володіє ад'ювантною активністю Dalsgaard та ін. у 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p. 243-254). Очищені фрагменти Quil А були ізольовані шляхом ВЕРХ, що зберігає ад'ювантну активність без токсичності, асоційованої з Quil А (ЕР 0362278), наприклад, QS7 та QS21 (що є також відомими як QA7 та QA21). QS-21 є природним сапоніном, що одержаний з кори Quillaja saponaria Molina, він індукує CD8+ цитотоксичність Τ клітин (CTL), Th1 клітин та переважну відповідь lgG2a антитіла, а також є переважним сапоніном у контексті даного винаходу. Були описані окремі композиції QS21, які, зокрема, додатково включають стерин (WO96/33739). Сапоніни, що утворюють частину згідно з даним винаходом, можуть бути відокремлені у формі міцел, змішаних міцел, (переважно, але не виключно з солями жовчних кислот) або можуть бути у формі ISCOM матриць (ЕР 0109942 В1), ліпосоми або споріднені колоїдні структури, такі, як червоподібні або кільцеподібні мультимерні комплекси або ліпідні/шаруваті структури та ламели, коли рецептуються з холестерином та ліпідом, або у формі емульсії масло-у-воді (наприклад, як у WO 95/17210). Сапоніни можуть переважно бути асоційовані із солями металів, такими, як гідроокис алюмінію або фосфат алюмінію (WO 98/15287). Бажано, коли сапонін є представлений у формі ліпосоми, ISCOM або емульсії масло-у-воді. Поліпшена система втягує комбінацію монофосфорил ліпіду А (або знешкодженого ліпіду А) та похідної сапоніну, зокрема, комбінацію QS21 та 3D-MPL, як розкрито в WO 94/00153, або менш реактогенну композицію, в якій QS21 пригнічується холестерином, як розкрито в WO 96/33739. Зокрема, потужна ад'ювантна композиція, що включає токоферол з або без QS21 та/або 3D-MPL в емульсії масло-у-воді, є описаною в WO 95/17210. В 97359 44 одному втіленні імуногенна композиція додатково включає сапонін, який може являти собою QS21. Приклади бажаних олігонуклеотидів мають наступні послідовності. Послідовністі бажано містять фосфородитіоатний модифікований інтернуклеотидний зв'язок. ОЛІГО 1 (SEQ ID NO:1): ТСС ATG ACG ТТС CTG ACG ТТ (CpG 1826) ОЛІГО 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) ОЛІГО 3 (SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG ОЛІГО 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) ОЛІГО 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) ОЛІГО 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) Альтернативні CpG олігонуклеотиди можуть включати бажані послідовності, приведені вище, в яких вони мають несуттєві делеції або доповнення. CpG олігонуклеотиди, що використовуються в даному винаході, можуть бути синтезовані у відповідності з будь-якими способами, відомими в області техніки (наприклад, див. ЕР 468520). Так, ці олігонуклеотиди можуть бути синтезовані при використанні автоматичного синтезатора. Ад'ювант може бути емульсією масло-у-воді або може включати емульсію в комбінації з іншими ад'ювантами. Масляна фаза емульсійної системи бажано включає здатне до метаболізації масло. Значення терміну "здатне до метаболізації масло" є добре відомим в області техніки. Здатне до метаболізації може бути визначене "здатне до трансформації шляхом метаболізму" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders th Company, 25 edition (1974)). Масло може бути будь-якої рослинною олією, риб'ячою маслом, тваринним або синтетичним маслом, яке не є токсичним для реципієнта та є здатним трасформуватися шляхом метаболізму. Горіхи, насіння та зерно є загальновідомими джерелами рослинних олій. Синтетичні масла також є частиною даного винаходу та можуть влючати комерційно доступні масла,такі, як NEOBEE та інші. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22тетракозагексаєн) є ненасиченим маслом, яке знаходиться у великій кількості у маслі, одержаному з печінки акули, та у більш низьких кількостях в оливковій олії, олії зародків пшениці, рисовій олії та дріжджах, та є, зокрема, бажаним маслом для застосування у даному винаході. Сквален являє собою здатну до метаболізації олію з урахуванням того факту, що він являє собою проміжну сполуку th у біосинтезі холестерину (Merck index, 10 Edition, entry no.8619). Токоли (наприклад, вітамін Е) також часто використовуються в ад'ювантах на основі масляних емульсій (ЕР 0382271 В1; US5667784; WO 95/17210). Токоли, що використовуються у масляних емульсіях (бажано в емульсіях масло-у-воді) згідно з винаходом, можуть бути рецептовані так, 45 як описано в ЕР 0382271 В1, з цієї причини токоли можуть бути дисперсіями токолових крапель, що необов'язково включають емульгатор, з розміром крапель менше 1 мікрона у діаметрі. Альтернативно, токоли можуть використовуватися у комбінації з іншими маслами, з утворенням масляної фази масляної емульсії. Приклади масляних емульсій, що можуть використовуватися у комбінації з токолом, є описаними у даній заявці вони можуть являти собою здатне до метаболізації масло, як описано вище. Ад'юванти на основі емульсії масло-у-воді самі по собі були запропоновані як корисні для ад'ювантних композицій (ЕР 0399843 В), крім того, комбінації емульсій масло-у-воді та інших активних агентів були описані як ад'юванти для вакцин (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Інші ад'юванти на основі емульсії масло-у-воді були описані, наприклад такі емульсії, як вода-у-маслі (US 5,422,109;ЕР 0480982 В2) та вода-у-маслі у водних емульсіях (US 5,424,067; ЕР 0480981 В). Усі вони утворюють бажані масляні емульсійні системи (зокрема, при введенні токолів) з утворенням ад'ювантів та композицій згідно з даним винаходом. Найбільш бажано, коли масляна емульсія (наприклад емульсії масло-у-воді) додатково включає емульгатор такий, як TWEEN 80 та/або стерин, такий, як холестерин. Переважна масляна емульсія (бажано емульсія масло-у-воді) включає здатне до метаболізації нетоксичне масло, таке, як сквалан, сквален або токоферол, такий, як альфатокоферол (та бажано обидва: сквален та токоферол) та необов'язково емульгатор (або поверхнево-активну сполуку), такий, як Твін 80. Може також бути включений стерин (бажано холестерин). Спосіб одержання емульсії масло-у-воді є добре відомим спеціалісту в даній області техніки. В загальному випадку спосіб включає змішування токолвмісної масляної фази з поверхневоактивною речовиною, такою, як розчин PBS/TWEEN80, після чого проводять гомогенізацію при використанні гомогенізатора, спеціалістові в даній області техніки буде зрозумілим, що спосіб, який включає пропускання суміші двічі через голку шприца, буде прийнятним для гомогенізації невеликих об'ємів рідини. У тій самій мірі процес емульгування у мікропсевдозріджувальному пристрої (M110S Microfluidics пристрій, максимум 50 пропускань, протягом 2 хвилин при максимальному тиску на вході 6 бар (тиск на виході 850 бар)) можуть бути адаптовані спеціалістом в даній області техніки для одержання більших або менших об'ємів емульсії. Пристосування можуть бути досягнуті шляхом простого експерименту, що включає вимірювання одержаної емульсії, поки не буде досягнуто одержання емульсії з необхідним діаметром крапель. В емульсії масло-у-воді масло та емульгатор будуть знаходитися у водному носії. Водний носій може являти собою, наприклад, забуферений фосфатом фізіологічний розчин. Розмір масляних крапель, що знаходяться у стабільній емульсії масло-у-воді є бажано меншим 1 мікрона, може бути в інтервалі суттєво 30-600 нм, бажано суттєво близько 30-500 нм у діаметрі, 97359 46 та найбільш бажано суттєво 150-500 нм у діаметрі, та зокрема, приблизно 150 нм у діаметрі, як вимірюється методом фотон кореляційної спектроскопії. Так, 80% числа масляних крапель буде знаходитися у межах бажаних інтервалів, більш бажано більше 90%, та найбільш бажано більше 95% очисла масляних крапель знаходяться у межах визначених інтервалів розміру. Кількість компонентів, що є присутніми у масляних емульсіях згідно з даним винаходом, традиційно знаходиться в межах від 0,5 до 20% або від 2 до 10% масла (об'єму загальної дози), такого, як сквален; та у разі присутності від 2 до 10% альфа-токоферолу; та від 0,3 до 3% поверхнево-активної сполуки, такої, як поліоксіетиленсорбіт моноалеат. Бажано, коли співвідношення масло (бажано сквален): токол (бажано альфа-токоферол) є рівним або меншим 1, оскільки це забезпечує більш стабільну емульсію. Емульгатор, такий, як Твін 80 або Span 85, може також бути присутнім на рівні приблизно 1%. У деяких випадках може бути бажаним, коли вакцини згідно з даним винаходом будуть додатково містити стабілізатор. Приклади бажаних емульсійних систем є описаними у WO 95/17210, WO 99/11241 та WO 99/12565, які розкривають емульсійні ад'юванти, на основі сквалену, альфа-токоферолу та TWEEN 80, необов'язково рецептовані з імуностимуляторами QS21 та/або 3D-MPL. Таким чином в особливо бажаному втіленні даного винаходу, ад'ювант згідно з винаходом може додатково включаюти додаткові імуностимулятори, такі, як LPS або його похідні та/або сапоніни. Приклади додаткових імуностимуляторів є описаними в даній заявці та у "Vaccine Design - The Subunit та Addjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., та Newman, M.J., Plenum Press, New York та London, ISBN 0-30644867-Х. У бажаному аспекті ад'ювант та імуногенні композиції згідно з винаходом включають сапонін (бажано QS21) та/або LPS похідну (бажано 3DMPL) у масляній емульсії, описаній вище, необов'язково зі стерином (бажано холестерином). Додатково масляна емульсія (бажано емульсія масло-у-воді) може містити span 85 та/або лецитин та/або трикаприлін. Ад'юванти, що включають емульсію масло-у-воді, стерин та сапонін, є описаними у WO 99/12565. Типово, для введення людині сапонін (бажано QS21) та/або LPS похідна (бажано 3D-MPL) буде міститися у дозі імуногенної композиції для людини в інтервалі 1 мкг - 200 мкг, наприклад, 10-100 мкг, бажано 10 мкг-50 мкг на дозу. Типово, масляна емульсія (бажано емульсія масло-у-воді) буде включати від 2 до 10% здатної до метаболізації олії. Бажано, вона буде включати від 2 до 10% сквалену, від 2 до 10% альфа-токоферолу та від 0,3 до 3% (бажано 0,4-2%) емульгатора (бажано Твін 80 [поліоксіетиленсорбіт моноолеат]). Коли є присутніми сквален та альфа-токоферол, бажане співвідношення сквален:альфа-токоферол є рівним або меншим 1, оскільки це забезпечує більш стабільну емульсію. Span 85 (сорбіттриолеат) може також бути присутнім на рівні від 0,5 до 1% в 47 емульсії, що використовується у винаході. У деяких випадках може бути бажаним, коли імуногенні композиції та вакцини згідно з даним винаходом будуть додатково містити стабілізатор, наприклад, інші емульгатори/поверхнево-активні речовини, th включаючи каприлову кислоту (Merck index 10 Edition, entry no. 1739), де трикаприлін є особливо бажаним. Коли включаються сквален та сапонін (бажано QS21), є вигідним також додавати стерин (бажано холестерин) до композиції, оскільки це дозволяє знизити загальний рівень масла в емульсії. Це приводить до зниження витрат на виробництво, поліпшення загального комфорту вакцинації, а також до кількісних та якісних удосконалень одержаних імунних відповідей, таких, як поліпшена продукція IFN-. Таким чином, ад'ювантна система згідно з даним винаходом типово включає співвідношення здатного до метаболізації масла та сапоніну сапонін (ваг/ваг) у межах від 200:1 до 300:1, крім того, даний винахід може використовуватися форму "низького масла" бажаний інтервал для якої складає від 1:1 до 200:1, бажано від 20:1 до 100:1, та найбільш бажано суттєво 48:1, ця вакцина зберігає сприятливі ад'ювантні властивості усіх компонентів зі значно зниженим профілем реактогенності. Згідно з цим особливо бажані втілення мають співвідношення сквален:QS21 (ваг/ваг) в інтервалі від 1:1 до 250:1, також бажаний інтервал складає від 20:1 до 200:1, бажано від 20:1 до 100:1, та найбільш бажано суттєво 48:1. Бажано, коли стерин (найбільш бажано холестерин) також включається, та співвідношення сапонін:стерин є таким, як описано в даній заявці. Емульсійні системи згідно з даним винаходом бажано мають невеликий розмір крапель у субмікронному діапазоні. Найбільш бажано, коли розміри крапель будуть в інтервалі від 120 до 750 нм, та найбільш бажано від 120 до 600 нм у діаметрі. Зокрема, потужна ад'ювантна композиція (для заключної комбінації з АІРО4 в імуногенних композиціях згідно з винаходом) містить сапонін (бажано QS21), LPS похідну (бажано 3D-MPL) та масляну емульсію (бажано сквален та альфа-токоферол в емульсії масло-у-воді) СРМ, як описано у WO 95/17210 або у WO 99/12565 (зокрема, ад'ювантна композиція 11 у Прикладі 2, Таблиця 1). Приклади TLR 2 агоніста включають пептидоглікан або ліпопротеїн. Імідазохіноліни, такі, як іміквімод та резиквімод є відомими TLR7 агоністами. Одноланцюгова РНК є також відомим TLR агоністом (TLR8 у людей та TLR7 мишей), де одноланцюгова РНК та полі IС (поліінозиноваполіцитидилова кислота - комерційний синтетичний міметик вірусної РНК) є прикладами TLR 3 агоністів. 3D-MPL є прикладом TLR4 агоніста, у той час, як CPG являє собою приклад TLR9 агоніста. Імуногенна композиція може включати антиген та імуностимулятор, адсорбований на солі металу. Вакциннні композиції на основі алюмінію, де антиген та імуностимулятор 3-де-О-ацилований монофосфорил ліпід A (3D-MPL), є адсорбованими на одній тій самій частинці, є описаними у ЕР 0576478 В1, ЕР 0689454 В1, та ЕР 0633784 В1. У 97359 48 цих випадках антиген спочатку адсорбують на солі алюмінію, після чого здійснюють адсорбцію імуностимулятора 3D-MPL на ті самі частинки солі алюмінію. Такі процеси спочатку передбачають приготування суспензії 3D-MPL шляхом обробки ультразвуком у водяній бані до тих пір, поки частинки не досягнуть розміру від 80 до 500 нм. Антиген типово адсорбують на солі алюмінію протягом 1 години при кімнатній температурі при перемішуванні. 3D-MPL суспензію потім додають до адсорбованого антигену та композицію інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години, а потім витримують при температурі 4°С до використання. В іншому процесі імуностимулятор та антиген знаходяться на різних частинках металу, як описано у ЕР 1126876. Удосконалений процес включає адсорбцію імуностимулятора на частинці металу, після чого проводять адсорбцію антигену на інших частинках солі металу, після цього перемішують дискретні частинки металу з утворенням вакцини. Ад'ювант для застосування в даному винаході може являти собою ад'ювантну композицію, що включає імуностимулятор, адсорбований на частинці металу, що характеризується тим, що частинка солі металу є суттєво вільною від іншого антигену. Крім того, вакцини, що забезпечуються даним винаходом, характеризуються тим, що імуностимулятор є адсорбованим на частинках солі металу, які є суттєво вільними від іншого антигену, та тим, що частинки металічної солі, які є адсорбованими з антигеном, є суттєво вільними від іншого імуностимулятора. Згідно з цим даний винахід забезпечує ад'ювантну композицію, що включає імуностимулятор, який був адсорбований на частинці солі металу, та який характеризується тим, що композиція є суттєво вільною від іншого антигену. Крім того, ця ад'ювантна композиція може являти собою проміжний продукт, яка, якщо використовується такий ад'ювант, необхідний для виробництва вакцини. Згідно з цим забезпечується спосіб для виробництва вакцини, що включає змішування ад'ювантної композиції, яка містить один або більше імуностимуляторів, адсорбованих на частинці металу з антигенм. Бажано, коли антиген був попередньо адсорбований на солі металу. Вказана сіль металу може бути ідентичною або подібною до солі металу, на якій адсорбований імуностимулятор. Бажано, коли сіль металу являє собою сіль алюмінію, наприклад, фосфат алюмінію або гідроокис алюмінію. Даний винахід також забезпечує вакцинну композицію, що включає імуностимулятор, адсорбований на першій частинці солі металу, та антиген, адсорбований на солі металу, що характеризується тим, що перша та друга частинки солі металу є окремими частинками. LPS або LOS похідні або мутації, або похідні ліпіду А, описані в даній заявці, сконструйовані так, що є менш токсичними (наприклад, 3D-MPL), ніж нативні ліпополісахариди та є почерговими еквівалентами стосовно будь-якого застосування таких залишків, описаних в даній заявці. Вони можуть бути TLR4 лігандами, як описано вище. Інші такі похідні є описаними у WO020786737, 49 WO9850399, WO0134617, WO0212258, WO03065806. В одному втіленні ад'ювант, що використовується для композицій згідно з винаходом, включає ліпосомний носій (виготовлений за допомогою відомих методик з фосфоліпідів (таких, як діолеоїлфосфатидил холін [DOPC]) та необов'язково стерину [такого, як холестерин]). Такі ліпосомні носії можуть нести похідні ліпіду А [таку, як 3D-MPL див. вище] та/або сапоніни (такі, як QS21 - див. вище). В одному втіленні ад'ювант включає (на 0,5 мл дози) 0,1-10 мг, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2 або 0,5-1 мг (наприклад, 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 або 1 мг) фосфоліпіду (наприклад DOPC), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,0750,75, 0,1-0,3 або 0,125-0,25 мг (наприклад, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 або 0,125 мг) стерину (наприклад холестерину), 5-60, 10-50 або 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 або 50 мкг) похідної ліпіду А (наприклад, 3D-MPL) та 5-60, 10-50 або 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 або 50 мкг) сапоніну (наприклад, QS21). В одному втіленні ад'ювант, що використовується для композицій згідно з винаходом включає емульсію масло-у-воді, виготовлену зі здатного до метаболізації масла (такого, як сквален), емульгатора (такого, як Tween 80) та необов'язково токолу (такого, як альфа-токоферол). В одному втіленні ад'ювант включає (на 0,5 мл дози) 0,5-15, 1-13, 211, 4-8 або 5-6 мг (наприклад, 2-3, 5-6 або 10-11 мг) здатного до метаболізації масла (такого, як сквален), 0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4 або 2-3 мг (наприклад, 0,9-1,1, 2-3 або 4-5 мг) емульгатора (такого, як Tween 80) та необов'язково 0,5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 мг (наприклад, 11-13, 5-6 або 2-3 мг) токолу (такого, як альфа-токоферол). Цей ад'ювант може необов'язково додатково включаюти 5-60, 10-50 або 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 або 50 мкг) похідної ліпіду А (наприклад, 3D-MPL). Цей ад'ювант може необов'язково містити 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 або 0,1250,25 мг (наприклад, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 або 0,125 мг) стерину (наприклад, холестерину), 5-60, 10-50 або 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 або 50 мкг) похідної ліпіду А (наприклад, 3D-MPL), та 5-60, 10-50 або 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 або 50 мкг) сапоніну (наприклад, QS21). В одному втіленні ад'ювант, що використовується для композицій згідно з винаходом, включає фосфат алюмінію та похідну ліпіду А (таку, як 3DMPL). Цей ад'ювант може включати (на 0,5 мл дози) 100-750, 200-500 або 300-400 мкг АІ у вигляді фосфату алюмінію, та 5-60, 10-50 або 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 або 50 мкг) похідної ліпіду А (наприклад, 3D-MPL). Такі вакцинні препарати згідно з даним винаходом, можуть використовуватися для захисту або лікування ссавця, чутливого до інфекції, за допомогою введення вказаної вакцини системним шляхом, або через слизові оболонки. Ці введення можуть включати ін'єкцію шляхом внутрішньом'язового, інтраперитонеального, інтрадермального або підшкірного введення, або введення через слизову оболонку до орально 97359 50 го/травного, респіраторного, сечостатевого трактів. Інтраназальне введення вакцин для лікування пневмонії або середнього отиту є переважним (оскільки назофарингеальне носійство пневмококів може більш ефективно запобігатися, послаблюючи, таким чином, інфекцію на ранній стадії). Незважаючи на те, що вакцина згідно з винаходом може вводитися як одинична доза, її компоненти можуть також сумісно вводитися одночасно або в різні моменти часу (наприклад, пневмококові сахаридні кон'югати можуть вводитися окремо, у той самий час або через 1-2 тижні після введення будь-якого компоненту бактеріального білка для оптимальної координації імунних відповідей стосовно кожної іншої). Для сумісного введення оптимальний Th1 ад'ювант може бути присутнім у будь-якій або усіх різних введеннях. На доповнення до одного шляху введення можуть використовуватися 2 різні шляхи введення. Наприклад, сахариди або сахаридні кон'югати можуть вводитися IM (або ID), а бактеріальні білки можуть вводитися IN (або ID). На доповнення до цього, вакцини згідно з винаходом можуть вводитися IМ для примуючих дозувань, a IN дози для бустерних доз. Кількість кон'югату антигену в кожній вакцинній дозі є вибраною як кількість, яка індукує імунопротективну відповідь без значних шкідливих побічних ефектів у типових вакцинах. Така кількість буде варіювати у залежності від специфічного імуногену, що використовується та від того, як він представлений. В загальному випадку очікується, що кожна доза буде включати 0,1-100 мкг полісахариду, типово 0,1-50 мкг, 0,1-100 мкг, 1-10 мкг або 1-5 мкг полісахаридних кон'югатів. Вміст білкових антигенів у вакцині бути типово знаходитися у межах 1-100 мкг, бажано 5-50 мкг, найбільш типово в інтервалі 5-25 мкг. Після початкової вакцинації, особи можуть одержувати одну або декілька бустерних імунізацій, розділених проміжком часу. Вакцинний препарат є в загальному вигляді описаним у Vaccine Design ("The subunit та adjuvant approach" (ред. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Інкапсуляція у ліпосоми є описаною Fullerton, патент США № 4,235,877. Вакцини згідно з даним винаходом можуть зберігатися у розчині або у ліофілізований формі. Бажано, коли розчин піддають ліофілізації у присутності цукру, такого, як цукроза або лактоза. Також є бажаним, коли вони піддаються ліофілізації та відновлюються перед застосуванням. Ліофілізація може приводити до одержання більш стабільної композиції (вакцини). Способи Винахід також охоплює спосіб одержання імуногенних композицій та вакцин згідно з винаходом. В одному втіленні процес згідно з винаходом являє собою спосіб одержання вакцини, що включає етап змішування антигенів для одержання імуногенної композиції згідно з винаходом та додання фармацевтично прийнятного наповнювача. Способи лікування Винахід також охоплює спосіб лікування стафілококової інфекції, зокрема, нозокоміальних 51 (внутрішньолікарняних) інфекцій, які виникають у лікарні. Імуногенна композиція або вакцина згідно з винаходом є, зокрема, бажаною для використання у випадках планових операцій. Такі пацієнти будуть знати дату хірургічного втручання наперед та можуть бути інокульовані наперед. Оскільки є невідомим, чи буде пацієнт піддаватися впливу інфекції S. aureus, чи S. epidermidis, є бажаним провести інокуляцію вакциною згідно з винаходом, що захищає від обох, як описано вище. Типово, дорослих людей у віці більше 16 років, які очікують планової операції, піддають обробці імуногенними композиціями та вакцинами згідно з винаходом. Альтернативно, дітей у віці 3-16 років, які очікують планової операції, піддають обробці імуногенними композиціями та вакцинами згідно з винаходом. Є також можливим вводити вакцину згідно з винаходом медичним працівникам. Вакцинні препарати згідно з даним винаходом можуть використовуватися для захисту або лікування ссавця, чутливого до інфекції, шляхом введення вказаної вакцини за допомогою системного введення або введення через слизові оболонки. Ці введення можуть включати ін'єкцію внутрішньом'язовим, інтраперитонеальним, інтрадермальним або підшкірним шляхами; або шляхом введення через слизові оболонки в оральний/травний, респіраторний, сечо-статевий тракти. Кількість антигену у кожній вакцинній дозі вибирають як кількість, яка індукує імунопротективну відповідь без значних шкідливих побічних ефектів у типових вакцинах. Така кількість буде варіювати у залежності від специфічного імуногену, що використовується та від того, як він представлений. Вміст білка у вакцині бути типово знаходитися у межах 1-100 мкг, бажано 5-50 мкг, найбільш типово в інтервалі 5-25 мкг. Оптимальна кількість для конкретної вакцини буде визначатися за допомогою стандартних досліджень, що передбачають спостереження за прийнятною імунною відповіддю в осіб. Після початкової вакцинації, особи можуть одержувати одну або декілька бустерних імунізацій, розділених проміжком часу. Незважаючи на те, що вакцини згідно з даним винаходом можуть вводитися будь-яким шляхом, введення описаних вакцин у шкіру (ID) утворює одне втілення згідно з даним винаходом. Шкіра людини включає зовнішню "рогову" кутикулу, що називається роговим шаром, що покриває епідерму. Внизу цієї епідерми є шар, який називається дерма, який, у свою чергу, покриває підшкірну тканину. Дослідники показали, що ін'єкція вакцини у шкіру, та зокрема, дерму, встимулює імунну відповідь, що може бути асоційовано з рядом додаткових переваг. Інтрадермальна вакцинація з використанням вакцин, описаних в даній заявці утворює бажану ознаку згідно з даним винаходом. Традиційна методика для інтрадермальної ін'єкції, "процедура манту", включає етапи очищення шкіри, та потім натягування однією рукою, та за допомогою голки зі скошеним краєм з вузьким каналом (калібр 26-31) скошений край голки вводять під кутом 10-15°. Як тільки скос голки введений, тіло голки вводять нижче у шкіру та далі 97359 52 просувають при слабкому тиску до послаблення її під шкірою. Потім рідину вводять дуже повільно, формуючи, таким чином пухирець або шишку на шкірній поверхні, після чого повільно витягають голку. Нещодавно були описані спеціально розроблені пристрої для введення рідких агентів у або через шкіру, наприклад, пристрої, описані у WO 99/34850 та ЕР 1092444, а також пристрої для впорскування струменем описані, наприклад у WO 01/13977; US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520, 639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 та WO 97/13537. Альтернативні способи для інтардермального введення вакцинних препаратів можуть включати традиційні шприци та голки, або пристрої, призначені для балістичної доставки твердих вакцин (WO 99/27961) або трансдермальні пластирі (WO 97/48440; WO 98/28037); або такі, що застосовуються до поверхні шкіри (трансдермальна або трансшкірна доставка WO 98/20734 ; WO 98/28037). Коли вакцини згідно з даним винаходом вводяться у шкіру, або зокрема, у дерму, вакцина знаходиться у малому об'ємі рідини, зокрема, об'єм складає від приблизно 0,05 мл до 0,2 мл. Вміст антигенів у шкірних або інтрадермальних вакцинах згідно з даним винаходом може бути подібним до традиційних доз, як це є у внутрішньом'язових вакцинах (див. вище). Проте ознакою шкірних та інтрадермальних вакцин є те, що композиції можуть бути у "низькій дозі". Відповідно до цього білкові антигени у вакцинах "низької дози" є бажано присутніми у дозі від 0,1 до 10 мкг, бажано у дозі від 0,1 до 5 мкг на дозу; сахаридні (бажано кон'юговані) антигени можуть бути присутніми у межах 0,01-1 мкг, та бажано від 0,01 до 0,5 мкг сахариду на дозу. Як використовується в даній заявці, термін "інтрадермальна доставка" означає доставку вакцини у район дерми у шкірі. Проте вакцина не буде з необхідністю розташовуватися у дермі. Дерма є шаром у шкірі, який розміщений між приблизно 1,0 та приблизно 2,0 мм від поверхні шкіри людини, проте існує деяка кількість варіацій між індивідуумами та у різних частинах тіла. В загальному випадку, слід очікувати досягнення дерми шляхом проходження 1,5 мм нижче поверхні шкіри. Дерма розміщена між роговим шаром та епідермою на поверхні та підшкірним шаром, розміщеним нижче. У залежності від способу доставки вакцина може в основному розміщуватися виключно або в основному у межах епідерми та дерми. У залежності від способу доставки вакцина може в основному розміщуватися виключно або в основному у межах дерми або вона може в основному розподілятися в епідермісі та дермі. Втілення винаходу являє собою спосіб запобігання або лікування стафілококової інфекції або захворювання, що включає етап введення імуно 53 генної композиції або вакцини згідно з винаходом пацієнту, який цього потребує. Додаткове втілення винаходу являє собою застосування імуногенної композиції згідно з винаходом у виробництві вакцини для лікування або запобігання стафілококової інфекції або захворювання, необов'язково, пост-хірургічної стафілококової інфекції. Термін "стафілококова інфекція" охоплює інфекцію, спричинену S. aureus та/або S. epidermidis та іншими стафілококовими штамами, здатними викликати інфекцію у ссавця, необов'язково у людини-хазяїна. Терміни "такий, що включає", "включають" та "включає" в даній заявці призначені винахідниками для необов'язкової заміни термінів "такий, що складається", "складаються з" "складається з", відповідно у будь-якому випадку. Усі посилання або патентні заявки, що цитуються в даному описі, введені в дану заявку як посилання. 97359 54 Для кращого розуміння даного винаходу представлені наступні приклади. Приклади представлені тільки з метою ілюстрації та не вважаються такими, що обмежують об'єм даного винаходу будь-яким чином. Приклади Приклад 1 Конструювання плазміди для експресії рекомбінантних білків А: Клонування. Прийнятні рестрикційні сайти конструювали в олігонуклеотидах, специфічних для стафілококового гена, що дозволяють проводити спрямоване клонування продукту ПЛР в експресійну плазміду E.coli pET24d або pQE-30, так, що білок може бути експресований у вигляді злитого білка, що містить (His)6 мітку для афінної хроматографії на N- або С-термінальному кінці. Використовувані праймери являли собою: 55 Продукт ПЛР спочатку вводили у pGEM -Τ клонуючий вектор (Novagen) при використанні Тор 10 бактеріальних клітин згідно з інструкціями виробника. Ця проміжна конструкція була зроблена для того, щоб поліпшити подальше клонування в експресійний вектор. Трансформанти, що містили вставку ДНК, відбирали за допомогою аналізу при використанні рестрикційних ферментів. Після перетравлювання аліквоту ~20 мкл продукту реакції піддавали аналізу за допомогою електрофорезу на агарозному гелі (0,8% агарози у Трисацетатному ЕДТА (ТАЕ) буфер). ДНК фрагменти піддавали візуалізації при освітлюванні в УФ промінні після гель-електрофорезу та забарвлювання бромідом етидію. ДНК стандартного молекулярного розміру (сходинки 1 кб, Life Technologies) паралельного піддавали електрофорезу із тестовими зразками та використовували для оцінки розміру фрагментів ДНК. Плазміду, очищену від відібраних трансформантів для кожного клонування, потім послідовно перетравлювали до завершення при використанні прийнятних рестрикційних ферментів, як рекомендовано виробником (Life Technologies). Перетравлений фрагмент ДНК потім очищали при використанні спінових колонок на основі силікагелю перед лігуванням з pET24d або pQE-30 плазмідою. Клонування Ebh (Н2 фрагмент), АаА, IsdA, IsdB, HarA, Atl-амідази, Atlглюкозаміну, MRPII, IsaA проводили при використанні pET24d плазміди, а клонування ClfA, SdrC, SdrE, FnbpA, SdrG/Fbe, альфа-токсину та Sbi проводили при використанні pQE-30 плазміди. В: Одержання експресійного вектора Для одержання експресійної плазміди pET24d або pQE-30, призначеної для лігування, її також подібним чином перетравлювали до завершення при використанні прийнятних рестрикційних ферментів. Приблизно 5-кратний молярний надлишок перетравлених фрагментів стосовно приготовленого вектора використовували для програми реакції лігування. Стандартну реакцію лігування в об'ємі ~20 мкл (~16°С, ~16 годин), використовуючи способи, добре відомі в галузі техніки, проводили при використанні Т4 ДНК лігази (-2,0 одиниць/реакція, Life Technologies). Аліквоту лігування (~5 мкл) використовували для трансформації M15(pREP4) або BT21::DE3 електрокомпетентних клітин згідно зі способом, добре відомим в області техніки. Через -2-3 години періоду вирощування при температурі 37°С у ~1,0 мл бульйону LB трансформовані клітини висаджували на планшети з LB агаром, які містять ампіцилін (100 мкг/мл) та/або канаміцин (30 мкг/млі). Антибіотики входили до складу селективного середовища. Планшети інкубували протягом ночі при 37°С протягом -16 годин. Збирали індивідуальні ApR/KanR колонії при використанні стерильної палички та використовували для перенесення інокуляту на свіжі LB ApR/KanR планшети, а також у бульйонну культуру ~1,0 мл LB Ар/Kan. Як планшети з "плямами", так і бульйонну культуру інкубували протягом ночі при 37°С або у стандартному інкубаторі (планшети) або на водяній бані при струшуванні. ПЛР аналіз на основі цільних клітин використовували для 97359 56 перевірки того факту, що трансформанти містили ДНК вставку. При цьому ~,.0 мл нічної бульйонної культури LB Ар/Kan переносили у поліпропіленові пробірки на 1,5 мл та збирали клітини при центрифугуванні на мікроцентрифузі Бекмана (~3 хв., кімнатна температура, -12,000 X g). Осад клітин суспендували у ~200 мкл стерильної води, та аліквоту ~10 мкл використовували для програми на основі ~50 мкл заключного об'єму продуктів ПЛР, що містить як зворотні, так і прямі праймери ампліфікації. Початковий етап денатурації при 95°С продовжували до 3 хвилин для того, що впевнитися у термальному руйнуванні бактеріальних клітин та вивільненні плазмідної ДНК. Використовували АВІ модель 9700 термального синтезатора та трьохетапний термальний профіль ампліфікації на основі 32 циклів, тобто 95°С, 45 сек.; 55-58°С, 45 сек., 72°С, 1 хвилина, для ампліфікації BASB203 фрагменту із зразків трансформантів, які піддавали лізису. Після термальної ампліфікації, аліквоту -20 мкл реакційної суміші аналізували при використанні електрофорезу в агарозному гелі (0,8% агарози у Трис-ЕДТА (ТАЕ) буфері). ДНК фрагменти піддавали візуалізації в ультрафіолетовому світлі після проведення гельелектрофорезу та забарвлювання бромідом етидію. Стандарт молекулярного розміру ДНК (сходинки 1 кбаз, Life Technologies) піддавали електрофорезу паралельно із тестовими зразками та використовували для оцінки розміру продуктів ПЛР. Трансформанти, які забезпечували одержання очікуваного розміру продукту ПЛР, ідентифікували як штами, що містять конструкцію для експресії білка. Штами, які містять плазміду експресії, аналізували на індуцибельну експресію рекомбінантного білка. С: Аналіз експресії ПЛР-позитивних трансформантів. Аліквоту нічної культури (~1,0 мл) інокулювали у колбу Ерленмейєра на 125 мл, що містить ~25 мл LB Ар/Kan бульйону та вирощували при 37°С при струшуванні (-250 об./хв.), поки помутніння культури не досягало оптичної густини (O.D.) при 600 нм - 05, тобто до середини log фази (звичайно приблизно через 1,5-2,0 години). У цей час приблизно половину культури (~12,5 мл) переносили до другої колби Ерленмейєра на 125 мл та експресію рекомбінантного білка індукували шляхом додання IPTG (1,0M матковий розчин, приготовлений у стерильній воді, Sigma) до одержання заключної концентрації 1,0 мМ. Інкубація індукованих IPTG та неіндукованих культур тривала протягом додаткових ~4 годин при 37°С при струшуванні. Зразки (~1,0 мл) як індукованої, так і неіндукованої культури видаляли після періоду індукції та клітини збирали за допомогою центрифугування у мікроцентрифузі при кімнатній температурі протягом ~3 хвилин. Індивідуальні клітинні осади суспендували у ~50 мкл стерильної води, потім перемішували з рівним об'ємом 2 X SDS -PAGE буфера для зразків (за Лемлі), що містить 2-меркаптоетанол, та поміщали на киплячу водну баню на ~3 хвилини для денатурації білка. Рівні об'єми (~15 мкл) сирових IPTG-індукованого та неіндукованого клітинних 57 лізатів завантажували у подвійний 12% Трис/гліциновий поліакриламідний гель (1 мм товщина, мінігелі, Novex). Індуковані та неіндуковані зразки лізатів піддавали електрофорезу разом з попередньо забарвленими маркерами молекулярної ваги (SeeBlue, Novex) при звичайних умовах, використовуючи SDS/Трис/гліциновий буфер для розгону (BioRad). Після проведення електрофорезу один гель забарвлювали Кумассі брильянтовим голубим R250 (BioRad), а потім знебарвлювали для візуалізації нового(их) ІРТСіндуцибельного(их) білка(білків). Другий гель піддавали електроблоттінгу на PVDF мембрані (розмір пор 0,45 мікрон, Novex) протягом ~2 годин при 4°С при використанні пристрою для блоттінгу BioRad Mini-Protean II та метанолу буфера Тоубінса для переносу на основі метанолу (20%). Блокування мембрани та інкубацію антитіл проводили згідно зі способами, відомими в, області техніки. Моноклональне анти-RGS (His)3 антитіло, а також друге кроляче анти-мишине антитіло, кон'юговане з HRP (QiaGen), використовували для підтвердження експресії та ідентичності рекомбінантного білка. Візуалізацію реактивної моделі анти-His антитіла досягали при використанні або АВТ нерозчинного субстрату, або при використанні Hyperfilm з хемілюмінісцентною системою Amersham ECL. Приклад 2 Одержання рекомбінантного білка Бактеріальний штам Рекомбінантний експресійний штам Е. coli M15(pREP4), що містить плазміду (pQE30), або BL21::DE3, що містить плазміду pET24d, яка кодує стафілококовий білок, використовували для продукції клітинної маси для очистки рекомбінантного білка. Середовище Ферментаційне середовище, яке використовували для продукції рекомбінантного білка, складалося з 2Х YT бульйону (Difco), що містить 100 мкг/мл Ар та/або 30 мкг/мл Km. Антиспінювальний агент додавали до середовища при ферментації у кількості 0,25 мл/л (антиспінювач 204, Sigma). Для індукції експресії рекомбінантного білка IPTG (ізопропіл -D-тіогалактопіранозид) додавали до ферментаційного середовища (заключна концентрація 1 мМ). Одержання рекомбінантних білків При нативних умовах IPTG додавали при заключній концентрації 1 мМ та культуру вирощували протягом 4 додаткових годин. Потім культуру центрифугували при швидкості 6,000 об./хв. протягом 10 хвилин, та осад ресуспендували у фосфатному буфері (50 мМ K2НРО4, KН2РО4 рН 7), що включає суміш інгібіторів протеази. Зразок піддавали обробці при використанні способу лізису під тиском Френча, застосовуючи тиск 1500 бар (2 прогони). Після центрифугування протягом 30 хвилин при 15000 об./хв. супернатант зберігали для додаткової очистки та додавали NaCI до концентрації 0,5M. Зразок потім завантажували у колонку Ni-NTA смола (ХK 16 колонка Pharmacia, Ni-NTA смола Qiagen), врівноважену 50 мМ K2НРО4, KН2РО4 рН 7. Після завантаження зразка колонку промивали буфером 97359 58 А (0,2M NaH2PO4 pH7, 0,3M NaCI, 10% гліцерин). Для елюювання зв'язаного білка проводили етап з використанням ступінчастого градієнту, де різні співвідношення буфера В (0,2M NaH2PO4 pH7, 0,3M NaCI, 10% гліцерин та 200 мМ імідазолу) додавали до буфера А. Пропорцію буфера В поступово підвищували від 10% до 100%. Після очищення елюйовану фракцію, що містить білок, розділяли на пули, піддавали концентруванню та діалізу проти 0,002M ΚΗ2ΡΟ4/Κ2ΗΡΟ4 рН7, 0,15M NaCI. Цей метод використовували для очистки ClfA, SdrG, IsdA, IsaB, HarA, Atl-глюкозаміну та альфатоксину. При умовах денатурації Додавали IPTG при заключній концентрації 1 мМ, та культуру вирощували протягом 4 додаткових годин. Потім культуру центрифугували при 6,000 об./хв. протягом 10 хвилин та осад ресуспендували у фосфатному буфері (50 мМ K2НРО4, KН2РО4 рН 7), що включає суміш інгібіторів протеази. Зразок піддавали обробці при використанні способу лізису під тиском Френча, застосовуючи тиск 1500 бар (2 прогони). Після центрифугування протягом 30 хвилин при 15000 об./хв., осад промивали фосфатним буфером, що включає 1M сечовини. Зразок центрифугували протягом 30 хвилин при 15000 об./хв., та осад ресуспендували у 8M сечовини, 0,1M NaH2PO4, 0,5M NaCI, 0,01M Трис-НСІ рН 8 та витримували протягом ночі при кімнатній температурі. Зразок центрифугували протягом 20 хвилин при 15000 об./хв., та супернатант зберігали для додаткової очистки. Зразок потім завантажували у колонку Ni-NTA смола (ХK 16 колонка Pharmacia, Ni-NTA смола Qiagen), врівноважену у 8M сечовини, 0,1M NaH2PO4, 0,5M NaCI, 0,01M Трис-Hcl рН 8. Після проходження потоку через колонку, колонку послідовно промивали буфером А (8M сечовина, 0,1M NaH2PO4, 0,5M NaCI, 0,01M Трис, рН 8,0), буфером С (8M сечовина, 0,1M NaH2PO4, 0,5M NaCI, 0,01M Трис, рН 6,3), буфером D (8M сечовина, 0,1M NaH2PO4, 0,5M NaCI, 0,01M Трис, рН 5,9) та буфером Ε (8M сечовина, 0,1M NaH2PO4, 0,5M NaCI, 0,01M Трис, рН 4,5). Рекомбінантний білок елюювали з колонки під час промивань буфером D та Е. Денатурований рекомбінантний білок може бути розчинений у розчині, який не містить сечовини. З цією метою денатурований білок, що міститься у 8M сечовині, послідовно піддавали діалізу проти 4M сечовини, 0,1M Na2PO4, 0,01M Трис-HCI, рН 7,1, 2M сечовини, 0,1M NaH2PO4, 0,01М Трис-HCI, рН 7,1, 0,5M аргініну та 0,002M KН2РО4/K2НРО4 рН 7,1, 0,15M NaCI, 0,5M аргініну. Цей спосіб використовували для очистки Ebh (H2 фрагмент), АаА, SdrC, FnbpA, Sbi, Atl-амідази та IsaA. Очищені білки піддавали аналізу при використанні SDS-PAGE. Результати для одного білка, очищеного при нативних умовах (альфа-токсин), та одного білка, очищеного при умовах денатурації (SdrC), представлені на Фігурах 3 та 4. Приклад 3 Приготування кон'югатів капсулярного полісахариду S. aureus при використанні CDAP 59 Активація та злиття нативного PS8 при використанні CDAP: SA08-TT004 Активацію та злиття проводили при кімнатній температурі при постійному перемішуванні. 10 мг нативного полісахариду розчиняли з одержанням заключної концентрації полісахариду 2,5 мг/мл в 0,2M NaCI. Потім розчин доводили до значення рН 6,0+/-0,2 перед етапом активації. У певний момент часу 0,50 мкл розчину CDAP (100 мг/мл свіжо приготовленого у суміші ацетонітрил/WFI, 50/50) додавали у ручному режимі до досягнення прийнятного співвідношення CDAP/PS (0,5/1). Через 1,5 хвилини значення рН підвищували до рН 9,00+/-0,05 шляхом додання 0,5M NaOH. Додання NaOH тривало приблизно 1 хвилину, після цього рН стабілізували на значенні рН 9,00+/0,05 аж до додання носія. Через 4,5 хвилини додавали 1,5 мл ТТ (10 мг/мл у 0,2M NaCI) до досягнення прийнятного співвідношення білок/полісахарид (1,5/1); рН негайно доводили до значення для злиття рН 9,00+/0,05. Розчин залишали на одну годину при ручному регулюванні значення рН. Після проведення етапу злиття додавали 0,5 мл 2М гліцину (співвідношення гліцин/полісахарид (ваг/ваг.): 7,5/1); рН негайно доводили до значення 9,00+/-0,05. Розчин залишали на 30 хвилин при ручному регулюванні значення рН. Потім кон'югат освітлювали при використанні 5 мкм фільтру Minisart та вводили у колонку Sephacryl S400HR (XK16/100). Швидкість витікання встановлювали на рівні 30 мл/год. при використанні 150 мМ NaCI. Фракції елюювання аналізували при використанні резорцинолу та ΒCΑ. Фракції, що представляють інтерес, поєднували та фільтрували на 0,22 мкм фільтрі Sterivex. Одержаний кон'югат мав заключне співвідношення TT/PS (ваг/ваг.) 1,05, як було оцінено за допомогою аналізу при використанні резорцинолу та аналізу за Лоурі. Приклад 4 Приготування кон'югатів капсулярного полісахариду S. aureus при використанні CDAP на каліброваних полісахаридах Активація та злиття для каліброваного PS8 при використанні CDAP PS зважували на основі 10% теоретичного вмісту вологи. 2 г нативного вологого PS розчиняли протягом ночі у WFI при початковій концентрації 10 мг/мл. Перед калібруванням розчин нативного PS освітлювали при використанні відсікаючого фільтра 5 мкм. Пристрій для гомогенізації EMLILSIFLEX С-50, в якому гомогенізуючу камеру замінювали камерою для взаємодії Microfluidics F20Y-0,75 мкм, використовували для зменшення молекулярної ваги та густини полісахариду перед етапом активації. Зменшення розміру проводили при тиску 10000 фунтів на кв. дюйм протягом 10 перших циклів, а потім при тиску 15000 фунтів на кв. дюйм протягом 60 циклів. За розвитком процесу зменшення розміру слідкували шляхом вимірювання густини. Калібрування зупиняли після 70 циклів, коли досягали цільового значення 2,74±0,2 ер. 97359 60 Активацію та злиття проводили при кімнатній температурі при постійному перемішуванні. 50 мг каліброваного полісахариду 8 розводили з одержанням концентрації полісахариду 5 мг/мл у 0,2M NaCI. У певний момент часу 0,375 мкл розчину CDAP (100 мг/мл свіжо приготовленого у суміші ацетонітрил/WFI, 50/50) додавали у ручному режимі до досягнення прийнятного співвідношення CDAP/PS (0,75/1). Через 1 хвилину значення рН підвищували до рН 9,00+/-0,05 шляхом додання 0,5M NaOH. Через 2,5 хвилини додавали 10 мл ТТ при концентрації 10 мг/мл у 0,2M NaCI до досягнення прийнятного співвідношення білок/полісахарид (2/1); рН негайно доводили до значення для злиття рН 9,00+/-0,05. Розчин залишали на 55 хвилин при ручному регулюванні значення рН. Після проведення етапу злиття додавали 2,5 мл 2M гліцину (співвідношення гліцин/полісахарид (ваг./ваг.): 7,5/1); рН негайно доводили до значення 9,00+/-0,05 при використанні регулятора рН. Розчин залишали на 30 хвилин при ручному регулюванні значення рН. Потім кон'югат освітлювали при використанні 5 мкм фільтра Minisart та вводили у колонку Sephacryl S400HR (ХK16/100). Швидкість витікання встановлювали на рівні 60 мл/год. Фракції елюювання аналізували при використанні резорцинолу та дозування білка. Фракції, що представляють інтерес, пожднували та фільтрували на 0,22 мкм фільтрі Millipack20. Одержаний кон'югат мав заключне співвідношення TT/PS 1,94. Приклад 5 Приготування кон'югатів капсулярного полісахариду S. aureus при використанні EDAC Активація та злиття при використанні EDAC: Кон'югат капсулярний полісахарид типу 8 S. aureus - TT: Дериватизація полісахариду Активацію та злиття проводили при кімнатній температурі при постійному перемішуванні. 30 мг нативного полісахариду розводили з одержанням заключної концентрації полісахариду 5 мг/мл у воді. Розчин доводили до значення рН 4,5-5,0 при використанні 0,5N HCI, а потім додавали 66 мкг ADH (2,2 мг/мг PS). Після повного розчинення додавали 60 мг EDAC (2 мг/мг PS). Через 70 хвилин значення рН підвищували до рН 7,5 при використанні 1N NaOH для припинення реакції. Вільний ADH видаляли шляхом очистки на колонці Sephacryl S100HR (XK 16/40). Швидкість витікання фіксували на значення 60 мл/год., використовуючи при цьому 0,2M NaCI як буфер для елюювання. Зменшення розміру проводили шляхом обробки ультразвуком протягом 15 хвилин, що дозволяло проводити стерильну фільтрацію на фільтрі МіІІех (0,22 мкм). Злиття Токсоїд правця додавали до 5-10 мг дериватизованого полісахариду у 0,2M NaCI та значення рН доводили до рН 5,0 або рН 6,0 шляхом додання 0,5N HCI. EDAC розчиняли в 0,1M Трис буфері з рН 7,5, а потім додавали протягом періоду часу 10