Аналоги нейропептиду y, що містять щонайменше одну заміну на синтетичну амінокислоту

Реферат: Даний винахід стосується нових аналогів нейропептиду Y, фармацевтичних композицій, що містять їх, лікарських форм, що містять їх, а також способу лікування захворювань або станів, опосередкованих зв'язуванням рецептора нейропептиду Y. Більш конкретно, даний винахід пов'язаний з новими аналогами нейропептиду Y, що включають щонайменше одну амінокислотну заміну на неприродну амінокислоту, таку як 4Нур, в положенні 34, які селективно зв'язуються з нейропептидним рецептором підтипу Y1 в порівнянні з рецептором нейропептиду підтипу Y2. UA 101435 C2 (12) UA 101435 C2 UA 101435 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить до нових аналогів нейропептиду Y, фармацевтичних композицій, що містять їх, лікарським формам, що містять їх, а також способу лікування захворювань або станів, опосередкованих зв'язуванням рецептора нейропептиду Y. Більш конкретно, даний винахід стосується нових аналогів нейропептиду Y, що містять щонайменше одну амінокислотну заміну на неприродну амінокислоту, таку як 4Hyp, в положенні 34, які селективно зв'язуються з нейропептидним рецептором підтипу Y1 в порівнянні з нейропептидним рецептором підтипу Y2. Рівень техніки Нейропептид Y ("NPY"), пептидний нейромедіатор довжиною 36 амінокислот, є представником сімейства панкреатичних пептидів і має значну гомологію послідовності з панкреатичним поліпептидом і пептидом YY. Людський нейропептид Y ("hNPY") має послідовність: H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-ArgTyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 (SEQ ID NO:1). NPY був виявлений, виділений і секвенований з мозку свині і був названий "нейропептидом Y" внаслідок його виділення з нервової тканини і присутності тирозину як N- і С-кінцевої амінокислоти. NPY і інші представники його сімейства пептидів всі характеризуються третинною структурою, що складається з N-кінцевої поліпролінової спіралі і амфіфільної -спіралі, зв'язаної з -вигином, що утворює шпилькоподібну петлю, яку іноді називають "панкреатичним поліпептидним укладанням". Спіралі утримуються разом гідрофобними взаємодіями. Амідований С-кінець виступає з петлі шпильки. Услід за своїм відкриттям, NPY ідентифікували як найбільш поширений пептид в центральній нервовій системі, з широкою поширеністю, що включає кору головного мозку, стовбур мозку, гіпокамп, гіпоталамус, мигдалевидне тіло і таламус, а також присутній в периферичній нервовій системі в симпатичних нейронах і хромафінних клітинах надниркових залоз. Очевидно, NPY відповідає головним критеріям нейромедіатора, оскільки він нагромаджується в синаптичних гранулах, вивільняється при електричній стимуляції нервів і діє в специфічних рецепторах. Очевидно, що NPY сам по собі є важливим месенджером, ймовірно в мозку, де NPY потужно інгібує активність аденілатциклази і спричиняє підвищення внутрішньоклітинних рівнів кальцію. Внутрішньомозкова ін'єкція NPY викликає зміни кров'яного тиску, підвищення споживання їжі, збільшення накопичення жиру, підвищення рівня цукру і інсуліну в крові, зниження рухової активності, зниження температури тіла і каталепсію. Ймовірно, NPY взаємодіє з сімейством близькоспоріднених рецепторів. Вказані рецептори загалом розділяють на декілька підтипів на основі здатності різних тканин і рецепторів зв'язувати різні фрагменти нейропептиду Y і близькоспорідненого PYY. Рецептор підтипу Y1 ("рецептор NPY-Y1"), очевидно, є головним судинним рецептором NPY. Рецептор підтипу Y2 ("рецептор NPY-Y2") також може зустрічатися постсинаптично на гладких м'язах судин. Рецептор підтипу Y3 ("рецептор NPY-Y3"), ймовірно, є NPY-специфічним, не зв'язуючи при цьому PYY. Даний рецептор, можливо, присутній серед інших областей в тканинах надниркових залоз, кістковому мозку, серці і стовбурі мозку. Як огляд щодо нейропептиду Y і рецепторів нейропептиду Y, див., наприклад, C. Wahlestedt and D. Reis, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 33:309-352 (1993). В публікації за Договором про патентну кооперацію (PCT) WO 95/00161 описаний ряд антагоністів і агоністів NPY для регуляції біологічної активності, таких як ожиріння і серцево-судинна функція. У європейському патенті 0759441 і патенті США 5576337 указано, що фізіологічні порушення, пов'язані з надлишком нейропептиду Y, включають: порушення або захворювання, що стосуються серця, кровоносних судин або ниркової системи, такі як спазм судин, серцева недостатність, шок, гіпертрофія серця, підвищений кров'яний тиск, стенокардія, інфаркт міокарда, раптова серцева смерть, аритмія, хвороба периферичних судин і ниркові порушення, такі як порушення циркуляції рідини, порушення масообміну або ниркова недостатність; стани, пов'язані з підвищеною активністю симпатичного нерва, наприклад, під час або після операції на коронарних артеріях, а також впливів і операцій в шлунково-кишковому тракті; хвороби мозку і захворювання, пов'язані з центральною нервовою системою, такі як церебральний інфаркт, нейродегенерація, епілепсія, інсульт, і стани, пов'язані з інсультом, спазмом судин і крововиливом в мозку, депресією, тривогою, шизофренією і деменцією; стани, пов'язані з болем або ноцицепцією; захворювання, пов'язані з патологічною моторикою і секрецією шлунковокишкового тракту, такі як різні форми непрохідності кишечнику, нетримання сечі і хвороба Крона; порушення, пов'язані з патологією споживання напоїв і їжі, такі як анорексія і метаболічні порушення; захворювання, пов'язані з статевою дисфункцією і репродуктивними порушеннями; 1 UA 101435 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стани або порушення, пов'язані із запаленням; респіраторні захворювання, такі як астма і стани, пов'язані з астмою і бронхоспазмом; а також захворювання, пов'язані з аномальною секрецією гормонів, такі як лютеїнізуючий гормон, гормон росту, інсулін і пролактин. У публікації PCT WO 02/43776 (Reubi) описане застосування сполук, які зв'язують рецептор NPY-Y1, для приготування фармацевтичної композиції для діагностики або лікування пухлин, що експресують рецептор NPY-Y1, зокрема рак молочної залози, рак яєчників і гліобластоми. Існують численні патенти і патентні публікації, в яких розкриті деякі аналоги NPY і їх застосування, такі як патент США 5026685, патент США 5328899, патент США 6511984, публікація PCT WO 02/43776, публікація PCT WO2007/039318 і т.д. Незважаючи на вищесказане, зберігається потреба в аналогах NPY, що мають поліпшені активність і/або селективність, і/або in vivo або in vitro характеристики. Суть винаходу В одному аспекті, даний винахід надає пептидні варіанти hNPY наступної формули (I) (SEQ ID NO:2): 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 (R R )-A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A2 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 1 A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -A -R (I) в якій: 1 1 2 3 4 5 4 5 A являє собою Tyr, (X , X , X , X , X )Phe або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-С(О); 2 A являє собою Pro, 3Hyp, цис-3Hyp, 4Hyp або цис-4Hyp; 3 4 5 A являє собою Ser, Abu, Aib, Ala, Thr або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-С(О); 4 4 5 A являє собою Lys, Arg, hArg, Dab, Dap, Orn або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-С(О); 5 A являє собою Pro, 3Hyp, цис-3Hyp, 4Hyp або цис-4Hyp; 6 4 5 A являє собою Asp, Aib, Asn, Gln, Glu або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-С(О); 7 4 5 A являє собою Asn, Aib, Gln або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-С(О); 8 A являє собою Pro, 3Hyp, цис-3Hyp, 4Hyp або цис-4Hyp; 9 4 5 A являє собою Gly, Aib або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 10 4 5 A являє собою Glu, Aib, Asn, Asp, Gln або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 11 4 5 A являє собою Asp, Aib, Asn, Gln, Glu або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 12 4 5 A являє собою Ala, Abu, Aib, Nva, Val або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 13 A являє собою Pro, 3Hyp, цис-3Hyp, 4Hyp або цис-4Hyp; 14 4 5 A являє собою Ala, Abu, Aib, Nva, Val або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 15 4 5 A являє собою Glu, Aib, Asn, Asp, Gln або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 16 4 5 A являє собою Asp, Aib, Asn, Gln, Glu або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 17 A являє собою Met, Acc, Aib, Cha, Ile, Leu, hLeu, Nle, Nva, Tle, Val або HN-CH((CH2)n4 5 N(R R ))-C(O); 18 4 5 A являє собою Ala, Abu, Aib, Nva, Val або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 19 4 5 A являє собою Arg, hArg, Apc, Dab, Dap, Lys, Orn або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 20 1 2 3 4 5 4 5 A являє собою Tyr, (X ,X ,X ,X ,X )Phe або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 21 1 2 3 4 5 4 5 A являє собою Tyr, (X ,X ,X ,X ,X )Phe або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 22 4 5 A являє собою Ser, Abu, Aib, Ala, Thr або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 23 4 5 A являє собою Ala, Abu, Aib, Nva, Val або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 24 4 5 A являє собою Leu, Acc, Cha, Ile, hLeu, Nle, Nva, Tle, Val або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 25 4 5 A являє собою Arg, hArg, Dab, Dap, Lys, Orn або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 26 4 5 A являє собою His, 2Pal, 3Pal, 4Pal або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 27 1 2 3 4 5 4 5 A являє собою Tyr, (X ,X ,X ,X ,X )Phe або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 28 4 5 A являє собою Ile, Acc, Cha, Leu, hLeu, Nle, Nva, Tle, Val або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 29 4 5 A являє собою Asn, Aib, Gln або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 30 4 5 A являє собою Leu, Acc, Cha, Ile, hLeu, Nle, Nva, Tle, Val або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 31 4 5 A являє собою Ile, Acc, Cha, Leu, hLeu, Nle, Nva, Tle, Val або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 32 4 5 A являє собою Thr, Aib, Ser або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 33 4 5 A являє собою Arg, hArg, Dab, Dap, Lys, Orn або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 34 A являє собою Gln, Asn, Dhp, 3Hyp, цис-3Hyp, 4Hyp, цис-4Hyp, Inp, Ktp, Nip, Oic, hPro, Tic 4 5 або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 35 A являє собою Arg, Aic, Ape, hArg, Dab, Dap, Lys, Orn, NH 2Phe, NH2CH2Phe або HN4 5 CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 36 1 2 3 4 5 4 5 A являє собою Tyr, Aic, (X ,X ,X ,X ,X )Phe або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 37 4 5 A являє собою HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O) або відсутній; 1 6 7 6 R являє собою OH, NH2, (C1-30)алкокси або NH-X -CH2-X , де X являє собою (C1-40)алкіл або 7 (C2-40)алкеніл, і де X являє собою Н, OH, CO2H або С(О)-NH2; 2 UA 101435 C2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3 кожний з R і R , незалежно в кожному випадку, вибраний з групи, що складається з Н, (C 130)алкілу, (C1-30)гетероалкілу, (C1-30)ацилу, (C2-30)алкенілу, (C2-30)алкінілу, арил(C1-30)алкілу, арил(C1-30)ацилу, заміщеного (C1-30)алкілу, заміщеного (C1-30)гетероалкілу, заміщеного (C230)ацилу, заміщеного (C2-30)алкенілу, заміщеного (C2-30)алкінілу, заміщеного арил(C1-30)алкілу і заміщеного арил(C1-30)ацилу; 2 за умови, що коли R являє собою (C1-30)ацил, арил(C1-30)ацил, заміщений (C2-30)ацил або 3 заміщений арил(C1-30)ацил, R являє собою Н, (C1-30)алкіл, (C1-30)гетероалкіл, (C2-30)алкеніл, (C230)алкініл, арил(C1-30)алкіл, заміщений (C1-30)алкіл, заміщений (C1-30)гетероалкіл, заміщений (C 230)алкеніл, заміщений (C2-30)алкініл або заміщений арил(C1-30)алкіл; 4 5 кожний з R і R , незалежно в кожному випадку, являє собою Н, (C1-40)алкіл, (C1(C1-40)ацил, (C2-40)алкеніл, (C2-40)алкініл, арил(C1-40)алкіл, арил(C1-40)ацил, 40)гетероалкіл, заміщений (C1-40)алкіл, заміщений (C1-40)гетероалкіл, заміщений (C1-40)ацил, заміщений (C240)алкеніл, заміщений (C2-40)алкініл, заміщений арил(C1-40)алкіл, заміщений арил(C1-40)ацил, (C14 40)алкілсульфоніл або С(NH)-NH2, коли R являє собою (C1-40)ацил, арил(C1-40)ацил, заміщений 5 (C1-40)ацил, заміщений арил(C1-40)ацил, (C1-40)алкілсульфоніл або С(NH)-NH2, тоді R являє собою Н або (C1-C40)алкіл, (C1-40)гетероалкіл, (C2-40)алкеніл, (C2-40)алкініл, арил(C1-40)алкіл, заміщений (C1-40)алкіл, заміщений (C1-40)гетероалкіл, заміщений (C2-40)алкеніл, заміщений (C240)алкініл або заміщений арил(C1-40)алкіл; n, незалежно в кожному випадку, являє собою 1, 2, 3, 4 або 5; 1 2 3 4 5 кожний з X , X , X , X і X , незалежно в кожному випадку, являє собою Н, F, Cl, Br, I, (C 110)алкіл, заміщений (C 1-10)алкіл, арил, заміщений арил, О, CH2NH2, NH2, NO2 або CN; і за умови, що сполука містить щонайменше одну заміну на неприродну амінокислоту. Підгрупою (IA) сполук, що охоплюються вищезгаданою формулою I, є сполуки, в яких: 1 A являє собою Tyr; 2 A являє собою Pro; 3 A являє собою Ser або Aib; 4 A являє собою Lys; 5 A являє собою Pro; 6 A являє собою Asp або Aib; 7 A являє собою Asn або Aib; 8 A являє собою Pro; 9 A являє собою Gly або Aib; 10 A являє собою Glu або Aib; 11 A являє собою Asp або Aib; 12 A являє собою Ala або Aib; 13 A являє собою Pro; 14 A являє собою Ala або Aib; 15 A являє собою Glu або Aib; 16 A являє собою Asp або Aib; 17 A являє собою Met, A6c, Aib або Nle; 18 A являє собою Ala або Aib; 19 A являє собою Arg; 20 A являє собою Tyr; 21 A являє собою Tyr; 22 A являє собою Ser або Aib; 23 A являє собою Ala або Aib; 24 A являє собою Leu або A6c; 25 A являє собою Arg; 26 A являє собою His; 27 A являє собою Tyr; 28 A являє собою Ile або A6c; 29 A являє собою Asn або Aib; 30 A являє собою Leu або A6c; 31 A являє собою Ile, A6c або Leu; 32 A являє собою Thr або Aib; 33 A являє собою Arg; 34 4 5 A являє собою Dhp, 4Hyp, Inp, Nip, hPro, Tic або HN-CH((CH2)n-N(R R ))-C(O); 35 A являє собою Arg, Apc, Lys, 4NH2Phe або 4NH2CH2Phe; 36 A являє собою Tyr або Aic; 37 A відсутній; 3 UA 101435 C2 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 R являє собою NH2; 2 3 кожний з R і R , незалежно в кожному випадку, являє собою Н або (C1-30)ацил; 2 3 за умови, що коли R являє собою (C1-30)ацил, R являє собою Н; 4 5 кожний з R і R , незалежно в кожному випадку, являє собою Н або (C1-40)ацил; n дорівнює 4; і 1 2 3 4 5 кожний з X , X , X , X і X , незалежно в кожному випадку, являє собою Н, CH2NH2 або NH2. 35 36 У формулі (I) або підгрупі (IA) пептидний зв'язок між A і A може бути замінений 35 36 псевдопептидним зв'язком, де A -A може бути Lys-ψ(CH2-NH)Tyr або Lys-ψ(CH2-N(Ac))Tyr. 34 У формулі (I) або підгрупі (IA) A переважно являє собою 4Hyp. 4 5 ε У формулі (I) або підгрупі (IA) HN-CH((CH2)n-N(R R ))-С(О) переважно являє собою Lys(N C(O)-(CH2)12-CH3). Переважними сполуками формули (I) або підгрупи (IA) є наступні сполуки: 10 34 Приклад 1: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:3); 17 34 Приклад 2: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:4); 11,17 34 Приклад 3: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:5); 34 Приклад 4: [4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:6); 22 34 Приклад 5: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:7); 31 34 Приклад 6: [A6c , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:8); 30 34 Приклад 7: [A6c , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:9); 28 34 Приклад 8: [A6c , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:10); 3 34 Приклад 9: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:11); 24 34 Приклад 10: [A6c , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:12); 6 34 Приклад 11: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:13); 18 34 Приклад 12: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:14); 29 34 Приклад 13: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:15); 32 34 Приклад 14: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:16); 23 34 Приклад 15: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:17); 17 34 Приклад 16: [A6c , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:18); 11 34 Приклад 17: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:19); 12 34 Приклад 18: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:20); 14 34 Приклад 19: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:21); 15 34 Приклад 20: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:22); 16 34 Приклад 21: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:23); 7 34 Приклад 22: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO: 24); 9 34 Приклад 23: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:25); 10,17 34 Приклад 24: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:26); 15,17 34 Приклад 25: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:27); 11,15 17 34 Приклад 26: [Aib , Nle , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:28); 10,15 17 34 Приклад 27: [Aib , Nle , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:29); 11,15,17 34 Приклад 28: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:30); 12,15,17 34 Приклад 29: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:31); 10,15,17 34 Приклад 30: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:32); 11,16 34 Приклад 31: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:33); 10,16 34 Приклад 32: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:34); 11,17 34 35 36 Приклад 33: [Aib , 4Hyp , Lys -ψ(CH2-N(Ac))Tyr ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:35); 17 34 35 Приклад 34: [Aib , 4Hyp , Apc ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:36); 17 34 36 Приклад 35: [Aib , 4Hyp , Aic ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:37); 17 34 35 Приклад 36: [Aib , 4Hyp , 4NH2Phe ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:38); 17 34 35 Приклад 37: [Aib , 4Hyp , 4NH2CH2Phe ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:39); 17 34 35 36 Приклад 38: [Aib , 4Hyp , Lys -ψ(CH2-NH)Tyr ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:40); 11,17 34 35 36 Приклад 39: [Aib , 4Hyp , Lys -ψ(CH2-NH)Tyr ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:41); 34 Приклад 40: [Nip ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:42); 34 Приклад 41: [Inp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:43); 34 Приклад42: [Dhp ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:44); 34 Приклад 43: [hPro ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:45); 34 Приклад 44: [Tic ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:46) и 31 34 ε Приклад 45: [Leu ,Lys (N -C(O)-(CH2)12-CH3)]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:47). 4 UA 101435 C2 5 10 15 Докладний опис винаходу Термін "амінокислота", що використовується в даній заявці, стосується будь-якої природної або неприродної амінокислоти, включаючи, крім іншого, -амінокислоти, -амінокислоти або амінокислоти, яка також може бути D- або L-амінокислотою, якщо не вказане інше. За винятком N-кінцевої амінокислоти, всі скорочення амінокислот (наприклад, Ala) в даному описі мають структуру -NH-C(R)(R')-CО-, де всі R і R', незалежно, є воднем або боковим ланцюгом амінокислоти (наприклад, у випадку Ala R=CH 3, а R'=Н), або R і R' можуть бути сполучені з формуванням кільцевої системи. У випадку N-кінцевої амінокислоти скорочення 2 3 2 3 означає структуру (R R )-N-C(R)(R')-СО-, де R і R мають значення, визначене в формулі (I). Пептид даного винаходу також позначається згідно з іншим форматом, наприклад, 34 [Pro ]hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:48), причому заміщені амінокислоти в природній послідовності вказані в квадратних дужках, наприклад, Pro замість Gln в hNPY. Позначення "NH2" в hNPY(1-36)-NH2 (SEQ ID NO:1) вказує, що С-кінець пептиду амідований, тоді як hNPY(136)-OH (SEQ ID NO:49) означає форму вільної кислоти. Наступний перелік деяких скорочень, що використовуються в даній заявці, представлений для простоти пошуку, проте, будь-яке скорочення, що використовується, але не визначене в даній заявці, не використовується в суперечності з його загальновизнаними значеннями. Abu Acc Adc Ado Ahp Ahx Aib Aic Ala або А Anc Aoc Apc Apn Arg або R hArg Asn або N Asp або D Aun Cha Cys або С Dab Dap Dhp Dmt Gaba Gln або Q Glu або Е Gly або G His або Н 3Hyp -аміномасляна кислота 1-аміно-1-цикло(C3-9)алкілкарбонова кислота, де A3c означає 1-аміно-1-циклопропанкарбонову кислоту; A4c означає 1-аміно-1-циклобутанкарбонову кислоту; A5c означає 1-аміно-1-циклопентанкарбонову кислоту; і A6c означає 1-аміно-1-циклогексанкарбонову кислоту 10-амінодеканова кислота 12-амінододеканова кислота 7-аміногептанова кислота 6-аміногексанова кислота α-аміноізомасляна кислота 2-аміноіндан-2-карбонова кислота аланін 9-амінононанова кислота 8-амінооктанова кислота 4-аміно-4-карбоксипіперидин, представлений структурною формулою: , в якій паралельні лінії "=" означають положення приєднання молекули до іншої молекули або послідовності. 5-амінопентанова кислота аргінін гомоаргінін аспарагін аспарагінова кислота 11-аміноундеканова кислота -циклогексилаланін цистеїн 2,4-діаміномасляна кислота 2,3-діамінопропіонова кислота 3,4-дегідропролін 5,5-диметилтіазолідин-4-карбонова кислота 4-аміномасляна кислота глутамін глутамінова кислота гліцин гістидин транс-3-гідрокси-L-пролін, тобто, (2S, 3S)-3-гідроксипіролідин-2-карбонова кислота 5 UA 101435 C2 цис-3Hyp цис-3-гідрокси-L-пролін, тобто, (2S, 3R)-3-гідроксипіролідин-2-карбонова кислота 4Hyp 4-гідроксипролін, тобто, (2S, 4R)-4-гідроксипіролідин-2-карбонова кислота цис-4Hyp цис-4-гідрокси-L-пролін, тобто, (2S, 4S)-4-гідроксипіролідин-2-карбонова кислота Ile або I ізолейцин Inc індолін-2-карбонова кислота Inp ізоніпекотова кислота Ktp 4-кетопролін Leu або L лейцин hLeu гомолейцин Lys або K лізин Met або М метіонін Nip ніпекотова кислота Nle норлейцин вказує, що група в круглих дужках приєднана до епсилон-атома азоту бокового N ланцюга Lys Nva норвалін Oic октагідроіндол-2-карбонова кислота Orn орнітин 2-Pal -(2-піридил)аланін 3-Pal -(3-піридил)аланін 4-Pal -(4-піридил)аланін Phe або F фенілаланін hPhe гомофенілаланін 4NH2CH2Phe 4-амінометилфенілаланін 4NH2Phe 4-амінофенілаланін Pro або Р пролін hPro гомопролін Sar саркозин або N-метилгліцин Ser або S серин Thr або Т треонін Tic 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-3-карбонова кислота Tle трет-лейцин Val або V валін Деякі інші скорочення, що використовуються в даному описі, визначені таким чином: Ac ацетил Aloc алілоксикарбоніл Boc трет-бутилоксикарбоніл Bhoc бензгідрилоксикарбоніл BSA бичачий сироватковий альбумін Bzl бензил DCM дихлорметан Dde 1-(4,4-диметил-2,6-діоксоциклогекс-1-илідин)етил DIC N, N-діізопропілкарбодіімід DIEA діізопропілетиламін Dmab 4-{N-(1-(4,4-диметил-2,6-діоксоциклогексиліден)-3-метилбутил)аміно}бензил DMAP 4-(диметиламіно)піридин ДМФА диметилформамід DNP 2,4-динітрофеніл EMEM мінімальне підтримуюче середовище Ігла Et етил Fmoc флуоренілметилоксикарбоніл HATU гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію HBTU гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію cHex циклогексил HOAT гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію HOBt 1-гідроксибензотриазол ВЕРХ високоефективна рідинна хроматографія MBHA 4-метилбензгідриламін 6 UA 101435 C2 Mmt 4-метокситритил NMP N-метил-2-піролідинон Pbf 2,2,4,6,7-пентаметилдигідробензофуран-5-сульфоніл tBu трет-бутил TIS триізопропілсилан TOS тозил Trt тритил ТФО трифтороцтова кислота TFFH гексафторфосфат тетраметилфторфорамідинію Lys-ψ(CH2-NH)Tyr має структуру: 5 10 15 20 25 30 35 40 Грецька буква псі "ψ" використовується в даній заявці для позначення того, що пептидний зв'язок був замінений псевдопептидним зв'язком. При позначенні амінокислотної послідовності термін ψ використовується в форматі А-ψ(Х-Х')-В, де А являє собою аміноацильний радикал, карбонільна група якого була модифікована до Х, а В являє собою аміноацильний радикал, аміногрупа якого була модифікована до Х'. Х і Х' показані у вигляді послідовностей символів елементів, розділених зв'язком, наприклад, Lys-ψ(CH2-NH)-Tyr. "Алкіл" стосується вуглеводневої групи, що містить один або декілька атомів вуглецю, в якій деяка кількість атомів вуглецю, якщо такі присутні, сполучені одинарними зв'язками, приклади яких включають, крім іншого, метил, етил, пропіл і бутил. Алкільна вуглеводнева група може бути лінійною або містити один або декілька бокових ланцюгів або циклічних груп, приклади яких включають, крім іншого, ізопропіл і трет-бутил. "Заміщений алкіл" стосується алкілу, в якому один або декілька атомів водню вуглеводневої групи заміщені одним або декількома замісниками, вибраними з групи, що складається з галогену (наприклад, фтору, хлору, брому або йоду), OH, CN, SH, NH2, NHCH3, NO2, (C1-2)алкілу, заміщеного 1-6 атомами галогену, CF3, OCH3, OCF3 і (СН2)0-4-СООН. У різних варіантах здійснення присутні 1, 2, 3 або 4 замісники. Присутність (СН 2)0-4-СООН приводить до утворення алкілвмісної кислоти. Приклади алкілвмісних кислот, що містять (СН2)0-4-СООН, включають, крім іншого, 2-норборнаноцтову кислоту, трет-масляну кислоту і 3-циклопентилпропіонову кислоту. "Гетероалкіл" стосується алкілу, в якому один або декілька атомів вуглецю у вуглеводневій групі заміщені одним або декількома з наступних атомів або груп: аміно, амідо, О, S, N або карбоніл. У різних варіантах здійснення присутні 1 або 2 гетероатоми. "Заміщений гетероалкіл" стосується гетероалкілу, в якому один або декілька атомів водню вуглеводневої групи заміщені одним або декількома замісниками, вибраними з групи, що складається з галогену (тобто фтору, хлору, брому і йоду), OH, CN, SH, NH 2, NHCH3, NO2, (C12)алкілу, заміщеного 1-6 атомами галогену, CF3, OCH3, OCF3 і (СН2)0-4-СООН. У різних варіантах здійснення присутні 1, 2, 3 або 4 замісники. "Алкеніл" стосується вуглеводневої групи, що складається з двох або більше атомів вуглецю, в якій присутній один або декілька подвійних вуглець-вуглецевих зв'язків, приклади якої включають, крім іншого, вініл, аліл, бутеніл і пропеніл. Алкенільна вуглеводнева група може бути лінійною або містити один або декілька бокових ланцюгів або циклічних груп, приклади яких включають, крім іншого, н-бутеніл або т-бутеніл, і н-пентеніл або циклопентеніл. "Заміщений алкеніл" стосується алкенілу, в якому один або декілька атомів водню заміщені одним або декількома замісниками, вибраними з групи, що складається з галогену (тобто фтору, хлору, брому і йоду), OH, CN, SH, NH2, NHCH3, NO2, (C1-2)алкілу, заміщеного 1-6 атомами галогену, CF3, OCH3, OCF3 і (СН2)0-4-СООН. У різних варіантах здійснення присутні 1, 2, 3 або 4 замісники. "Арил" стосується необов'язково заміщеної ароматичної групи щонайменше з одним кільцем, що має кон'юговану -електронну систему, що містить до двох кон'югованих або конденсованих кільцевих систем. Арил включає, крім іншого, карбоциклічну арильну, гетероциклічну арильну і біарильну групи. Переважно, арил є 5- або 6-членним кільцем. Переважні атоми для гетероциклічного арилу включають, крім іншого, один або декілька атомів 7 UA 101435 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сірки, кисню і азоту. Приклади арилу включають, крім іншого, феніл, 1-нафтил, 2-нафтил, індол, хінолін, 2-імідазол і 9-антрацен. Замісники арилу вибрані з групи, що складається з (С 1-4)алкілу, (С1-4)алкокси, галогену (тобто фтору, хлору, брому і йоду), OH, CN, SH, NH2, NO2, (C1-2)алкілу, заміщеного 1-5 атомами галогену, CF3, OCF3 і (СН2)0-4-СООН. У різних варіантах здійснення присутні 1, 2, 3 або 4 замісники. "Алкіларил" означає "алкіл", приєднаний до "арилу", як визначено вище. Термін "циклоалкіл" включає моноциклоалкільну групу або біциклоалкільну групу з вказаною кількістю атомів вуглецю, відомі фахівцям в даній галузі. Термін "гетероцикл" включає в себе моноциклічні і біциклічні системи, що містять один або декілька гетероатомів, таких як атоми кисню, азоту і/або сірки. Вказані кільцеві системи можуть бути ароматичними, такими як, наприклад, піридин, індол, хінолін, піримідин, тіофен (також відомий як тієніл), фуран, бензотіофен, тетразол, дигідроіндол, індазол, N-форміліндол, бензімідазол, тіазол і тіадіазол. Вказані кільцеві системи також можуть бути неароматичними, такими як, наприклад, піролідин, піперидин, морфолін і т.п. Синтез Сполуки даного винаходу можуть бути, і були отримані із застосуванням методик, розкритих в даних прикладах, а так само методик, відомих з рівня техніки. Наприклад, поліпептидна область аналога NPY може бути хімічно або біохімічно синтезована і/або модифікована. Див., наприклад, Stewart, J. M., et al., Solid Phase Synthesis, Pierce Chemical Co., 2-ге вид. (1984); а також див., наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning, А Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) з приводу прикладів методик біохімічного синтезу, що включає введення нуклеїнової кислоти в клітину і експресію нуклеїнових кислот. Приклади наводяться з метою ілюстрації і не повинні розглядатися як обмеження об'єму даного винаходу яким-небудь чином. 10 34 Приклад 1: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 Вказаний в заголовку пептид синтезували з використанням Fmoc-хімії. С-кінцеву частину пептиду (залишки 18-36) синтезували на пептидному синтезаторі ABI 433 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) в масштабі 1,0 ммоль. У реакційну ямку вносили 1,37 г 0,73 ммоль/смоли Rink Amide MBHA (Novabiochem, San Diego, CA, USA). Потім смолу обробляли 10 мл NMP протягом 15 хвилин до набухання смоли. При синтезі пептиду використовували методику ABI ® FastMoc 1,0 . Кожний цикл складався із зняття N-кінцевих Fmoc-груп з використанням 20 % піперидину з подальшим ретельним промиванням в NMP. Потім заздалегідь заряджені 1,0 ммоль картриджі з кожною амінокислотою розчиняли в 0,45 M HOBT/HBTU. Після закінчення достатнього часу для розчинення амінокислоти, її автоматично переносили в активаційну ямку. Ще два 1,0 ммоль картриджі з амінокислотою розчиняли і переносили в активаційну ямку з використанням, таким чином, загалом 3 еквівалентів амінокислоти в стадії приєднання. Потім в активаційну ямку вносили 3 мл 2 M розчину DIPEA, загалом до 6 екв. DIPEA. Потім всю отриману суміш наносили на смолу і проводили перемішування протягом 15 хвилин. Реакційну ямку звільняли, промивали NMP, і потім проводили другу стадію приєднання. Після другої стадії приєднання смолу знов ретельно промивали. Кожну подальшу амінокислоту приєднували аналогічним способом. Після стадії приєднання першого залишку Tyr, в кожній з наступних 4 стадій приєднання, а також в кожній стадії приєднання Arg, смолу блокували 5 мл блокуючого розчину (0,5 M оцтовий ангідрид/0,13 M DIPEA/0,01 M HOBT) для захисту неацильованих груп смоли. У стадіях приєднання використовували наступні амінокислотні картриджі: Цикл 1) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 2) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 3) Fmoc-4Hyp-OH; Цикл 4) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 5) Fmoc-Thr(tBu)-OH; Цикл 6) Fmoc-Ile-OH; Цикл 7) Fmoc-Leu-OH; Цикл 8) Fmoc-Asn(Trt)-OH; Цикл 9) Fmoc-Ile-OH; Цикл 10) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 11) FmocHis(Trt)-OH; Цикл 12) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 13) Fmoc-Leu-OH; Цикл 14) Fmoc-Ala-OH; Цикл 15) Fmoc-Ser(tBu)-OH; Цикл 16) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 17) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 18) FmocArg(Pbf)-OH; і Цикл 19) Fmoc-Ala-OH. Після останньої стадії приєднання смолу промивали NMP, після чого проводили стандартне зняття N-кінцевої Fmoc-групи з подальшим промиванням NMP і потім DCM. Після збирання С-кінцевої частини пептидного скелету (залишки 18-36) для синтезу Nкінцевої частини пептиду використали тільки одну десяту частину смоли (0,1 ммоль), а іншу смолу зберегли. N-кінцеву частину вказаного в заголовку пептиду (залишки 1-17) синтезували з використанням Fmoc-хімії при допомозі НВЧ на пептидному синтезаторі Liberty (CEM, Matthews, NC, USA) в масштабі 0,1 ммоль. Смолу з попереднього синтезу вміщували в конічну пробірку об'ємом 50 мл разом з 15 мл ДМФА і вводили в положення смоли на синтезаторі. Потім смолу кількісно переносили в реакційну ямку за допомогою автоматизованого процесу. 8 UA 101435 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використовували стандартну методику синтезу Liberty для синтезу в масштабі 0,1 ммоль. Дана методика включає зняття N-кінцевої Fmoc-групи шляхом первинної обробки 7 мл 20 % піперидину, що містить 0,1 M HOBT, в ДМФА. Початкову стадію зняття захисту проводили протягом 30 секунд при НВЧ-опроміненні (45 ват, максимальна температура 75 °C) і барботуванні азотом (цикл 3 секунди/з перервою 7 секунд). Потім реакційну ямку звільняли і проводили другу обробку піперидином, ідентичну першій обробці, за винятком того, що її тривалість становила 3 хвилини. Потім зі смоли видаляли піперидин і ретельно промивали декілька разів ДМФА. Потім додавали захищену амінокислоту, Fmoc-Met-OH (2,5 мл, 5 еквівалентів), отриману у вигляді 0,2 M стокового розчину в ДМФА, з подальшим додаванням 1,0 мл 0,45 M (4,5 екв.) HBTU в ДМФА. Потім додавали 0,5 мл 2 M (10 екв.) DIPEA в NMP. Стадію приєднання проводили протягом 5 хвилин при використанні НВЧ-випромінювання потужністю 20 ват, при максимальній температурі 75 °C, і аналогічного режиму барботування азотом. Після першої стадії приєднання реакційну ямку звільняли від рідкої фази і повторювали стадію приєднання. Потім аналогічно Циклу 1 ініціювали Цикл 2. Всі амінокислоти вводили аналогічним чином, і в ході синтезу всієї послідовності використовували стратегію подвійного приєднання. Приєднання залишків 9-10 (Gly-Aib) включало застосування методики блокування безпосередньо після стадії приєднання. Блокування проводили, додаючи 7 мл 0,5 M оцтового ангідриду, що містить 0,015 M HOBT в NMP, разом з 2 мл 2 M розчину DIPEA, при використанні багатостадійної методики з обробкою НВЧ: потужність 50 ват протягом 30 секунд (максимальна температура 65 °C), з подальшим вимкненням НВЧ-випромінювання на 30 секунд, потім другий раунд обробки НВЧ-випромінюванням протягом 30 секунд (50 ват), а потім знов вимкнення НВЧ-випромінювання на 30 секунд. Після цього зі смоли видаляли рідку фазу і повністю промивали смолу ДМФА. Використовували наступні амінокислоти (Advanced Chemtech, Louisville, KY, USA): Цикл 20) Fmoc-Met-OH; Цикл 21) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Цикл 22) FmocGlu(OtBu)-OH; Цикл 23) Fmoc-Ala-OH; Цикл 24) Fmoc-Pro-OH; Цикл 25) Fmoc-Ala-OH; Цикл 26) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Цикл 27) Fmoc-Aib-OH; Цикл 28) Fmoc-Gly-OH; Цикл 29) Fmoc-Pro-OH; Цикл 30) Fmoc-Asn(Trt)-OH; Цикл 31) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Цикл 32) Fmoc-Pro-OH; Цикл 33) Fmoc-Lys(Boc)-OH; Цикл 34) Fmoc-Ser(tBu)-OH; Цикл 35) Fmoc-Pro-OH; Цикл 36) Fmoc-Tyr(tBu)OH. Після того як пептидний скелет повністю синтезували, стандартну обробку піперидином використовували для видалення N-кінцевої Fmoc-групи при використанні стандартної методики зняття захисту, описаної вище. Потім смолу ретельно промивали ДМФА, після чого переносили назад в конічну пробірку об'ємом 50 мл, використовуючи ДМФА як розчинник для перенесення. З пептиду знімали захисні групи і від'єднувати від смоли за допомогою обробки 5 мл наступного реагенту: 5 % TIS, 2 % води, 5 % (мас./об.) DTT і 88 % ТФО, з подальшим перемішуванням протягом 3,5 годин. Фільтрат збирали в 45 мл холодного безводного діетилового ефіру. Тверду фазу осаджували протягом 10 хвилин при 3500 об./хв. в центрифузі, що охолоджується. Ефір видаляли з осаду і пептид ресуспендували в новій порції ефіру. Обробку ефіром проводили в цілому 2 рази. Після останнього промивання ефіром пептид залишали на повітрі для видалення залишків ефіру. Осад пептиду ресуспендували в 8 мл ацетонітрилу, а потім в 8 мл деіонізованої води до повного розчинення. Далі розчин пептиду аналізували з допомогою мас-спектрометрії. Мас-спектрометричний аналіз з використанням іонізації електророзпиленням виявив основний продукт, що має масу 4212,1, що відповідало цільовому продукту. Аналіз з допомогою аналітичної ВЕРХ при використанні колонки C18 250×4,6 мм (Phenomenex, Torrance, CA, USA) з використанням градієнта ацетонітрилу 2-60 % (0,1 % ТФО) протягом 30 хвилин виявив основний продукт з чистотою 45 %. Потім неочищений пептид очищали з допомогою препаративної ВЕРХ на колонці C18 в зверненій фазі, використовуючи 10-60 % ацетонітрил (0,1 % ТФО) протягом 50 хвилин при швидкості потоку 10 мл/хв. Очищений продукт аналізували з допомогою ВЕРХ на предмет чистоти (>99 %) і з допомогою мас-спектрометрії (4212,8 Да), що показала хорошу відповідність експериментальної маси розрахунковій масі 4212,7. Потім пептид ліофілізували, отримавши внаслідок 39 мг очищеного продукту, що відповідає 9 % виходу. 17 34 Приклад 2: [Aib , 4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 Вказаний в заголовку пептид синтезували, використовуючи Fmoc-хімію. С-кінцеву частину пептиду (залишки 18-36) синтезували на пептидному синтезаторі ABI 433А (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) в масштабі 1,0 ммоль. У реакційну ямку вносили 1,37 г 0,73 ммоль/смоли Rink Amide MBHA (Novabiochem, San Diego, CA, USA). Потім смолу обробляли 10 мл NMP протягом 15 хвилин до набухання смоли. При синтезі пептиду використовували методику ABI FastMoc 1,0об. 9 UA 101435 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Кожний цикл складався із зняття N-кінцевих Fmoc-груп з використанням 20 % піперидину з подальшим ретельним промиванням в NMP. Потім заздалегідь заряджені 1,0 ммоль картриджі з кожною амінокислотою розчиняли в 0,45 M HOBT/HBTU. Після розчинення амінокислоти, її автоматично переносили в активаційну ямку. Ще два 1,0 ммоль картриджі з амінокислотою розчиняли і переносили в активаційну ямку з використанням, таким чином, в цілому 3 еквівалентів амінокислоти в стадії приєднання. Потім в активаційну ямку вносили 3 мл 2 M розчину DIPEA, в цілому до 6 екв. DIPEA. Потім всю отриману суміш наносили на смолу і проводили перемішування протягом 15 хвилин. Реакційну ямку звільняли, промивали NMP, і потім проводили другу стадію приєднання. Після другої стадії приєднання смолу знов ретельно промивали. Кожну наступну амінокислоту приєднували аналогічним способом. Після стадії приєднання першого залишку Tyr, в кожній з наступних чотирьох стадій приєднання, а також в кожній стадії приєднання Arg, смолу блокували 5 мл блокуючого розчину (0,5 M оцтовий ангідрид/0,13 M DIPEA/0,01 M HOBT) для захисту неацильованих груп смоли. У стадіях приєднання використовували наступні амінокислотні картриджі: Цикл 1) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 2) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 3) Fmoc4Hyp-OH; Цикл 4) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 5) Fmoc-Thr(tBu)-OH; Цикл 6) Fmoc-Ile-OH; Цикл 7) Fmoc-Leu-OH; Цикл 8) Fmoc-Asn(Trt)-OH; Цикл 9) Fmoc-Ile-OH; Цикл 10) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 11) Fmoc-His(Trt)-OH; Цикл 12) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 13) Fmoc-Leu-OH; Цикл 14) Fmoc-AlaOH; Цикл 15) Fmoc-Ser(tBu)-OH; Цикл 16) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 17) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 18) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; і Цикл 19) Fmoc-Ala-OH. Після останньої стадії приєднання смолу промивали NMP, після чого проводили стандартне зняття N-кінцевої Fmoc-групи з подальшим промиванням NMP і потім DCM. Після збирання Скінцевої частини пептидного скелета (залишки 18-36) для синтезу N-кінцевої частини пептиду використали одну десяту частину смоли (0,1 ммоль), а іншу смолу зберегли. N-кінцеву частину вказаного в заголовку пептиду (залишки 1-17) синтезували з використанням Fmoc-хімії при допомозі НВЧ на пептидному синтезаторі Liberty (CEM, Matthews, NC, USA) в масштабі 0,1 ммоль. Смолу з попереднього синтезу вміщували в конічну пробірку об'ємом 50 мл разом з 15 мл ДМФА і вводили в положення смоли на синтезаторі. Потім смолу кількісно переносили в реакційну ямку за допомогою автоматизованого процесу. Використовували стандартну методику синтезу Liberty для синтезу в масштабі 0,1 ммоль, що включає зняття N-кінцевої Fmoc-групи шляхом первинної обробки 7 мл 20 % піперидину, що містить 0,1 M HOBT, в ДМФА. Початкова стадія зняття захисту продовжувалася протягом 30 секунд при НВЧ-опроміненні (45 ват, максимальна температура 75 °C) і барботуванні азотом (цикл 3 секунди/з перервою 7 секунд). Потім реакційну ямку звільняли від рідкої фази і проводили другу обробку піперидином, ідентичну першій обробці, протягом 3 хвилин. Потім смолу осушували і ретельно промивали декілька разів ДМФА. Потім додавали захищену амінокислоту, Fmoc-Aib-OH (2,5 мл, 5 еквівалентів), отриману у вигляді 0,2 M стокового розчину в ДМФА, з подальшим додаванням 1,0 мл 0,45 M (4,5 екв.) HBTU в ДМФА. Потім додавали 0,5 мл 2 M (10 екв.) DIPEA в NMP. Стадію приєднання проводили протягом 5 хвилин при використанні НВЧ-випромінювання потужністю 20 ват, при максимальній температурі 75 °C, і аналогічного режиму барботування азотом. Після першої стадії приєднання реакційну ямку звільняли від рідкої фази і повторювали стадію приєднання. Потім ініціювали Цикл 2, аналогічний Циклу 1. Всі амінокислоти вводили аналогічним чином, і в ході синтезу всієї послідовності використали стратегію подвійного приєднання. Приєднання залишків 16-17 (Asp-Aib) включало застосування методики блокування безпосередньо після стадії приєднання. Блокування проводили, додаючи 7 мл 0,5 M оцтового ангідриду, що містить 0,015 M HOBT в NMP, разом з 2 мл 2 M розчину DIPEA, при використанні багатостадійної методики з обробкою НВЧ: потужність 50 ват протягом 30 секунд (максимальна температура 65 °C), з подальшим вимкненням НВЧ-випромінювання на 30 секунд, потім другий раунд обробки НВЧ-випромінюванням протягом 30 секунд (50 ват), а потім знов вимкнення НВЧвипромінювання на 30 секунд. Після цього смолу осушували і повністю промивали смолу ДМФА. Використовували наступні амінокислоти (Advanced Chemtech, Louisville, KY, USA): Цикл 20) Fmoc-Aib-OH; Цикл 21) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Цикл 22) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; Цикл 23) Fmoc-AlaOH; Цикл 24) Fmoc-Pro-OH; Цикл 25) Fmoc-Ala-OH; Цикл 26) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Цикл 27) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; Цикл 28) Fmoc-Gly-OH; Цикл 29) Fmoc-Pro-OH; Цикл 30) Fmoc-Asn(Trt)-OH; Цикл 31) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Цикл 32) Fmoc-Pro-OH; Цикл 33) Fmoc-Lys(Boc)-OH; Цикл 34) Fmoc-Ser(tBu)-OH; Цикл 35) Fmoc-Pro-OH; і Цикл 36) Fmoc-Tyr(tBu)-OH. Після того як пептидний скелет повністю синтезували, стандартну обробку піперидином використовували для видалення N-кінцевої Fmoc-групи при використанні стандартної методики 10 UA 101435 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зняття захисту, описаної вище. Потім смолу ретельно промивали ДМФА, після чого переносили назад в конічну пробірку об'ємом 50 мл, використовуючи ДМФА як розчинник для перенесення. З пептиду знімали захисні групи і від'єднували від смоли за допомогою обробки 5 мл наступного реагенту: 5 % TIS, 2 % води, 5 % (мас./об.) DTT і 88 % ТФО, з подальшим перемішуванням протягом 3,5 годин. Фільтрат збирали в 45 мл холодного безводного діетилового ефіру. Тверду фазу осаджували протягом 10 хвилин при 3500 об./хв. в центрифузі, що охолоджується. Ефір видаляли з осаду і пептид ресуспендували в новій порції ефіру. Обробку ефіром проводили в цілому 2 рази. Після останнього промивання ефіром пептид залишали на повітрі для видалення залишків ефіру. Осад пептиду ресуспендували в 8 мл ацетонітрилу, а потім в 8 мл деіонізованої води до повного розчинення. Далі розчин пептиду аналізували з допомогою мас-спектрометрії. Мас-спектрометричний аналіз з використанням іонізації електророзпиленням виявив основний продукт, що має масу 4210,8, що відповідало цільовому продукту. Аналіз з допомогою аналітичної ВЕРХ при використанні колонки C18 250×4,6 мм (Phenomenex, Torrance, CA, USA) з використанням градієнта ацетонітрилу 2-60 % (0,1 % ТФО) протягом 30 хвилин виявив основний продукт з чистотою 54 %. Потім неочищений пептид очищали з допомогою препаративної ВЕРХ на колонці C18 в зверненій фазі, використовуючи 10-60 % ацетонітрил (0,1 % ТФО) протягом 50 хвилин при швидкості потоку 10 мл/хв. Очищений продукт аналізували з допомогою ВЕРХ на предмет чистоти (>99 %) і з допомогою мас-спектрометрії (4210,6 Да), що показала хорошу відповідність експериментальної маси розрахунковій масі 4210,6. Потім пептид ліофілізували, отримавши в результаті 53 мг очищеного продукту, що відповідає 13 % виходу. 11,17 34 Приклад 3: [Aib ,4Hyp ]hNPY(1-36)-NH2 Вказаний в заголовку пептид синтезували, використовуючи Fmoc-хімію. С-кінцеву частину пептиду (залишки 18-36) синтезували на пептидному синтезаторі ABI 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) в масштабі 1,0 ммоль. У реакційну ямку вносили 1,37 г 0,73 ммоль/смоли Rink Amide MBHA (Novabiochem, San Diego, CA, USA). Потім смолу обробляли 10 мл NMP протягом 15 хвилин до набухання смоли. При синтезі пептиду використовували методику ABI ® FastMoc 1,0 . Кожний цикл складався із зняття N-кінцевих Fmoc-груп з використанням 20 % піперидину з подальшим ретельним промиванням в NMP. Потім заздалегідь заряджені 1,0 ммоль картриджі з кожною амінокислотою розчиняли в 0,45 M HOBT/HBTU. Після розчинення амінокислоти, її автоматично переносили в активаційну ямку. Ще два 1,0 ммоль картриджі з амінокислотою розчиняли і переносили в активаційну ямку з використанням, таким чином, в цілому 3 еквівалентів амінокислоти в стадії приєднання. Потім в активаційну ямку вносили 3 мл 2 M розчину DIPEA, в цілому до 6 екв. DIPEA. Потім всю отриману суміш наносили на смолу і проводили перемішування протягом 15 хвилин. Реакційну ямку звільняли, промивали NMP, і потім проводили другу стадію приєднання. Після другої стадії приєднання смолу знов ретельно промивали. Кожну подальшу амінокислоту приєднували аналогічним способом. Після стадії приєднання першого залишку Tyr, в кожній з наступних чотирьох стадій приєднання, а також в кожній стадії приєднання Arg, смолу блокували 5 мл блокуючого розчину (0,5 M оцтовий ангідрид/0,13 M DIPEA/0,01 M HOBT) для захисту неацильованих груп смоли. У стадіях приєднання використовували наступні амінокислотні картриджі: Цикл 1) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 2) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 3) Fmoc4Hyp-OH; Цикл 4) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 5) Fmoc-Thr(tBu)-OH; Цикл 6) Fmoc-Ile-OH; Цикл 7) Fmoc-Leu-OH; Цикл 8) Fmoc-Asn(Trt)-OH; Цикл 9) Fmoc-Ile-OH; Цикл 10) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 11) Fmoc-His(Trt)-OH; Цикл 12) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Цикл 13) Fmoc-Leu-OH; Цикл 14) Fmoc-AlaOH; Цикл 15) Fmoc-Ser(tBu)-OH; Цикл 16) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 17) Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Цикл 18) Fmoc-Arg(Pbf)-OH; і Цикл 19) Fmoc-Ala-OH. Після останньої стадії приєднання смолу промивали NMP, після чого проводили стандартне зняття N-кінцевої Fmoc-групи з подальшим промиванням NMP і потім DCM. Після збирання С-кінцевої частини пептидного скелету (залишки 18-36) для синтезу Nкінцевої частини пептиду використали тільки одну десяту частину смоли (0,1 ммоль), а іншу смолу зберегли. N-кінцеву частину вказаного в заголовку пептиду (залишки 1-17) синтезували з використанням Fmoc-хімії при допомозі НВЧ на пептидному синтезаторі Liberty (CEM, Matthews, NC, USA) в масштабі 0,1 ммоль. Смолу з попереднього синтезу вміщували в конічну пробірку об'ємом 50 мл разом з 15 мл ДМФА і вводили в положення смоли на синтезаторі. Потім смолу кількісно переносили в реакційну ямку за допомогою автоматизованого процесу. Використали стандартну методику синтезу Liberty для синтезу в масштабі 0,1 ммоль. Дана методика включає зняття N-кінцевої Fmoc-групи шляхом первинної обробки 7 мл 20 % піперидину, що містить 0,1 M HOBT, в ДМФА. Початкова стадія зняття захисту тривала протягом 30 секунд при НВЧ 11 UA 101435 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 опроміненні (45 ват, максимальна температура 75 °C) і барботуванні азотом (цикл 3 секунди/з перервою 7 секунд). Потім реакційну ямку звільняли від рідкої фази і проводили другу обробку піперидином, ідентичну першій обробці, за винятком того, що тривалість обробки становила 3 хвилини. Потім зі смоли видаляли піперидин і ретельно промивали декілька разів ДМФА. Потім додавали захищену амінокислоту, Fmoc-Aib-OH (2,5 мл, 5 еквівалентів), отриману у вигляді 0,2 M стокового розчину в ДМФА, з подальшим додаванням 1,0 мл 0,45 M (4,5 екв.) HBTU в ДМФА. Потім додавали 0,5 мл 2 M (10 екв.) DIPEA в NMP. Стадію приєднання проводили протягом 5 хвилин при використанні НВЧ-випромінювання потужністю 20 ват, при максимальній температурі 75 °C, і аналогічного режиму барботування азотом. Після першої стадії приєднання реакційну ямку звільняли від рідкої фази і повторювали стадію приєднання. Потім ініціювали Цикл 2, аналогічний Циклу 1. Всі амінокислоти вводили аналогічним чином, при цьому в ході всього процесу використали стратегію подвійного приєднання. Приєднання залишків 10-11 і 16-17 (Glu-Aib і Asp-Aib) включало застосування методики блокування безпосередньо після стадії приєднання. Блокування проводили, додаючи 7 мл 0,5 M оцтового ангідриду, що містить 0,015 M HOBT в NMP, разом з 2 мл 2 M розчину DIPEA, при використанні багатостадійної методики з обробкою НВЧ: потужність 50 ват протягом 30 секунд (максимальна температура 65 °C), з подальшим вимкненням НВЧ-випромінювання на 30 секунд, потім другий раунд обробки НВЧ-випромінюванням протягом 30 секунд (50 ват), а потім знов вимкнення НВЧ-випромінювання на 30 секунд. Після цього зі смоли видаляли рідку фазу і повністю промивали смолу ДМФА. Використали наступні амінокислоти (Advanced Chemtech, Louisville, KY, USA): Цикл 20) Fmoc-Aib-OH; Цикл 21) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Цикл 22) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; Цикл 23) Fmoc-Ala-OH; Цикл 24) Fmoc-Pro-OH; Цикл 25) Fmoc-Ala-OH; Cycle 26) Fmoc-Aib-OH; Цикл 27) Fmoc-Glu(OtBu)-OH; Цикл 28) Fmoc-Gly-OH; Цикл 29) Fmoc-Pro-OH; Цикл 30) FmocAsn(Trt)-OH; Цикл 31) Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Цикл 32) Fmoc-Pro-OH; Цикл 33) Fmoc-Lys(Boc)-OH; Цикл 34) Fmoc-Ser(tBu)-OH; Цикл 35) Fmoc-Pro-OH; і Цикл 36) Fmoc-Tyr(tBu)-OH. Після того як пептидний скелет повністю синтезували, стандартну обробку піперидином використали для видалення N-кінцевої Fmoc-групи при використанні стандартної методики зняття захисту, описаної вище. Потім смолу ретельно промивали ДМФА, після чого переносили назад в конічну пробірку об'ємом 50 мл, використовуючи ДМФА як розчинник для перенесення. З пептиду знімали захисні групи і від'єднувати від смоли за допомогою обробки 5 мл наступного реагенту: 5 % TIS, 2 % води, 5 % (мас./об.) DTT і 88 % ТФО, з подальшим перемішуванням протягом 3,5 годин. Фільтрат збирали в 45 мл холодного безводного етилового ефіру. Тверду фазу осаджували протягом 10 хвилин при 3500 об./хв. в центрифузі, що охолоджується. Ефір видаляли з осаду і пептид ресуспендували в новій порції ефіру. Обробку ефіром проводили в цілому 2 разу. Після останнього промивання ефіром пептид залишали на повітрі для видалення залишків ефіру. Осад пептиду ресуспендували в 8 мл ацетонітрилу, а потім в 8 мл деіонізованої води до повного розчинення. Далі розчин пептиду аналізували з допомогою мас-спектрометрії. Мас-спектрометричний аналіз з використанням іонізації електророзпиленням виявив основний продукт, що має масу 4180,7, що відповідало цільовому продукту. Аналіз з допомогою аналітичної ВЕРХ при використанні колонки C18 250×4,6 мм (Phenomenex, Torrance, CA, USA) з використанням градієнта ацетонітрилу 2-60 % (0,1 % ТФО) протягом 30 хвилин виявив основний продукт з чистотою 68 %. Потім неочищений пептид очищали з допомогою препаративної ВЕРХ на колонці C18 в зверненій фазі, використовуючи 10-60 % ацетонітрил (0,1 % ТФО) протягом 50 хвилин при швидкості потоку 10 мл/хв. Очищений продукт аналізували з допомогою ВЕРХ на предмет чистоти (>99 %) і з допомогою мас-спектрометрії (4180,5 Так), при цьому експериментальна маса відповідала розрахунковій масі 4180,6. Потім пептид ліофілізували, отримавши внаслідок 53 мг очищеного продукту, що відповідає 13 % виходу. Інші сполуки винаходу можуть бути отримані середнім фахівцем в даній галузі із застосуванням методик синтезу, аналогічних розкритим в попередніх прикладах. Фізичні дані сполук, представлених в даній заявці, наведені в Таблиці 1. 12 UA 101435 C2 Таблиця 1 Номер прикладу 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 5 Мол. маса (розрахункова) 4212.7 4210.6 4180.6 4256.7 4254.7 4268.7 4268.7 4268.7 4254.7 4268.7 4226.7 4270.7 4227.7 4240.7 4270.7 4250.7 4226.7 4270.7 4270.7 4212.7 4226.7 4227.7 4284.8 4166.6 4166.6 4164.7 4150.7 4136.6 4180.6 4122.6 4196.7 4182.7 4180.7 4180.6 4206.6 4216.6 4230.6 4168.6 4138.6 4254.7 4254.7 4238.7 4254.7 4302.8 4482.1 Мол. маса (МС-ІЕР) % чистоти (ВЕРХ) 4212.8 4210.6 4180.5 4257.3 4255.0 4268.9 4268.7 4268.9 4254.8 4268.9 4227.0 4270.9 4227.4 4241.0 4270.6 4250.9 4226.9 4270.8 4270.5 4212.7 4226.8 4227.8 4284.7 4166.9 4166.6 4164.7 4150.4 4136.5 4181.0 4122.6 4197.0 4182.7 4180.9 4180.5 4206.8 4217.0 4231.1 4168.2 4139.1 4255.4 4255.9 4238.5 4254.7 4302.7 4482.4 99.9 99.9 99.9 98.2 98.7 98.8 97.3 96.7 96.3 95.6 95.2 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 98.1 99.9 99.9 99.9 99.9 98.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 97.7 98.2 99.9 96.5 98.8 >99 In vitro радіолігандні аналізи зв'язування рецепторів NPY-Y1 і NPY-Y2 Лінії клітин нейробластоми людини, SK-N-MC і SK-N-BE2 (Американська колекція типових культур, Rockville, MD, USA), що експресують рецептори NPY-Y1 і NPY-Y2, відповідно, культивували в EMEM, що містить 10 % ембріональної сироватки теляти і 5 % екстракту курячих ембріонів, і інкубували при 37 °C в зволоженій атмосфері 95 % повітря і 5 % CO2. Для in vitro аналізів зв'язування радіолігандів рецепторами NPY-Y1 і NPY-Y2, отримували відповідні клітини (SK-N-MC для NPY-Y1; SK-N-BE2 для NPY-Y2), гомогенізували їх в 20 мл 13 UA 101435 C2 5 10 15 20 охолодженого на льоду 50 мМ Трис-HCl при допомозі Brinkman Polytron (Westbury, NY, USA) (режим 6, 15 сек). Гомогенати двічі промивали при допомозі центрифугування (39000 g/10 хв.), і отримані осади ресуспендували в 50 мМ Трис-HCl, що містить 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл бацитрацину (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) і 0,1 % BSA. 125 Для аналізу аліквоти (0,4 мл) вищезгаданих суспензій інкубували з 0,05 нМ [ I]PYY (2200 Кі/ммоль, Perkin-Elmer, Boston, MA), з і без 0,05 мл немічених конкурентних пептидів, що 125 тестуються. Після інкубації протягом 100 хв. (25 °C), зв'язаний [ I]PYY відділяли від вільного шляхом швидкої фільтрації через фільтри GF/С (Brandel, Gaithersburg, MD, USA), що заздалегідь просочилися 0,3 % поліетиленіміном. Потім фільтри промивали три рази 5 мл аліквотами охолодженого на льоду 50 мМ Трис-HCl, і визначали радіоактивність зв'язаного радіоізотопу, що уловлюється на фільтрах, при допомозі гамма-спектрометрії (Wallac LKB, Gaithersburg, MD, USA). Специфічне зв'язування визначали як різницю загальної кількості 125 125 зв'язаного [ I]PYY і кількості [ I]PYY, зв'язаної в присутності 1000 нМ PYY (Bachem, Torrence, CA, USA). Константи інгібування (Ki) обчислювали, використовуючи відоме рівняння ЧенгаПруссофа, і вказані дані, а також селективність вказаних сполук відносно NPY-Y1 і NPY-Y2, наведені в Таблиці 2. Кожну із сполук Прикладів 1-38 і 40-45 піддавали вищеописаним радіолігандним аналізам, і при цьому було встановлено, що майже всі вказані сполуки мали Ki нижче за 100 нМ, причому деякі з представлених сполук мали Ki в суб-нМ діапазоні. Також було встановлено, що майже всі вказані сполуки надзвичайно селективно зв'язуються з NPY-Y1 в порівнянні з NPY-Y2. Таблиця 2 Номер прикладу 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Kі (нМ) для Y1 0.04 0.08 0.11 0.21 0.68 0.31 0.60 3.48 2.58 0.98 2.95 1.19 3.47 257.27 0.26 0.29 0.03 0.21 0.24 0.20 0.13 1.23 0.20 0.19 0.85 0.94 0.74 0.18 1.16 0.59 1.91 1.40 239.06 69.78 Kі (нМ) для Y2 198 >1000 944 658 420 319 347 52 420 578 178 505 727 >1000 710 >1000 595 171 997 >1000 45 >1000 >1000 >1000 841 198 104 441 >1000 766 202 483 >1000 >1000 14 Селективність Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 UA 101435 C2 Продовження таблиці 2 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 5 10 15 20 25 30 35 40 45 3.58 34.23 52.94 502.28 Немає даних 11.80 9.68 0.48 0.67 1.44 55.85 >1000 >1000 >1000 >1000 Немає даних 895 >1000 466 22 151 38 Y1 Y1 Y1 Y1 Немає даних Y1 Y1 Y1 Y1 Y1 Y2 Вступ Пептиди даного винаходу можуть бути надані в формі фармацевтично прийнятних солей. Приклади таких солей включають, крім іншого, солі, утворені з органічними кислотами (наприклад, оцтовою, молочною, малеїновою, лимонною, яблучною, аскорбіновою, янтарною, бензойною, метансульфоновою, толуолсульфоновою або памовою кислотою), неорганічними кислотами (наприклад, соляною кислотою, сірчаною кислотою або фосфорною кислотою), а також полімерними кислотами (наприклад, дигалова кислота, карбоксилметилцелюлоза, полімолочна, полігліколева або співполімери полімолочної-гліколевої кислот). Типовий спосіб отримання солі пептиду даного винаходу відомий в рівні техніки і може бути виконаний за допомогою стандартних способів сольового обміну. Відповідно, сіль ТФО пептиду даного винаходу (сіль ТФО отримують в результаті очищення пептиду з використанням препаративної ВЕРХ при елюції буферними розчинами, що містять ТФО) може бути перетворена в іншу сіль, таку як ацетат, шляхом розчинення пептиду в невеликій кількості 0,25 Н водного розчину оцтової кислоти. Розчин, що отримується, наносять на напівпрепаративну колонку ВЕРХ (Zorbax, 300 SB, С-8). Колонку елююють (1) 0,1 Н водним розчином ацетату амонію протягом 0,5 години, (2) 0,25 Н водним розчином оцтової кислоти протягом 0,5 години, і (3) лінійним градієнтом (20 %-100 % розчину В протягом 30 хвилин) при швидкості потоку 4 мл/хв. (розчин А являє собою 0,25 Н водний розчин оцтової кислоти; розчин В являє собою 0,25 Н розчин оцтової кислоти в ацетонітрилі/вода, 80:20). Фракції, що містять пептид, збирають і ліофілізують до сухого стану. Дозування активного компонента в композиціях даного винаходу може бути різне, проте, необхідно, щоб кількість активного компонента була такою, щоб була отримана відповідна дозована лікарська форма. Вибране дозування залежить від необхідного терапевтичного ефекту, шляху введення і тривалості терапії. Як правило, ефективне дозування відносно -7 -4 активності даного винаходу знаходиться в діапазоні 1×10 - 200 мг/кг/день, переважно 1×10 100 мг/кг/день, і може бути введена у вигляді разової дози або розділена на декілька доз. Сполуки даного винаходу можуть бути введені пероральним, перентеральним (наприклад, з допомогою внутрішньом'язової, внутрішньоочеревинної, внутрішньовенної або підшкірної ін'єкції, або імпланту), назальним, вагінальним, ректальним, під'язиковим або місцевим шляхами введення, і можуть бути об'єднані з фармацевтично прийнятними носіями з отриманням дозованих лікарських форм, що відповідають кожному шляху введення. Тверді дозовані форми для перорального введення можуть включати в себе капсули, таблетки, пілюлі, порошки і гранули. У таких твердих дозованих формах активна сполука змішана щонайменше з одним інертним фармацевтично прийнятним носієм, таким як сахароза, лактоза або крохмаль. Такі дозовані форми також можуть містити, згідно із загальноприйнятими стандартами, інші додаткові речовини, що відрізняються від таких інертних розріджувачів, наприклад, ковзних речовин, таких як стеарат магнію. У випадку капсул, таблеток і пілюль, дозовані лікарські форми також можуть містити буферні агенти. Таблетки і пілюлі додатково можуть бути приготовані з ентеросолюбільними покриттями. Рідкі дозовані лікарські форми для перорального введення включають, крім іншого, фармацевтично прийнятні емульсії, розчини, суспензії, сиропи, еліксири і т.п., що містять інертні розріджувачі, що звичайно використовуються в даній галузі, такі як вода. Крім таких інертних розріджувачів, композиції також можуть включати в себе допоміжні добавки, такі як змочувальні агенти, емульгуючі і суспендуючі агенти, а також підсолоджувачі, ароматизатори і віддушки. Препарати згідно з винаходом для парентерального введення включають, крім іншого, стерильні водні або неводні розчини, суспензії, емульсії і т.п. Прикладами неводних розчинників 15 UA 101435 C2 5 10 15 20 25 30 або носіїв є пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії, такі як оливкова олія і кукурудзяна олія, желатин, а також органічні ефіри, що вводять ін'єкцією, такі як етилолеат. Такі дозовані лікарські форми також можуть містити допоміжні добавки, такі як консерванти, змочувальні, емульгуючі і диспергуючі агенти. Вони можуть бути стерилізовані, наприклад, шляхом фільтрації через фільтр, що затримує бактерії, шляхом введення стерилізуючих агентів, опромінення або нагрівання вказаних композицій. Вони можуть бути приготовані в формі стерильних твердих композицій, які можуть бути розчинені в стерильній воді або якомунебудь іншому стерильному ін'єкційному середовищі, безпосередньо перед застосуванням. Композиціями для ректального або вагінального введення переважно є супозиторії, які можуть містити, крім активної речовини, інертні основи, такі як масло какао або віск для супозиторіїв. Композиції для назального або під'язикового введення також готують зі стандартними інертними основами, добре відомими в даній галузі. Крім того, сполука даного винаходу може бути введена в формі композиції з уповільненим вивільненням, такій як композиції, описані в наступних патентах і заявках на патенти. У патенті США 5672659 описані композиції з уповільненим вивільненням, що включають біоактивний засіб і поліефір. У патенті США 5595760 описані композиції з уповільненим вивільненням, що включають біоактивний засіб в гелевій формі. У патенті США 5821221 описані полімерні композиції з уповільненим вивільненням, що включають біоактивний засіб і хітозан. У патенті США 5916883 описані композиції з уповільненим вивільненням, що включають біоактивний засіб і циклодекстрин. У публікації PCT WO99/38536 описані композиції, що абсорбуються з уповільненим вивільненням біоактивного засобу. У публікації PCT WO00/04916 описаний спосіб отримання мікрочастинок, що включають терапевтичний засіб, таких як пептид, в процесі "масло у воді". У публікації PCT WO00/09166 описані комплекси, що включають терапевтичний засіб, такий як пептид, і фосфорильований полімер. У публікації PCT WO00/25826 описані комплекси, що включають терапевтичний засіб, такий як пептид, і полімер, що містить лактон, що не полімеризується. Якщо не визначене інше, всі технічні і наукові терміни, використані в даній заявці, мають таке ж значення, в якому вони звичайно розуміються середнім фахівцем в даній галузі техніки, до якої належить даний винахід. Крім того, всі публікації, заявки на патенти, патенти і інші джерела, вказані в даній заявці, на даний час повністю включені шляхом посилання. 16 UA 101435 C2 17 UA 101435 C2 18 UA 101435 C2 19 UA 101435 C2 20 UA 101435 C2 21 UA 101435 C2 22 UA 101435 C2 23 UA 101435 C2 24 UA 101435 C2 25 UA 101435 C2 26 UA 101435 C2 27 UA 101435 C2 28