Антитіло, яке специфічно зв’язується з cd22, та його терапевтичне та діагностичне застосування

1. Молекула антитіла, яка має специфічність відносно CD22 людини, що містить важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить SEQ ID NO: 1 для CDR-H1, SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 13, або SEQ ID NO: 15, або SEQ ID NO: 16, або послідовність GINPGNNYATYRRKFQG, наведену в gН7 на Фіг.6, для CDR-H2, і SEQ ID NO: 3 для CDR-H3, і легкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, SEQ ID NO: 5 для CDR-L2 і SEQ ID NO: 6 для CDR-L3. 2. Молекула антитіла за п.1, яка є CDR-щепленою молекулою антитіла. 3. Молекула антитіла за п.2, в якій варіабельний домен містить акцепторні людські каркасні ділянки і донорні CDR тварини, яка відрізняється від людини. 4. Молекула антитіла за п.3, в якій людські акцепторні каркасні ділянки варіабельного домену важкого ланцюга основані на послідовностях SEQ ID NO: 21 і SEQ ID NO: 22 і містять донорні залишки в положеннях 1, 28, 48, 71 і 93, згідно з нумерацією Kabat, які відповідають залишкам 1, 28, 48, 72 і 97, відповідно, в послідовності SEQ ID NO: 8. 5. Молекула антитіла за п.4, що додатково містить донорні залишки в положеннях 67 і 69, згідно з нумерацією Kabat, які відповідають залишкам 68 і 70, відповідно, в послідовності SEQ ID NO: 8. 6. Молекула антитіла за п.3, в якій людські акцепторні каркасні області варіабельного домену легкого ланцюга основані на послідовностях SEQ ID NO: 17 і SEQ ID NO: 18 і містять донорні залишки в положеннях 2, 4, 37, 38, 45 і 60, згідно з нумераці UA (21) 20041209866 (22) 02.05.2003 (24) 25.11.2010 (86) PCT/GB03/01934, 02.05.2003 (31) 0210121.0 (32) 02.05.2002 (33) GB (46) 25.11.2010, Бюл.№ 22, 2010 р. (72) ПОППЛВЕЛЛ ЕНДРЮ ДЖОРДЖ, GB, ТІКЛ САЙМОН ПІТЕР, GB, ЛЕДІМЕН ХЕДЕР МАРГАРЕТ, GB (73) Ю-СІ-БІ ФАРМА С.А., BE (56) WO A 9604925, 22.02.1996. WO A 0194585, 13.12.2001. WO A 9215683, 17.09.1992. WO A 9429451, 22.12.1994. US A 5714350, 03.02.1998. WO A 9109967, 11.07.1991. S. LEUNG ET AL.: "Construction and characterization of a humanized, internalizing, B-cell (CD22)-specific, leukemia/lymphoma antibody, LL2." MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 32, no. 17/18, December 1995 (1995-12), pages 1413-1427, XP000942678 Oxford, GB. S. LEUNG ET AL.: "Effect of Vk framework-1 glycosylation on the binding affinity of lymphomaspecific murine and chimeric LL2 antibodies and its potential use as a novel conjugation site." INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 60, 1995, pages 534-538, XP002066554 New York, NY, USA. I. BENHAR ET AL.: "Mutations of two lysine residues in the CDR loops of a recombinant immunotoxin that reduce its sensitivity to chemical derivatization." BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. 5, July 1994 (1994-07), pages 321-326, XP000564453 Washington, DC, USA. T. VAUGHAN ET AL.: "Human antibodies by design." NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 16, June 1998 (1998-06), pages 535-539, XP000941675 New York, NY, USA. 2 (19) 1 3 92580 4 єю Kabat, які відповідають залишкам 2, 4, 42, 43, 50 і 65, відповідно, в послідовності SEQ ID NO: 7. 7. Молекула антитіла за п.6, яка додатково містить донорний залишок в положенні 3, згідно з нумерацією Kabat, який відповідає залишку в цьому положенні в послідовності SEQ ID NO: 7. 8. Молекула антитіла за п.1, яка є молекулою мишачого моноклонального анти-CD22-антитіла 5/44, в якій варіабельний домен легкого ланцюга має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 7, і варіабельний домен важкого ланцюга має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 8. 9. Молекула антитіла за п.1, яка є химерною молекулою антитіла, що містить послідовності варіабельних доменів легкого і важкого ланцюгів моноклонального антитіла за п.8, зазначені в SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, відповідно. 10. Молекула антитіла, яка має специфічність відносно CD22 людини, яка містить важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить CDR, що має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 1 для CDRH1, послідовність GINPGNNYATYRRKFQG для CDR-H2 і послідовність SEQ ID NO: 3 для CDR-H3, і містить легкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить CDR, що має послідовність наведену в SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, SEQ ID NO: 5 для CDR-L2 і SEQ ID NO: 6 для CDR-L3. 11. Молекула антитіла, яка має специфічність відносно CD22 людини, що містить важкий ланцюг за п.4 і легкий ланцюг за п.6. 12. Молекула антитіла, яка має специфічність відносно CD22 людини, за будь-яким з пп.1-7, 10-11, що містить варіабельну ділянку легкого ланцюга 5/44-gL1 (SEQ ID NO: 19) і варіабельну ділянку важкого ланцюга 5/44-gН7 (SEQ ID NO: 27). 13. Молекула антитіла, яка має специфічність відносно CD22 людини, що має легкий ланцюг, який містить послідовність, наведену в SEQ ID NO: 28, і важкий ланцюг, який містить послідовність, наведену в SEQ ID NO: 30. 14. Варіант молекули антитіла за будь-яким з пп.13, який після видалення сайта глікозилювання або реакційноздатного лізину має підвищену афінність у відношенні CD22 у порівнянні з мишачим моноклональним антитілом, з якого він отриманий. 15. Варіант за п.14, який отриманий з використанням протоколу дозрівання афінності. 16. Послідовність ДНК, яка кодує важкий ланцюг і/або легкий ланцюг молекули антитіла за будьяким з пп.1-13. 17. Клонуючий вектор, який містить послідовність ДНК за п.16. 18. Експресуючий вектор, який містить послідовність ДНК за п.16. 19. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п.17. 20. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п.18. 21. Застосування CDR-щепленої молекули антитіла за будь-яким з пп.1-13 або послідовності ДНК за п.16 для лікування патології, опосередкованої клітинами, експресуючими D22. 22. Застосування за п.21, де вказаною патологією є злоякісна лімфома. 23. Застосування за п.22, де злоякісною лімфомою є неходжкінська лімфома. 24. Застосування CDR-щепленої молекули антитіла за будь-яким з пп.1-13, яка має специфічність відносно CD22 людини, або застосування послідовності ДНК за п.16 у виробництві лікарського засобу для лікування патології, опосередкованої клітинами, що експресують CD22. 25. Застосування за п.24, де патологія являє собою злоякісну лімфому. 26. Застосування за п.25, де злоякісною лімфомою є неходжкінська лімфома. 27. Спосіб одержання молекули антитіла за будьяким з пп.1-13, що включає в себе культивування клітини-хазяїна за будь-яким з пп.19 або 20 в умовах, які придатні для експресії білка з ДНК, що кодує зазначену молекулу антитіла, і виділення з вказаної молекули антитіла. 28. Спосіб одержання терапевтичної або діагностичної композиції, яка містить молекулу антитіла за будь-яким з пп.1-13 або послідовність ДНК за п.16, що включає в себе змішування вказаної молекули антитіла за будь-яким з пп.1-13 з фармацевтично прийнятним наповнювачем, розріджувачем або носієм. Даний винахід відноситься до молекули антитіла, що володіє специфічністю по відношенню до антигенних детермінантів антигену В-лімфоцитів CD22. Даний винахід також відноситься до терапевтичних застосувань молекули антитіла і способів одержання молекули антитіла. У природній молекулі антитіла є два важких ланцюги і два легких ланцюги. Кожний важкий ланцюг і кожний легкий ланцюг має на своєму N-кінці варіабельний домен. Кожний варіабельний домен складається з чотирьох каркасних ділянок (FR), що чергуються з трьома ділянками, які визначають комплементарність (CDR). Залишки варіабельних доменів традиційно нумерують згідно з системою, розробленою Kabat et al. Дана система вказана в Kabat et al, 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (в подальшому «Kabat et al. (вище)»). Вказану систему нумерації використовують в даному описі за винятком випадків, обумовлених особливо. Позначення залишків по Кабату не завжди безпосередньо відповідає лінійній нумерації амінокислотних залишків. Реальна лінійна амінокислотна послідовність може містити менше або містити додаткові амінокислоти у порівнянні з суворою нумерацією Кабата, що відповідає укороченню або інсерції структурного компонента або в каркасі, або в CDR основній структури варіабельного домену. Правильну нумерацію залишків по Кабату можна визначити для даного антитіла вирівнюванням залишків гомології в послідовності антитіла зі «стандартною» пронумерованою по Кабату послідовністю. CDR варіабельного домену важкого ланцюга розташовані в залишках 31-35 (CDR-H1), залишках 5 50-65 (CDR-H2) і залишках 95-102 (CDR-H3) згідно з нумерацією Кабата. CDR варіабельного домену легкого ланцюга розташовані в залишках 24-34 (CDR-L1), залишках 50-56 (CDR-L2) і залишках - 89-97 (CDR-L3) згідно з нумерацією Кабата. Конструювання CDR-прищеплених антитіл описане в Європейській заявці на видачу патенту ЕР-А-0239400, в якій заявлений спосіб, за допомогою якого CDR мишачого моноклонального антитіла прищеплюють в каркасні ділянки варіабельних доменів імуноглобуліну людини сайт-направленим мутагенезом, використовуючи довгі олiгонуклеотиди. CDR визначають антигензв'язувальну специфічність антитіл і являють собою відносно короткі пептидні послідовності, які утримуються каркасними ділянками варіабельних доменів. Найбільш ранню роботу з гуманізації моноклональних антитіл за допомогою CDR-щеплення здійснювали на моноклональних антитілах, що впізнають синтетичні антигенні, такі як NP. Однак описані приклади, в яких CDC-щепленням гуманізували мишаче моноклональне антитіло, що впізнає лізоцим, і щуряче моноклональне антитіло, що впізнає антиген на Т-клітинах людини, Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) і Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), відповідно. Riechmann et al. виявили, що окремо перенесення CDR (які визначені Kabat (Kabat et al. (вище) і Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) було недостатнім для забезпечення задовільної антигензв'язувальної активності в CDR-прищепленому продукті. Виявили, що ряд каркасних залишків повинні бути змінені так, щоб вони відповідали залишкам каркасної ділянки донора. Запропоновані критерії для вибору каркасних залишків, які необхідно змінити, описані в міжнародній заявці на видачу патенту No.WO 90/07861. Опублікований ряд оглядів, в яких обговорюються CDR-прищеплені антитіла, включаючи Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). Злоякісні лімфоми являють собою різноманітну групу неоплазм. Більшість випадків зустрічається у немолодих людей. Неходжкінська лімфома (NHL) є захворюванням, яке в цей час вражає від 200000 до 250000 пацієнтів в США. Це друге злоякісне пухлинне захворювання, що найбільш швидко розповсюджується в США, яке розповсюджується зі швидкістю приблизно 55000 нових випадків на рік. Частота зустрічальності зростає зі швидкістю, яка вище, ніж можна розрахувати просто через збільшення віку популяції і впливу відомими факторами ризику. Класифікація лімфом є складною, і вона була розроблена в останні десятиріччя. У 1994р. введена виправлена євро-американська класифікація лімфом (REAL). В даній класифікації лімфоми Вклітинної (що найчастіше ідентифікуються), Тклітинної і некласифікованої природи систематизовані в умовні підтипи. У щоденній практиці розподіл NHL на категорії низької, проміжної і високої міри злоякісності на основі їх загального гістологі 92580 6 чного прояву широко відображає їх клінічну поведінку. NHL переважно вражає лімфатичні вузли, але у окремих пацієнтів в пухлину можуть бути залучені інші анатомічні місця, такі як печінка, селезінка, кістковий мозок, легеня, кишечник і шкіра. Захворювання звичайно існує у вигляді безболісного збільшення лімфатичних вузлів. Екстронодальна лімфома найчастіше вражає кишечник, хоча документально показана первинна лімфома фактично кожного органу. Системні симптоми включають лихоманку, потіння, слабкість і втрату ваги. До цього часу основним визначальним фактором в терапії NHL була система стадіювання по Ann Arbor, повністю основана на анатомічній мірі захворювання. Дана інформація може бути деталізована включенням додаткових прогностичних показників, включаючи вік, рівні лактатдегідрогенази в сироватці і статус прояву. Але і при цьому знання системи стадіювання по Ann Arbor разом з гістологічним і імунологічним підтипом пухлини все ще є основним визначальним фактором лікування. NHL низької міри злоякісності має в'яле протікання з середньою виживаністю пацієнтів від 8 до 10 років. Лікування, що існує в наш час, мало впливає на виживаність, хоча опромінення локального захворювання і хіміотерапія у випадку системних симптомів поліпшує якість життя пацієнтів. Комбінована хіміотерапія може бути призначена для рецидивуючого захворювання. Захворювання проміжної і особливо захворювання високої міри злоякісності є надзвичайно агресивним і має тенденцію до дисемінації. Захворювання такої міри вимагає невідкладного лікування. Променева терапія може бути корисним компонентом лікування пацієнтів з дуже масивним захворюванням. Використана множина різних схем хіміотерапії і довготривала безрецидивна виживаність може бути одержана у більше ніж половини пацієнтів. Терапія високими дозами з підтримкою стволовими клітинами спочатку вводилась для пацієнтів з рецидивуючим або рефрактерним захворюванням, але в наш час все більше і більше знаходить місце в терапії першої лінії для пацієнтів із захворюванням високого ризику. В останні роки тенденція до все більш агресивного терапевтичного підходу повинна бути урівноважена у відношенні загалом більш немолодого віку і пов'язаною з цим фізичною слабкістю багатьох пацієнтів з NHL і необхідністю узгодження токсичності лікування з індивідуальним прогнозом кожного випадку захворювання пацієнта. Необхідні поліпшені схеми лікування, які є більш ефективними і краще переносимими. Нещодавно введені агенти включають нові цитотоксичні лікарські засоби, що поступово включаються в комбінації, і введення основаного на антитілах лікування. Неходжкінська лімфома охоплює ряд Вклітинних лімфом. Отже, антигени В-клітин являють собою відповідні мішені для терапії антитілами. CD22 є мембранним глікопротеїдом з М.м. 135кД, що відноситься до сімейства білків, які зв'язують сіалову кислоту, названих сіалоадгезинами. 7 Він виявляється в цитоплазмі на ранній стадії розвитку В-клітин, з'являється на поверхні клітин одночасно з IgD і виявляється на більшості зрілих Вклітин. Експресія збільшується після активації Вклітин. CD22 втрачається при кінцевому диференціюванні, і звичайно повідомляється про те, що він відсутній в плазматичних клітинах. Таким чином, вказаний антиген, що інтерналізується, присутній на поверхні пре-В-клітин і зрілих В-клітин, але не стволових клітин або плазматичних клітин. У людини існують дві ізоформи CD22. Переважаюча форма (CD22P) містить 7 подібних імуноглобуліну (Ig-подібних) доменів у позаклітинній ділянці. У варіанті CD22a відсутній Ig-подібний домен 4 і він може мати укорочений цитоплазматичний домен. Показано, що антитіла, які блокують адгезію CD22 з моноцитами, нейтрофілами, лімфоцитами і еритроцитами, зв'язуються в першому або другому Ig-подібному домені. Цитоплазматичний домен CD22 фосфорилюється по тирозину при лігуванні рецептора Вклітинного антигену і зв'язується з Lyk, Syk і фосфатидилінозитол-3-кіназою. Функція CD22 полягає у знижувальному модулюванні порогової величини активації В-клітин. Він також опосередковує адгезію клітин через взаємодію з-~ клітинами, що несуть відповідні сіалоглікокон'югати. CD22 експресується у випадку більшості Вклітинного лейкозу і лімфом, включаючи NHL, гострий лімфобластний лейкоз (B-ALL), хронічний лімфоцитарний лейкоз (B-CLL) і особливо гострий нелімфоцитарний лейкоз (ANLL). Моноклональні антитіла проти CD22 описані на попередньому рівні техніки. У WO 98/41641 описані рекомбінантні анти-СБ22-антитіла із залишками цистеїну в VΗ44 і VL100. У WO 96/04925 описані ділянки VH і VL анти-СD22-антитіла LL2. У патенті США No.5686072 описані комбінації антиСD22 і анти-CD19 імунотоксинів. У WO 98/42378 описане застосування «голих» анти-СD22-антитіл для лікування В-клітинних злоякісних захворювань. Ряд основаних на антитілах терапевтичних засобів або нещодавно ліцензовані, наприклад, ритуксан (немічена химерна 1 (+m IV-ділянка) людини, специфічна для CD20), або перебувають в стадії клінічних випробувань для даного захворювання. Вони основані або на опосередкованій комплементом або ADCC-опосередкованій загибелі Вклітин, або на застосуванні радіонуклідів, таких як 131 І або 90Y, які створюють пов'язані з приготуванням і застосуванням проблеми для лікарів і пацієнтів. Існує необхідність в молекулі антитіла для лікування NHL, яку можна багато разів використати і можна легко і ефективно одержувати. Існує також необхідність в молекулі антитіла, яка володіє високою афінністю у відношенні CD22 і низькою імуногенністю для людини. У першому аспекті даний винахід відноситься до молекули антитіла, яка володіє специфічністю по відношенню до CD22 людини, що містить важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить CDR (яка визначена Rabat et al., (вище)), що має послідовність, наведену у вигляді НІ на Фіг.1 (SEQ ID NO: 1) для CDR-H1, у вигляді Н2 на Фіг.1 (SEQ 92580 8 ID NO: 2) або Н2, з якої був видалений потенційний сайт глікозилування, або Н2, l якій залишок лізину в положенні 60 (згідно з системою нумерації Kabat) був замінений альтернативною амінокислотою, або Н2, в якій і сайт глікозилування і реакційно-здатний лізин в положенні 60 були видалені, для CDR-H2 або у вигляді Н3 на Фіг.1 (SEQ ID NO: 3) для СDR-Н3. Молекула антитіла згідно з першим аспектом даного винаходу містить, щонайменше, одну CDR, вибрану з Н1, Н2 і Н3 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 3), у випадку варіабельного домену важкого ланцюга. Переважно молекула антитіла містить, щонайменше, дві або більше, переважно всі три CDR у варіабельному домені важкого ланцюга. У другому аспекті даного винаходу пропонується молекула антитіла, яка володіє специфічністю по відношенню до CD22 людини, що містить легкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить CDR (яка визначена Kabat et al., (вище)), що має послідовність, наведену у вигляді L1 на Фіг.1 (SEQ ID NO: 4) для CDR-L1, L2 на Фіг.1 (SEQ ID NO: 5) для CDR-L2 або L3 на Фіг.1 (SEQ ID NO: 6) для CDR-L3. Молекула антитіла згідно з другим аспектом даного винаходу містить, щонайменше, одну CDR, вибрану з LI, L2 і L3 (SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 6) для варіабельного домену легкого ланцюга. Переважно молекула антитіла містить, щонайменше, дві або більше, переважно всі три CDR у варіабельному домені легкого ланцюга. Молекули антитіл згідно з першим і другим аспектами даного винаходу переважно мають комплементарний легкий ланцюг або комплементарний важкий ланцюг, відповідно. Переважно молекула антитіла згідно з першим або другим аспектами даного винаходу містить важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить CDR (яка визначена Rabat et al., (вище)), що має послідовність, наведену у вигляді НІ на Фіг.1 (SEQ ID NO: 1) для CDR-H1, у вигляді Н2 на Фіг.1 (SEQ ID NO: 2) або Н2, з якої був видалений потенційний сайт глікозилування, або Н2, в якій залишок лізину в положенні 60 (згідно з системою нумерації Kabat) був замінений альтернативною амінокислотою, або Н2, в якій і сайт глікозилування і реакційно-здатний лізин в положенні 60 були видалені, для CDR-H2 або у вигляді Н3 на Фіг.1 (SEQ ID NO: 3) для CDR-H3, і легкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить CDR (яка визначена Kabat et al., (вище)), що має послідовність, наведену у вигляді L1 на Фіг.1 (SEQ ID NO: 4) для CDR-L1, у вигляді L2 та Фіг.1 (SEQ ID NO: 5) для CDR-L2 або у вигляді L3 на Фіг.1 (SEQ ID NO: 6) для CDR-L3. Вищезгадані CDR, наведені в SEQ ID NO: 1-6 і на Фіг.1, одержані з мишачого моноклонального антитіла 5/44. Повні послідовності варіабельних доменів мишачого антитіла 5/44 показані на Фіг.2 (легкий ланцюг) (SEQ ID NO: 7) і Фіг.3 (важкий ланцюг) (SEQ ID NO: 8). Дане мишаче антитіло також називають далі «донорне антитіло» або «мишаче моноклональне антитіло». 9 Перший альтернативно переважний варіант згідно з першим або другим аспектами даного винаходу являє собою мишаче моноклональне антитіло 5/44, що має послідовності варіабельних доменів легкого і важкого ланцюгів, показані на Фіг.2 (SEQ ID NO: 7) і Фіг.3 (SEQ ID NO: 8), відповідно. Константна ділянка легкого ланцюга 5/44 є каппа типу, а константна ділянка важкого ланцюга є ділянкою IgGl. У другому альтернативно переважному варіанті антитіло згідно з будь-яким першим або другим аспектами даного винаходу є химерною молекулою антитіла миша/людина, названою в даному описі химерною молекулою антитіла 5/44. Химерна молекула антитіла містить варіабельні домени мишачого моноклонального антитіла 5/44 (SEQ ID NO: 7 і 8) і константні домени людини. Переважно химерна молекула антитіла 5/44 містить С-домен каппа людини (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; номер доступу в Genebank J00241) в легкому ланцюгу і домени гамма 4 людини (Flanagan et al., Nature, 300, 709-713, 1982) у важкому ланцюгу, необов'язково із заміною залишку серину в положенні 241 залишком проліну. Переважно антитіло згідно з даним винаходом містить важкий ланцюг, в якій варіабельний домен містить як CDR-H2 (яка визначена Kabat et al., (вище)) Н2', в якій була видалена послідовність потенційного сайта глікозилування і яка несподівано збільшувала афінність химерного антитіла 5/44 у відношенні антигену CD22, і який переважно має як CDR-H2 послідовність, наведену у вигляді Н2' (SEQIDNO: 13). Альтернативно або додатково антитіло згідно з даним винаходом може містити важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить як CDR-H2 (яка визначена Kabat et al., (вище)) Н2", в якій залишок лізину в положенні 60, який розташований у відкритому положенні в CDR-H2 і який, як вважають, має потенційну можливість взаємодіяти з кон'югуючими агентами, приводячи до зниження антигензв'язувальної афінності, замінений на альтернативну амінокислоту, щоб в результаті одержати консервативну заміну. Переважно CDR-Н2 має послідовність, наведену у вигляді Н2" (SEQ ID NO: 15). Альтернативно або додатково антитіло згідно з даним винаходом може містити важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить як CDR-H2 (яка визначена Kabat et al., (вище)) Н2"', в якій і послідовність потенційного сайту глікозилування і залишок лізину в положенні 60 замінені альтернативними амінокислотами. Переважно CDR-H2 має послідовність, наведену у вигляді Н2'" (SEQIDNO: 16). У третьому альтернативно переважному варіанті антитіло згідно з будь-яким першим або другим аспектами даного винаходу є CDRприщепленою молекулою антитіла. Термін «CDRприщеплена молекула антитіла» в значенні, що використовується в даному описі, відноситься до молекули антитіла, в якій важкий і/або легкий ланцюг містить одну або декілька CDR (включаючи при бажанні модифіковану CDR) з донорного антитіла (наприклад, мишачого моноклонального 92580 10 антитіла), прищеплених в каркас варіабельної ділянки важкого і/або легкого ланцюга акцепторного антитіла (наприклад, антитіла людини). Переважно таке CDR-прищеплене антитіло має варіабельний домен, що містить акцепторні каркасні ділянки людини, а також одну або декілька вищезгаданих донорних CDR. У тому випадку, коли прищеплюють CDR, можна використати будь-яку відповідну каркасну послідовність варіабельної ділянки акцептор, що відноситься до класу/типу донорного антитіла, з якого одержані CDR, включаючи каркасні ділянки миші, примату і людини. Прикладами каркасних ділянок людини, які можна використати в даному винаході, є KOL, NEWM, REI, EU, TUR, ТЕІ, LAY і РОМ (Kabat et al. (вище)). Наприклад, KOL і NEWM можна використати для важкого ланцюга, REI можна використати для легкого ланцюга і EU, LAY і РОМ можна використати як для важкого ланцюга, так і для легкого ланцюга. Альтернативно можна використати послідовності зародкової лінії людини. Переважною каркасною ділянкою у випадку легкого ланцюга є послідовність підгрупи зародкової лінії людини (DPK9+JK1), показана на Фіг.5 (SEQ ID NO: 17). Переважною каркасною ділянкою у випадку важкого ланцюга є послідовність підгрупи (DP7+JH4) людини, показана на Фіг.6 (SEQ ID NO: 21). У CDR-прищепленому антитілі згідно з даним винаходом переважно використати як акцепторне антитіло антитіло, що має ланцюги, які гомологічні ланцюгам донорного антитіла. Важкий і легкий ланцюги акцептора не обов'язково повинні бути одержані з того ж самого антитіла і за бажанням можуть містити складові ланцюги, що мають каркасні ділянки, одержані з різних ланцюгів. Також в CDR-прищепленому антитілі згідно з даним винаходом каркасні ділянки не повинні мати точно таку ж послідовність, як послідовності акцепторного антитіла. Наприклад, незвичайні залишки можуть бути замінені на залишки, що більш часто зустрічаються, для даного класу або типу акцепторного ланцюга. Альтернативно вибрані залишки в каркасних ділянках акцептора можуть бути замінені так, щоб вони відповідали залишку, виявленому в такому ж положенні в донорному антитілі, або залишку, який являє собою консервативну заміну залишку, виявленого в такому ж положенні в донорному антитілі. Такі заміни повинні здійснюватись по мінімуму, необхідному для відновлення афінності донорного антитіла. Протокол вибору залишків в каркасних ділянках акцептора, які необхідно змінити, вказаний в WO 91/09967. Переважно, якщо в молекулі CDRприщепленого антитіла згідно з даним винаходом акцепторний легкий ланцюг має послідовності підгрупи DPK9+JK1 людини (показану на Фіг.2) (SEQ ID NO: 17), то акцепторы каркасні ділянки легкого ланцюга містять донорні залишки в положеннях 2, 4, 37, 38, 45 і 60 і можуть додатково містити донорний залишок в положенні 3 (згідно Kabat et al. (вище)). Переважно, якщо в молекулі CDRприщепленого антитіла згідно з даним винаходом акцепторний важкий ланцюг має послідовність 11 DP7+JH4 людини (показану на Фіг.3) (SEQ ID NO: 21), то акцепторы каркасні ділянки важкого ланцюга містять крім однієї або декількох донорних CDR донорні залишки в положеннях 1, 28, 48, 71 і 93 і можуть додатково містити донорні залишки в положеннях 67 і 69 (згідно Kabat et al. (вище)). Донорні залишки являють собою залишки з донорного антитіла, тобто антитіла, з якого початково одержували CDR. Переважно антитіло згідно з даним винаходом містить важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить як CDR-H2 (яка визначена Kabat et al., (вище)) H2', в якій послідовність потенційного сайту глікозилування була видалена, щоб збільшити афінність химерного антитіла 5/44 у відношенні антигенна CD22, і який переважно має як CDR-H2 послідовність, наведену у вигляді Н2' (SEQ ID NO: 13). Альтернативно або додатково антитіло згідно з даним винаходом може містити важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить як CDR-H2 (яка визначена Kabat et al., (вище)) Н2", в якій залишок лізину в положенні 60, який розташований у відкритому положенні в CDR-H2 і який, як вважають, має потенційну можливість взаємодіяти з кон'югуючими агентами, приводячи до зниження антигензв'язу вальної афінності, замінюють на альтернативну амінокислоту. Переважно CDR-H2 має послідовність, наведену у вигляді Н2" (SEQ ID NO: 15). Альтернативно або додатково антитіло згідно з даним винаходом може містити важкий ланцюг, в якому варіабельний домен містить як CDR-H2 (яка визначена Kabat et al., (вище)) Н2"', в якій і послідовність потенційного сайту глікозилування і залишок лізину в положенні 60 замінені альтернативними амінокислотами. Переважно CDR-H2 має послідовність, наведену у вигляді Н2'" (SEQ ID NO: 16). Молекула антитіла згідно з даним винаходом може містити: повну молекулу антитіла, що має повнорозмірні важкі і легкі ланцюги; його фрагмент, такий як фрагмент Fab, модифікований Fab, Fab', F(ab')2 або Fv; мономер або димер легкого ланцюга або важкого ланцюга; одноланцюгове антитіло, наприклад, одноланцюговий Fv, в якому варіабельні домени важкого і легкого ланцюга пов'язані пептидним лінкером. Подібним чином варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюга можна комбінувати з іншими доменами антитіл в залежності від ситуації. Молекула антитіла згідно з даним винаходом може мати пов'язану з нею ефекторну або репортерну молекулу. Наприклад, молекула антитіла може мати макроцикл для хелатування атома важкого металу або токсин, такий як рицин, пов'язаний з нею структурою ковалентного містка. Альтернативно можна використати способи технології рекомбінантних ДНК, щоб одержати молекулу антитіла, в якій фрагмент Fc (домени СН2, СН3 і шарнірний домен), домени СН2 і СН3 або домен СН3 повної молекули імуноглобуліну буй замінений (замінені) або пов'язаний (пов'язані) пептидним зв'язком з функціональним неімуноглобуліновим білком, таким як молекула ферменту або токсину. 92580 12 Молекула антитіла згідно з даним винаходом переважно має афінність зв'язування, що складає щонайменше 0,85 10-10Μ, більш переважно щонайменше 0,75 10-10Μ і найбільш переважно що-10 найменше 0,5 10 Μ. Переважно молекула антитіла згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга 5/44-gLl (SEQ ID NO: 19) і варіабельний домен важкого ланцюга 5/44-gH7 (SEQ ID NO: 27). Послідовності варіабельних доменів вказаних легкого і важкого ланцюгів показані на Фіг.5 і 6, відповідно. Даний винахід також відноситься до варіантів молекули антитіла згідно з даним винаходом, які мають підвищену афінність по відношенню до CD22. Такі варіанти можна одержати, використовуючи ряд протоколів дозрівання афінності, включаючи мутування CDR (Yang et al, J. Моl. Biol, 254, 392-403, 1995), перестановку ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), застосування мутаторних штамів Ε. coli (Low et al., J. Моl. Biol., 250, 359-368, 1996), перестановку ДНК (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), фаговий дисплей (Thompson et al., J. Моl. Biol., 256, 77-88, 1996) і ПЛР на матеріалі статевих клітин (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (вище) обговорює вказані способи дозрівання афінності. Даний винахід також відноситься до послідовності ДНК, що кодує важкий і/або легкий ланцюг (ланцюги) молекули антитіла згідно з даним винаходом. Переважно послідовність ДНК кодує важкий або легкий ланцюг молекули антитіла згідно з даним винаходом. Послідовність ДНК згідно з даним винаходом може містити синтетичну ДНК, одержану, наприклад, хімічною обробкою, кДНК, геномну ДНК або будь-яку їх комбінацію. Даний винахід також відноситься до клонуючого або експресуючого вектора, що містить одну або декілька послідовностей ДНК згідно з даним винаходом. Переважно клонуючий або експресуючий вектор містить дві послідовності ДНК, що кодують легкий ланцюг і важкий ланцюг молекули антитіла згідно з даним винаходом, відповідно. Загальні способи, за допомогою яких можна сконструювати вектори, способи трансфекції і способи культивування добре відомі фахівцям в даній галузі. У зв'язку з цим наведено посилання на «Current Protocols in Molecular Biology», 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York і керівництво Maniatis, випущене Cold Spring Harbor Publishing. Послідовності ДНК, які кодують молекулу антитіла згідно з даним винаходом, можна одержати способами, добре відомими фахівцям в даній галузі. Наприклад, послідовності ДНК, що кодують частину або повністю важкий і легкий ланцюги антитіла, можуть бути синтезовані відповідно до вимог на основі визначених послідовностей ДНК або на основі відповідних амінокислотних послідовностей. ДНК, що кодує акцепторні каркасні послідовності, широко доступна фахівцям в даній галузі і 13 може бути легко синтезована на основі їх відомих амінокислотних послідовностей. Можна використати стандартні способи молекулярної біології, щоб одержати послідовності ДНК, які кодують молекулу антитіла згідно з даним винаходом. Необхідні послідовності ДНК можна синтезувати повністю або частково, використовуючи методику синтезу олігонуклеотидів. В залежності від обставин можна використати спосіб сайтнаправленого мутагенезу і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Будь-яку відповідну систему клітинахазяїн/вектор можна використати для експресії послідовностей ДНК, що кодують молекулу антитіла згідно з даним винаходом. Можна використати бактеріальні системи, наприклад Е. соІі, та інші системи мікроорганізмів, зокрема для експресії фрагментів антитіл, таких як Fab- і Р(аb')2фрагменти, і особливо фрагменти Fv і одноланцюгові фрагменти антитіл, наприклад одноланцюгові Fv. Еукаріотичні системи експресії в клітинаххазяїнах, наприклад системи ссавців, можна використати для одержання більш великих молекул антитіл, включаючи повні молекули антитіл. Відповідні клітини-хазяїни ссавців включають СНО, клітини мієломи і гібрид оми. Даний винахід також відноситься до способу одержання молекули антитіла згідно з даним винаходом, що включає культивування клітинихазяїна, що містить вектор згідно з даним винаходом, в умовах, придатних для того, щоб привести до експресії білка з ДНК, що кодує молекулу антитіла згідно з даним винаходом, і виділення молекули антитіла. Молекула антитіла може містити тільки поліпептид важкого або легкого ланцюга, і в цьому випадку для трансфекції клітин-хазяїнів необхідно використати послідовність, що кодує тільки поліпептид важкого ланцюга або легкого ланцюга. Для одержання продуктів, що містять обидва ланцюги, важкий і легкий, лінію клітин можна трансфікувати двома векторами, першим вектором, що кодує поліпептид легкого ланцюга, і другим вектором, що кодує поліпептид важкого ланцюга. Альтернативно можна використати один вектор, при цьому вектор містить послідовності, що кодують поліпептиди легкого ланцюга і важкого ланцюга. Даний винахід також відноситься до терапевтичної або діагностичної композиції, що містить молекулу антитіла згідно з даним винаходом в комбінації з фармацевтично прийнятним наповнювачем, розріджувачем або носієм. Даний винахід також відноситься до способу одержання терапевтичної або діагностичної композиції, що включає змішування молекули антитіла згідно з даним винаходом разом з фармацевтично прийнятним наповнювачем, розріджувачем або носієм. Молекула антитіла може бути єдиним активним інгредієнтом в терапевтичній або діагностичній композиції або може знаходитись в супроводі інших активних інгредієнтів, включаючи інгредієнти, що є іншими антитілами, наприклад, антитілами проти Т-клітин, антитілами проти IFN або анти 92580 14 ЛПС-антитілами, або інгредієнтів, що не є антитілами, таких як ксантини. Фармацевтичні композиції переважно містять терапевтично ефективну кількість антитіла згідно з винаходом. Термін «терапевтично ефективна кількість» в значенні, що використовується в даному описі, відноситься до кількості терапевтичного засобу, необхідного для лікування, ослаблення або профілактики захворювання або стану, що є мішенню, або для вияву терапевтичного або профілактичного ефекту, що реєструється. Для будьякого антитіла терапевтично ефективну дозу спочатку можна визначити або в аналізах на культурі клітин, або в моделях на тваринах, звичайно гризунах, кроликах, собаках, свинях або приматах. Модель на тваринах також можна використати для визначення відповідного діапазону концентрацій і шляху введення. Потім таку інформацію можна використати для визначення застосовних доз і шляхів введення для людини. Точна ефективна кількість для людини буде залежати від тяжкості стану хвороби, загального стану здоров'я суб'єкта, віку, ваги і статі суб'єкта, харчування, часу і частоти введення, комбінації(цій) лікарських засобів, реакційної чутливості і толерантності/чутливості до терапії. Дана кількість може бути визначена звичайним експериментуванням, і вона залежить від рішення лікаря. Загалом ефективна доза буде складати від 0,01мг/кг до 50мг/кг, переважно від 0,1мг/кг до 20мг/кг, більш переважно приблизно 15мг/кг. Композиції можна вводити пацієнту окремо або можна вводити в комбінації з іншими агентами, лікарськими засобами або гормонами. Доза, в якій вводять молекулу антитіла згідно з даним винаходом, залежить від природи стану, який необхідно лікувати, міри злоякісності лімфоми або лейкозу і від того, чи використовується молекула антитіла профілактично або для лікування існуючого стану. Частота дози буде залежати від часу півжиття молекули антитіла і тривалості його дії. Якщо молекула антитіла має короткий час півжиття (наприклад, від 2 до 10 годин), то може бути необхідно давати одну або декілька доз на добу. Альтернативно якщо молекула антитіла має тривалий час півжиття (наприклад, від 2 до 15 днів) може бути необхідно вводити дозу тільки один раз на добу, один раз на тиждень або навіть один раз кожні 1 або 2 місяці. Фармацевтична композиція також може містити фармацевтично прийнятний носій для введення антитіла. Носій не повинен сам по собі індукувати вироблення антитіл, небезпечних для індивідуума, який отримує композицію, і повинен бути нетоксичним. Відповідними носіями можуть бути великі, повільно метаболізовані макромолекули, такі як білки, поліпептиди, ліпосоми, полісахариди, полімолочні кислоти, поліглколеві кислоти, полімерні амінокислоти, співполімери амінокислот і неактивні вірусні частинки. Можуть бути використані фармацевтично прийнятні солі, наприклад, солі неорганічних кислот, такі як гідрохлориди, гідроброміди, фосфати і су 15 льфати, або солі органічних кислот, такі як ацетати, пропіонати, малонати і бензоати. Фармацевтично прийнятні носії у фармацевтичних композиціях можуть додатково містити рідини, такі як вода, фізіологічний розчин, гліцерин і етанол. Додатково в таких композиціях можуть бути присутніми допоміжні речовини, такі як зволожуючі або емульгуючі агенти або речовини для забуферювання рН. Такі носії роблять можливим готувати фармацевтичні композиції у вигляді таблеток, пілюль, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів, зависей і суспензій для прийому пацієнтом усередину. Переважні форми для введення включають форми, придатні для парентерального введення, наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії, наприклад, ін'єкції болюсів або безперервної інфузії. У тому випадку, коли продукт призначений для ін'єкції або інфузії, він може приймати форму суспензії, розчину або емульсії в масляному або водному наповнювачі, і він може містити агенти для приготування композиції, такі як суспендуючі агенти, консерванти, стабілізатори і/або диспергуючі агенти. Альтернативно молекула антитіла може бути в сухій формі для перерозчинення перед застосуванням з використанням відповідної стерильної рідини. Після приготування композиції згідно з даним винаходом можна вводити безпосередньо суб'єкту. Суб'єктом, що піддається лікуванню, може бути тварина. Однак переважно композиції адаптовані для введення людині. Фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом можна вводити будь-якою кількістю способів, включаючи, але не обмежуючи вказаним, пероральний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньоартеріальний, інтрамедулярний, інтратекальний, інтравентрикулярний, трансдермальний, черезшкірний (наприклад, див. WO 98/20734), підшкірний, внутрішньочеревинний, інтраназальний, ентеральний, місцевий, під'язиковий, внутрішньовагінальний або ректальний шляхи. Також можна використати гіпоспреї, щоб вводити фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом. Звичайно терапевтичні композиції можуть бути приготовані у вигляді ін'єктованих препаратів, або у вигляді рідких розчинів, або суспензій. Також можуть бути приготовані тверді форми, відповідні для розчинення або суспендування в рідких наповнювачах перед ін'єкцією. Пряма доставка композицій, як правило, буде здійснюватись шляхом ін'єкції підшкірно, внутрішньочеревинно, внутрішньовенно або внутрішньом'язово, або доставлялись в інтерстиціальний простір тканини. Композиції також можна вводити в-місце пошкодження. Дозоване лікування може являти собою схему на основі однократної дози або схему на основі багаторазових доз. Буде зрозуміло, що активним інгредієнтом в композиції буде молекула антитіла. Як така вона буде чутлива до деградації в шлунково-кишковому тракті. Таким чином, якщо композицію необхідно вводити шляхом з використанням шлунковокишкового тракту, композиція повинна буде містити агенти, які захищають антитіло від деградації, 92580 16 але які вивільняють антитіло після того, як відбудеться всмоктування з шлунково-кишкового тракту. Всебічне обговорення фармацевтично прийнятних носіїв є в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, NJ. 1991). Також передбачається, що антитіло згідно з даним винаходом буде вводитись з використанням генної терапії. Щоб цього досягнути, послідовності ДНК, що кодують важкий і легкий ланцюги молекули антитіла, під контролем відповідних компонентів ДНК вводять пацієнту з тим, щоб ланцюги антитіла експресувались з послідовностей ДНК і проходили збирання in situ. Даний винахід також відноситься до молекули антитіла згідно з даним винаходом для застосування при лікуванні захворювання, опосередкованого клітинами, експресуючими CD22. Даний винахід, крім того, відноситься до застосування молекули антитіла згідно з даним винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування захворювання, опосередкованого клітинами, експресуючими CD22. Молекулу антитіла згідно з даним винаходом можна використати при будь-якій терапії, коли потрібно знизити рівень клітин, експресуючих CD22, які присутні в організмі людини або тварини. Вказані СО22-експресуючі клітини можуть циркулювати в організмі або бути присутніми на небажано високому рівні локалізованими в конкретному місці в організмі. Наприклад, підвищені рівні клітин, експресуючих CD22, будуть присутні при В-клітинних лімфомах і лейкозі. Молекулу антитіла згідно з даним винаходом можна використати для лікування захворювань, опосередкованих клітинами, експресуючими CD22. Молекулу антитіла згідно з даним винаходом переважно використовують для лікування злоякісних лімфом і лейкозу, найбільш переважно NHL. Даний винахід також відноситься до способу 1 лікування людини або тварини, страждаючого від захворювання або для якого існує ризик виникнення захворювання, опосередкованого клітинами, експресуючими CD22, при цьому спосіб включає введення суб'єкту ефективної кількості молекули антитіла згідно з даним винаходом. Молекулу антитіла згідно з даним винаходом також можна використати для діагностики, наприклад, при діагностиці in vivo, і візуалізації патологічних станів, в які залучені клітини, які експресують CD22. Далі даний винахід описаний тільки за допомогою ілюстрації в наступних прикладах, в яких дані посилання на супроводжуючі їх фігури, на яких: На Фіг.1 показана амінокислотна послідовність CDR мишачого моноклонального антитіла 5/44 (SEQ ID NO: 1-6). На Фіг.2 показана повна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла 5/44. На Фіг.3 показана повна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла 5/44. 17 На Фіг.4 показана стратегія видалення сайту глікозилування і реакційно-здатного лізину в CDRH2. На Фіг.5 показана конструкція щеплення для послідовності легкого ланцюга 5/44. На Фіг.6 показана конструкція щеплення для послідовності важкого ланцюга 5/44. На Фіг.7 показані вектори pMRR14 і pMRR10.1. На Фіг.8 показані результати аналізу Віасоrе химерних мутантів 5/44. На Фіг.9 показані олігонуклеотиди для збирання генів gH1 і gL1 5/44. На Фіг.10 показані проміжні вектори pCR2.1(544gH1) і PCR2.1 (544gL1). На Фіг.11 показані олігонуклеотидні касети, що використовуються для одержання наступного щеплення. На Фіг.12 показаний аналіз конкуренції між флуоресцентно міченим мишачим антитілом 5/44 і прищепленими варіантами; і На Фіг.13 показана повна послідовність ДНК і білка прищеплених важкого і легкого ланцюгів. Приклад 1: Створення відібраних для випробувань варіантів антитіл Панель антитіл проти CD22 відбирали з гібридом, використовуючи наступні критерії для відбору: зв'язування з клітинами Дауді, інтерналізація в клітини Дауді, зв'язування з периферичними мононуклеарними клітинами крові (РВМС), інтерналізація в РВМС, афінність (більше ніж 10-9Μ), 1 миші і швидкість продукування. Як переважне антитіло вибране антитіло 5/44. Приклад 2: Клонування гену і експресія химерної молекуліантитіла 5/44 Одержання клітин гібридоми 5/44 і одержання з них РНК Гібридому 5/44 створювали, використовуючи звичайну методику гібридом після імунізації мишей білком CD22 людини. РНК з клітин гібридоми 5/44 одержували, використовуючи набір RNEasy (Qiagen, Crawley, UK; No. в каталозі 74106). Одержану РНК обернено транскрибували в кДНК, як описано нижче. Розподіл CD22 на пухлинах NHL Зробили імуногистохімічне дослідження, щоб оцінити частоту зустрічальності і розподіл фарбування з використанням моноклональних антитіл 5/44 проти CD22. У дослідження включали контрольні антитіла проти CD20 і CD79a, щоб підтвердити В-клітинні ділянки пухлин. Всього досліджували 50 пухлин і класифікували їх таким чином, використовуючи систему робочого формулювання і систему класифікації REAL: - 7 В-лімфобластний лейкоз/лімфома (висока/І) - 4 B-CLL/дрібноклітинна лімфоцитарна лімфома (низька/А) 3 лімфоплазмацитарна лімфома/імуноцитома (низька/А) -1 лімфома мантійних клітин (проміжна/F) - 14 лімфома фолікулярного центра (низька проміжна/D) - 13 дифузна лімфома з великих клітин (проміжна - висока/G, Н) 92580 18 - 6 такі, що не класифікуються (K) - 2 Т-клітинні лімфоми 40 В-клітинних лімфом були позитивними у відношенні антигену CD22 при використанні антитіла 5/44 в концентрації 0,1мкг/мл, а інші 6 ставали позитивними, коли концентрацію збільшували до 0,5мкг/мл. У випадку інших 2 В-клітинних пухлин, які були негативними при 0,1мкг/мл, залишалось недостатньо тканини, щоб тестувати більш високу концентрацію. Однак паралельне тестування з іншим анти-СD22-антитілом Celltech 6/13, яке давало більш сильне фарбування, ніж 5/44, дало у всіх 48 В-клітинних лімфомах фарбування, позитивне по відношенню до CD22. Таким чином, можна зробити висновок, що антиген CD22 широко експресується на В-клітинних лімфомах і таким чином являє собою відповідну мішень для імунотерапії при NHL. ПЛР-клонування VH і VL 5/44 Послідовності кДНК, що кодують варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів 5/44, синтезували, використовуючи обернену транскриптазу, щоб одержати однониткові кДНК-копії з мРНК, присутньої в загальній масі РНК. Потім їх використали як матрицю для ампліфікації мишачих послідовностей V-ділянок, використовуючи специфічні олігонуклеотидні праймери в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). а) Синтез кДНК кДНК синтезували в об'ємі реакції 20мкл, що містить наступні реагенти: 50мМ трис-НСІ рН8,3, 75мМ KСl, 10мМ дитіотреїтол, 3мМ MgCl2, 0,5мМ кожного дезоксирибонуклеозидтрифосфату, 20 одиниць RNAsin, 75нг випадкового гексануклеотидного праймера, 2мкг РНК 5/44 і 200 одиниць оберненої транскриптази вірусу лейкозу Молоні мишей. Після інкубації при 42°С протягом 60 хвилин реакцію зупиняли нагріванням при 95°С протягом 5 хвилин. b) ПЛР Аліквоти кДНК піддавали ПЛР, використовуючи комбінації праймерів, специфічних для важкого і легкого ланцюгів. Як прямі праймери використали пули вироджених праймерів, сконструйованих для відпалювання з консервативними послідовностями сигнального пептиду. Всі вказані послідовності містять по порядку сайт рестрикції (VL Sful; VH Hindlll), починаючи з 7 нуклеотидів від їх 5'-кінців, послідовність GCCGCCACC (SEQ ID NO: 50), щоб забезпечити оптимальну трансляцію мРНК, які одержуються в результаті, кодон ініціації і 20-30 нуклеотидів на основі послідовностей лідерного пептиду відомих мишачих антитіл (Rabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health). 3'-праймери конструювали так, щоб вони перекривали з'єднання каркас 4-J-C антитіла і містили сайт рестрикції для ферменту BsiWI, щоб полегшити клонування ПЛР-фрагменту VL. 3'-праймери важкого ланцюга являють собою суміш, сконструйовану так, щоб вони перекривали з'єднання J-C антитіла. 3 і-праймер включає сайт рестрикції Араї, щоб полегшити клонування. 3'-ділянка праймерів 19 92580 20 містить змішану послідовність, основану на послідовностях, виявлених у відомих мишачих антитілах (Kabat et al., 1991, вище). Комбінації описаних вище праймерів роблять можливим клонування ПЛР-продуктів для VH і VL безпосередньо у відповідному експресуючому векторі (див. нижче), щоб одержати химерні (мишалюдина) важкі і легкі ланцюги, і експресію даних генів в клітинах ссавців, щоб одержати химерні антитіла необхідного ізотипу. Інкубації (100мкл) для ПЛР проводили таким чином. Кожна реакційна суміш містила 10мМ трисНСІ рН8,3, 1,5мМ MgCl2, 50мМ KСl, 0,01% мас/об, желатину, 0,25мМ кожного дезоксирибонуклеозидтрифосфату, 10пмоль суміші 5'-праймерів, 10пмоль 3'-праймера, 1мкл кДНК і 1 одиницю полімерази Taq. Реакційні суміші інкубували при 95°С протягом 5 хвилин і потім піддавали циклу 94°С протягом 1 хвилини, 55°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Після 30 циклів аліквоти кожної реакційної суміші аналізували електрофорезом в агарозному гелі. Для V-ділянки важкого ланцюга ампліфікований продукт ДНК одержували тільки коли пул праймерів, що випалюється на початку каркаса І, замінював пул праймерів сигнального пептиду. Фрагменти клонували у векторах для секвенуван ня ДНК. Визначали послідовність ДНК, щоб одержати виведену амінокислотну послідовність. Дану виведену послідовність підтверджували, звертаючись до N-кінцевої послідовності білка, визначеної експериментально. На Фіг.2 і 3 показана послідовність ДНК/білка зрілих V-ділянок легкого і важкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла 5/44, відповідно. с) Молекулярне клонування ПЛР-фрагментів Потім послідовності V-ділянки мишей клонували в експресуючих векторах pMRR10.1 i pMRR14 (Фіг.7). Вказані вектори являють собою вектори для експресії легкого і важкого ланцюга, відповідно, що містять ДНК, яка кодує константні ділянки легкого ланцюга каппа людини і важкого ланцюга гамма-4 людини. Ділянку VL субклонували в експресуючий вектор за допомогою рестрикційного розщеплення і лігування з вектора для секвенування, використовуючи сайти рестрикції Sful і BsiWI, створюючи плазміду pMRR10(544cL). ДНК важкого ланцюга ампліфікували в ПЛР, використовуючи 5'-праймер, щоб ввести сигнальний пептид, оскільки його не одержували в методиці клонування - використали лідер важкого ланцюга мишачого антитіла з інший власної гібридоми (названої 162). 5'-праймер мав наступну послідовність: Обернений праймер був ідентичний праймеру, що використовується у вихідному клону ванні гену VH. Одержаний в результаті продукт ПЛР розщеплювали ферментами Hindlll і АраІ, субклонували, і підтверджували його послідовність ДНК, створюючи плазміду pMRR14(544cH). Тимчасова котрансфекція обох експресуючих векторів в клітини СНО давала химерне антитіло с5/44. Котрансфекцію проводили, використовуючи реагент ліпофектамін згідно з протоколами виробника (InVitrogencLife Technology, Groningen, The Netherlands. No. в каталозі 11668-027). Видалення сайту глікозилування і реакційноздатного лізину Потенційна N-пов'язана послідовність сайту глікозилування виявлена в CDR-Н2, що має амінокислотну послідовність N-Y-T (Фіг.3). SDS-ΠΑΑΓ, Вестерн-блотинг і фарбування на карбогідрати гелів 5/44 і його фрагментів (включаючи Fab) показали, що даний сайт був дійсно глікозильований (не показано). Крім того, виявлений залишок лізину у відкритому положенні в CDR-H2, який мав потенційну можливість зменшувати афінність зв'язування антитіла, забезпечуючи додатковий сайт для кон'югування з агентом, з яким антитіло може бути кон'юговано. Використали методику ПЛР, щоб ввести амінокислотні заміни в послідовність CDR-H2, намагаючись видалити сайт глікозилування і/або реакційно-здатний лізин, як показано на Фіг.4. Прямі праймери, що кодують мутації N55Q, T57A або T57V, використали для видалення сайту глікозилування (Фіг.4) і створювали четвертий прямий праймер, що містить заміну K60R, щоб видалити реакційно-здатний залишок лізину (Фіг.4). Обернений праймер каркасу 4 використали в кожній з вказаних ПЛР-ампліфікацій. Продукти ПЛР розщеплювали ферментами ХbаІ і АраІ і вбудовували в pMRR14 (544cH) (також розщеплений ХbаІ і АраІ), щоб створити експресуючі плазміди, що кодують вказані мутанти. Мутації N55Q, Т57А і T57V видаляли сайт глікозилування за рахунок зміни амінокислотної послідовності, так що вона відрізнялась від консенсусу N-X-T/S, в той час як мутація K60R замінювала потенційно реакційно-здатний лізин схожим чином позитивно зарядженим залишком аргініну. Одержані в результаті варіанти плазмід сН котрансфікували плазмідою cL, щоб створити експресовані варіанти химерних антитіл. Оцінка активності химерних генів Активність химерних генів оцінювали після тимчасової трансфекції клітин CHO. с) Визначення констант афінності аналізом ВіаСоrе Афінності химерного 5/44 або його варіантів, в яких були видалені їх сайт глікозилування або їх реакційно-здатний лізин, досліджували, використовуючи методику ΒΙΑ для зв'язування з конструкціями CD22-mFc. Результати показані на Фіг.8. Всі вимірювання зв'язування здійснювали на приладі ВІАсоrе™ 2000' (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). Аналіз здійснювали на основі захоплення 21 CD22mFc за допомогою імобілізованого анти-Fc миші. Антитіло було в розчинній фазі. Зразки, стандарт і контролі (50мкл) ін'єктували на імобілізоване анти-Fc миші, потім антитіло в розчиненій фазі. Після кожного циклу поверхню регенували 50мкл 40мМ НСl зі швидкістю 30мкл/хв. Кінетичний аналіз здійснювали, використовуючи комп'ютерну програму BIAevaluation 3.1 (Pharmacia). Видалення сайту глікозилування в конструкції Т57А приводило до трохи більш високої швидкості утворення комплексу і небагато більш повільної швидкості розпаду комплексу у порівнянні з химерним 5/44, даючи приблизно 5-кратне збільшення афінності. Мутація N55Q не надавала впливу на афінність. Даний результат був несподіваним, оскільки він свідчить про те, що видалення карбогідрату саме по собі не надає впливу на зв'язування (як у випадку із заміною N55Q). Підвищену афінність спостерігали тільки у випадку заміни Т57А. Одним з можливих пояснень є те, що незалежно від присутності карбогідрату треонін в положенні 57 впливає негативним чином на зв'язування, яке виключається при перетворенні треоніну в аланін. Гіпотеза про те, що важливе значення має малий розмір аланіну і що негативна дія треоніну пов'язана з його розміром, підтверджується результатом, одержаним з використанням мутації T57V: що заміна валіном в положенні 57 не приносить користі (результати не показані). Видалення лізину внаслідок мутації K60R мало нейтральну дію на афінність, тобто введення аргініну видаляє потенційно реакційно-здатний сайт, не піддаючи ризику афінність. Таким чином обидві мутації для видалення сайту глікозилування і для видалення реакційноздатного лізину включали в конструкцію при гуманізації. Приклад 2: CDR-щеплення 5/44 Молекулярне клонування генів варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіла 5/44 і їх застосування для одержання химерних (миша/чоловік) антитіл 5/44 описане вище. Нуклеотидна і амінокислотна послідовності VL- і VH-доменів 5/44 миші показані на Фіг.2 і 3 (SEQ ID NO: 7 і 8), відповідно. У даному прикладі описане CDRщеплення антитіла 5/44 в каркасні ділянки людини, щоб знизити можливу імуногенність у людини, згідно зі способом Adair et al., (WO 91/09967). CDR-щеплення легкого ланцюга 5/44 Вирівнювання послідовності білка з консенсусними послідовностями з V-ділянки легкого ланцюга каппа підгрупи І людини показало 64% ідентичність послідовностей. Тому вибрані для конструювання CDR-прищепленого легкого ланцюга акцепторні каркасні ділянки відповідали каркасним ділянкам послідовності 012, DPK9 зародкової лінії підгрупи І VK людини. Акцепторну послідовність каркаса 4 одержували з послідовності JK1 зародкової лінії J-ділянки людини. Порівняння амінокислотних послідовностей каркасних ділянок 5/44 миші і акцепторної послідовності наведене на Фіг.5 і воно показує, що існує 27 відмінностей між донорними і акцепторними ланцюгами. У кожному положенні робили аналіз потенційної можливості мишачого залишку робити 92580 22 внесок в зв'язування антигену, або прямо, або опосередковано внаслідок впливу на укладання або на ділянку контакту VH/VL. Якщо вважали, що мишачий залишок має важливе значення і в достатній мірі відрізняється від людського залишку по розміру, полярності або заряду, то такий мишачий залишок зберігали. На основі даного аналізу конструювали дві версії CDR-прищепленого легкого ланцюга, що мають послідовності, наведені в SEQ ID NO: 19 і SEQ ID NO: 20 (Фіг.5). CDR-щеплення важкого ланцюга 5/44 CDR-щеплення важкого ланцюга 5/44 здійснювали, використовуючи таку ж методику, яка описана для легкого ланцюга. Виявлено, що V-домен важкого ланцюга 5/44 гомологічний важким ланцюгам людини, що відносяться до підгрупи І (70% ідентичність послідовностей), і тому послідовність каркасу VH1-3, DP7 зародкової лінії підгрупи І людини використали як акцепторний каркас. Акцепторні послідовності каркасу 4 одержували з послідовності JH4 зародкової лінії J-ділянки людини. Порівняння важкого ланцюга 5/44 з каркасними ділянками показане на Фіг.6, де можна бачити, що важкий ланцюг 5/44 відрізняється від акцепторної послідовності за 22 положеннями. Аналіз внеску, який будь-яке з вказаних положень може робити у зв'язування антигенна, привів до 5 варіантів CDR-прищеплених важких ланцюгів, що конструюються, які мають послідовності, наведені в SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 і SEQ ID NO: 27 (Фіг.6). Конструювання генів для прищеплених послідовностей Проектували гени для кодування прищеплених послідовностей gH1 і gL1, і проектували і конструювали серію олігонуклеотидів, що перекриваються (Фіг.9). Методику ПЛР-збирання використали для конструювання генів CDR-прищеплених V-ділянок. Готували реакційні суміші об'ємом 100мкл, що містять 10мМ трис-НСІ рН8,3, 1,5мМ MgCl2, 50мМ KСl, 0,001% желатину, 0,25мМ кожного дезоксирибонуклеозидтрифосфату, 1пмоль кожного з «внутрішніх» праймерів (Т1, Т2, Т3, В1, В2, В3), 10пмоль кожного із «зовнішніх» праймерів (Fl, R1) і 1 одиницю полімерази Taq (AmpliTaq, Applied BioSystems, No. в каталозі N808-9171). Параметри циклу ПЛР являли собою 94°С протягом 1 хвилини, 55°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини, 30 циклів. Потім продукти реакції розганяли в 1,5% агарозному гелі, вирізали і витягували, використовуючи центрифужні колонки QIAGEN (набір для екстракції з гелю QIAquick, No. в каталозі 28706). ДНК елюювали в об'ємі 30мкл. Потім алфквоти (1мкл) ДНК gH1 і gL1 клонували в клонуючому векторі In Vitrogen TOPO ТА pCR2.1 TOPO (No. в каталозі К4500-01) згідно з інструкціями виробника. Даний неекспресуючий вектор служив як проміжний продукт клонування, щоб полегшити секвенування великого числа клонів. Секвенування ДНК з використанням специфічних для вектора праймерів застосовували для ідентифікації правильних клонів, що містять gH1 і gL1, створюючи плазміди рСR2.1 (544gH1) I pCR2.1 (544gL1) (Фіг.10). 23 Спосіб заміни олігонуклеотидних касет використали для створення гуманізованих щеплень gH4,5,6 і 7 і gL2. На Фіг.11 показана конструкція олігонуклеотидних касет. Щоб сконструювати кожний варіант, вектор (pCR2.1 (544gH1) або pCR2.1 (544gL1)) розрізали показаними ферментами рестрикції (Xmal/SacII для важкого ланцюга, Xmal/BstEII для легкого ланцюга). Великий векторний фрагмент очищали з агарозного гелю і використали для лігування з олігонуклеотидною касетою. Вказані касети складаються з 2 комплементарних олігонуклеотидів (показаних на Фіг.11), що змішуються в концентрації 0,5пмоль/мкл в об'ємі 200мкл 12,5мМ трис-НСІ рН7,5, 2,5мМ MgCl2, 25мМ NaCl, 0,25мМ дитіоеритритол. Відпалювання здійснювали нагріванням до 95°С протягом 3 хвилин на водяній бані (об'єм 500мл), потім даючи можливість реакційній суміші повільно охолонути до кімнатної температури. Потім піддану відпалюванню олігонуклеотидну касету розбавляли в десять разів у воді перед лігуванням у відповідним чином розрізаний вектор. Секвенування ДНК використали для підтвердження правильної послідовності, створюючи плазміди pCR2.1(5/44-gH4-7) і pCR2.1(5/44-gL2). Потім перевірені прищеплені послідовності субклонували в експресуючих векторах pMRR14 (важкий ланцюг) і pMR10.1 (легкий ланцюг). Активність CDR-прищеплених послідовностей в зв'язуванні CD22 Вектори, що кодують прищеплені варіанти, котрансфікували в клітини СНО в різних комбінаціях разом з вихідними ланцюгами химерного антитіла. Активність зв'язування порівнювали в конкурентному аналізі, здійснюючи конкуренцію з вихідним антитілом 5/44 миші за зв'язування з клітинами Ramos (одержаними з АТСС, лінія лімфобластних клітин людини лімфоми Беркітта, експресуючих поверхневий CD22). Даний аналіз вважався найкращим способом порівняння щеплення відносно їх здатності зв'язуватись з CD22 клітинної поверхні. Результати показані на Фіг.8. Як можна бачити, існує дуже незначна відмінність між будь-яким з щеплень, при цьому всі вони проявляли себе більш ефективно, ніж химерне антитіло в конкуренції проти мишачого батьківського антитіла. Вве 92580 24 дення З додаткових залишків людини на кінці CDR-H3 (gH5 і gH7) очевидно не надавало впливу на зв'язування. Була вибрана комбінація щеплення з найменшою кількістю мишачих залишків, gL1gH7. Прищеплений легкий ланцюг gL1 мав 6 донорних залишків. Залишки V2, V4, L37 і Q45 є потенційно важливими для упаковки залишками. Залишок Н38 знаходиться в ділянці контакту VH/VL. Залишок D60 є поверхневим залишком поблизу CDR-L2 і може безпосередньо робити внесок в зв'язування антигену. З цих залишків V2, L37, Q45 і D60 виявлені в послідовностях зародкової лінії каппа-генів людини з інших підгруп.Прищеплений важкий ланцюг gH7 має 4 донорних каркасних залишки (залишок R28 вважається частиною CDR-H1 згідно зі структурним визначенням, що використовується при CDR-щепленні (див. Adair et al. (1991 WO 91/09967)). Залишки E1 і А71 є поверхневими залишками поблизу CDR. Залишок 148 є потенційним пакуючим залишком. Залишок Т93 присутній в ділянці контакту VH/VL. З вказаних залишків Е1 і А71 виявлені в інших генах зародкової лінії підгрупи І людини. Залишок 148 виявлений у підгрупі 4 зародкової лінії людини, і Т73 виявлений в підгрупі 3 зародкової лінії людини. Повна послідовність ДНК і білка як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга, включаючи зразкове положення інтронів в генах константних ділянок, що надаються векторами, показані на Фіг.13 і наведені в SEQ ID NO: 29 і SEQ ID NO: 28 відповідно для легкого ланцюга і SEQ ID NO: 31 і SEQ ID NO: 30 відповідно для важкого ланцюга. ДНК, що кодує вказані гени легкого і важкого ланцюга, вирізали з вказаних векторів. ДНК важкого ланцюга розщеплювали в 5'-сайті Hindlll, потім обробляли фрагментом Кленова ДНК полімерази І Е. соlі, щоб створити тупий 5'-кінець. Розщеплення в 3'-сайті EcoRI давало в результаті фрагмент важкого ланцюга, який очищали з агарозних гелів. Таким же чином одержували фрагмент легкого ланцюга, затуплений в 5'-сайті Sful і з 3'-сайтом EcoRI. Обидва фрагменти клонували в основаних на DHFR експресуючих векторах і використали для створення стабільних клітинних ліній на клітинах СНО. 25 92580 26 27 92580 28 29 92580 30 31 92580 32 33 92580 34 35 92580 36 37 92580 38 39 92580 40 41 92580 42 43 92580 44 45 92580 46 47 92580 48 49 92580 50 51 92580 52 53 92580 54 55 92580 56 57 92580 58 59 92580 60