Антитіло, що зв’язується з tau, фосфорилованим за серином 422 (рs422), для застосування при лікуванні таупатії

Реферат: Винахід належить до антитіла, яке зв'язується з Таu, фосфорилованим за серином 422 (pS422), для застосування при лікуванні таупатії, способу продукування антитіла та фармацевтичної композиції, що його містить. UA 99579 C2 (12) UA 99579 C2 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід відноситься до застосування антитіла, що специфічно зв'язується з фосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:9 (pS422), для лікування захворювань головного мозку. Білок Tau людини (білок, асоційований з мікротрубочками, Tau (білок нейрофібрилярних клубків, білок парних спіральних філаментів Tau, PHF-Tau) являє собою нейрональний білок, асоційований з мікротрубочками, виявлений переважно в аксонах, функцією якого є стимуляція полімеризації тубуліну і стабілізація мікротрубочок. Шість ізоформ (ізоформа A, B, C, D, E, F, G, фетальний Tau) виявлено у головному мозку людини, де сама довга ізоформа містить 441 амінокислоту (ізоформа F, Uniprot P10636-8). Tau та його властивості також описані Reynolds, C.H. et al., J. Neurochem. 69 (1997) 191-198. Tau в його гіперфосфорилованій формі є основним компонентом парних спіральних філаментів (PHF), будівельного блоку нейрофібрилярних ушкоджень у головному мозку при хворобі Альцгеймера (БА). Tau може фосфорилуватися за його залишками серину або треоніну декількома різними кіназами, що включають GSK3beta, cdk5, MARK і членів сімейства MAP кіназ. Таупатії характеризуються аномальним гіперфосфорилуванням Tau та являють собою відповідно до Iqbal, K. et al. (Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1739 (2005) 198-210): • Хворобу Альцгеймера, включаючи тільки клубкову форму цього захворювання • Синдром Дауна, випадки у дорослих • Комплекс паркінсонізм-деменція (синдром Гуама) • Деменцію боксерів • Хворобу Піка • Деменцію з аргірофільними зернами • Лобово-скроневу деменцію • Кортико-базальну дегенерацію • Палідо-понто-нігральну дегенерацію • Прогресуючий над’ядерний параліч • Хворобу Герштмана-Штрауслера-Шейнкера з клубками. Тепер у Tau з головних мозків хвороби Альцгеймера виявлено майже 40 серинових (S)/треонінових (T) сайтів фосфорилування (Hanger, D.P. et al., J. Biol. Chem 282 (2007) 2364523654). Розвиток патології Tau при хворобі Альцгеймера обумовлений його станом фосфорилування. Однак більшість з 40 сайтів фосфорилування не пов'язана з патологією захворювання, оскільки вони також виявлені у Tau, екстрагованому з тканини здорового фетального головного мозку. Тільки декілька фосфорилувань є унікальними для хворобливого стану, і приблизно вони відповідальні за аномальну характеристичну нерозчинність і агрегацію, що визначає Tau у PHF головного мозку з хворобою Альцгеймера (Morishima-Kawashima, M. et al., J. Biol. Chem 270 (1995) 823-829). Згідно Pei, J.J. et al., Journal of Alzheimer's Disease 14 (2008) 385-392, в існуючій літературі представлена обмежена й неясна інформація про те, які з цих сайтів специфічні для головного мозку при БА. Pei використовував ряд фосфоспецифічних антитіл до Tau і виміряв їхні рівні у гомогенатах медіальної скроневої кори від 22 БА й 10 контролів. Автори Bussiere, T. et al. (Acta Neuropathol. 97 (1999) 221-230) описують, що фосфорилований серин 422 на білках Tau є патологічним епітопом, виявленим при деяких захворюваннях з нейрофібрилярною дегенерацією. Augustinack, J.C. et al., (Acta Neuropathol 103 (2002) 26-35) описують pS422 як корелюючий з тяжкістю нейрональної патології при хворобі Альцгеймера. Guillozet-Bongaarts, A. (J. Neurochem 97 (2006) 1005-1014) описують фосфорилування Tau при S422 як складову частину процесу дозрівання PHF. Tau pS422 також виявлений у сполученні з патологією, що розвивається, у різних моделях хвороби Альцгеймера на трансгенних мишах. Так, Deters, N. et al. згадують у статті Biochem. Biophys. Res. Commun. 379 (2009) 400-405, що подвійні трансгенні миші Dom5/pR5 проявляють 7-кратно підвищені числа нейронів гіпокампа, які містять Tau зі специфічно фосфорилованим патологічним епітопом S422. Goetz, J. et al. (Science 293 (2001) 1491-1495) повідомили про появу Tau, фосфорилованого за S422, у головному мозку трансгенних мишей Tau P301L, ін’єкованих фібрилами Abeta42. EP 2009104 відноситься до епітопів білка Tau, які зустрічаються у фосфорилованому стані у білку Tau з PHF хвороби Альцгеймера, і до застосування цих епітопів для створення антитіл, що специфічно виявляють білок Tau хвороби Альцгеймера. WO 2002/062851 і US 7446180 відносяться до антитіл зі специфічністю до аномально вкороченої форми білка Tau і до діагностичних і терапевтичних аспектів відносно хвороби Альцгеймера й родинних таупатій. 1 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 WO 98/22120 відноситься до способу лікування пацієнта з хворобою Альцгеймера, що включає стадію введення пацієнтові антитіла проти фосфорилованого фрагмента Tau з амінокислот від приблизно 207 до приблизно 222, амінокислот від приблизно 224 до приблизно 240 і амінокислот від приблизно 390 до приблизно 408. Дослідження на тваринах, де фосфорилований Tau-фрагмент 379-408 [P-Ser396,404] використовують для вакцинації трансгенних мишей Tau, згадані у статті Asuni, A.A. et al., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129. US 2008/0050383 відноситься до способів лікування й попередження хвороби Альцгеймера або інших таупатій у суб'єкта шляхом введення фрагмента білка Tau. Моноклональні антитіла проти Tau pS422 описані, наприклад, в EP 1876185. Поліклональні антитіла проти Tau pS422 є у продажу (наприклад, ProSci Inc. і Biosource International). Винахід включає антитіло, що зв'язується з Tau, фосфорилованим за серином 422 (Tau pS422), що характеризується специфічним зв'язуванням з фосфорилованим фрагментом Tau Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO:9) і з Tau pS422, але не зв'язується з Tau і з фосфорилованим фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, для застосування при лікуванні таупатії, і такий спосіб лікування. Винахід включає антитіло, що зв'язується з Tau, фосфорилованим за серином 422 (Tau pS422), що характеризується специфічним зв'язуванням з фосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:9 і з Tau pS422, але не зв'язується з Tau і з фосфорилованим фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, для одержання ліків для лікування таупатії й до такого способу одержання. Винахід включає антитіло, що зв'язує фосфорилований Tau, що характеризується специфічним зв'язуванням з тим же епітопом, що зв'язує Mab2.10.3 (антитіло анти-Tau pS422). Винахід включає застосування антитіла, що зв'язує фосфорилований Tau, що характеризується специфічним зв'язуванням із тим же епітопом, що зв'язує Mab2.10.3 (антитіло анти-Tau pS422), для застосування при лікуванні таупатії або для одержання ліків для лікування таупатії. Антитіло відповідно до винаходу специфічно зв'язується з Tau pS422 і з агрегованим (фібрилярним), фосфорилованим Tau. Антитіло відповідно до винаходу не зв'язується з нефосфорилованим Tau, нефосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:10 і з фосфорилованим фрагментом MCAK SEQ ID NO:17. Антитіло відповідно до винаходу переважно належить до підтипу IgG1 людини. У наступній формі здійснення винаходу антитіло відповідно до винаходу переважно належить до підтипу IgG4 людини. Винахід включає антитіло анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає a) CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7 і CDR3H SEQ ID NO:8, b) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 і CDR3H SEQ ID NO:25, c) CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 і CDR3H SEQ ID NO:33, d) CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 і CDR3H SEQ ID NO:41, e) CDR1H SEQ ID NO:47, CDR2H SEQ ID NO:48 і CDR3H SEQ ID NO:49, f) CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:56 і CDR3H SEQ ID NO:57, або g) CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 і CDR3H SEQ ID NO:65. Краще антитіло характеризується тим, що воно включає a) CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 і CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5, b) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 і CDR3H SEQ ID NO:25, і CDR1L SEQ ID NO:27, CDR2L SEQ ID NO:28, CDR3L SEQ ID NO:29, c) CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 і CDR3H SEQ ID NO:33, і CDR1L SEQ ID NO:35, CDR2L SEQ ID NO:36, CDR3L SEQ ID NO:37, d) CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 і CDR3H SEQ ID NO:41, і CDR1L SEQ ID NO:43, CDR2L SEQ ID NO:44, CDR3L SEQ ID NO:45, e) CDR1H SEQ ID NO:47, CDR2H SEQ ID NO:48, і CDR3H SEQ ID NO:49, і CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:52, CDR3L SEQ ID NO:53, f) CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:56 і CDR3H SEQ ID NO:57, і CDR1L SEQ ID NO:59, CDR2L SEQ ID NO:60, CDR3L SEQ ID NO:61, або g) CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 і CDR3H SEQ ID NO:65, і CDR1L SEQ ID NO:67, CDR2L SEQ ID NO:68, CDR3L SEQ ID NO:69. Краще антитіло характеризується тим, що воно включає a) варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:1 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:2, b) варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:26 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:22, c) варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:34 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:30, d) варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:42 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:38, 2 UA 99579 C2 e) варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:50 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:46, f) варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:58 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:54, або 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 g) варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:66 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:62. Винахід включає гуманізований варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab2.10.3. Винахід включає химерний варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab2.10.3. Винахід включає варіант, виснажений за T-клітинним епітопом, антитіла анти-Tau pS422 Mab2.10.3. Mab2.10.3 характеризується його варіабельними ланцюгами SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2. Винахід включає гуманізований варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 005. Винахід включає химерний варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 005. Винахід включає варіант, виснажений за Tклітинним епітопом, антитіла анти-Tau pS422 Mab 005. Mab 005 характеризується його варіабельними ланцюгами SEQ ID NO:26 і SEQ ID NO:22. Винахід включає гуманізований варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 019. Винахід включає химерний варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 019. Винахід включає варіант, виснажений за Tклітинним епітопом, антитіла анти-Tau pS422 Mab 019. Mab 019 характеризується його варіабельними ланцюгами SEQ ID NO:34 і SEQ ID NO:30. Винахід включає гуманізований варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 020. Винахід включає химерний варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 020. Винахід включає варіант, виснажений заTклітинним епітопом, антитіла анти-Tau pS422 Mab 020. Mab 020 характеризується його варіабельними ланцюгами SEQ ID NO:42 і SEQ ID NO:38. Винахід включає гуманізований варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 085. Винахід включає химерний варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 085. Винахід включає варіант, виснажений за Tклітинним епітопом, антитіла анти-Tau pS422 Mab 085. Mab 085 характеризується його варіабельними ланцюгами SEQ ID NO:50 і SEQ ID NO:46. Винахід включає гуманізований варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 086. Винахід включає химерний варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 086. Винахід включає варіант, виснажений за Tклітинним епітопом, антитіла анти-Tau pS422 Mab 086. Mab 086 характеризується його варіабельними ланцюгами SEQ ID NO:58 і SEQ ID NO:54. Винахід включає гуманізований варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 097. Винахід включає химерний варіант антитіла анти-Tau pS422 Mab 097. Винахід включає варіант, виснажений за Tклітинним епітопом, антитіла анти-Tau pS422 Mab 097. Mab 097 характеризується його варіабельними ланцюгами SEQ ID NO:66 і SEQ ID NO:62. Винахід включає химерний, гуманізований або виснажений за T-клітинним епітопом варіант антитіла анти-Tau pS422, що включає CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 і CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:1 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:2. Винахід включає химерний, гуманізований або виснажений за T-клітинним епітопом варіант антитіла анти-Tau pS422, що включає CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 і CDR3H SEQ ID NO:25, і CDR1L SEQ ID NO:27, CDR2L SEQ ID NO:28, CDR3L SEQ ID NO:29, або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:26 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:22. Винахід включає химерний, гуманізований або виснажений за T-клітинним епітопом варіант антитіла анти-Tau pS422, що включає CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 і CDR3H SEQ ID NO:33, і CDR1L SEQ ID NO:35, CDR2L SEQ ID NO:36, CDR3L SEQ ID NO:37 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:34 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:30. Винахід включає химерний, гуманізований або виснажений за T-клітинним епітопом варіант антитіла анти-Tau pS422, що включає CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 і CDR3H SEQ ID NO:41, і CDR1L SEQ ID NO:43, CDR2L SEQ ID NO:44, CDR3L SEQ ID NO:45 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:42 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:38. Винахід включає химерний, гуманізований або виснажений за T-клітинним епітопом варіант антитіла анти-Tau pS422, що включає CDR1H SEQ ID NO:47, CDR2H SEQ ID NO:48 і CDR3H SEQ ID NO:49, і CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:52, CDR3L SEQ ID NO:53 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:50 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:46. Винахід включає химерний, гуманізований або виснажений за T-клітинним епітопом варіант антитіла анти-Tau pS422, що включає CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:56 і CDR3H SEQ ID NO:57, і CDR1L SEQ ID NO:59, CDR2L SEQ ID NO:60, CDR3L SEQ ID NO:61 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:58 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:54. Винахід включає химерний, гуманізований або виснажений за T-клітинним епітопом варіант антитіла анти-Tau pS422, що включає CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 і CDR3H SEQ ID NO:65, і CDR1L SEQ ID NO:67, CDR2L SEQ ID NO:68, CDR3L SEQ ID NO:69 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:66 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:62. 3 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід включає спосіб гуманізації, виснаження за T-клітинним епітопом або химеризації антитіла анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 і CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:1 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:2. Винахід включає спосіб гуманізації, виснаження за T-клітинним епітопом або химеризації антитіла анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 і CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:1 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:2. Винахід включає спосіб гуманізації, виснаження за T-клітинним епітопом або химеризації антитіла анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 і CDR3H SEQ ID NO:25, і CDR1L SEQ ID NO:27, CDR2L SEQ ID NO:28, CDR3L SEQ ID NO:29 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:26 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:22. Винахід включає спосіб гуманізації, виснаження за T-клітинним епітопом або химеризації антитіла анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 і CDR3H SEQ ID NO:33, і CDR1L SEQ ID NO:35, CDR2L SEQ ID NO:36, CDR3L SEQ ID NO:37 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:34 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:30. Винахід включає спосіб гуманізації, виснаження за T-клітинним епітопом або химеризації антитіла анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 і CDR3H SEQ ID NO:41, і CDR1L SEQ ID NO:43, CDR2L SEQ ID NO:44, CDR3L SEQ ID NO:45 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:42 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:38. Винахід включає спосіб гуманізації, виснаження за T-клітинним епітопом або химеризації антитіла анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:47, CDR2H SEQ ID NO:48 і CDR3H SEQ ID NO:49, і CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:52, CDR3L SEQ ID NO:53 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:50 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:46. Винахід включає спосіб гуманізації, виснаження за T-клітинним епітопом або химеризації антитіла анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:56 і CDR3H SEQ ID NO:57, і CDR1L SEQ ID NO:59, CDR2L SEQ ID NO:60, CDR3L SEQ ID NO:61 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:58 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:54. Винахід включає спосіб гуманізації, виснаження за T-клітинним епітопом або химеризації антитіла анти-Tau pS422, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 і CDR3H SEQ ID NO:65, і CDR1L SEQ ID NO:67, CDR2L SEQ ID NO:68, CDR3L SEQ ID NO:69 або варіабельний легкий ланцюг SEQ ID NO:66 і варіабельний важкий ланцюг SEQ ID NO:62. Краще антитіло, що зв'язується з Tau pS422 і характеризується вищевказаними амінокислотними послідовностями й фрагментами амінокислотних послідовностей, належить до підтипу IgG1 людини. Краще антитіло, що зв'язується з Tau pS422 і характеризується вищевказаними амінокислотними послідовностями й фрагментами амінокислотних послідовностей, належить до підтипу IgG4 людини. Наступною формою здійснення винаходу є фармацевтична композиція, що містить антитіло відповідно до винаходу. Наступною формою здійснення винаходу є застосування антитіла відповідно до винаходу для одержання фармацевтичної композиції. Наступною формою здійснення винаходу є застосування антитіла відповідно до винаходу для лікування таупатії, вибраної з групи, що складається з хвороби Альцгеймера (ХА), включаючи тільки клубкову форму захворювання, синдрому Дауна (випадків у дорослих), комплексу паркінсонізм-деменція (синдрому Гуама), деменції боксерів, хвороби Піка, деменції з аргірофільними зернами, лобово-скроневої деменції, кортико-базальної дегенерації, палідопонто-нігральної дегенерації, прогресуючого над’ядерного паралічу й хвороби ГерштманаШтрауслера-Шейнкера з клубками. Наступною формою здійснення винаходу є спосіб одержання фармацевтичної композиції, що містить антитіло відповідно до винаходу. 4 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Наступною формою здійснення винаходу є нуклеїнова кислота, що кодує варіабельний домен важкого ланцюга й/або варіабельний домен легкого ланцюга антитіла відповідно до винаходу. Далі у винаході запропоновані експресійні вектори, що містять нуклеїнову кислоту відповідно до винаходу, здатні експресувати цю нуклеїнову кислоту у прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяїні, і клітини-хазяїни, що містять такі вектори для рекомбінантного продукування такого антитіла. Далі винахід включає прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, що містить вектор відповідно до винаходу. Далі винахід включає спосіб продукування рекомбінантного людського або гуманізованого антитіла відповідно до винаходу, що характеризується експресією нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу у прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяїні й виділенням антитіла з клітини або з супернатанта клітинної культури. Далі винахід включає антитіло, яке може бути отримане таким рекомбінантним способом. Далі винахід включає спосіб селекції моноклонального антитіла відповідно до винаходу, що характеризується одержанням ряду моноклональних антитіл, які зв'язуються з Tau pS422, визначенням специфічного зв'язування цих антитіл із фосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:9, з Tau і з фосфорилованим фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, і селекцією антитіла зі специфічним зв'язуванням з даним фосфорилованим фрагментом Tau, щонайменше 10000кратним у порівнянні з його зв'язуванням з Tau, і зі специфічним зв'язуванням з даним фосфорилованим фрагментом Tau, щонайменше 100-кратним у порівнянні з його зв'язуванням з фосфорилованим фрагментом MCAK Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-LysIle-Pro-Ala (SEQ ID NO:17). Кращий винахід включає спосіб селекції моноклонального антитіла відповідно до винаходу, що характеризується одержанням ряду моноклональних антитіл, які зв'язуються з Tau pS422, визначенням специфічного зв'язування цих антитіл з фосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:9, з Tau pS422, з Tau і з фосфорилованим фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, і селекцією антитіла зі специфічним зв'язуванням з даним фосфорилованим фрагментом Tau і з Tau pS422, щонайменше 10000-кратним у порівнянні з його зв'язуванням з Tau, і зі специфічним зв'язуванням з даним фосфорилованим фрагментом Tau, щонайменше 100-кратним у порівнянні з його зв'язуванням з фосфорилованим фрагментом MCAK Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-ArgArg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:17). Кращий винахід включає спосіб селекції моноклонального антитіла відповідно до винаходу, що характеризується одержанням ряду моноклональних антитіл,які зв'язуються з Tau pS422, визначенням специфічного зв'язування цих антитіл з фосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:9, з Tau pS422, з Tau і з фосфорилованим фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, і селекцією антитіла зі специфічним зв'язуванням з даним фосфорилованим фрагментом Tau і з Tau pS422, щонайменше 10000-кратним у порівнянні з його зв'язуванням з Tau, і зі специфічним зв'язуванням з даним фосфорилованим фрагментом Tau і з Tau pS422, щонайменше 100кратним у порівнянні з його зв'язуванням з фосфорилованим фрагментом MCAK Ile-Gln-Lys-GlnLys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:17). Антитіла відповідно до винаходу проявляють корисні ефекти для пацієнтів, що потребують спрямованої терапії на Tau. Антитіла відповідно до винаходу мають нові й винахідницькі властивості, що викликають користь для пацієнта, що страждає таупатією, зокрема, ХА. Далі у винаході запропонований спосіб лікування пацієнта, що страждає таупатією, зокрема, ХА, що включає введення пацієнтові, в якого діагностоване таке захворювання (і, отже, потребує такої терапії), антитіла, що зв'язується з pS422, відповідно до винаходу. Антитіло переважно вводять у фармацевтичній композиції. Наступною формою здійснення винаходу є спосіб лікування пацієнта, що страждає таупатією, зокрема, ХА, який характеризується введенням цьому пацієнтові антитіла відповідно до винаходу. Далі винахід включає застосування антитіла відповідно до винаходу для лікування пацієнта, що страждає таупатією, зокрема, ХА, і для одержання фармацевтичної композиції відповідно до винаходу. Крім того, винахід включає спосіб одержання фармацевтичної композиції відповідно до винаходу. Далі винахід включає фармацевтичну композицію, що містить антитіло відповідно до винаходу, необов'язково разом із буфером і/або ад’ювантом, корисним для готування препаратів антитіл для фармацевтичних потреб. 5 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Далі у винаході запропонована фармацевтична композиція, що містить антитіло відповідно до винаходу у фармацевтично прийнятному носії. В одній формі здійснення фармацевтична композиція може бути включена у готовий виріб або у набір. Антитіло за даним винаходом можна застосовувати для діагностики неврологічного розладу, такого як хвороба Альцгеймера, шляхом виявлення фосфорилованого поліпептиду Tau. Антитіло за даним винаходом можна також застосовувати для специфічного виявлення Tau pS422 або агрегованого, фосфорилованого Tau. Термін “Tau” відповідно до винаходу охоплює саму довгу ізоформу Tau людини, що містить 441 амінокислоту (ізоформу F, Uniprot P10636-8). Термін “фосфорилований Tau (pTau)“ відповідно до винаходу охоплює фосфориловану форму самої довгої ізоформи Tau людини, що містить 441 амінокислоту (ізоформу F, Uniprot P10636-8), утворену шляхом фосфорилування за S422 кіназою ERK2. Термін “агрегований, фосфорилований Tau” або “агрегований (фібрилярний), фосфорилований Tau” відповідно до винаходу охоплює агреговану й фосфориловану форму самої довгої ізоформи Tau людини, що містить 441 амінокислоту (ізоформу F, Uniprot P10636-8), утворену шляхом фосфорилування агрегованого Tau кіназою ERK2. Термін “фрагмент Tau” відповідно до винаходу охоплює фрагмент Tau Ser-Ile-Asp-Met-ValAsp-Ser-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO:10). Термін “фосфорилований фрагмент Tau” відповідно до винаходу охоплює фосфорилований фрагмент Tau Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO:9). Термін “MCAK” відповідно до винаходу охоплює мітотичний кінезин людини, асоційований з центромірою (кінезиноподібний білок KIF2C, UniProt Q99661)). MCAK_Human (88-102)[95-pSer] являє собою фосфорилований фрагмент MCAK, що складається з амінокислот 88-102, фосфорилований за серином 95 (SEQ ID NO:17). Цей фосфорилований фрагмент MCAK не має ідентичності або подоби послідовності у порівнянні з фосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:9. Автори винаходу виявили, що антитіла проти фосфорилованих фрагментів Tau відповідно до рівня техніки можуть проявляти значну перехресну реактивність з неспорідненими фосфорилованими пептидами й білками людини. Для антитіл відповідно до винаходу, які не зв'язуються з фосфорилованим фрагментом MCAK, таку небажану перехресну реактивність неможливо виявити. Зв'язування з Tau pS422 і зв'язування з Tau досліджують за допомогою ELISA (твердофазного імуноферментного аналізу) з електролюмінесцентним зчитуванням. Tau або Tau pS422 іммобілізують при концентрації 2 мкг/мл і додають тестоване антитіло (наприклад, людини або миші). Для виявлення зв'язаного тестованого антитіла додають мічений рутенієм IgG проти людини або проти миші, відповідно, при концентрації 0,5 мкг/мл. Специфічне зв'язування з Tau pS422 виявляють, якщо відношення сигналу виявлення Tau pS422 і Tau є щонайменше 10000-кратним при максимальному сигналі зв'язування Tau pS422. Зв'язування з фосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:9, зв'язування з нефосфорилованим фрагментом Tau SEQ ID NO:10 і з фосфорилованим фрагментом MCAK SEQ ID NO:17 досліджують за допомогою ELISA. Тестоване антитіло інкубують з іммобілізованим фосфорилованим фрагментом Tau і для порівняння з іммобілізованим нефосфорилованим фрагментом Tau або з фрагментом MCAK. Це антитіло є міченим, і мітку виявляють. Специфічне зв'язування з фосфорилованим фрагментом Tau виявляють, якщо відношення сигналу виявлення з використанням фосфорилованого фрагмента Tau і нефосфорилованого фрагмента Tau становить щонайменше 100 при максимальному сигналі зв'язування фосфорилованого фрагмента Tau, і, якщо відношення сигналу виявлення з використанням фосфорилованого фрагмента Tau і фосфорилованого фрагмента MCAK також становить щонайменше 100 при максимальному сигналі зв'язування фосфорилованого фрагмента Tau. Термін “епітоп Mab2.10.3” охоплює епітоп, локалізований всередині фосфорилованого фрагмента Tau Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO:9), що специфічно розпізнається Mab2.10.3. Властивість зв'язування епітопу антитіла до Tau відповідно до даного винаходу визначають за допомогою аналізу перехресного блокування зв'язування in vitro, такого як аналіз перехресного блокування зв'язування Biacore™ in vitro, щоб визначити здатність Mab2.10.3 до стеричного утруднення зв'язування тестованого антитіла з pTau. Для такого аналізу Mab2.10.3 іммобілізують як перше антитіло на сенсорі Biacore, після чого здійснюють послідовні упорскування pTau і другого антитіла, що підлягає тестуванню. Якщо друге антитіло не проявляє якого-небудь виявленого сигналу зв'язування, це друге антитіло зв'язується з тим же епітопом, що й Mab2.10.3. 6 UA 99579 C2 -8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 -1 Антитіло відповідно до винаходу зв'язується з Tau pS422 зі спорідненістю від 5x10 M до -1 10 M , як визначено за допомогою аналізу Biacore™, описаного вище. Зв'язування з фібрилярними агрегатами Tau pS422 досліджують за допомогою аналізу Biacore. Для цього аналізу агрегований Tau pS422 іммобілізують, і додають тестоване антитіло у різних концентраціях, використовуючи коефіцієнт розведення 2 і максимальну концентрацію 200 нМ. Антитіло відповідно до винаходу зв'язується з фібрилярним Tau pS422 з Kd від 0,1 до 30, переважно з Kd від 10 до 20 нм. Термін “моноклональне антитіло або антитіло” охоплює різні форми антитіла, переважно моноклонального антитіла й особливо переважно моноклонального антитіла IgG1 або IgG4. Антитіло відповідно до винаходу переважно являє собою людське антитіло, гуманізоване антитіло, химерне антитіло або додатково генетично сконструйоване антитіло, якщо зберігаються його характеристичні властивості відповідно до винаходу. Антитіла, виснажені за T-клітинним епітопом, можуть бути отримані з використанням способів, описаних у WO 98/08097 “Фрагменти антитіла” включають ділянку повнорозмірного антитіла, переважно його варіабельний домен або щонайменше його антигензв’язуючий сайт. Приклади фрагментів антитіла включають діатіла, одноланцюгові молекули антитіла й мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Антитіла scFv описані, наприклад, у Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Крім того, фрагменти антитіла включають одноланцюгові поліпептиди, що мають характеристики домену VH, а саме здатні до складання разом із доменом VL, або домену VL, що зв'язується з Tau pS422, а саме здатні до складання разом із доменом VH з утворенням функціонального антигензв’язуючого сайту. Термін “гуманізоване антитіло” відноситься до антитіл, у яких каркасні ділянки й/або “ділянки визначення комплементарності” (CDR) модифіковані таким чином, що включають CDR імуноглобуліну іншого виду у порівнянні з видом батьківського імуноглобуліну. У кращій формі здійснення a) CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 і CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5, b) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 і CDR3H SEQ ID NO:25 і CDR1L SEQ ID NO:27, CDR2L SEQ ID NO:28, CDR3L SEQ ID NO:29, c) CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 і CDR3H SEQ ID NO:33 і CDR1L SEQ ID NO:35, CDR2L SEQ ID NO:36, CDR3L SEQ ID NO:37, d) CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 і CDR3H SEQ ID NO:41 і CDR1L SEQ ID NO:43, CDR2L SEQ ID NO:44, CDR3L SEQ ID NO:45, e) CDR1H SEQ ID NO:47, CDR2H SEQ ID NO:48 і CDR3H SEQ ID NO:49 і CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:52, CDR3L SEQ ID NO:53, f) CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:56 і CDR3H SEQ ID NO:57 і CDR1L SEQ ID NO:59, CDR2L SEQ ID NO:60, CDR3L SEQ ID NO:61 або g) CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 і CDR3H SEQ ID NO:65 і CDR1L SEQ ID NO:67, CDR2L SEQ ID NO:68, CDR3L SEQ ID NO:69 прищеплюють на каркасну ділянку людського антитіла з одержанням “гуманізованого антитіла”. Див., наприклад, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; і Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. “Варіабельний домен” (варіабельний домен легкого ланцюга (V L), варіабельний домен важкого ланцюга (VH)), як використовують у даній заявці, означає кожну з пар доменів легкого й важкого ланцюга, які залучені безпосередньо у зв'язування антитіла з антигеном. Варіабельні домени легкого й важкого ланцюга мають однакову загальну структуру, і кожний домен включає чотири каркасних (FR) ділянки, послідовності яких широко консервативні, з'єднані трьома “гіперваріабельними ділянками” (або ділянками визначення комплементарності, CDR). Каркасні ділянки приймають -складчасту конформацію, а CDR можуть утворити петлі, що з'єднують складчасту структуру. Ділянки CDR у кожному ланцюзі втримуються у своїй тривимірній структурі каркасними ділянками й разом із CDR з іншого ланцюга утворюють антигензв’язуючий сайт. Ділянки CDR3 важкого й легкого ланцюга антитіла грають особливо важливу роль в єднальній специфічності/спорідненості антитіл відповідно до винаходу й, отже, утворюють наступний аспект винаходу. Термін “антигензв’язуюча ділянка антитіла” при використанні у даній заявці відноситься до амінокислотних залишків антитіла, які відповідальні за зв'язування антигену. Антигензв’язуюча ділянка антитіла включає амінокислотні залишки з “ділянок визначення комплементарності” або “CDR”. “Каркасні” або “FR” ділянки являють собою ділянки варіабельних доменів, інші, ніж залишки гіперваріабельних ділянок, як визначено у даній заявці. Таким чином, варіабельні домени легкого й важкого ланцюгів антитіла включають від N- до C-кінця домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Зокрема, CDR3 важкого ланцюга є ділянкою, що вносить -12 7 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 найбільший вклад у зв'язування антигену й визначає властивості антитіла. Ділянки CDR і FR визначають у відповідності зі стандартним визначенням Кебота, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) і/або як залишки з “гіперваріабельної петлі”. Термін”CDR1H” означає ділянку CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, обчислену згідно Кеботу. CDR2L, CDR3H тощо означають відповідні ділянки з важкого (H) або легкого (L) ланцюга. Наприклад, антитіло, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:6, означає, що антитіло включає цю амінокислотну послідовність як варіабельну ділянку важкого ланцюга CDR1 у його варіабельному важкому ланцюзі. Наприклад, антитіло, яке характеризується тим, що воно включає CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8, означає, що антитіло включає в його важкому ланцюзі як послідовність CDR1 SEQ ID NO:6, як послідовність CDR2 SEQ ID NO:7 і як послідовність CDR3 SEQ ID NO:8. Терміни “нуклеїнова кислота” або “молекула нуклеїнової кислоти”, як використовують у даній заявці, мають на увазі як такі, що включають молекули, ДНК і молекули РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути однониткову або двониткову, але переважно являє собою двониткову ДНК. Термін ”амінокислота”, як використовують у даній заявці при даному застосуванні, означає групу карбоксі--амінокислот, що зустрічаються у природі, яка включає аланін (трибуквений код: ala, однобуквений код: A), аргінін (arg, R), аспарагін (asn, N), аспарагінову кислоту (asp, D), цистеїн (cys, C), глутамін (gln, Q), глутамінову кислоту (glu, E), гліцин (gly, G), гістидин (his, H), ізолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лізин (lys, K), метіонін (met, M), фенілаланін (phe, F), пролін (pro, P), серин (ser, S), треонін (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) і валін (val, V). Нуклеїнова кислота “оперативно зчеплена”, коли її поміщають у функціональні взаємовідносини з іншою амінокислотою. Наприклад, ДНК для препослідовності або секреторної лідерної послідовності оперативно зчеплена з ДНК для поліпептиду, якщо вона експресується у вигляді пребілка, що бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер оперативно зчеплений з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідовності; або сайт зв'язування рибосоми оперативно зчеплений з кодуючою послідовністю, якщо він розташований так, що сприяє трансляції. У цілому “оперативно зчеплений” означає, що послідовності ДНК, які є зчепленими, є колінеарними, і у випадку секреторної лідерної послідовності є безперервними й перебувають в одній рамці зчитування. Однак енхансери не обов'язково повинні бути безперервними. Зчеплення здійснюють шляхом лігування у зручних сайтах рестрикції. Якщо такі сайти не існують, використовують синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери відповідно до загальноприйнятої практики. Як використовують у даній заявці, вираження “клітина”, “клітинна лінія” і “клітинна культура” використовують взаємозамінно, і всі такі позначення включають потомство. Таким чином, слова “трансформанти” і “трансформовані клітини” включають первинну обговорювану клітину й культури, що мають від неї походження, незалежно від числа переносів. Також зрозуміло, що все потомство може бути не у точності ідентичним за вмістом ДНК внаслідок навмисних або випадкових мутацій. Включено варіанти потомства, що мають одну і ту же функцію й біологічну активність, скринінг на яку здійснюють у вихідній трансформованій клітині. “Ділянка Fc” антитіла не залучена безпосередньо у зв'язування антитіла з антигеном, але проявляє різні ефекторні функції. “Ділянка Fc антитіла” є терміном, добре відомим фахівцям у даній галузі техніки, і визначена на підставі розщеплення антитіл папаїном. Залежно від амінокислотної послідовності каркасної області їхніх важких ланцюгів антитіла або імуноглобуліни ділять на класи: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, і деякі з них можуть бути додатково розділені на підкласи (підтипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, IgA1 і IgA2. Відповідно до константних областей важкого ланцюга різні класи імуноглобулінів називають , , ,  і  відповідно. Антитіло відповідно до винаходу переважно включає ділянку Fc людського походження, що належить до підтипу IgG1 або IgG4. Константні легкі й важкі ланцюги людини й константні ланцюги підтипу IgG1 або IgG4 добре відомі на рівні техніки й описані, наприклад, Кеботом (див., наприклад, Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Наприклад, корисна константна область важкого ланцюга людини включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:13 або 14 (IgG1) або SEQ ID NO:15 або 16 (IgG4). Наприклад, корисна константна область легкого ланцюга людини включає амінокислотну послідовність константну область легкого ланцюга каппа SEQ ID NO:11. Крім того, переважно, щоб антитіло мало мишаче походження й включало каркас варіабельної послідовності антитіла мишачого антитіла відповідно до Кеботу (див., наприклад, Sequences of th Proteins of Immunological Interest, Kabat, E.A. et al., 5 edition, DIANE Publishing (1992)). 8 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід включає спосіб лікування пацієнта, що потребує терапії, який характеризується введенням цьому пацієнтові антитіла відповідно до винаходу. Винахід включає застосування антитіла відповідно до винаходу для терапії. Винахід включає застосування антитіла відповідно до винаходу для одержання ліків для лікування таупатії, зокрема, ХА. Винахід включає застосування антитіла відповідно до винаходу для лікування захворювань головного мозку, переважно для лікування таупатії, зокрема, ХА. Наступною формою здійснення винаходу є спосіб продукування антитіла відповідно до винаходу, який характеризується тим, що послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг антитіла відповідно до винаходу, і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг цього антитіла, вбудовують в один або у два експресійних вектори, цей вектор (вектори) вбудовують в еукаріотичну клітину-хазяїна, і кодоване антитіло експресують і виділяють з клітини-хазяїна або з супернатанта. Антитіла відповідно до винаходу переважно продукують рекомбінантними способами. Такі способи широко відомі на рівні техніки й включають експресію білка у прокаріотичних і еукаріотичних клітинах із наступним виділенням поліпептиду антитіла й звичайно очищенням до фармацевтично прийнятної чистоти. Для експресії білка нуклеїнові кислоти, що кодують легкі й важкі ланцюги або їхні фрагменти, вбудовують в експресійні вектори стандартними способами. Експресію здійснюють у придатних прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах, таких як клітини CHO, клітини NS0, клітини SP2/0, клітини HEK293, клітини COS, дріжджі або клітини E. coli, і антитіло виділяють з клітин (з супернатанта або після лізису клітин). Рекомбінантне продукування антитіл описане, наприклад, в оглядових статтях Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. Антитіла можуть бути присутніми у цілих клітинах, у клітинному лізаті або у частково очищеній або по суті чистій формі. Очищення здійснюють з метою усунення інших клітинних компонентів або інших контамінантів, наприклад, інших клітинних нуклеїнових кислот або білків, стандартними методами (див. Ausubel, F. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)). Експресія у клітинах NS0 описана, наприклад, Barnes, L.M. et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Транзитна експресія описана, наприклад, Durocher, Y. et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Клонування варіабельних доменів описано Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 7787. Краща система транзитної експресії (HEK 293) описана Schlaeger, E.-J. і Christensen, K. у Cytotechnology 30 (1999) 71-83, і Schlaeger, E.-J. в J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199. Моноклональні антитіла доцільно виділяти з культурального середовища загальноприйнятими методами очищення імуноглобулінів, такими як, наприклад, білок Aсефароза, хроматографія на гідроксіапатиті, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія. ДНК і РНК, що кодує моноклональні антитіла, легко виділяють і секвенують, використовуючи загальноприйняті методи. Клітини гібридоми можуть служити як джерело такої ДНК і РНК. Коли ДНК виділена, вона може бути вбудована в експресійні вектори, якими потім трансфікують клітини-хазяїни, такі як клітини HEK 293, клітини CHO або клітини мієломи, які в інших обставинах не продукують білок імуноглобулін, щоб одержати синтез рекомбінантних моноклональних антитіл у клітинах-хазяїнах. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують варіанти амінокислотної послідовності антитіла анти-pS422, одержують за допомогою ряду способів, відомих у даній галузі техніки. Ці способи включають, але не обмежені ними, виділення з природного джерела (у випадку варіантів амінокислотної послідовності, що зустрічаються у природі) або одержання за допомогою опосередкованого олігонуклеотидами (або сайт-спрямованого) мутагенезу, ПЛР мутагенезу й касетного мутагенезу отриманого раніше варіанта або неваріантної версії гуманізованого антитіла анти-pS422. Варіабельні домени важкого й легкого ланцюга відповідно до винаходу поєднують з послідовностями промотору, ініціації трансляції, константної області, 3' нетрансльованої області, поліаденілювання й термінації транскрипції з утворенням експресійних векторних конструкцій. Експресійні конструкції важкого й легкого ланцюга можуть бути об'єднані в одному векторі, котрансфіковані, серійно трансфіковані або трансфіковані окремо у клітини-хазяїни, які потім зливають з утворенням однієї клітини-хазяїна, що експресує обидва ланцюги. В іншому аспекті у даному винаході запропонована композиція, наприклад, фармацевтична композиція, що містить моноклональне антитіло або їхню комбінацію, або його антигензв’язуючу 9 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ділянку за даним винаходом, включені у композицію разом із фармацевтично прийнятним носієм. Як використовують у даній заявці, “фармацевтично прийнятний носій” включає будь-яке або всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові агенти, ізотонічні та уповільнювальні абсорбцію/резорбцію агенти тощо, які є фізіологічно сумісними. Переважно носій придатний для ін'єкції або інфузії. Композицію за даним винаходом можна вводити за допомогою ряду способів, відомих у даній галузі техніки. Як зрозуміло фахівцям у даній галузі техніки, шлях і/або спосіб введення буде варіювати залежно від бажаних результатів. Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії й стерильні порошки для готування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсії. Застосування таких середовищ і агентів для фармацевтично активних речовин відоме у даній галузі техніки. Крім води, носій може являти собою, наприклад, ізотонічний забуференний фізіологічний розчин. Незалежно від вибраного шляху введення сполуки за даним винаходом, які можна застосовувати у придатній гідратованій формі, і/або фармацевтичні композиції за даним винаходом готують у фармацевтично прийнятних лікарських формах загальноприйнятими способами, відомими фахівцям у даній галузі техніки. Дійсні рівні дозування активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях за даним винаходом можна варіювати таким чином, щоб одержати кількість активного інгредієнта, яка ефективна для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, композиції й способу введення, але нетоксична для пацієнта (ефективна кількість). Вибраний рівень дозування буде залежати від ряду фармакокінетичних факторів, що включають активність конкретних застосовуваних композицій за даним винаходом або їх ефіру, солі або аміду, шлях введення, час введення, швидкість виведення конкретного застосовуваної сполуки, інші ліки, сполуки й/або речовини, які використовують у комбінації з конкретними застосовуваними композиціями, вік, стать, маса, стан, загальна стан здоров'я й попередній анамнез захворювання пацієнта, що підлягає лікуванню, і тому подібні фактори, добре відомі у галузі медицини. Винахід включає застосування антитіл відповідно до винаходу для лікування пацієнта, що страждає таупатією, зокрема, ХА. Винахід також включає спосіб лікування пацієнта, що страждає таким захворюванням, шляхом введення цьому пацієнтові антитіла відповідно до винаходу. Далі у винаході запропонований спосіб одержання фармацевтичної композиції, що містить антитіло відповідно до винаходу разом із фармацевтично прийнятним носієм, і застосування антитіла відповідно до винаходу для такого способу. Далі у винаході запропоноване застосування антитіла відповідно до винаходу для одержання фармацевтичного агента, переважно разом із фармацевтично прийнятним носієм, для лікування пацієнта, що страждає таупатією, зокрема, ХА. У винаході також запропоноване застосування антитіла відповідно до винаходу для одержання фармацевтичного агента, переважно разом із фармацевтично прийнятним носієм, для лікування пацієнта, що страждає раком, зокрема, таупатією, зокрема, ХА. Наведені нижче приклади, перелік послідовностей і графічних матеріалів запропоновані, щоб сприяти розумінню винаходу, дійсний обсяг якого викладений у прикладеній формулі винаходу. Зрозуміло, що можуть бути зроблені модифікації у викладених методах без відхилення від сутності винаходу. Опис переліку послідовностей 50 55 60 SEQ ID NO:1 Варіабельний легкий ланцюг Mab 2.10.3 SEQ ID NO:2 Варіабельний важкий ланцюг Mab 2.10.3 SEQ ID NO:3 DR1L SEQ ID NO:4 CDR2L SEQ ID NO:5 CDR3L SEQ ID NO:6 CDR1H SEQ ID NO:7 CDR2H SEQ ID NO:8 CDR3H SEQ ID NO:9 Фосфорилований фрагмент Tau SEQ ID NO:10 Нефосфорилований SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO:11 Константна область легкого ланцюга каппа людини 10 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:12 Константна область легкого ланцюга каппа людини SEQ ID NO:13 Константна область 1 людини (алотип G1m1,17) SEQ ID NO:14 Константна область 1 людини (алотип G1m17) SEQ ID NO:15 Константна область IgG4 людини SEQ ID NO:16 Константна область IgG4 людини SPLE-мутант SEQ ID NO:17 Фосфорилований фрагмент MCAK fragment (MCAK_Human (88-102)[95-pSer] SEQ ID NO:18 Праймер SEQ ID NO:19 Праймер SEQ ID NO:20 Праймер SEQ ID NO:21 Праймер SEQ ID NO:22 Варіабельний важкий ланцюг Mab 005 SEQ ID NO:23 CDRH1 SEQ ID NO:24 CDRH2 SEQ ID NO:25 CDRH3 SEQ ID NO:26 Варіабельний легкий ланцюг Mab 005 SEQ ID NO:27 CDRL1 SEQ ID NO:28 CDRL2 SEQ ID NO:29 CDRL3 SEQ ID NO:30 Варіабельний важкий ланцюг Mab 019 SEQ ID NO:31 CDRH1 SEQ ID NO:32 CDRH2 SEQ ID NO:33 CDRH3 SEQ ID NO:34 Варіабельний легкий ланцюг Mab 019 SEQ ID NO:35 CDRL1 SEQ ID NO:36 CDRL2 SEQ ID NO:37 CDRL3 SEQ ID NO:38 Варіабельний важкий ланцюг Mab 020 SEQ ID NO:39 CDRH1 SEQ ID NO:40 CDRH2 SEQ ID NO:41 CDRH3 SEQ ID NO:42 Варіабельний легкий ланцюг Mab 020 SEQ ID NO:43 CDRL1 SEQ ID NO:44 CDRL2 SEQ ID NO:45 CDRL3 SEQ ID NO:46 Варіабельний важкий ланцюг Mab 085 SEQ ID NO:47 CDRH1 SEQ ID NO:48 CDRH2 SEQ ID NO:49 CDRH3 SEQ ID NO:50 Варіабельний легкий ланцюг Mab 085 SEQ ID NO:51 CDRL1 SEQ ID NO:52 CDRL2 SEQ ID NO:53 CDRL3 SEQ ID NO:54 Варіабельний важкий ланцюг Mab 086 SEQ ID NO:55 CDRH1 SEQ ID NO:56 CDRH2 SEQ ID NO:57 CDRH3 SEQ ID NO:58 Варіабельний легкий ланцюг Mab 086 SEQ ID NO:59 CDRL1 SEQ ID NO:60 CDRL2 SEQ ID NO:61 CDRL3 SEQ ID NO:62 Варіабельний важкий ланцюг Mab 097 SEQ ID NO:63 CDRH1 SEQ ID NO:64 CDRH2 SEQ ID NO:65 CDRH3 SEQ ID NO:66 Варіабельний легкий ланцюг Mab 097 SEQ ID NO:67 CDRL1 SEQ ID NO:68 CDRL2 SEQ ID NO:69 CDRL3 SEQ ID NO:70 Константна область імуноглобуліну кролика (каппа) SEQ ID NO:71 Константна область імуноглобуліну кролика (гамма) 11 UA 99579 C2 SEQ ID NO:72 Константна область імуноглобуліну миші (каппа) SEQ ID NO:73 Константна область імуноглобуліну миші (гамма) Опис графічних матеріалів 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 1: Інтрацеребральна локалізація pS422 IgG1 після ip введення у мишачій моделі TauPS2APP. Конфокальні мікрофотографії після множинного флуоресцентного фарбування першими антитілами проти IgG1, кон’югованими з Alexa488, і антитілом анти-pTau AT8, кон’югованим із Alexa555, виявили зв'язаний IgG1 (A) і відкладення pTau (B), разом із DAPI для клітинних ядер (C). Сполучені зображення показують спільно локалізоване фарбування антиIgG1 і pTau у деяких pTau-позитивних клітинах (D). Фіг. 2: Контроль носія інтрацеребральної локалізації IgG1 у мишачій моделі TauPS2APP. Конфокальні мікрофотографії після множинного флуоресцентного фарбування зрізу головного мозку TauPS2APP, що показують огляд зони утворення CA1 гіпокампа. Множинне фарбування першими антитілами проти IgG1, кон’югованими з Alexa488, негативно (A). Антитіло анти-pTau AT8, кон’юговане з Alexa555, виявило відкладення pTau (B). Фарбування DAPI на клітинні ядра (C). Сполучені зображення показані у (D). Прийнятної імунофлуоресценції анти-IgG1 не спостерігали у мишей TauPS2APP після ін'єкції носія. Фіг. 3: Внутрішньоклітинна локалізація pS422 IgG1 після ip введення у мишачій моделі TauPS2APP. Конфокальні мікрофотографії після множинного флуоресцентного фарбування зрізу головного мозку TauPS2APP, що показують позитивно мічені клітини у межах префронтальної кори. Множинне фарбування першими антитілами проти IgG1, кон’югованими з Alexa488, і антитілом анти-pTau AT8, кон’югованим із Alexa555, виявило зв'язаний IgG1 (A) і відкладення pTau (B). Сполучені зображення показують спільно локалізоване перинуклеарне й дендритне фарбування анти-IgG1 і pTau разом із фарбуваннямDAPI на клітинні ядра синім кольором (C). Фіг 4: Внутрішньоклітинна локалізація pS422 IgG1 після ip введення у мишачій моделі TauPS2APP. Конфокальні мікрофотографії після множинного флуоресцентного фарбування зрізу головного мозку TauPS2APP, що показують позитивно мічені клітини у межах пірамідального шару зони CA1 гіпокампа. Множинне фарбування першими антитілами проти IgG1, кон’югованими з Alexa488, і антитілом анти-pTau AT8, кон’югованим із Alexa555, виявило зв'язаний IgG1 (A) і відкладення pTau (B). Сполучені зображення показують спільно локалізоване перинуклеарне й дендритне фарбування анти-IgG1 і pTau разом із фарбуванням DAPI на клітинні ядра (C). Фіг. 5: Внутрішньоклітинна локалізація pS422 IgG2a після ip введення у мишачій моделі TauPS2APP. Конфокальні мікрофотографії після множинного флуоресцентного фарбування зрізу головного мозку TauPS2APP, що показують позитивно мічені клітини у межах пірамідального шару зони CA1 гіпокампа. Множинне фарбування першими антитілами проти IgG2a, кон’югованими з Alexa488, і антитілом анти-pTau AT8, кон’югованим із Alexa555, виявило зв'язаний IgG2a (A) і відкладення pTau (B). Сполучені зображення показують спільно локалізоване перинуклеарне фарбування анти-IgG2a і pTau разом із фарбуванням DAPI на клітинні ядра (C). Фіг. 6: Внутрішньоклітинна локалізація pS422 IgG2b після ip введення у мишачій моделі TauPS2APP. Конфокальні мікрофотографії після множинного флуоресцентного фарбування зрізу головного мозку TauPS2APP, що показують позитивно мічені клітини у межах зони префронтальної кори. Множинне фарбування першими антитілами проти IgG2b, кон’югованими з Alexa488, і антитілом анти-pTau AT8, кон’югованим із Alexa555, виявило зв'язаний IgG2b (A) і відкладення pTau (B). Сполучені зображення показують спільно локалізоване перинуклеарне фарбування анти-IgG2b і pTau, зазначене стрілками (C). Фіг. 7: Аналіз миші TauPS2APP. A: Фарбування сріблом за Gallyas сагітального зрізу головного мозку 16-місячної миші TauPS2APP. Типові клубкові інтранейрональні структури видні у чорному кольорі й підтверджують позитивні нейрони pTau, виявлені імунофлуоресцентною мікроскопією. B: Мічений імунним фарбуванням золотом ультратонкий зріз 16-місячної миші TauPS2APP. Анти-Tau pS422 mAb специфічно зв'язується з фібрилярними структурами у дендритних відростках у зоні CA1 гіпокампа, як виявлено другим антитілом, кон’югованим із 10 нм колоїдним золотом (стрілка). Розмір і щільність мічених фібрил дозволяє припустити, що вони порівнянні з парними спіральними філаментами фосфорилованих білків Tau, виявленими у нейронах, що дегенерують, при хворобі Альцгеймера. Фіг. 8: Зв'язування in vitro антитіл анти-Tau pS422 зі зрізами головного мозку ХА. Флуоресцентні мікрофотографії кортикальних зрізів головного мозку людини з ХА з 12 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 моноклональними антитілами анти-Tau pS422 (клони 2.10.3, 2.20.4 і 5.6.11) при зазначеній концентрації, що показують позитивно мічені відкладення pTau. Помітні внутрішньоклітинні відкладення pTau, подібні більшим нейрофібрилярним клубкам і поздовжнім ниткам нейропіля. Фіг. 9: Селективність антитіл анти-Tau pS422 для Tau pS422 у порівнянні з Tau. Вимірювання за допомогою ELISA селективності антитіл анти-Tau pS422 з використанням планшетів, покритих Tau (▲) або Tau pS422 (●). Для порівняння Tau-селективне антитіло 4/2 показане на верхній лівій панелі. Фіг. 10: In vitro агрегований Tau є фібрилярним. Електронна мікрофотографія негативно пофарбованого агрегованого Tau. Фіг. 11: Флуоресцентні мікрофотографії кортикальних зрізів головного мозку людини з ХА, пофарбовані моноклональними антитілами кролика анти-Tau pS422 Mab 005 (перший ряд), Mab 019 (другий ряд), Mab 020 (третій ряд), Mab 085 (четвертий ряд), Mab 086 (п'ятий ряд) і Mab 097 (шостий ряд), що показують позитивно мічені відкладення й філаменти pTau. Серійне розведення IgG показане у кожному ряді, починаючи з 2,0 мкг/мл (ліворуч), 0,4 мкг/мл, 0,08 мкг/мл і 0,016 мкг/мл. Приклад 1 Одержання й очищення антитіл a) Одержання антитіла Мишей імунізували фрагментом Tau SEQ ID NO:9 (Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-ProGln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp), що відповідає амінокислотам 416-430 самої довгої ізоформи Tau людини. Щоб дати можливість прямого сполучення за допомогою тіолу з KLH, додавали цистеїн до N-кінця фрагмента Tau. Протокол наступної імунізації, злиття й клонування й скринінгу на специфічні антитіла анти-Tau pS422 описаний в EP 1876185. b) Очищення клонів 2.10.3, 2.20.4 і 5.6.11 Безклітинний супернатант культури гібридоми (250-300 мл) наносили на колонку 25 мл MEP Hypercell (pall Biosciences), яка була врівноважена 50 мМ Трис-Cl pH 8,0. Після промивання буфером для врівноважування антитіло елюювали 30 мМ цитратом натрію, 100 мМ NaCl pH 4,1. Фракції, що містять антитіло, поєднували, а потім піддавали діалізу у діалізних трубках SpectraPor 6-8000 протягом ночі при 4 °C проти 5 літрів 10 мМ Трис-Cl pH 8,0. Діалізований матеріал наносили на колонку 10 мл Source 17Q (GE Healthcare), що була врівноважена у 10 мМ Трис-Cl pH 8,0 (буфер A). Після промивання буфером A антитіло елюювали градієнтом 0-25% буфера B у 10 об'ємах колонки. Буфер B містив 10 мМ Трис-Cl, 1 M NaCl pH 8,0. Антитіло елюювало приблизно при 200 мМ NaCl. Чистоту індивідуальних фракцій перевіряли за допомогою електрофорезу у ДСН-ПААГ, і самі чисті фракції поєднували. За добу до ін'єкції мишам кожне антитіло піддавали діалізу проти ФСБ, і концентрацію антитіла доводили до 3,2 мг/мл. Приклад 2 Одержання Tau, Tau pS422, агрегованого Tau і агрегованого Tau pS422 Tau, що містить N-кінцеву злиту мітку (His)6-SUMO, експресували в E. coli і очищали іонообмінною хроматографією на HiTrapQ (GE Healthcare, Switzerland) з наступною афінною хроматографією на сефарозі Ni-NTA (Qiagen, Switzerland). Потім злиту мітку відщеплювали розщепленням протеазою SUMO (Invitrogen, Netherlands) з наступною другою стадією хроматографії на сефарозі Ni-NTA для видалення злитої мітки. Tau-pSer422 одержували шляхом інкубації Tau з протеїнкіназою ERK2. Молярне відношення ERK2:Tau (приблизно 1:10) було вибрано таким чином, щоб забезпечити максимальний вихід фосфорилування за S422, з наступною інкубацією протягом ночі при 37 °C у 10 мМ Трис-Cl pH 8,0, що містить 1 мМ MgCl2 і 2 мМ АТФ. Потім припустили, що це є стехіометричним фосфорилуванням за сайтом 422. Фосфорилування перевіряли за допомогою Вестернблоттингу, використовуючи власне моноклональне антитіло, специфічне до pS422 у Tau. Агрегований (фібрилярний) Tau одержували шляхом інкубації очищеного Tau при кінцевій концентрації 5 мкМ у 10 мМ Трис-Cl pH 8,0, що містить 50 мкМ арахідонову кислоту (Sigma, Switzerland). Інкубацію проводили при 37 °C протягом 16 год. Стан агрегації перевіряли флуоресцентною спектроскопією у присутності 10 мкМ Thio S (Barghorn and Mandelkow [2002] Biochemistry 41:14885-14896) і електронною мікроскопією (фіг. 10). Як показано на фіг. 10, агрегований Tau має фібрилярний зовнішній вигляд. Агрегований, фосфорилований Tau одержували шляхом інкубації попередньо агрегованого Tau з кіназою ERK2, як описано вище. 13 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Приклад 3 Моноклональні антитіла анти-Tau pS422 мають високу селективність до Tau, фосфорилованому за S422 a) Пептидний синтез Пептидні синтези проводили в автоматичному синтезаторі пептидів, використовуючи хімію Fmoc. У повторюваних циклах пептидні послідовності збирали шляхом послідовного сполучення відповідних Fmoc-амінокислот. На кожній стадії сполучення N-кінцеву Fmoc-групу видаляли обробкою смоли 20% піперидином у N-метилпіролідоні. Сполучення проводили, використовуючи Fmoc-захищену амінокислоту (1 ммоль), активовану HBTU/HOBt (1 ммоль кожного) і DIPEA (2 ммоль) у ДМФ. Після кожної стадії сполучення не прореагувавші аміногрупи кепували обробкою сумішші оцтової кислоти (0,5 M), DIPEA (0,125 M) і HOBt (0,015 M) у NMP (10 хв вортекс). Між кожними стадіями смолу промивали N-метилпіролідоном і ДМФ. Включення стерично утруднених амінокислот здійснювали в автоматичних подвійних сполученнях. Для цієї мети смолу двічі обробляли 1 ммоль активованого будівельного блоку без стадії кепування між циклами сполучення. У фосфорилованих пептидних послідовностях відповідну похідну серину включали у вигляді будівельного блоку Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH. Після завершення цільових послідовностей Fmoc-Glu(біотиніл-ПЕГ)-OH (біотин, приєднаний через ПЕГ спейсер) сполучили з пептидом MCAK, використовуючи стандартні умови сполучення амінокислот, тоді як 4x βаланін (U) і 1x ε-лізин приєднували до послідовностей фосфо-Tau, використовуючи стандартні умови. Потім DMTr-біотин кон’югували з пептидами фосфо-Tau з одержанням біотинілованих цільових послідовностей. Після кінцевого видалення захисту Fmoc (тільки для MCAK) всі пептидні смоли поміщали окремо у фільтрувальні фрити і обробляли сумішшю трифтороцтової кислоти, води й триізопропілсилану (19 мл : 0,5 мл : 0,5 мл) протягом 2,5 год. Розчини для відщеплення фільтрували, і пептиди осаджували додаванням холодного (0 °C) діізопропілового ефіру (300 мл) з одержанням безбарвних твердих речовин, які неодноразово промивали діізопропіловим ефіром. Сирі продукти повторно розчиняли у суміші оцтова кислота/вода, ліофілізували, а потім очищали препаративною ВЕРХ зі зверненою фазою, використовуючи градієнт ацетонітрил/вода, що містить 0,1% ТФО. HBTU: 2-(1H-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію гексафторфосфат HOBt: Гідроксибензотриазол DIPEA: N,N-діізопропілетиламін NMP: N-метил-2-піролідон b) Аналіз із фосфорилованим пептидом Tau Пептиди, що представляють послідовність Tau pS422 416–430 (фосфорилованого й нефосфорилованого) і MCAK_Human (88-102)[95-pSer], синтезували й біотинілювали, щоб дати можливість покриття мікротитраційного планшета, міченого стрептавідином. Для тестування на максимальне зв'язування фосфопептиду Tau з аналітичними планшетами різні концентрації фосфопептиду Tau у діапазоні від 1 нг/мл до 2000 нг/мл використовували для покриття. Нарешті, 50 нг/мл фосфопептиду Tau використовували для покриття протягом 60 хв при кімнатній температурі. Антитіла анти-Tau pS422 2.10.3., 2.20.4 і 5.6.11 інкубували у мічених пептидами мікротитраційних планшетах протягом 60 хв при концентраціях аж до 1000 нг/мл. Після промивання зв'язування антитіл виявляли, використовуючи антитіло IgG Fc проти миші, ® що було міченим POD. Після інкубації з ABTS протягом 20 хв при кімнатній температурі вимірювали поглинання (O.D.) при 405 нм - 492 нм. Зв'язування антитіла визначали за EC50. Типове значення EC50 можна було визначити у діапазоні від 100 нг/мл для 2.10.3., 8 нг/мл для 2.20.4 і 1 нг/мл для 5.6.11. Нефосфорилований фрагмент Tau і (MCAK_Human (88-102)[95-pSer]) використовували як контролі. Зв'язування контрольних пептидів не спостерігалося. Типові фонові значення становили близько 30 mE (таблиця 1), що становить приблизно 1% максимального значення, вимірюваного з фосфорилованим фрагментом Tau. Отже, Mab2.10.3 зв'язується з фосфорилованим фрагментом Tau щонайменше з 100-кратною селективністю у порівнянні з нефосфорилованим пептидом Tau SEQ ID NO:10 і з MCAK_Human (88-102)[95pSer]. Результати представлені у таблиці 1. Таблиця 1 Антитіло 2.10.3. Макс. O.D. зв'язування фосфоризованого фрагмента Таu 3300 mE Макс. O.D. зв'язування фрагмента Таu 30 mE 14 Відношення (O.D. Фосфоризованого фрагмента Tau /O.D. фрагмента Таu) 110 O.D. Фосфоризованого фрагмента МСАК 30 mЕ UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 c) Аналіз із повнорозмірним Tau і Tau pS422 TM Аналізи проводили, використовуючи аналітичну платформу Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland, USAMD). 96-ямкові мікротитраційні планшети MSD покривали Tau або Tau pS422 при концентрації 2 мкг/мл у буфері ФСБ протягом 1 год при кімнатній температурі. Потім планшети блокували додаванням ФСБ, що містить 5% БСА й 1% Твін 20, протягом 1 год. ® Антитіла розводили у буфері Low Cross Buffer (MSD), що містить 0,1% БСА й 0,1% Твін 20, при концентрації від 30 пг/мл до 20 нг/мл (за винятком клону 2.10.3, де діапазон концентрації становив від 3 нг/мл до 250 нг/мл) і додавали у покриті, блоковані планшети та інкубували протягом 3 год при кімнатній температурі. Потім планшети промивали три рази буфером ФСБ, що містить 1% Твін. Для виявлення зв'язаного антитіла SULFO-мічений IgG проти миші (MSD) додавали при концентрації 0,5 мкг/мл, і планшети інкубували протягом 1 год при кімнатній температурі. Після додавання буфера Read Buffer (MSD) планшети зчитували у пристрої, що зчитує, для планшетів MSD Sector Imager 6000. На фіг. 9 показані дані, отримані з використанням або Tau, або Tau pS422 як партнер зв'язування для моноклональних антитіл анти-Tau pS422 (клон 5.6.11, 2.20.4 і 2.10.3). Антитіла Tau pS422 порівнювали як контроль з антитілом анти-Tau (клон 4/2), що розпізнає і Tau, і Tau pS422. Шляхом порівняння зв'язування з Tau pS422 і Tau було виявлено, що сигнали зв'язування з Tau не відрізняються від фонових сигналів, і, отже, зв'язування з Tau не було виявлено. Таким чином, було обчислено, що кожне з трьох антитіл анти-Tau pS422 зв'язується з Tau pS422 щонайменше з 10000-кратною селективністю у порівнянні з Tau. Приклад 4 Антитіло анти-Tau pS422 зв'язується з фібрилярними агрегатами Tau pS422 TM Аналіз Biacore використовували для вимірювання зв'язування анти-Tau pS422 (клон 2.10.3) з препаратами агрегованого, фібрилярного Tau pS422. Фосфориловані фібрили вважають поданням in vitro PHF форми Tau, що зустрічається у головному мозку при хворобі Альцгеймера. Фібрилярний матеріал був отриманий і фосфорилований, як описано у Прикладі 2. Іммобілізація на сенсорних чіпах: Агрегований Tau pS422 іммобілізували ковалентно шляхом амінного сполучення на CM5сенсорному чіпі. З цією метою агрегований Tau pS422 розводили у 19 разів у 10 мМ ацетаті натрію pH 5,0. Активовану поверхню сенсора приводили у контакт із розчином білка до іммобілізації бажаного рівня білка на чіпі. Потім реакційні складні ефіри N-гідроксисукциніміди, що залишилися, блокували шляхом упорскування 1 M етаноламіну pH 8,0. Було іммобілізовано 450 одиниць реакції (RU) білка, щоб охарактеризувати поводження зв'язування анти-Tau pS422 (клон 2.10.3). Аналіз іммобілізації проводили при КТ, і ФСБ використовували як буфер пробігу. Кінетичне титрування: Для характеризації антитіла буфер пробігу заміняли буфером 10 мМ Трис-Cl pH 8,0, 250 мМ NaCl і готували серію концентрацій антитіла: 5 різних концентрацій, коефіцієнт розведення 2, максимальна концентрація 200 нМ. Різні розчини антитіла впорскували послідовно, починаючи з найнижчої концентрації. Поверхню сенсора регенерували 100 мМ H3PO4 після так званого кінетичного титрування. Вимірювання проводили три рази. Оцінки даних здійснювали з використанням програмного забезпечення Biaeval. Обчислення параметрів засноване на припущенні, що зв'язування антитіла агрегованим Tau pS422 є повністю моновалентним. Кінетичні й термодинамічні параметри, що характеризують єднальне поводження антитіла з іммобілізованим білком, представлені у таблиці 2. Таблиця 2 KD нМ 17,0 Ка Мхс 5 6,2×10 kd -1 c -2 1×10 Rmax RU 208 Таким чином, анти-Tau pS422 (клон 2.10.3) зв'язується з фібрилярним фосфо-Tau з KD 17 50 нМ. 55 Приклад 5 Зв'язування in vitro моноклональних антитіл анти-Tau pS422 з внутрішньоклітинним pTau у зрізах головного мозку пацієнта з хворобою Альцгеймера Специфічне й чутливе імунологічне фарбування патології патологічно релевантного pTau у тканині головного мозку при хворобі Альцгеймера досліджували за допомогою експериментів за 15 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуногістохімічним фарбуванням, використовуючи зрізи замороженої тканини головного мозку людини від пацієнтів ХА. Оцінювання здійснювали, використовуючи заморожену посмертну тканину головного мозку від пацієнтів ХА, в яких нейропатологічним шляхом була встановлена стадія VI за Браак. Зрізи замороженої тканини головного мозку одержували й обробляли для імуногістохімії без яких-небудь хімічних реактивів, тобто альдегідною фіксацією. Виявлення відкладень pTau здійснювали, використовуючи друге антитіло, мічене флуоресцентною міткою, специфічне до IgG миші, і моніторинг здійснювали за допомогою флуоресцентної світлової мікроскопії. Коротко, зрізи нефіксованої тканини головного мозку, отримані на кріостаті, із зон кори головного мозку, отриманого посмертно від пацієнтів, у яких була позитивно діагностована хвороба Альцгеймера, мітили за допомогою непрямої імунофлуоресценції. У даному описі показані зображення, отримані з тканини орбітальної фронтальної звивини від пацієнта ХА (пацієнт 01-05; внутрішній банк головного мозку). Послідовну інкубацію у дві стадії використовували для виявлення зв'язаних мишачих антитіл із різних клонів, які виявляли за допомогою очищеного афінною хроматографією IgG (H+L) коза проти миші, кон’югованого з Cy3 (Jackson Immuno Research). Одержання зрізів, фарбування й флуоресцентну мікроскопію здійснювали у відповідності зі стандартними методиками. Специфічне й чутливе фарбування патології pTau очевидно для клонів 2.10.3, 2.20.4 і 5.6.11 (фіг. 8). Чітко видно насичене фарбування всіх типів відкладень pTau, а саме нейрофібрилярних клубків, ниток нейропіля й дистрофічних нейритів. Мінімальна ефективна концентрація 0,05 мкг/мл була визначена для всіх досліджених клонів, що вказує на високо чутливе зв'язування з генуїнними відкладеннями pTau людини. Виявлення відкладень pTau можна також здійснювати шляхом використання антитіла IgG4 відповідно до винаходу й міченого флуоресцентною міткою другого антитіла, специфічного до IgG4 людини, і здійснювати моніторинг за допомогою флуоресцентної світлової мікроскопії. Приклад 6 Одержання потрійних трансгенних мишей TauPS2APP Трансгенних мишей TauPS2APP одержували схрещуванням гомозиготних самок PS2APP з лінії B6.172H (Ozmen, L. et al., Neurodegen. Dis. 6 (2009) 29-36) з гомозиготними самцями Tau з лінії TauP301L (Goetz et al., Science 293 (2001) 1491-1495). Всі отримані у результаті трансгенні миші гетерозиготні за мутацією APP шведський, мутацією пресеніліну 2 N141I людини й мутацією Tau P301L. Експресія трансгенів керується мишачим промотором Thy-1 у випадку APP людини, а експресія трансгенів Tau - пріоним промотором у випадку трансгена пресеніліну 2 людини. Тварин тримали при 12-годинному світловому циклі, і вони одержували вільний доступ до корму й води. Віварій акредитований Акредитацією утримання лабораторних тварин. Всі процедури проводили, строго дотримуючись швейцарських федеральних законів по захисту тварин і правил Асоціації по атестації й акредитації утримання лабораторних тварин і при особистому схваленні місцевої ветеринарної служби. Обробка мишей для імуногістохімічного аналізу: мишей анестезували, використовуючи 4% ізофлуран, і умертвляли шляхом декапітації. Кров збирали у пробірки, покриті ЕДТА-NaF (Milian). Головний мозок витягали, швидко заморожували на сухому льоді й зберігали при -80 °C до подальшого використання. В експериментах використовували самців і самок мишей у віці 20 місяців. У цьому віці посилене внутрішньоклітинне накопичення гіперфосфорилованого Tau і нейрофібрилярна патологія чітко видні у головному мозку від всіх мишей, протестованих до теперішнього часу. Приклад 7 Гістологія й ультраструктурний аналіз відкладень pTau у мишачій моделі TauPS2APP У мишей TauPS2APP розвивається залежний від віку й прогресуючий фенотип з інтранейрональними відкладеннями pTau зі структурами, подібними нейрофібрилярним клубкам, які виявляють у декількох зонах головного мозку. Істотну патологію pTau спостерігають у віці 24 місяців. Типово декілька нейронів, які є позитивними за внутрішньоклітинним Tau pS422, виявляють у межах префронтальної кори й у шарі пірамідальних клітин у зоні CA1 гіпокампа й у зоні, яка примикає до опорної структури гіпокампа. Було виявлено, що у цьому віці pTau поширюється у поліморфний шар і уздовж границі жолоба гіпокампа у зону CA3 і фімбрій, а також у крайову смужку. Фарбування сріблом за Gallyas здійснювали, як описано у статті (Gallyas, F., Acta Morphologica Acad. Sci. Hung. 19 (1971) 1-8), з мінорними модифікаціями, а саме з попередньою інкубацією у 3% періодній кислоті, і після відмивання в 0,5% оцтовій кислоті з додатковим відмиванням у 5% тіосульфаті натрію протягом 2 хв. Контрастне фарбування здійснювали 16 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стандартним гематоксиліном і еозином. Фарбування сріблом за Gallyas підтвердило появу численних клубкових відкладень у гіпокампі й у корі головного мозку мишей TauPS2APP (фіг. 7A). Ультраструктуру відкладень pTau досліджували за допомогою імуноелектронної мікроскопії. 16-місячних мишей TauPS2APP перфузували 2% формальдегідом і 0,5% глутаральдегідом у ФСБ. Зрізи головного мозку помістили у Lowicryl HM20 і одержували ультратонкі зрізи, як описано раніше (Richards, J.G. et al., J. Neurosci. 23 (2003) 8989-9003). Коротко, зрізи інкубували з анти-Tau pS422 при 10 мкг/мл у ФСБ з 2% БСА протягом 1 год. Після 6 відмивань у ФСБ/2% БСА зрізи інкубували з другим антитілом IgG коза проти миші (Amersham, Arlington Heights, IL), ® кон’югованим із 10 нм золотом, у співвідношенні 1:20 у ФСБ/2% БСА/0,1% Твін 20 протягом 1 год і відмивали у ФСБ з 2% БСА. Для контролів автори винаходу використовували зрізи, оброблені нормальною мишачою сироваткою, що приводить у результаті до надзвичайно 2 малого фона менше 10 частинок золота на площі 10 мкм . Електронні мікрофотографії знімали JEOL 1210 при 100 кВ. Ультраструктурне дослідження гіпокампа 16-місячних мишей TauPS2APP з численними pTau-позитивними нейронами виявило мічені імунним фарбуванням золотом фібрилярні відкладення, типові для парних спіральних філаментів (PHF) усередині дендритних відростків (фіг. 7B). Ультратонкі зрізи, мічені анти-Tau pS422 mAb, виявили специфічне зв'язування з фібрилярними структурами всередині дендритних відростків у зоні CA1 гіпокампа, як виявлено за допомогою другого антитіла, кон’югованого з 10 нм колоїдним золотом, видимим у вигляді чорних точок (фіг. 7B). Мічення імунним фарбуванням золотом демонструє, що епітоп pS422 Tau локалізований у внутрішньоклітинних фібрилярних структурах у нейронах досліджених мишей TauPS2APP. Розмір і щільність мічених фібрил дозволяє припустити, що вони порівнянні за структурою з PHF, які спостерігають у нейронах, що дегенерують, пацієнтів з ХА. Локалізація pTau PHF чітко демонструє внутрішньоклітинний розподіл відкладень агрегованого pTau у трансгенних мишей TauPS2APP. Приклад 8 Зв'язування in vivo моноклональних антитіл анти-Tau pS422 з внутрішньоклітинним pTau у головному мозку мишей pTau мишачої моделі хвороби Альцгеймера, виявлене за допомогою імуногістохімії й конфокальної лазерної скануючої мікроскопії Відібрані антитіла анти-Tau pS422 (див. таблицю 1) тестували у 24-місячних потрійних трансгенних мишей TauPS2APP і оцінювали на зв'язування з відкладеннями pTau in vivo. Дослідження проводили на мишачій моделі TauPS2APP, у якій розвивається залежний від віку й прогресуючий фенотип із інтранейрональними відкладеннями pTau зі структурами, подібними нейрофібрилярним клубкам, які виявлені у декількох зонах головного мозку, як описано у Прикладі 4. Використовувані антитіла проти Tau pS422 вводили i.p. у дозі 20 мг/кг. Імуногістохімічне фарбування здійснювали через двоє діб після ip введення, щоб виявити відкладення pTau і зв'язані антитіла підтипу IgG миші. Групи по три миші у кожній умертвляли через двоє діб після дозування. Мишей піддавали глибокій анестезії (~2 хвилини у 5% об/об Forene™ майже до досягнення стану асфіксії), потім розкривали грудну клітку, і перикардій витягали й перфузували ФСБ, і мишей піддавали декапітації, головний мозок ділили навпіл і швидко заморожували на сухому льоді. Парасагітальні зрізи на кріостаті свіжозаморожених головних мозків різали при товщині 20 мкм кріостатом (CM3050S, Leica), закріплювали на попередньо охолоджених стеклах Histobond (Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany) і зберігали при -20 °C. Потрійне імунофлуоресцентне фарбування наносили, щоб виявити зв'язані антитіла антиTau pS422. Зрізи гідратували у ФСБ і обробляли 100% ацетоном,попередньо охолодженим до 20 °C, протягом 2 хв. Всі наступні стадії послідовно проводили в автоматі для фарбування (Autostainer Plus DakoCytomation, High Wycombe, UK) при кімнатній температурі. Стекла зі зрізами головного мозку промивали ФСБ, що містить 0,01% Твін 20, pH 7,4, протягом 5 хвилин і блокували сайти неспецифічного зв'язування послідовною інкубацією у ФСБ з 1% бичачим сироватковим альбуміном, 1% овальбуміном і 1% нормальною сироваткою кози протягом 20 хвилин. Після відмивання ФСБ і 0,01% Твіном 20 стекла інкубували зі специфічними до ізотипу IgG ідентифікуючими антитілами, тобто очищеними афінною хроматографією IgG1, IgG2a або ® IgG2b коза проти миші, ковалентно кон’югованими з барвником Alexa Fluor 488 (A21121, A21131 або A21141, Molecular Probes), при 20 мкг/мл в 1% БСА у ФСБ, pH 7,4 протягом 1 години. Після відмивання ФСБ з 0,01% Твіном 20 локалізацію pTau оцінювали за допомогою мічення 5 мкг/мл антитіла анти-pTau (AT-8, Pierce Biotechnology), мишачого моноклонального антитіла до фосфорилованого епітопу S202/205 у білку Tau, яке було ковалентно кон’юговане з барвником Alexa Fluor 555, і наносили його у ФСБ з 1% бичачим сироватковим альбуміном, 1% 17 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 овальбуміном і 1% нормальною сироваткою кози протягом 1 години. Після відмивання ФСБ і 0,01% Твіном 20 клітинні ядра контрастно офарбовували 4,6'-діамідино-2-фенілідолом (DAPI) при 1 мкг/мл у ФСБ протягом 5 хвилин. Після відмивання ФСБ і 0,01% Твіном 20 власну флуоресценцію ліпофусцину знижували гасінням за допомогою інкубації у 4 мМ CuSO 4 у 50 мМ ацетаті амонію, pH 5 протягом 30 хвилин. Після промивання стекол двічі дистильованою водою ® й кінцевим відмиванням ФСБ і 0,01% Твіном 20 стекла брали флуоресцентним заливальним середовищем (S3023 DakoCytomation, High Wycombe, UK). Зображення максимальної проекції знімали послідовно у каналах випромінення, що не перекриваються, за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа Leica SP2, AOBS при установці об'єктива 1 Ері. Істотна патологія pTau відзначена у мишей TauPS2APP у віці 24 місяця. Типово декілька нейронів, які мають сильний позитивний сигнал внутрішньоклітинного Tau pS422, було виявлено у межах префронтальної кори й шарі пірамідальних клітин зони CA1 гіпокампа й зони, яка примикає до опорної структури. Було виявлено, що у цьому віці pTau поширюється у поліморфний шар і уздовж границі жолоба гіпокампа у зону CA3 і фімбрій, а також у крайову смужку. Імунологічні фарбування у зонах префронтальної кори й CA1 з гіпокампального утворення у мишей TauPS2APP у віці 24 місяця показано у зображеннях конфокальної мікроскопії (фіг. 1-6). Антитіла до внутрішньоклітинного pTau і введені антитіла на підтип IgG були чітко виявлені й спільно локалізовані у клітинах зон головного мозку з істотною патологією pTau. Репрезентативні приклади внутрішньоклітинної локалізації IgG1 показані на фіг. 1, 3 і 4 з контролем-носієм (фіг. 2). Клітини, позитивні за IgG2a (фіг. 5) і IgG2b (фіг. 6), також були виявлені у деяких клітинах. Деякі з pTau-позитивних клітин проявляли типову нейрофібрилярну морфологію, що нагадує нейрофібрилярні клубки, які виявлені у нейронах, що дегенерують, тканини головного мозку від пацієнтів з ХА. Спільно локалізовану імунологічну реактивність антитіл підтипу IgG миші, зокрема, для IgG1 і pTau, спостерігали у дендритних відростках, типово у префронтальній корі й шарі гранулярних клітин у зоні CA1 гіпокампального утворення (фіг. 3 і 4). Всі протестовані антитіла анти-Tau pS422 показали специфічне зв'язування з внутрішньоклітинними відкладеннями pTau. Однак ступінь зв'язування варіювала між трьома ізотипами IgG, як показано у таблиці 3. Таблиця 3 Антитіло Таu_.2.10.3 Таu_.2.20.4 Таu_.5.6.11 Ізотип IgG Інтенсивність TauPS2APP Фарбування lgG1 lgG2a lgG2b у головному мозку миші XXX X X де Х= слабка, XX = середня й ХХХ= сильна реактивність ІГХ 35 40 45 50 Приклад 9 Хронічна обробка моноклональним антитілом анти-Tau pS422 зменшує патологію Tau у мишачій моделі хвороби Альцгеймера Здатність мишачого анти-Tau pS422 Mab до зменшення патології Tau у мишей у мишачій моделі хвороби Альцгеймера тестують шляхом введення антитіла потрійним трансгенним мишам Tau.PS2APP протягом періоду 4 місяці. Таким чином, групу з 20 потрійних трансгенних мишей Tau.PS2APP у віці 7 місяців обробляють ip введенням один раз на тиждень мишачого анти-Tau pS422 Mab (клон 2.10.3). Антитіло вводять при концентрації 2 мг/мл у носії (20 мМ гістидин, 140 мМ NaCl pH 6,0) з одержанням кінцевої дози 20 мг/кг. Друга група з 20 потрійних трансгенних мишей одержує еквівалентний об'єм носія. Після 4 місяців всіх мишей умертвляють і витягають головний мозок, як описано у Прикладі 5. Потім кожний мозок ділять на дві півкулі, одну з яких готують для імуногістохімічного аналізу, як описано у Прикладі 5. Другу півкулю використовують для кількісного визначення рівнів pTau шляхом імунологічного аналізу, як описано нижче. 1. Екстракція головного мозку миші для кількісних аналізів Tau і pTau Головний мозок зважують і гомогенізують скляним гомогенізатором у 10 об'ємах охолодженого у льоді буфера, що містить 25 мМ Трис-Cl, 800 мМ NaCl, 10% сахарозу, pH 7,5. 18 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Потім гомогенати центрифугують при 20000 x g. Отримані у результаті супернатанти розводять ® ФСБ/1% БСА/1% Твін 20 1:100 (для аналізів Tau) або 1:10 (для аналізів pTau). 2. Кількісні аналізи Tau і pTau Всі аналізи проводять, використовуючи аналітичну платформу Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland, USAMD). Іммобілізуючі та ідентифікуючі антитіла мітять біотином і SULFO-Tag™, відповідно, у відповідності зі стандартними протоколами, запропонованими фірмою MSD. В аналізах були використані наступні антитіла: (i) 5A6, мишаче антитіло, спрямоване проти амінокислот 19-46 у Tau, як описано в Johnson, G.V. et al., J. Neurochem 68 (1997) 430-433; (ii) AT180, мишаче антитіло, спрямоване проти pT231 у Tau [Innogenetics, Belgium]; (iii) мишаче анти-Tau pS422 клон 2.5.2, як описано в EP1876185A1; (iv) мишаче антиTau клон 4/53, індуковане проти повнорозмірного Tau. Антитіло 5A6 використовують в якості іммобілізуючого антитіла, інші антитіла використовують як ідентифікуючі антитіла. 96-ямкові планшети MSD, покриті стрептавідином, блокують протягом 1 год при КТ 5% БСА. ® Планшети відмивають три рази відмивним буфером (ФСБ, 0,05% Твін 20). Потім додають ® іммобілізуюче антитіло, розведене в аналітичному буфері (ФСБ/1% БСА/1% Твін 20), і планшети інкубують при 4°C протягом 30 хвилин. Потім планшети відмивають один раз. Потім у кожну ямку додають 75 мкл аналітичного буфера, після чого додають 25 мкл розведеного супернатанта головного мозку й 25 мкл Sulfo-міченого ідентифікуючого антитіла. Планшети струшують при 4°C протягом 1 год, а потім відмивають один раз. Нарешті, додають 170 мкл MSD Read Buffer, і планшети зчитують на MSD Sector Imager 6000. Щоб дати можливість кількісного визначення Tau і Tau pS422 в екстрактах головного мозку миші, будували стандартні криві, використовуючи Tau і Tau pS422, отримані, як описано у Прикладі 2. Про зниження патології Tau у потрійних трансгенних мишей Tau.PS2APP у результаті хронічної обробки моноклональним антитілом анти-Tau pS422 свідчило зменшення типової патології Tau, яке спостерігали у мишей, оброблених антитілом, у віці 11 місяців у порівнянні з мишами того ж віку, обробленими носієм. Це зменшення продемонстроване за зниженою вагою нейрофібрилярних клубків, як виявлено за допомогою імуногістохімії, і за зниженим рівнем різних видів pTau, присутніх в екстрактах головного мозку, як виміряно за допомогою кількісного імунологічного аналізу. Приклад 10 Одержання й очищення антитіл кролика a) Імунізація Для імунізації використовували кроликів лінії NZW з Charles River Laboratories International, Inc. Фосфопептид Tau (416-430)[pS422], підданий сполученню на KLH, розчиняли у буфері K3PO4 pH 7,0 при концентрації 1 мг/мл і змішували (1:1) з повним ад’ювантом Фрейнда (ПАФ) до утворення стабільної емульсії. Три кролики одержали внутрішньошкірну (i.d.) ін'єкцію 2 мл емульсії з наступною другою внутрішньом'язовою (i.m.) і третьою підшкірною (s.c.) ін'єкцією, кожна по 1 мл з інтервалом в один тиждень. Четверту i.m. ін'єкцію 1 мл здійснювали через два тижні після двох наступних s.c. ін'єкцій по 1 мл з чотиритижневим інтервалом. Зразки по 10 мл периферичної цільної крові кожної тварини збирали через 4-6 діб після третьої, четвертої, п’ятої і шостої ін'єкції та використовували для сортування окремих клітин FACS (флуоресцентного сортування активованих клітин). Додатково 0,5 мл сироватки кожної тварини збирали у той же час і використовували для визначення специфічної відповіді антитіла Tau (416-463)[pS422]. b) Відповідь антитіла Відповідь антитіла на імунізацію визначали шляхом серійного розведення сироваток, використовуючи ELISA, в якому 30 нг на ямку біотинілованого Tau (416-430)[pS422] інкубували в o 1x ФСБ при 4 C протягом ночі на 96-ямкових мікротитраційних планшетах (MC1347, Micro Coat Biotechnologie GmbH, Bernried, Germany), попередньо оброблених стрептавідином. Для виявлення IgG коза проти кролика, який зшитий з пероксидазою хріну (The Jackson laboratory), використовували при розведенні 1:16000. Субстрат BM Blue POD, що осаджує тетраметилбензидин (TMB), готовий до вживання розчин від фірми Roche Diagnostics GmbH, використовували для візуалізації. Реакцію зупиняли 1 н. HCl і вимірювали у Tecan Infinite при 450/690 нм. c) Клонування B-клітин Покриття планшетів Стерильні 6-ямкові планшети, покриті стрептавідином (градації для клітинних культур), інкубували або з сумішшю 3 біотинілованих контрольних пептидів (нефосфорилований Tau (416-430), MCAK_Human (88-102)[95-pSer] і MAP2_Human (1802-1816)[pSer-1802]), або збіотинілованим фосфопептидом Tau (416-430)[pS422], кожний у концентрації 0,5-1 мкг/мл у ФСБ 19 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 при кімнатній температурі протягом 1 год. Планшети відмивали у стерильному ФСБ три рази перед використанням. 6-ямкові планшети для клітинних культур покривали 2 мкг/мл KLH (гемоціаніном лімфи равлика) у карбонатному буфері (0,1 M бікарбонат натрію, 34 мМ двозаміщений гідрокарбонат натрію, pH 9,55) протягом ночі при 4°C. Планшети відмивали у стерильному ФСБ три рази перед використанням. Виділення мононуклеарних клітин периферичної крові кролика (МНПК) Цільну кров, що містить ЕДТА, розводили у два рази 1x ФСБ перед центрифугуванням у градієнті щільності на лімфоліті для ссавців (Cedarlane Laboratories), що здійснювали для виділення МНПК кролика. МНПК двічі промивали перед фарбуванням антитілами. Середовище EL-4 B5 Середовище RPMI 1640 (Pan Biootech, Aidenbach, Germany) з додаванням 10% ФСТ (Hyclone, Logan, UT, USA), 2 мМ глутаміну, 1% розчину пеніциліну/ стрептоміцину (PAA, Pasching, Austria), 2 мМ пірувату натрію, 10 мМ ГЕПЕС (PAN Biotech, Aidenbach, Germany) і 0,05 мМ бета-меркаптоетанолу (Gibco, Paisley, Scotland) Виснаження макрофагів/моноцитів Стерильні 6-ямкові планшети (градації для клітинних культур) використовували для виснаження макрофагів і моноцитів за допомогою неспецифічної адгезії. Ямки покривали або KLH (гемоціаніном лімфи равлика), або стрептавідином і контрольними пептидами. Кожну ямку заповнювали максимум 4 мл середовища й мононуклеарними клітинами периферичної крові у 6 кількості аж до 6x10 від імунізованого кролика й давали можливість для зв'язування протягом 1 год при 37°C в інкубаторі. 50% клітин у супернатанті використовували для стадії пеннінгу; інші 50% клітин безпосередньо піддавали імунофлуоресцентному фарбуванню й сортуванню окремих клітин. Пеннінг B-клітин на пептидах 6-ямкові планшети для клітинних культур, покриті стрептавідином і біотинілованим пептидом 6 Tau (416-430)[pS422], засівали клітинами у кількості аж до 6x10 на 4 мл середовища й давали можливість для зв'язування протягом 1 год при 37°C в інкубаторі. Не прикріплені клітини видаляли обережним відмиванням ямок 1-2 рази 1x ФСБ. Інші прикріплені клітини відокремлювали трипсином протягом 10 хв при 37°C в інкубаторі, а потім двічі відмивали у середовищі. Клітини тримали на льоді до імунофлуоресцентного фарбування. Імунофлуоресцентне фарбування й сортування окремих клітин Мічене ФІТЦ (флуоресцеїнізотіоціанатом) IgG використовували для сортування окремих клітин за допомогою AbD Serotec (STAR121F, Düsseldorf, Germany). Для поверхневого фарбування клітини зі стадії виснаження й пеннінгу інкубували з міченим ФІТЦ антитілом IgG проти кролика у ФСБ протягом 30-хвилинного хитання у холодній кімнаті при 4°C у темряві. Після центрифугування супернатанти видаляли відсмоктуванням. МНПК піддавали 2 циклам центрифугування й відмивання охолодженим у льоді ФСБ. Нарешті, МНПК ресуспендували в охолодженому у льоді ФСБ і відразу піддавали аналізам FACS. Перед аналізами FACS додавали пропідіумйодид у концентрації 5 мкг/мл (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) для розрізнення мертвих і живих клітин. FACS проводили, використовуючи прилад Becton Dickinson FACSAria, обладнаний програмним забезпеченням FACSDiva (BD Biosciences, USA), і окремі, мічені ФІТЦ живі клітини депонували в 96-ямкових планшетах. B-клітинна культура B-клітинні культури одержували способом, подібним описаному у статті Zubler, R.H. et al., J Immunol. 134 (1985) 3662-3668. Коротко, окремі сортовані B-клітини культивували в 96-ямкових планшетах з 210 мкл/ямку середовища EL-4 B5 з Pansorbin Cells (1:20000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland), 5% супернатантом тимоцитів кролика й опроміненими гаммавипромінюванням клітинами тимоми миші EL-4-B5 (2 × 104/ямку) протягом 7 діб при 37°C в атмосфері 5% CO2 в інкубаторі. Супернатанти B-клітинної культури витягали для скринінгу, і клітини відразу збирали для клонування гена варіабельної області або заморожували при −80°C у 100 мкл буфера RLT (Qiagen, Hilden, Germany). d) Скринінг B-клітинних клонів Супернатанти B-клітинної культури піддавали скринінгу на зв'язування з біотинілованим Tau (416-430)[pS422] за допомогою ELISA. Нефосфорилований Tau (416-430), KLH (гемоціанін лімфи равлика) і неопрацьований фосфопептид MCAK_Human (88-102)[95-pSer] використовували як контрольні антигени. Для готування планшетів ELISA мікротитраційні планшети, попередньо покриті стрептавідином, інкубували з біотинілованим Tau (415430)[pS422] при 50 нг/мл протягом 1 години при кімнатній температурі. Покриття KLH або контрольними пептидами здійснювали при 1 мкг/мл. Супернатанти B-клітин розводили від 1:5 до 1:10 та інкубували у мікротитраційних планшетах, покритих антигеном, протягом 60 хв. Після 20 UA 99579 C2 5 10 15 інтенсивного відмивання зв'язування антитіл кролика виявляли, використовуючи ідентифікуюче антитіло IgG вівця проти кролика, кон’юговане з дигоксигеніном (Chemicon AQ301D). Після інкубації з TMB при кімнатній температурі вимірювали поглинання при 370 нм - 492 нм. Bклітинні клони, що дають сигнали вище фонових з біотинілованим Tau (416-430)[pS422], але не дають сигнали з KLH і MCAK_Human (88-102)[95-pSer], розглядали далі й піддавали клонуванню гена варіабельної області. e) ПЛР ампліфікація V-доменів і секвенування ® Сумарну РНК одержували, використовуючи набір для РНК NucleoSpin 8/96 (Macherey&Nagel; 740709.4, 740698) відповідно до протоколу фірми-виготовлювача. Всі стадії проводили на системі роботи з рідинами epMotion 5075 (Eppendorf). РНК елюювали 60 мкл води, вільної від РНК-аз. 6 мкл РНК використовували для одержання кДНК за допомогою зворотно-транскриптазної реакції, використовуючи набір для синтезу першої нитки Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen 18080-400) і олігоdТ-праймер відповідно до інструкцій фірми-виготовлювача. 4 мкл кДНК використовували для ампліфікації варіабельних областей важкого й легкого ланцюга імуноглобуліну (VH і VL) з сумішшю AccuPrime Supermix (Invitrogen 12344-040) у кінцевому об'ємі 50 мкл, використовуючи праймери rbHCfinal.up і rbHCfinal.do для важкого ланцюга й rbLCfinal.up і rbLCfinal.do для легкого ланцюга (Таблиця 4). Умови ПЛР були наступними: “гарячий старт” при 94°C протягом 5 хв; 35 циклів 20 с при 94°C, 20 с при 70°C, 45 с при 68°C і кінцева елонгація при 68°C протягом 7 хв. 20 Таблиця 4 rbHCfinal.up rbHCfinal.do rbLCfinal.up rbLCfinal.do 25 30 35 40 45 50 AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC 8 мкл із 50 мкл розчину ПЛР наносили на 48 E-Gel 2% (Invitrogen G8008-02). Позитивні ® реакції ПЛР очищали, використовуючи набір NucleoSpin Extract II (Macherey&Nagel; 740609250) відповідно до протоколу фірми-виготовлювача, і елюювали у 50 мкл буфера для елюювання. 12 мкл очищених продуктів ПЛР секвенували безпосередньо в обох напрямках, використовуючи rbHCfinal.up і rbHCfinal.do для важких ланцюгів і rbLCfinal.up і rbLCfinal.do для легких ланцюгів (Таблиця 4). d) Рекомбінантна експресія моноклональних антитіл кролика й химерні антитіла кролик/миша Для рекомбінантної експресії моноклональних антитіл кролика продукти ПЛР, що кодують VH або VL, клонували у вигляді кДНК в експресійних векторах способом клонування з виступаючими кінцями (Haun, R.S. et al., Biotechniques 13 (1992) 515-518; Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256). Лінеаризовані експресійні плазміди, що кодують константну область каппа або гамма кролика, і вставки VL або VH, ампліфікували за допомогою ПЛР, використовуючи праймери, що перекриваються. Очищені продукти ПЛР інкубували з T4 ДНК полімеразою, яка утворює виступаючі однониткові кінці. Реакцію зупиняли додаванням dCTP. На наступній стадії плазміду й вставку поєднували та інкубували з recA, який індукує сайтспецифічну рекомбінацію. Рекомбіновані плазміди трансформували в E.coli. На наступну добу вирослі колонії збирали й тестували на правильно рекомбіновану плазміду шляхом одержання препарату плазміди, рестрикційного аналізу й секвенування ДНК. Для експресії антитіла ізольовані плазміди HC і LC транзитно котрансфікували у клітини HEK293, і супернатанти збирали через 1 тиждень. Для клонування й експресії химерних антитіл кролика й миші області VH і VL ампліфікували за допомогою ПЛР і субклонували в експресійних векторах, що містять константну область каппа миші або константну область гамма 1 миші. Химерні плазміди кролик/миша HC і LC виділяли, тестували за допомогою рестрикційного аналізу й секвенування ДНК на правильну вставку й транзитно котрансфікували у клітини HEK293. Супернатанти збирали через тиждень після трансфекції. e) Очищення антитіла Рекомбінантно експресовані моноклональні антитіла кролика очищали з супернатантів клітинної культури на колонках MabSelectSuRe™ (GE Healthcare). Перед нанесенням зразка колонку врівноважували 25 ммоль/л Трис-HCl, 25 ммоль/л NaCl, pH 7,4. Елюювання антитіла здійснювали 50 ммоль/л ацетату, pH 3,14. Елюйований зразок відразу наносили на колонку для знесолення (Sephadex G25, GE Healthcare) та елюювали у 20 ммоль/л His-HCl, 140 ммоль/л NaCl, pH 6,0. Цей буфер також використовували для зберігання очищеного антитіла. Звичайна 21 UA 99579 C2 5 10 15 20 25 30 35 температура зберігання становила 4°C, кімнатну температуру під час процесу очищення й -80°C після розподілу на аліквоти. Рекомбінантно експресовані химерні антитіла кролик/миша з супернатантів клітинних культур очищали на колонках MabSelectSuRe™ (GE Healthcare). Перед нанесенням зразка колонку врівноважували 1x ФСБ, pH 7,4. Елюювання антитіл здійснювали 100 ммоль/л цитрату, pH 3,0. Елюйований зразок відразу нейтралізували 2 моль/л Трис/HCl pH 9,0. Потім антитіла наносили на колонку для гель-фільтрації (Superdex 200, GE Healthcare) та елюювали у 20 ммоль/л His-HCl, 140 ммоль/л NaCl, pH 6,0. Цей буфер також використовували для зберігання очищених антитіл. Звичайна температура зберігання становила 4°C, кімнатну температуру під час процесу очищення й -80°C після розподілу на аліквоти. Приклад 11 Моноклональні антитіла кролика анти-Tau pS422 високоселективні для Tau, фосфорилованого за pS422, і зв'язуються з фібрилярними агрегатами Tau pS422 a) ELISA Моноклональні антитіла кролика рекомбінантно експресували у клітинах HEK 293. Супернатанти клітинних культур або очищені антитіла кролика тестували на зв'язування з біотинілованим Tau (416-430)[pS422], нефосфорилованим Tau (416-430), KLH (гемоціанін лімфи равлика) і неопрацьованим фосфопептидом MCAK_Human (88-102)[95-pSer] за допомогою ELISA. Для готування планшетів ELISA мікротитраційні планшети, попередньо покриті стрептавідином, інкубували з біотинілованим Tau (415-430)[pS422] при 50 нг/мл протягом 1 години при кімнатній температурі. Покриття KLH або контрольними пептидами здійснювали при 1 мкг/мл. Антитіло анти-Tau pS422 кролика (Abcam AB51071) або супернатанти, що містять антитіло кролика, інкубували у мічених антигеном мікротитраційних планшетах протягом 60 хв при різних концентраціях. Після інтенсивного відмивання зв'язування антитіл кролика виявляли, використовуючи ідентифікуюче антитіло IgG вівця проти кролика, кон’юговане з дигоксигеніном. Після інкубації з TMB при кімнатній температурі вимірювали поглинання при 370 нм - 492 нм. Зв'язування антитіла характеризували за його значеннями EC 50. Зв'язування антитіла з пептидами, що являють собою біотинілований Tau (416-430)[pS422] і нефосфорилований Tau (416-430), характеризували за його значеннями EC50. Перехресну реактивність з KLH або фосфопептидом MCAK оцінювали шляхом вимірювання в одній точці при високих концентраціях, тобто при розведенні супернатантів клітинних культур 1:5. Результати показані у таблиці 5. Було виявлено, що значення EC50 зв'язування з фосфопептидом Tau більше ніж у 100 разів нижче, ніж значення EC50 зв'язування з пептидом Tau, що вказує на щонайменше 100кратну селективність для фосфорилованого фрагмента Tau у порівнянні з нефосфорилованим пептидом Tau. Зв'язування з KLH і контрольним фосфопептидом MCAK перебувало на рівні фона з усіма антитілами, що становить приблизно 1