Антитіло, що містить варіант вихідної людської fс-ділянки

1. Антитіло, що містить варіант вихідної людської Fc-ділянки або її частину, яке відрізняється тим, що згаданий варіант містить щонайменше одну амінокислотну заміну, порівняно з вихідною Fc-ділянкою, причому згадана амінокислотна заміна знаходиться у положенні 247 послідовності людської Fc. 2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що заміна вибрана з групи, яку складають 247L, 247Н, 247I. 3. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що щонайменше однією амінокислотною заміною у варіанті Fc-ділянки є 247I. 4. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що згадане антитіло, яке містить варіант вихідної Fc-ділянки, опосередковує антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж антитіло, яке містить вихідну Fc-ділянку. 5. Антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що згадане антитіло, яке містить варіант вихідної Fc C2 2 (19) 1 3 86605 4 ділянки, способи ідентифікації корисних варіантів тої кишки). Існує, однак, багато антитіл, які були Fc-ділянки та способи застосування варіантів Fcвключені до клінічних випробувань і не одержали ділянки (наприклад, для лікування захворювання). схвалення унаслідок відсутності ефективності або У організмі людини існують імуноглобуліни п'яінших пов'язаних проблем. ти типів. Ці групи відомі як IgG, IgM, IgD, IgA та IgE Для підвищення ефективності і прискорення і розрізняються за ізотипами гена важкого ланцюга схвалення додаткових терапевтичних антитіл не(гамма, мю, дельта, альфа та іпсилон, відповідно). обхідними є композиції та способи зміни FcНайпоширенішим ізотипом є IgG, який складається ділянок для одержання варіантів поліпептидів із з двох ідентичних важких поліпептидних ланцюгів і поліпшеними властивостями. двох ідентичних легких поліпептидних ланцюгів Цей винахід пропонує варіанти поліпептидної (дивись Фіг. 1). Два важкі ланцюги ковалентно взаFc-ділянки, олігонуклеотиди, які кодують варіанти ємно зв'язані дисульфідними зв'язками, а кожен Fc-ділянки та їхні сегменти. Зокрема, цей винахід легкий ланцюг зв'язується з важким ланцюгом дипропонує композиції, що містять нові варіанти Fcсульфідним зв'язком (дивись Фіг. 1). Кожен важкий ділянки, способи ідентифікації корисних варіантів ланцюг містить приблизно 445 амінокислотних Fc-ділянки та способи застосування варіантів Fcзалишків, а кожен легкий ланцюг містить приблизділянки. но 215 амінокислотних залишків. Відповідно до певних варіантів здійснення, цей Кожен важкий ланцюг містить чотири окремих винахід пропонує композиції, які містять варіант домени, які, взагалі, називають варіабельною ді(або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує лянкою важкого ланцюга (VH), константним домезгаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має ном 1 важкого ланцюга (СН1), константним домепринаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант ном 2 важкого ланцюга (CH2) і константним опосередковує антитілозалежну клітинноопосередоменом 3 важкого ланцюга (СН3) (дивись Фіг. 1). дковану цитотоксичність (ADCC) у присутності Домен СН1 і домен СН2 сполучаються шарнірною ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж ділянкою (міждоменні сегменти), яка наділяє імувихідний поліпептид, і містить щонайменше одну ноглобулін (Ig) гнучкістю. Кожен легкий ланцюг амінокислотну модифікацію у положенні 247 Fcскладається з двох окремих ділянок, які, взагалі, ділянки. У конкретних варіантах здійснення згаданазивають варіабельною ділянкою легкого ланцюний варіант містить антитіло (наприклад, антига (VL) і константною ділянкою легкого ланцюга СD20 антитіло). Відповідно до варіантів здійснен(CL). ня, яким віддається перевага, згаданою амінокисВаріабельні ділянки важких і легких ланцюгів лотною модифікацією є P247L. безпосередньо зв'язують антиген і несуть відповіВідповідно до інших варіантів здійснення, цей дальність за різноманітність і специфічність імуновинахід пропонує композиції, які містять варіант глобулінів. Кожна VL і VH має три комплементарно (або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує визначальні ділянки (CDR, відомі також як гіпервазгаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має ріабельні, або hv-ділянки). У разі поєднання VL і принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант VH завдяки взаємодіям важкого і легкого ланцюга, опосередковує антитілозалежну клітинноопосерегіперваріабельні ділянки утворюють зв'язувальну дковану цитотоксичність (ADCC) у присутності поверхню, яка контактує з антигеном. ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж У той час як варіабельні ділянки є залученими вихідний поліпептид, і містить щонайменше одну до зв'язування антигену, константні домени важкоамінокислотну модифікацію у положенні 251 Fcго ланцюга, головним чином СН2 і СН3, здійснюділянки. У конкретних варіантах здійснення, згадають функції, які не мають відношення до зв'язуний варіант містить антитіло (наприклад, антивання антигенів. Ця ділянка, у цілому відома як FcСD20 антитіло). Відповідно до варіантів здійсненділянка, має багато важливих функцій. Згадана Fcня, яким віддається перевага, згаданою амінокисділянка, наприклад, зв'язує комплемент, який молотною модифікацією є L251F. же ініціювати фагоцитоз або комплементзалежну Відповідно до інших варіантів здійснення, цей цитотоксичність (CDC). Fc-ділянка також зв'язує винахід пропонує композиції, які містять варіант Fc-рецептори, які можуть ініціювати фагоцитоз або (або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC). згаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянка також відіграє роль у наданні допомоги, принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант спрямованої на підтримання збереження імуноопосередковує антитілозалежну клітинноопосереглобуліну у системі кровообігу, і взаємодіє з білком дковану цитотоксичність (ADCC) у присутності А, який традиційно застосовують для очищення ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж імуноглобуліну. вихідний поліпептид, і містить щонайменше одну Недавно були виконані дослідження, спрямоамінокислотну модифікацію у положенні 256 Fcвані на поліпшення імуногенної якості та антигензділянки. Відповідно до конкретних варіантів здійсв'язувальних характеристик антитіл. Були, напринення, згаданий варіант містить антитіло (наприклад, розроблені моноклональні, химерні та клад, анти-СD20 антитіло). Відповідно до варіантів гуманізовані антитіла для імунотерапії. Прикладаздійснення, яким віддається перевага, згаданою ми антитіл, схваленими для імунотерапії відповідамінокислотною модифікацією є Т256М. них захворювань людей, є такі: RITUXAN (лімфоВідповідно до інших варіантів здійснення, цей ма), SYNAGIS (інфекційні захворювання), винахід пропонує композиції, які містять варіант ZENEPAX (трансплантат нирок), REMICADE (хво(або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує роба Крона і ревматоїдний артрит), HERCEPTIN згаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має (рак молочної залози) і EDRECOLOMAB (рак товспринаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант 5 86605 6 опосередковує антитілозалежну клітинноопосеренення, згаданий варіант містить антитіло (напридковану цитотоксичність (ADCC) у присутності клад, анти-CD20 антитіло). Відповідно до варіантів ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж здійснення, яким віддається перевага, згаданою вихідний поліпептид, і містить щонайменше одну амінокислотною модифікацією є А339Т. амінокислотну модифікацію у положенні 268 FcВідповідно до інших варіантів здійснення, цей ділянки. Відповідно до конкретних варіантів здійсвинахід пропонує композиції, які містять варіант нення, згаданий варіант містить антитіло (напри(або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує клад, airra-CD20 антитіло). Відповідно до варіантів згаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має здійснення, яким віддається перевага, згаданою принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант амінокислотною модифікацією є Н268Е. опосередковує вичерпання клітин-мішеней (наприВідповідно до інших варіантів здійснення, цей клад, В-клітин) у аналізі цільної крові з більшою винахід пропонує композиції, які містять варіант ефективністю, аніж вихідний поліпептид, і містить (або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує щонайменше одну амінокислотну модифікацію у згаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має положенні 378 Fc-ділянки. Відповідно до конкретпринаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант них варіантів здійснення, згаданий варіант містить опосередковує антитілозалежну клітинноопосереантитіло (наприклад, анти-CD20 антитіло). Відподковану цитотоксичність (ADCC) у присутності відно до варіантів здійснення, яким віддається ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж перевага, згаданою амінокислотною модифікацією вихідний поліпептид, і містить щонайменше одну є A378D. амінокислотну модифікацію у положенні 280 FcВідповідно до інших варіантів здійснення, цей ділянки. Відповідно до конкретних варіантів здійсвинахід пропонує композиції, які містять варіант нення, згаданий варіант містить антитіло (напри(або нуклеїновокислотну послідовність, яка згадаклад, анти-CD20 антитіло). Відповідно до варіантів ний варіант) вихідного поліпептиду, що має приздійснення, яким віддається перевага, згаданою наймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант амінокислотною модифікацією є D280A. опосередковує антитілозалежну клітинноопосереВідповідно до інших варіантів здійснення, цей дковану цитотоксичність (ADCC) у присутності винахід пропонує композиції, які містять варіант ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж (або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує вихідний поліпептид, і містить щонайменше одну згаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має амінокислотну модифікацію у положенні 440 Fcпринаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант ділянки. Відповідно до конкретних варіантів здійсопосередковує антитілозалежну клітинноопосеренення, згаданий варіант містить антитіло (напридковану цитотоксичність (ADCC) у присутності клад, анти-CD20 антитіло). Відповідно до варіантів ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж здійснення, яким віддається перевага, згаданою вихідний поліпептид, і містить щонайменше одну амінокислотною модифікацією є S440Y. амінокислотну модифікацію у положенні 330 FcВідповідно до певних варіантів здійснення, цей ділянки. Відповідно до конкретних варіантів здійсвинахід пропонує пептид (що містить амінокислотнення, згаданий варіант містить антитіло (наприну модифікацію P247L), що містить послідовність, клад, анти-CD20 антитіло). Відповідно до варіантів представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 15. Відповідно здійснення, яким віддається перевага, згаданою до інших варіантів здійснення, цей винахід пропоамінокислотною модифікацією є А330К. нує нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує Відповідно до інших варіантів здійснення, цей ділянку СН2 з модифікацією P247L (наприклад, винахід пропонує композиції, які містять варіант ПОСЛІДОВНІСТЬ № 40). Відповідно до певних (або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує варіантів здійснення, цей винахід пропонує амінозгаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має кислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант модифікацією P247L, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ опосередковує антитілозалежну клітинноопосере№ 15. Відповідно до певних варіантів здійснення, дковану цитотоксичність (ADCC) у присутності цей винахід пропонує пептид (що містить модифіефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж кацію L251F) із послідовністю, представленою вихідний поліпептид, і містить щонайменше одну ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16. Відповідно до додаткоамінокислотну модифікацію у положенні 332 Fcвих варіантів здійснення, цей винахід пропонує ділянки. Відповідно до конкретних варіантів здійснуклеїновокислотну послідовність, яка кодує ділянення, згаданий варіант містить антитіло (напринку СН2 із модифікацією L251F (наприклад, ПОклад, airra-CD20 антитіло). Відповідно до варіантів СЛІДОВНІСТЬ № 41). Відповідно до додаткових здійснення, яким віддається перевага, згаданою варіантів здійснення, цей винахід пропонує аміноамінокислотною модифікацією є І332Е. кислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з Відповідно до інших варіантів здійснення, цей модифікацією L251F, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ винахід пропонує композиції, які містять варіант № 16. (або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує Відповідно до певних варіантів здійснення, цей згаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має винахід пропонує пептид (що містить амінокислотпринаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант ну модифікацію Т256М), що містить послідовність, опосередковує антитілозалежну клітинноопосерепредставлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 17. Відповідно дковану цитотоксичність (ADCC) у присутності до інших варіантів здійснення, цей винахід пропоефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж нує нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує вихідний поліпептид, і містить щонайменше одну ділянку СН2 з модифікацією Т256М (наприклад, амінокислотну модифікацію у положенні 339 FcПОСЛІДОВНІСТЬ № 42). Відповідно до певних ділянки. Відповідно до конкретних варіантів здійсваріантів здійснення, цей винахід пропонує аміно 7 86605 8 кислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з ділянку СН2 з модифікацією A378D (наприклад, модифікацією Т256М, що містить ПОСЛІДОВПОСЛІДОВНІСТЬ № 55). Відповідно до певних НІСТЬ № 17. Відповідно до певних варіантів здійсваріантів здійснення, цей винахід пропонує амінонення, цей винахід пропонує пептид (що містить кислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з модифікацію Н268Е), що містить послідовність, модифікацією S440Y, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 20. Відповідно № 30. до додаткових варіантів здійснення, цей винахід Відповідно до певних варіантів здійснення, цей пропонує нуклеїновокислотну послідовність, яка винахід пропонує пептид (що містить модифікацію кодує ділянку СН2 з модифікацією Н268Е (наприS440Y), що містить послідовність, представлену клад, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 45). Відповідно до доПОСЛІДОВНІСТЮ № 31. Відповідно до інших вадаткових варіантів здійснення, цей винахід пропоріантів здійснення, цей винахід пропонує нуклеїнонує амінокислотну послідовність, яка кодує ділянку вокислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з СН2 з модифікацією Н268Е, що містить ПОСЛІмодифікацією S440Y (наприклад, ПОСЛІДОВДОВНІСТЬ № 20. НІСТЬ № 56). Відповідно до певних варіантів здійВідповідно до певних варіантів здійснення, цей снення, цей винахід пропонує амінокислотну повинахід пропонує пептид (що містить амінокислотслідовність, яка кодує ділянку СН2 з модифікацією ну модифікацію D280A), що містить послідовність, S440Y, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 31. представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 21. Відповідно Відповідно до певних варіантів здійснення, цей до інших варіантів здійснення, цей винахід проповинахід пропонує композиції, які містять варіант нує нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує (або нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з модифікацією D280A (наприклад, згаданий варіант) вихідного поліпептиду, що має ПОСЛІДОВНІСТЬ № 46). Відповідно до певних принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант варіантів здійснення, цей винахід пропонує аміномістить щонайменше одну амінокислотну модифікислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з кацію у положенні 247 Fc-ділянки, вибрану змодифікацією D280A, що містить ПОСЛІДОВпосеред Р247Н, Р247І і P247L. Відповідно до інших НІСТЬ № 21. Відповідно до певних варіантів здійсваріантів здійснення, цей винахід пропонує компонення, цей винахід пропонує пептид (що містить зиції, які містять варіант (або нуклеїновокислотну модифікацію А330К), що містить послідовність, послідовність, яка кодує згаданий варіант) вихідпредставлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 23. Відповідно ного поліпептиду, що має принаймні частину Fcдо додаткових варіантів здійснення, цей винахід ділянки, де згаданий варіант містить щонайменше пропонує нуклеїновокислотну послідовність, яка одну амінокислотну модифікацію у положенні 251 кодує ділянку СН2 з модифікацією А330К (наприFc-ділянки, де згаданою амінокислотною модифіклад, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 48). Відповідно до докацією є L251F. Відповідно до інших варіантів здійдаткових варіантів здійснення, цей винахід пропоснення, цей винахід пропонує композиції, які міснує амінокислотну послідовність, яка кодує ділянку тять варіант (або нуклеїновокислотну СН2 з модифікацією АЗЗОК, що містить ПОСЛІпослідовність, яка кодує згаданий варіант) вихідДОВНІСТЬ № 23. ного поліпептиду, що має принаймні частину FcВідповідно до певних варіантів здійснення, цей ділянки, де згаданий варіант містить щонайменше винахід пропонує пептид (що містить амінокислотодну амінокислотну модифікацію у положенні 256 ну модифікацію І332Е), що містить послідовність, Fc-ділянки, вибрану з-посеред Т256М і Т256Р. Відпредставлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 26. Відповідно повідно до інших варіантів здійснення, цей винахід до інших варіантів здійснення, цей винахід пропопропонує композиції, які містять варіант (або нукнує нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує леїновокислотну послідовність, яка кодує згаданий ділянку СН2 з модифікацією І332Е (наприклад, варіант) вихідного поліпептиду, що має принаймні ПОСЛІДОВНІСТЬ № 51). Відповідно до певних частину Fc-ділянки, де згаданий варіант містить варіантів здійснення, цей винахід пропонує амінощонайменше одну амінокислотну модифікацію у кислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з положенні 268 Fc-ділянки, вибрану з-посеред модифікацією І332Е, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ H268D і Н268Е. Відповідно до інших варіантів здій№ 26. Відповідно до певних варіантів здійснення, снення, цей винахід пропонує композиції, які місцей винахід пропонує пептид (що містить модифітять варіант (або нуклеїновокислотну послідовкацію А339Т), що містить послідовність, представність, яка кодує згаданий варіант) вихідного лену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 29. Відповідно до додаполіпептиду, що має принаймні частину Fcткових варіантів здійснення, цей винахід пропонує ділянки, де згаданий варіант містить щонайменше нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує діляодну амінокислотну модифікацію у положенні 280 нку СН2 з модифікацією А339Т (наприклад, ПОFc-ділянки, вибрану з-посеред D280A і D280K. СЛІДОВНІСТЬ № 54). Відповідно до додаткових Відповідно до інших варіантів здійснення, цей виваріантів здійснення, цей винахід пропонує амінонахід пропонує композиції, які містять варіант (або кислотну послідовність, яка кодує ділянку СН2 з нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує згамодифікацією А339Т, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ даний варіант) вихідного поліпептиду, що має при№ 29. наймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант Відповідно до певних варіантів здійснення, цей містить щонайменше одну амінокислотну модифівинахід пропонує пептид (що містить амінокислоткацію у положенні 330 Fc-ділянки, вибрану зну модифікацію A378D), що містить послідовність, посеред А330К і A330R. Відповідно до інших варіпредставлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 30. Відповідно антів здійснення, цей винахід пропонує композиції, до інших варіантів здійснення, цей винахід пропоякі містять варіант (або нуклеїновокислотну послінує нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує довність, яка кодує згаданий варіант) вихідного 9 86605 10 поліпептиду, що має принаймні частину Fc14. Відповідно до певних варіантів здійснення, ділянки, де згаданий варіант містить щонайменше згадані композиції містять амінокислотну послідоодну амінокислотну модифікацію у положенні 332 вність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 15. ВідпоFc-ділянки, вибрану з-посеред I332D і І332Е. Відвідно до певних варіантів здійснення, згадані комповідно до інших варіантів здійснення, цей винахід позиції містять нуклеїновокислотну послідовність, пропонує композиції, які містять варіант (або нукщо містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 38 та/або ПОСЛІлеїновокислотну послідовність, яка кодує згаданий ДОВНІСТЬ № 39 та/або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 40 чи варіант) вихідного поліпептиду, що має принаймні її комплемент або послідовності, які зв'язуються з частину Fc-ділянки, де згаданий варіант містить ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 38, № 39 або № 40 за щонайменше одну амінокислотну модифікацію у жорстких умов. Відповідно до додаткових варіантів положенні 339 Fc-ділянки, де згаданою амінокисздійснення, цей винахід пропонує клітини-хазяї лотною модифікацією є А339Т. Відповідно до ін(наприклад, клітини СНО (клітини яєчника китайсьших варіантів здійснення, цей винахід пропонує кого хом'ячка)) та вектори, що містять ПОСЛІДОкомпозиції, які містять варіант (або нуклеїновокисВНІСТЬ № 38 та/або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 39 лотну послідовність, яка кодує згаданий варіант) та/або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 40. Відповідно до конвихідного поліпептиду, що має принаймні частину кретних варіантів здійснення, цей винахід пропоFc-ділянки, де згаданий варіант містить щонайменує зчитуваний комп'ютером носій, де згаданий нше одну амінокислотну модифікацію у положенні зчитуваний комп'ютером носій кодує копію ПО378 Fc-ділянки, де згаданою амінокислотною моСЛІДОВНОСТІ № 13, 14, 15, 38, 39 або 40. дифікацією є A378D. Відповідно до інших варіантів Відповідно до певних варіантів здійснення, здійснення, цей винахід пропонує композиції, які згаданий варіант поліпептиду опосередковує антимістять варіант (або нуклеїновокислотну послідовтілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність, яка кодує згаданий варіант) вихідного поліність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із пептиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де більшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. згаданий варіант містить щонайменше одну аміноВідповідно до певних варіантів здійснення, згадакислотну модифікацію у положенні 440 Fc-ділянки, ний варіант поліпептиду містить антитіло або фраде згаданою амінокислотною модифікацією є гмент антитіла (наприклад, поліклональне антитіS440Y. ло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, Відповідно до певних варіантів здійснення, цей гуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). Відповідвинахід пропонує композиції, які містять варіант но до певних варіантів здійснення, згаданий вихідвихідного поліпептиду, що має принаймні частину ний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. Fc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує Відповідно до додаткових варіантів здійснення, антитілозалежну клітинноопосередковану цитотокзгаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку сичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно із більшою ефективністю, аніж вихідний поліпепдо інших варіантів здійснення, згаданий вихідний тид, і містить щонайменше одну амінокислотну поліпептид містить амінокислотну послідовність, модифікацію у положенні 247 Fc-ділянки. Відповівибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. дно до інших варіантів здійснення, цей винахід Відповідно до варіантів здійснення, яким відпропонує способи, що включають: а) надання: і) дається перевага, згаданою амінокислотною мокомпозиції, яка містить варіант вихідного поліпепдифікацією є Р247Н, Р247І або P247L. Відповідно тиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де до певних варіантів здійснення, згаданий варіант згаданий варіант опосередковує антитілозалежну поліпептиду містить другу, третю, четверту тощо клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у амінокислотну модифікацію на Fc-ділянці (дивись, присутності ефекторних клітин із більшою ефектинаприклад, Таблицю 1). Відповідно до певних вавністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайріантів здійснення, згаданий варіант являє собою менше одну амінокислотну модифікацію у полоСНО-експресований поліпептид. женні 247 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або Відповідно до певних варіантів здійснення, цей декількома симптомами захворювання; і b) ввевинахід пропонує композиції, які містять варіант дення згаданої композиції згаданому суб'єкту за вихідного поліпептиду, що має принаймні частину таких умов, за яких зменшується щонайменше Fc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує один із симптомів. Відповідно до конкретних варіаантитілозалежну клітинноопосередковану цитотокнтів здійснення, згаданий варіант містить антитіло сичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин або імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захвоіз більшою ефективністю, аніж вихідний поліпепрювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. тид, і містить щонайменше одну амінокислотну Відповідно до певних варіантів здійснення, модифікацію у положенні 251 Fc-ділянки. Відповізгаданий варіант містить принаймні частину Fcдно до інших варіантів здійснення, цей винахід ділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% пропонує способи, що включають: а) надання: і) чи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну композиції, яка містить варіант вихідного поліпепмодифікацію). Відповідно до певних варіантів здійтиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де снення, згадані варіанти поліпептиду містять ділязгаданий варіант опосередковує антитілозалежну нку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіаклітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у нтів здійснення, згадані композиції містять присутності ефекторних клітин із більшою ефектиамінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІвністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайДОВНІСТЬ № 13. Відповідно до певних варіантів менше одну амінокислотну модифікацію у полоздійснення, згадані композиції містять амінокисложенні 251 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або тну послідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № декількома симптомами захворювання; і b) вве 11 86605 12 дення згаданої композиції згаданому суб'єкту за пропонує способи, що включають: а) надання: і) таких умов, за яких зменшується щонайменше композиції, яка містить варіант вихідного поліпеподин із симптомів. Відповідно до конкретних варіатиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де нтів здійснення, згаданий варіант містить антитіло згаданий варіант опосередковує антитілозалежну або імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захвоклітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у рювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. присутності ефекторних клітин із більшою ефектиВідповідно до певних варіантів здійснення, вністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайзгаданий варіант містить принаймні частину Fcменше одну амінокислотну модифікацію у полоділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% женні 256 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або чи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну декількома симптомами захворювання; і b) ввемодифікацію). Відповідно до певних варіантів здійдення згаданої композиції згаданому суб'єкту за снення, згадані варіанти поліпептиду містять ділятаких умов, за яких зменшується щонайменше нку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіаодин із симптомів. Відповідно до конкретних варіантів здійснення, згадані композиції містять нтів здійснення, згаданий варіант містить антитіло амінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІабо імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захвоДОВНІСТЬ № 16. Відповідно до певних варіантів рювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. здійснення, згадані композиції містять нуклеїновоВідповідно до певних варіантів здійснення, кислотну послідовність, що містить ПОСЛІДОВзгаданий варіант містить принаймні частину FcНІСТЬ № 41 або її комплементом чи послідовносділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% ті, які зв'язуються з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 41 за чи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну жорстких умов. Відповідно до додаткових варіантів модифікацію). Відповідно до певних варіантів здійздійснення, цей винахід пропонує клітини-хазяї снення, згадані варіанти поліпептиду містять діля(наприклад, клітини СНО (клітини яєчника китайсьнку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіакого хом'ячка)) та вектори, що містять ПОСЛІДОнтів здійснення, згадані композиції містять ВНІСТЬ № 41. Відповідно до конкретних варіантів амінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІздійснення, цей винахід пропонує зчитуваний комДОВНІСТЬ № 17. Відповідно до певних варіантів п'ютером носій, де згаданий зчитуваний комп'ютездійснення, згадані композиції містять амінокислором носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСТІ № 16 або тну послідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № № 41. 18. Відповідно до певних варіантів здійснення, Відповідно до певних варіантів здійснення, згадані композиції містять нуклеїновокислотну позгаданий варіант поліпептиду опосередковує антислідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 42 тілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичта/або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 43 або її комплемент ність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із чи послідовності, які зв'язуються з ПОСЛІДОВНОбільшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. СТЯМИ № 42 або № 43 за жорстких умов. ВідповіВідповідно до певних варіантів здійснення, згададно до додаткових варіантів здійснення, цей винаний варіант поліпептиду містить антитіло або фрахід пропонує клітини-хазяї (наприклад, клітини гмент антитіла (наприклад, поліклональне антитіСНО (клітини яєчника китайського хом'ячка)) та ло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, вектори, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ № 42 та/або гуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). ВідповідПОСЛІДОВНІСТЬ № 43. Відповідно до конкретних но до певних варіантів здійснення, згаданий вихідваріантів здійснення, цей винахід пропонує зчитуний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. ваний комп'ютером носій, де згаданий зчитуваний Відповідно до додаткових варіантів здійснення, комп'ютером носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСТІ згаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку № 17, 18, 42 або 43. людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно Відповідно до певних варіантів здійснення, до інших варіантів здійснення, згаданий вихідний згаданий варіант поліпептиду опосередковує антиполіпептид містить амінокислотну послідовність, тілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичвибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. ність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із Відповідно до варіантів здійснення, яким відбільшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. дається перевага, згаданою амінокислотною моВідповідно до певних варіантів здійснення, згададифікацією є L251F. Відповідно до певних варіанний варіант поліпептиду містить антитіло або фратів здійснення, згаданий варіант поліпептиду гмент антитіла (наприклад, поліклональне антитімістить другу, третю, четверту тощо амінокислотну ло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, модифікацію на Fc-ділянці (дивись, наприклад, гуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). ВідповідТаблицю 1). Відповідно до певних варіантів здійсно до певних варіантів здійснення, згаданий вихіднення, згаданий варіант являє собою СНОний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. експресований поліпептид. Відповідно до додаткових варіантів здійснення, Відповідно до певних варіантів здійснення, цей згаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку винахід пропонує композиції, які містять варіант людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно вихідного поліпептиду, що має принаймні частину до інших варіантів здійснення, згаданий вихідний Fc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує поліпептид містить амінокислотну послідовність, антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоквибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. сичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин Відповідно до варіантів здійснення, яким відіз більшою ефективністю, аніж вихідний поліпепдається перевага, згаданою амінокислотною мотид, і містить щонайменше одну амінокислотну дифікацією є Т256М або Т256Р. Відповідно до пемодифікацію у положенні 256 Fc-ділянки. Відповівних варіантів здійснення, згаданий варіант дно до інших варіантів здійснення, цей винахід поліпептиду містить другу, третю, четверту тощо 13 86605 14 амінокислотну модифікацію на Fc-ділянці (дивись, Відповідно до конкретних варіантів здійснення, наприклад, Таблицю 1). Відповідно до певних вазгаданою щонайменше однією амінокислотною ріантів здійснення, згаданий варіант являє собою модифікацією є І332К або I332R. СНО-експресований поліпептид. Відповідно до певних варіантів здійснення, Відповідно до певних варіантів здійснення, цей згаданий варіант поліпептиду опосередковує антивинахід пропонує композиції, які містять варіант тілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичвихідного поліпептиду, що має принаймні частину ність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із Fc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує більшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. антитілозалежну клітинноопосередковану цитотокВідповідно до певних варіантів здійснення, згадасичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин ний варіант поліпептиду містить антитіло або фраіз більшою ефективністю, аніж вихідний поліпепгмент антитіла (наприклад, поліклональне антитітид, і містить щонайменше одну амінокислотну ло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, модифікацію у положенні 268 Fc-ділянки. Відповігуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). Відповіддно до інших варіантів здійснення, цей винахід но до певних варіантів здійснення, згаданий вихідпропонує способи, що включають: а) надання: і) ний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. композиції, яка містить варіант вихідного поліпепВідповідно до додаткових варіантів здійснення, тиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку згаданий варіант опосередковує антитілозалежну людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у до інших варіантів здійснення, згаданий вихідний присутності ефекторних клітин із більшою ефектиполіпептид містить амінокислотну послідовність, вністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайвибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. менше одну амінокислотну модифікацію у полоВідповідно до варіантів здійснення, яким відженні 268 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або дається перевага, згаданою амінокислотною модекількома симптомами захворювання; і b) введифікацією є H268D або Н268Е. Відповідно до дення згаданої композиції згаданому суб'єкту за певних варіантів здійснення, згаданий варіант потаких умов, за яких зменшується щонайменше ліпептиду містить другу, третю, четверту тощо один із симптомів. Відповідно до конкретних варіаамінокислотну модифікацію на Fc-ділянці (дивись, нтів здійснення, згаданий варіант містить антитіло наприклад, Таблицю 1). Відповідно до певних ваабо імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захворіантів здійснення, згаданий варіант являє собою рювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. СНО-експресований поліпептид. Відповідно до певних варіантів здійснення, Відповідно до певних варіантів здійснення, цей згаданий варіант містить принаймні частину Fcвинахід пропонує композиції, які містять варіант ділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% вихідного поліпептиду, що має принаймні частину чи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну Fc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує модифікацію). Відповідно до певних варіантів здійантитілозалежну клітинноопосередковану цитотокснення, згадані варіанти поліпептиду містять ділясичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин нку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіаіз більшою ефективністю, аніж вихідний поліпепнтів здійснення, згадані композиції містять тид, і містить щонайменше одну амінокислотну амінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІмодифікацію у положенні 280 Fc-ділянки. ВідповіДОВНІСТЬ № 19. Відповідно до певних варіантів дно до інших варіантів здійснення, цей винахід здійснення, згадані композиції містять амінокислопропонує способи, що включають: а) надання: і) тну послідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № композиції, яка містить варіант вихідного поліпеп20. Відповідно до певних варіантів здійснення, тиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де згадані композиції містять нуклеїновокислотну позгаданий варіант опосередковує антитілозалежну слідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 44 клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у та/або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 45 або її комплемент присутності ефекторних клітин із більшою ефектичи послідовності, які зв'язуються з ПОСЛІДОВНОвністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайСТЯМИ №№ 44 або 45 за жорстких умов. Відповіменше одну амінокислотну модифікацію у полодно до додаткових варіантів здійснення, цей винаженні 280 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або хід пропонує клітини-хазяї (наприклад, клітини декількома симптомами захворювання; і b) ввеСНО (клітини яєчника китайського хом'ячка)) та дення згаданої композиції згаданому суб'єкту за вектори, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ № 44 та/або таких умов, за яких зменшується щонайменше ПОСЛІДОВНІСТЬ № 45. Відповідно до конкретних один із симптомів. Відповідно до конкретних варіаваріантів здійснення, цей винахід пропонує зчитунтів здійснення, згаданий варіант містить антитіло ваний комп'ютером носій, де згаданий зчитуваний або імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захвокомп'ютером носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСТІ рювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. № 19, 20, 44 або 45. Відповідно до певних варіантів здійснення, Відповідно до певних варіантів здійснення, цей згаданий варіант містить принаймні частину Fcвинахід пропонує композиції, які містять варіант ділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% вихідного поліпептиду, що має принаймні частину чи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну Fc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує модифікацію). Відповідно до певних варіантів здійантитілозалежну клітинноопосередковану цитотокснення, згадані варіанти поліпептиду містять ділясичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин нку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіаіз меншою ефективністю, аніж вихідний поліпепнтів здійснення, згадані композиції містять тид, і містить щонайменше одну амінокислотну амінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІмодифікацію у положенні 332 Fc-ділянки. ДОВНІСТЬ № 21. Відповідно до певних варіантів 15 86605 16 здійснення, згадані композиції містять амінокислоодин із симптомів. Відповідно до конкретних варіатну послідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № нтів здійснення, згаданий варіант містить антитіло 22. Відповідно до певних варіантів здійснення, або імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захвозгадані композиції містять нуклеїновокислотну порювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. слідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 46 Відповідно до певних варіантів здійснення, та/або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 47 або її комплемент згаданий варіант містить принаймні частину Fcчи послідовності, які зв'язуються з ПОСЛІДОВНОділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% СТЯМИ № 46 або № 47 за жорстких умов. Відповічи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну дно до додаткових варіантів здійснення, цей винамодифікацію). Відповідно до певних варіантів здійхід пропонує клітини-хазяї (наприклад, клітини снення, згадані варіанти поліпептиду містять діляСНО (клітини яєчника китайського хом'ячка)) та нку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіавектори, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ № 46 та/або нтів здійснення, згадані композиції містять ПОСЛІДОВНІСТЬ № 47. Відповідно до конкретних амінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІваріантів здійснення, цей винахід пропонує зчитуДОВНІСТЬ № 23. Відповідно до певних варіантів ваний комп'ютером носій, де згаданий зчитуваний здійснення, згадані композиції містять амінокислокомп'ютером носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСТІ тну послідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № № 21, № 22, № 46 і № 47. 24. Відповідно до певних варіантів здійснення, Відповідно до певних варіантів здійснення, згадані композиції містять нуклеїновокислотну позгаданий варіант поліпептиду опосередковує антислідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 48 тілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичта/або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 49 або її комплемент ність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із чи послідовності, які зв'язуються з ПОСЛІДОВНОбільшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. СТЯМИ № 48 або № 49 за жорстких умов. ВідповіВідповідно до певних варіантів здійснення, згададно до додаткових варіантів здійснення, цей винаний варіант поліпептиду містить антитіло або фрахід пропонує клітини-хазяї (наприклад, клітини гмент антитіла (наприклад, поліклональне антитіСНО (клітини яєчника китайського хом'ячка)) та ло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, вектори, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ № 48 та/або гуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). ВідповідПОСЛІДОВНІСТЬ № 49. Відповідно до конкретних но до певних варіантів здійснення, згаданий вихідваріантів здійснення, цей винахід пропонує зчитуний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. ваний комп'ютером носій, де згаданий зчитуваний Відповідно до додаткових варіантів здійснення, комп'ютером носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСзгаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку ТЕЙ № 23, № 24, № 48 і № 49. людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно Відповідно до певних варіантів здійснення, до інших варіантів здійснення, згаданий вихідний згаданий варіант поліпептиду опосередковує антиполіпептид містить амінокислотну послідовність, тілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичвибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. ність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із Відповідно до варіантів здійснення, яким відбільшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. дається перевага, згаданою амінокислотною моВідповідно до певних варіантів здійснення, згададифікацією є D280A або D280K. Відповідно до пений варіант поліпептиду містить антитіло або фравних варіантів здійснення, згаданий варіант гмент антитіла (наприклад, поліклональне антитіполіпептиду містить другу, третю, четверту тощо ло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, амінокислотну модифікацію на Fc-ділянці (дивись, гуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). Відповіднаприклад, Таблицю 1). Відповідно до певних вано до певних варіантів здійснення, згаданий вихідріантів здійснення, згаданий варіант являє собою ний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. СНО-експресований поліпептид. Відповідно до додаткових варіантів здійснення, Відповідно до певних варіантів здійснення, цей згаданий вихідний полілептид містить Fc-ділянку винахід пропонує композиції, які містять варіант людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно вихідного поліпептиду, що має принаймні частину до інших варіантів здійснення, згаданий вихідний Fc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує поліпептид містить амінокислотну послідовність, антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоквибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. сичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин Відповідно до варіантів здійснення, яким відіз більшою ефективністю, аніж вихідний поліпепдається перевага, згаданою амінокислотною мотид, і містить щонайменше одну амінокислотну дифікацією є А330К або A330R. Відповідно до пемодифікацію у положенні 330 Fc-ділянки. Відповівних варіантів здійснення, згаданий варіант дно до інших варіантів здійснення, цей винахід поліпептиду містить другу, третю, четверту тощо пропонує способи, що включають: а) надання: і) амінокислотну модифікацію на Fc-ділянці (дивись, композиції, яка містить варіант вихідного поліпепнаприклад, Таблицю 1). Відповідно до певних ватиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де ріантів здійснення, згаданий варіант являє собою згаданий варіант опосередковує антитілозалежну СНО-експресований поліпептид. клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у Відповідно до певних варіантів здійснення, цей присутності ефекторних клітин із більшою ефективинахід пропонує композиції, які містять варіант вністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайвихідного поліпептиду, що має принаймні частину менше одну амінокислотну модифікацію . у полоFc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує женні 330 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або антитілозалежну клітинноопосередковану цитотокдекількома симптомами захворювання; і b) ввесичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин дення згаданої композиції згаданому суб'єкту за із більшою ефективністю, аніж вихідний поліпептаких умов, за яких зменшується щонайменше тид, і містить щонайменше одну амінокислотну 17 86605 18 модифікацію у положенні 332 Fc-ділянки. Відповіних варіантів здійснення, згаданий варіант дно до інших варіантів здійснення, цей винахід поліпептиду містить другу, третю, четверту тощо пропонує способи, що включають: а) надання: і) амінокислотну модифікацію на Fc-ділянці (дивись, композиції, яка містить варіант вихідного поліпепнаприклад, Таблицю 1). Відповідно до певних ватиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де ріантів здійснення, згаданий варіант являє собою згаданий варіант опосередковує антитілозалежну СНО-експресований поліпептид. клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у Відповідно до певних варіантів здійснення, цей присутності ефекторних клітин із більшою ефективинахід пропонує композиції, які містять варіант вністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайвихідного поліпептиду, що має принаймні частину менше одну амінокислотну модифікацію у полоFc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує женні 332 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або антитілозалежну клітинноопосередковану цитотокдекількома симптомами захворювання; і b) ввесичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин дення згаданої композиції згаданому суб'єкту за із більшою ефективністю, аніж вихідний поліпептаких умов, за яких зменшується щонайменше тид, і містить щонайменше одну амінокислотну один із симптомів. Відповідно до конкретних варіамодифікацію у положенні 339 Fc-ділянки. Відповінтів здійснення, згаданий варіант містить антитіло дно до інших варіантів здійснення, цей винахід або імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захвопропонує способи, що включають: а) надання: і) рювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. композиції, яка містить варіант вихідного поліпепВідповідно до певних варіантів здійснення, тиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант містить принаймні частину Fcзгаданий варіант опосередковує антитілозалежну ділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у чи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну присутності ефекторних клітин із більшою ефектимодифікацію). Відповідно до певних варіантів здійвністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайснення, згадані варіанти поліпептиду містять діляменше одну амінокислотну модифікацію у полонку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіаженні 339 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або нтів здійснення, згадані композиції містять декількома симптомами захворювання; і b) ввеамінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІдення згаданої композиції згаданому суб'єкту за ДОВНІСТЬ № 25. Відповідно до певних варіантів таких умов, за яких зменшується щонайменше здійснення, згадані композиції містять амінокислоодин із симптомів. Відповідно до конкретних варіатну послідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № нтів здійснення, згаданий варіант містить антитіло 26. Відповідно до певних варіантів здійснення, або імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захвозгадані композиції містять нуклеїновокислотну порювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. слідовність, що містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 50 Відповідно до певних варіантів здійснення, та/або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 51 або її комплемент згаданий варіант містить принаймні частину Fcчи послідовності, які зв'язуються з ПОСЛІДОВНОділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% СТЯМИ № 50 або № 51 за жорстких умов. Відповічи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну дно до додаткових варіантів здійснення, цей винамодифікацію). Відповідно до певних варіантів здійхід пропонує клітини-хазяї (наприклад, клітини снення, згадані варіанти поліпептиду містять діляСНО (клітини яєчника китайського хом'ячка)) та нку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіавектори, що містять ПОСЛІДОВНІСТЬ № 50 та/або нтів здійснення, згадані композиції містять ПОСЛІДОВНІСТЬ № 51. Відповідно до конкретних амінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІваріантів здійснення, цей винахід пропонує зчитуДОВНІСТЬ № 29. Відповідно до певних варіантів ваний комп'ютером носій, де згаданий зчитуваний здійснення, згадані композиції містять нуклеїновокомп'ютером носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСТІ кислотну послідовність, що містить ПОСЛІДОВ№ 25, 26, 50 і 51. НІСТЬ № 54 або її комплемент чи послідовності, Відповідно до певних варіантів здійснення, які зв'язуються з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 54 за жорсзгаданий варіант поліпептиду опосередковує антитких умов. Відповідно до додаткових варіантів тілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичздійснення, цей винахід пропонує клітини-хазяї ність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із (наприклад, клітини СНО (клітини яєчника китайсьбільшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. кого хом'ячка)) та вектори, що містять ПОСЛІДОВідповідно до певних варіантів здійснення, згадаВНІСТЬ № 54. Відповідно до конкретних варіантів ний варіант поліпептиду містить антитіло або фраздійснення, цей винахід пропонує зчитуваний комгмент антитіла (наприклад, поліклональне антитіп'ютером носій, де згаданий зчитуваний комп'ютело, моноклональне антитіло, химерне антитіло, ром носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 29 гуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). Відповідабо № 54. но до певних варіантів здійснення, згаданий вихідВідповідно до певних варіантів здійснення, ний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. згаданий варіант поліпептиду опосередковує антиВідповідно до додаткових варіантів здійснення, тілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичзгаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку ність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно більшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. до інших варіантів здійснення, згаданий вихідний Відповідно до певних варіантів здійснення, згадаполіпептид містить амінокислотну послідовність, ний варіант поліпептиду містить антитіло або фравибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. гмент антитіла (наприклад, поліклональне антитіВідповідно до варіантів здійснення, яким відло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, дається перевага, згаданою амінокислотною могуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). Відповіддифікацією є I332D або І332Е. Відповідно до певно до певних варіантів здійснення, згаданий вихід 19 86605 20 ний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. більшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. Відповідно до додаткових варіантів здійснення, Відповідно до певних варіантів здійснення, згадазгаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку ний варіант поліпептиду містить антитіло або фралюдського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно гмент антитіла (наприклад, поліклональне антитідо інших варіантів здійснення, згаданий вихідний ло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, поліпептид містить амінокислотну послідовність, гуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). Відповідвибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. но до певних варіантів здійснення, згаданий вихідВідповідно до варіантів здійснення, яким відний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. дається перевага, згаданою амінокислотною моВідповідно до додаткових варіантів здійснення, дифікацією є А339Т. Відповідно до певних варіанзгаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку тів здійснення, згаданий варіант поліпептиду людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно містить другу, третю, четверту тощо амінокислотну до інших варіантів здійснення, згаданий вихідний модифікацію на Fc-ділянці (дивись, наприклад, поліпептид містить амінокислотну послідовність, Таблицю 1). Відповідно до певних варіантів здійсвибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. нення, згаданий варіант являє собою СНОВідповідно до варіантів здійснення, яким віддаєтьекспресований поліпептид. ся перевага, згаданою амінокислотною модифікаВідповідно до певних варіантів здійснення, цей цією є A338D. Відповідно до певних варіантів здійвинахід пропонує композиції, які містять варіант снення, згаданий варіант поліпептиду містить вихідного поліпептиду, що має принаймні частину другу, третю, четверту тощо амінокислотну модиFc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує фікацію на Fc-ділянці (дивись, наприклад, Табливичерпання клітин-мішеней у аналізі цільної крові з цю 1). Відповідно до певних варіантів здійснення, більшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид, і згаданий варіант являє собою СНО-експресований містить щонайменше одну амінокислотну модифіполіпептид. кацію у положенні 378 Fc-ділянки. Відповідно до Відповідно до певних варіантів здійснення, цей інших варіантів здійснення, цей винахід пропонує винахід пропонує композиції, які містять варіант способи, що включають: а) надання: і) композиції, вихідного поліпептиду, що має принаймні частину яка містить варіант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянки, де згаданий варіант опосередковує принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант антитілозалежну клітинноопосередковану цитотокопосередковує вичерпання клітин-мішеней у анасичність (ADCC) у присутності ефекторних клітин лізі цільної крові з більшою ефективністю, аніж із більшою ефективністю, аніж вихідний поліпепвихідний поліпептид, і містить щонайменше одну тид, і містить щонайменше одну амінокислотну амінокислотну модифікацію у положенні 378 Fcмодифікацію у Положенні 440 Fc-ділянки. Відповіділянки та іі) суб'єкта з одним або декількома симдно до інших варіантів здійснення, цей винахід птомами захворювання; і b) введення згаданої пропонує способи, що включають: а) надання: і) композиції згаданому суб'єкту за таких умов, за композиції, яка містить варіант вихідного поліпепяких зменшується щонайменше один із симптомів. тиду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де Відповідно до конкретних варіантів здійснення, згаданий варіант опосередковує антитілозалежну згаданий варіант містить антитіло або імуноадгеклітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у зин, а суб'єкт має симптоми захворювання, яке присутності ефекторних клітин із більшою ефектиреагує на антитіло або імуноадгезин. вністю, аніж вихідний поліпептид, і містить щонайВідповідно до певних варіантів здійснення, менше одну амінокислотну модифікацію у полозгаданий варіант містить принаймні частину Fcженні 440 Fc-ділянки та іі) суб'єкта з одним або ділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% декількома симптомами захворювання; і b) ввечи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну дення згаданої композиції згаданому суб'єкту за модифікацію). Відповідно до певних варіантів здійтаких умов, за яких зменшується щонайменше снення, згадані варіанти поліпептиду містять діляодин із симптомів. Відповідно до конкретних варіанку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіантів здійснення, згаданий варіант містить антитіло нтів здійснення, згадані композиції містять або імуноадгезин, а суб'єкт має симптоми захвоамінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІрювання, яке реагує на антитіло або імуноадгезин. ДОВНІСТЬ № 30. Відповідно до певних варіантів Відповідно до певних варіантів здійснення, здійснення, згадані композиції містять нуклеїновозгаданий варіант містить принаймні частину Fcкислотну послідовність, що містить ПОСЛІДОВділянки (наприклад, 40%, 50%, 60%, 80% або 90% НІСТЬ № 55 або її комплемент чи послідовності, чи більше Fc-ділянки, що містить амінокислотну які зв'язуються з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 55 за жорсмодифікацію). Відповідно до певних варіантів здійтких умов. Відповідно до додаткових варіантів снення, згадані варіанти поліпептиду містять діляздійснення, цей винахід пропонує клітини-хазяї нку СН2 або СН3. Відповідно до додаткових варіа(наприклад, клітини СНО (клітини яєчника китайсьнтів здійснення, згадані композиції містять кого хом'ячка)) та вектори, що містять ПОСЛІДОамінокислотну послідовність, що містить ПОСЛІВНІСТЬ № 55. Відповідно до конкретних варіантів ДОВНІСТЬ № 31. Відповідно до певних варіантів здійснення, цей винахід пропонує зчитуваний комздійснення, згадані композиції містять нуклеїновоп'ютером носій, де згаданий зчитуваний комп'ютекислотну послідовність, що містить ПОСЛІДОВром носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 30 НІСТЬ № 56 або її комплемент чи послідовності, або № 55. які зв'язуються з ПОСЛІДОВНІСТЮ № 56 за жорсВідповідно до певних варіантів здійснення, тких умов. Відповідно до додаткових варіантів згаданий варіант поліпептиду опосередковує виздійснення, цей винахід пропонує клітини-хазяї черпання клітин-мішеней у аналізі цільної крові з (наприклад, клітини СНО (клітини яєчника китайсь 21 86605 22 кого хом'ячка)) та вектори, що містять ПОСЛІДОпозиції містять нуклеїновокислотну послідовність, ВНІСТЬ № 56. Відповідно до конкретних варіантів яка кодує варіант Fc-поліпептиду, який опосередздійснення, цей винахід пропонує зчитуваний комковує вичерпання клітин-мішеней у аналізі цільної п'ютером носій, де згаданий зчитуваний комп'ютекрові з більшою ефективністю, аніж вихідний поліром носій кодує копію ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 31 пептид, де згаданий варіант Fc-поліпептиду місабо № 56. тить амінокислотну модифікацію у положенні аміВідповідно до певних варіантів здійснення, нокислоти 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, згаданий варіант поліпептиду опосередковує анти378 або 440 чи їх комбінації. тілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичВідповідно до певних варіантів здійснення, ваність (ADCC) у присутності ефекторних клітин із ріанти за цим винаходом і нуклеїновокислотні побільшою ефективністю, аніж вихідний поліпептид. слідовності, які кодують згадані варіанти, пропоВідповідно до певних варіантів здійснення, згадануються щонайменше з одним компонентом у ний варіант поліпептиду містить антитіло або франаборі. Набір, наприклад, може містити щонаймегмент антитіла (наприклад, поліклональне антитінше варіант одного типу і письмові інструкції щодо ло, моноклональне антитіло, химерне антитіло, застосування згаданого варіанта. Згаданий набір гуманізоване антитіло або Fc-фрагмент). Відповідможе також містити буфери та інші корисні реакно до певних варіантів здійснення, згаданий вихідтиви. ний поліпептид містить Fc-ділянку людського IgG. Відповідно до певних варіантів здійснення, цей Відповідно до додаткових варіантів здійснення, винахід пропонує способи, які включають: а) назгаданий вихідний поліпептид містить Fc-ділянку дання: і) клітин, що експресують антиген-мішень людського IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Відповідно (наприклад, CD20), ії) композиції, що містить варідо інших варіантів здійснення, згаданий вихідний ант вихідного поліпептиду, який має принаймні поліпептид містить амінокислотну послідовність, частину Fc-ділянки, де згаданий варіант містить вибрану з-посеред ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-12. щонайменше одну амінокислотну модифікацію на Відповідно до варіантів здійснення, яким відFc-ділянці, та ііі) ефекторних клітин (наприклад, дається перевага, згаданою амінокислотною мозбагачені РВМС (мононуклеари периферичної дифікацією є S440Y. Відповідно до певних варіанкрові людини(-ей)-донора(-ів)), і b) контактування тів здійснення, згаданий варіант поліпептиду клітин-мішеней зі згаданою композицією і ефектомістить другу, третю, четверту тощо амінокислотну рними клітинами за таких умов, за яких згаданий модифікацію на Fc-ділянці (дивись, наприклад, варіант зв'язується з клітинами-мішенями (наприТаблицю 1). Відповідно до певних варіантів здійсклад, через ліганд, що експресується на поверхні нення, згаданий варіант являє собою СНОклітин), і с) визначення лізису клітин-мішеней (наекспресованийполіпептид. приклад, за виділенням LDH (лактатдегідрогеназа) Відповідно до додаткових варіантів здійсненабо хрому 51). ня, згадані композиції містять нуклеїновокислотну Відповідно до інших варіантів здійснення, цей послідовність, яка кодує варіант вихідного поліпевинахід пропонує способи, які включають: а) наптиду, що містить принаймні частину Fc-ділянки, дання: і) проб цільної крові, що містять клітини, які де згаданий варіант опосередковує антитілозалеекспресують антиген-мішень (наприклад, Вжну клітинноопосередковану цитотоксичність клітини, що експресують CD20) і іі) композиції, що (ADCC) у присутності ефекторних клітин із більмістить варіант вихідного поліпептиду, який має шою ефективністю, аніж вихідний поліпептид, і принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий варіант містить щонайменше одну амінокислотну модифімістить щонайменше одну амінокислотну модифікацію у положенні 247, 251, 256, 268, 280, 330, кацію на Fc-ділянці, і Ь) контактування клітин332, 339, 378 або 440 чи їх комбінацію на Fcмішеней зі згаданою композицією і ефекторними ділянці. Відповідно до певних варіантів здійснення, клітинами за таких умов, за яких згаданий варіант згадані композиції містять нуклеїновокислотну позв'язується з клітинами-мішенями (наприклад, чеслідовність, яка кодує варіант Fc-поліпеіггаду, який рез ліганд CD20, експресований на поверхні кліопосередковує антитілозалежну клітинноопосеретин), і с) визначення зникнення клітин-мішеней дковану цитотоксичність (ADCC) у присутності (наприклад, шляхом проведення FACS-аналізу ефекторних клітин із більшою ефективністю, аніж (аналіз збудженої флуоресценції сортованих клівихідний поліпептид, де згаданий варіант Fcтин) з іншим маркером В-клітин, наприклад, CD19). поліпептиду містить щонайменше одну амінокисВідповідно до певних варіантів здійснення, цей лотну модифікацію у положенні амінокислоти 247, винахід пропонує способи ідентифікації двовидо251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 або 440 чи їх вих поліпшених варіантів, які включають: а) накомбінації. дання: і) клітин-мішеней, іі) композиції, що містить Відповідно до додаткових варіантів здійсненваріант вихідного поліпептиду-"кандидату", який ня, згадані композиції містять нуклеїновокислотну має Fc-ділянку, де згаданий варіант-"кандидат" послідовність, яка кодує варіант вихідного поліпемістить щонайменше одну амінокислотну модифіптиду, що містить принаймні частину Fc-ділянки, кацію на Fc-ділянці, і де згаданий варіантде згаданий варіант опосередковує вичерпання "кандидат" опосередковує цитотоксичність клітинклітин-мішеней у аналізі цільної крові з більшою мішеней у присутності ефекторних клітин першого ефективністю, аніж вихідний поліпептид, і містить виду з більшою ефективністю, аніж вихідний поліщонайменше одну амінокислотну модифікацію у пептид, та ііі) ефекторних клітин другого виду, і Ь) положенні 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, інкубування згаданої композиції з клітинами378 або 440 чи їх комбінацію на Fc-ділянці. Відпомішенями за таких умов, за яких варіантвідно до певних варіантів здійснення, згадані ком"кандидат" зв'язує клітини-мішені з одержанням, 23 86605 24 таким чином, клітин-мішеней, зв'язаних варіантомВідповідно до конкретних варіантів здійснення, "кандидатом", с) змішування ефекторних клітин згаданий спосіб додатково включає стадію визнадругого виду з клітинами-мішенями, зв'язаними чення здатності вихідного поліпептиду до опосеваріантом-"кандидатом", d) визначення цитотоксиредковування цитотоксичності клітин-мішеней у чності клітин-мішеней (наприклад, опосередковаприсутності згаданого першого виду та/або згаданої згаданим варіантом-"кандидатом"), є) визнаного другого ваду. Згадані способи, наприклад, чення того, чи опосередковує варіант-"кандидат" можуть додатково включати змішування ефекторцитотоксичність клітин-мішеней у присутності ефених клітин першого або другого виду з клітинамикторних клітин другого виду з більшою ефективнісмішенями, зв'язаними вихідним поліпептидом, із тю, аніж вихідний поліпептид. подальшим визначенням цитотоксичності клітинВідповідно до певних варіантів здійснення, мішеней (наприклад, шляхом визначення такого згаданий спосіб додатково включає відбір вихіднозначення, яке могло б застосовуватись для порівго поліпептиду таким самим чином з ефекторними няння з ним значень, одержаних із варіантами). клітинами другого виду. Відповідно до додаткових Відповідно до певних варіантів здійснення, варіантів здійснення, стадії b) і с) здійснюються згаданий спосіб додатково включає стадію g) ввеодночасно. Відповідно до конкретних варіантів дення двовидового поліпшеного варіанта експездійснення, згаданий спосіб додатково включає риментальній тварині, де згадана експериментастадію f) ідентифікації варіанта-"кандидата", як льна тварина є членом другого виду. Відповідно поліпшеного двовидового варіанта, який опосередо інших варіантів здійснення, згаданий спосіб дковує цитотоксичність клітин-мішеней у присутдодатково включає, перед стадією а), стадію відності ефекторних клітин другого виду з більшою бирання варіанта-"кандидата" у аналізі зв'язуванефективністю, аніж вихідний поліпептид. Відповідня Fc-рецептора (FcR). Відповідно до певних варіно до інших варіантів здійснення, згаданий спосіб антів здійснення, аналіз зв'язування FcR являє додатково включає стадію f) ідентифікації варіансобою аналіз зв'язування Fc-рецептора новонарота-"кандидата", як поліпшеного двовидового варіджених (FcRn). анта, який опосередковує цитотоксичність клітинВідповідно до деяких варіантів, згаданий спомішеней у присутності ефекторних клітин другого сіб додатково включає, перед стадією а) стадію виду з ефективністю, приблизно у 1,2 рази (або відбору варіанта-"кандидата" у аналізі CDC (диприблизно у 1,5 рази, 5 разів або приблизно 10 вись, наприклад, розділ IV нижче). Відповідно до разів) вищою за ефективність вихідного поліпеппевних варіантів здійснення, ефекторними клітитиду (наприклад, спостерігається приблизно у 1,2 нами першого виду є мононуклеари периферичної рази більший лізис клітин-мішеней). крові (РВМС) людини. Відповідно до інших варіанВідповідно до інших варіантів здійснення, цей тів здійснення, ефекторними клітинами першого винахід пропонує способи ідентифікації двовидовиду є РВМС мишей або РВМС пацюків. Відповідвих поліпшених варіантів, які включають: а) нано до певних варіантів здійснення, ефекторними дання: і) клітин-мішеней, іі) композиції, що містить клітинами другого виду є РВМС мишей або РВМС варіант-"кандидат" вихідного поліпептиду, який пацюків. Відповідно до конкретних варіантів здійсмає Fc-ділянку, де згаданий варіант-"кандидат" нення, ефекторними клітинами другого виду є містить щонайменше одну амінокислотну модифіРВМС людини. кацію на Fc-ділянці, ііі) ефекторних клітин першого Відповідно до певних варіантів здійснення, цей виду та iv) ефекторних клітин другого виду, і b) винахід пропонує способи ідентифікації двовидоінкубування згаданої композиції з клітинамивих поліпшених варіантів, які включають: а) намішенями за таких умов, за яких варіантдання: і) композиції, що містить варіант-"кандидат" "кандидат" зв'язує клітини-мішені з одержанням, вихідного поліпептиду, який має Fc-ділянку, де таким чином, клітин-мішеней, зв'язаних варіантомзгаданий варіант-"кандидат" містить щонайменше "кандидатом", с) змішування ефекторних клітин одну амінокислотну модифікацію на Fc-ділянці, і першого виду з клітинами-мішенями, зв'язаними де згаданий варіант-"кандидат" опосередковує варіантом-"кандидатом", d) визначення цитотоксиCDC із більшою ефективністю, аніж вихідний полічності клітин-мішеней (наприклад, опосередковапептид, та іі) джерела комплементу другого виду, і ної згаданим варіантом-"кандидатом"), є) визнаb) інкубування згаданої композиції з комплементом чення того, чи опосередковує варіант-"кандидат" другого виду, та с) визначення того, чи опосередцитотоксичність клітин-мішеней у присутності ефековує варіант-"кандидат" CDC із більшою ефектикторних клітин першого виду з більшою ефективнівністю, аніж вихідний поліпептид. Відповідно до стю, аніж вихідний поліпептид, конкретних варіантів здійснення, згаданий спосіб f) змішування ефекторних клітин другого виду додатково включає стадію d) ідентифікації варіанз клітинами-мішенями, зв'язаними варіантомта-"кандидата", як двовидового поліпшеного варі"кандидатом" (одержаними, наприклад, на стадії анта. b)), Відповідно до певних варіантів здійснення, кліg) визначення цитотоксичності клітин-мішеней тинами-мішенями є людські клітини (наприклад, (наприклад, опосередкованої згаданим варіантомклітини, що надекспресують один або декілька з "кандидатом"), h) визначення того, чи опосередконаведених нижче пухлиноспецифічних антигенів: вує варіант-"кандидат" цитотоксичність клітинCD20, CD22, CD33, CD40, CD63, рецептор EGF мішеней у присутності ефекторних клітин другого (епідермальний фактор росту), рецептор her-2, виду з більшою ефективністю, аніж вихідний поліпростатаспецифічний мембранний антиген, вуглепептид. вод Υ Льюїса, гангліозиди GD2 і GD3, lamp-1, CO029, L6 і ephA2). Відповідно до певних варіантів 25 86605 26 здійснення, згаданий варіант містить антитіло (або рандомізовану послідовність CDR (гіперваріабейого фрагмент), специфічне відносно клітинльна ділянка) і іі) варіант Fc-ділянки. Відповідно до мішеней. Відповідно до інших варіантів здійснення, додаткових варіантів здійснення, цей винахід проваріант-"кандидат" опосередковує цитотоксичність понує композиції, що містять поліпептид, де згадаклітин-мішеней у присутності ефекторних клітин ний поліпептид містить: і) немодифікований людпершого виду приблизно у 1,2 рази ефективніше, ський каркас (наприклад, каркас людської аніж вихідний поліпептид. Відповідно до певних зародкової лінії), іі) щонайменше одну рандомізоваріантів здійснення, стадія є) включає здійснення вану послідовність CDR і іїі) варіант Fc-ділянки. контрольної реакції з вихідним поліпептидом. ВідОпис фігур повідно до додаткових варіантів здійснення, виміНа Фіг. 1 схематично зображено молекулу IgG рювання являє собою кількісне визначення загиз різними поміченими ділянками і сегментами. белі клітин-мішеней або лізису клітин-мішеней. На Фіг. 2 зображено впорядковане розміщення Відповідно до інших варіантів здійснення, клітиниамінокислотних послідовностей різних вихідних мішені інфікуються вірусами (наприклад, вірусом Fc-ділянок, у тому числі людського IgG1 (без алоВІЛ, цитомегаловірусом, вірусом гепатиту В або типів (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1) і з показаними аловірусом саркоми Рауса) або мікроорганізмами (натипами), людського IgG2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2), приклад, стафілококами, стрептококами, псевдолюдського IgG3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3), людськомонами тощо). Відповідно до певних варіантів го IgG4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4), мишачого IgG1 здійснення, клітини-мішені являють собою мікро(ПОСЛІДОВНІСТЬ №5), мишачого IgG2A (ПОСЛІорганізми (наприклад, стафілококи, стрептококи, ДОВНІСТЬ №6), мишачого IgG2B (ПОСЛІДОВпсевдомони тощо). Відповідно до певних варіантів НІСТЬ № 7) і мишачого IgG3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № здійснення, клітини-мішені замінюють на віруси 8). (наприклад, вірус ВІЛ, цитомегаловірус, вірус геНа Фіг. 3 показані різні амінокислотні послідопатиту В або вірус саркоми Рауса). вності, що включають ділянку СН2 (ПОСЛІДОВВідповідно до певних варіантів здійснення, цей НІСТЬ № 9) і ділянку СН3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10) винахід пропонує композиції, що містять CD20людського IgG1, а також послідовності f алотипу зв'язувальну молекулу або нуклеїновокислотну (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 11) і a, z алотипу (ПОСЛІпослідовність, яка кодує CD20-зв'язувальну молеДОВНІСТЬ № 12) людського IgG1, що включають кулу, де згадана СD20-зв'язувальна молекула місділянку СН1, шарнірну ділянку, ділянки СН2 і СН3. тить варіабельну ділянку легкого ланцюга і де згаНа Фіг. 4 показані змінені амінокислотні послідана варіабельна ділянка легкого ланцюга містить довності варіантів у контексті місцевих оточуючих амінокислотну послідовність, представлену ПОпослідовностей. СЛІДОВНІСТЮ № 57. Відповідно до інших варіанНа Фіг. 5 показані нуклеотидні послідовності, тів здійснення, цей винахід пропонує композиції, що кодують вихідні поліпептиди. що містять СБ20-зв'язувальну молекулу або нукНа Фіг. 6 показані змінені нуклеїновокислотні леїновокислотну послідовність, яка кодує СD20послідовності варіантів у контексті місцевих отозв'язувальну молекулу, де згадана CD20чуючих нуклеїновокислотних послідовностей. зв'язувальна молекула містить варіабельну ділянНа Фіг. 7А показані результати аналізу ADCC з ку важкого ланцюга і де згадана варіабельна діляпорівнянням Fc-ділянки дикого типу з А330К, нка важкого ланцюга містить амінокислотну посліA330R, І332Е і комбінацією мутацій як у положенні довність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 58. 330, так і у положенні 332. Відповідно до певних варіантів здійснення, цей На Фіг. 7В показані результати аналізу ADCC винахід пропонує композиції, що містять CD20із порівнянням амінокислотних варіантів Fcзв'язувальну молекулу або нуклеїновокислотну ділянки I332D і І332Е з глікан-модифікованим варіпослідовність, яка кодує CD20-зв'язувальну молеантом 33 (GnTIII) Fc-ділянки і вплив амінокислоткулу (дивись, наприклад, Фіг. 16), де згадана ної плюс гліканової модифікації 33 (I332E+GnTIII) CD20-зв'язувальна молекула містить варіабельну на активність ADCC. ділянку легкого ланцюга і варіабельну ділянку На. Фіг. 8 показані репрезентативні дані ADCC, важкого ланцюга, де згадана варіабельна ділянка одержані із застосуванням очищеного варіанта легкого ланцюга містить амінокислотну послідовIgG. ність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 57 (диНа Фіг. 9 показана активність ADCC варіантів вись Фіг. 15), і де згадана варіабельна ділянка варіабельної ділянки з низькою спорідненістю важкого ланцюга містить амінокислотну послідов(6F1) і відносно високою спорідненістю (33 і 5) до ність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 58 (диантигену CD20 проти ліній клітин-мішеней Wil-2 (А) вись Фіг. 15). або SKW6.4 (В). Відповідно до певних варіантів здійснення, цей На Фіг. 10 показані титраційні криві зв'язування винахід пропонує композиції, що містять поліпепFcgRI з варіантом Fc-ділянки IgG. тид, де згаданий поліпептид містить: і) немодифіНа Фіг. 11А, Фіг. 11В і Фіг. 11С показані репрекований людський каркас (наприклад, природний зентативні дані CDC, одержані при титруванні валюдський, який не піддавали жодним змінам) і іі) ріантів Fc-ділянки із застосуванням людського варіант Fc-ділянки. Відповідно до певних варіантів комплементу і клітин-мішеней Ramos. здійснення, згаданим немодифікованим людським Фіг. 12 показує репрезентативне вичерпання каркасом є каркас людської зародкової лінії. ВідВ-клітин ΑΜΕ-133 (варіабельна ділянка 33 з варіаповідно до інших варіантів здійснення, цей винахід нтом І332Е послідовності Fc), Rituxan і неспецифіпропонує композиції, що містять поліпептид, де чним IgG із застосуванням проби цільної крові, що згаданий поліпептид містить: і) щонайменше одну 27 86605 28 містить W (висока спорідненість) генотип рецепторозташування у 3' або прямому напрямку відносно промоторного елемента і кодувальної ділянки. ра FcgRIIIa. Сигнали термінації транскрипції і поліаденілування Фіг. 13 показує репрезентативне вичерпання знаходяться у З' або зворотному напрямку відносВ-клітин ΑΜΕ-133 (варіабельна ділянка 33 з варіано кодувальної ділянки. нтом І332Е послідовності Fc), Rituxan і неспецифіТермін "кодон" або "триплет", який застосовучним IgG із застосуванням проби цільної крові, що ється у цьому описі, означає набір із трьох прилегмістить FF (низька спорідненість) генотип рецеплих нуклеотидних мономерів, які визначають одну тора FcgRIIIa. з двадцяти природних амінокислот, які приймають Фіг. 14 показує репрезентативне вичерпання участь у біосинтезі поліпептидів. Згаданий термін В-клітин Rituxan, неспецифічним IgG і варіантами означає також нонсенс-кодони, які не визначають A378D і Т256Р, І332Е із застосуванням проби цільжодної амінокислоти. ної крові. Терміни "олігонуклеотид, який має нуклеотидФіг. 15 показує амінокислотну послідовність ну послідовність, що кодує поліпептид", "полінуклегкого (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 57) і важкого (ПОлеотид, який має нуклеотидну послідовність, що СЛІДОВНІСТЬ № 58) ланцюгів ΑΜΕ-133 (варіабекодує поліпептид" і "нуклеїновокислотна послідовльна ділянка 33 з варіантом І332Е послідовності ність, що кодує поліпептид", які застосовуються у Fc). цьому описі, означають нуклеїновокислотну посліФіг. 16 показує нуклеотидну послідовність легдовність, що містить кодувальну ділянку конкреткого (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 59) і важкого (ПОСЛІного поліпептиду. Згадана кодувальна ділянка ДОВНІСТЬ № 60) ланцюгів ΑΜΕ-133 (варіабельна може бути присутньою у формі кДНК, геномної ділянка 33 з варіантом І332Е послідовності Fc). ДНК або РНК. У разі присутності у формі ДНК, оліВизначення гонуклеотид або полінуклеотид може бути одноДля полегшення розуміння цього винаходу, ланцюговим (тобто смисловий ланцюг) або дволанижче наводиться визначення ряду термінів. нцюговим. Відповідні контрольні елементи, Терміни "суб'єкт" і "пацієнт", які застосовуютьнаприклад, енхансери/промотори, точки сплайсинся у цьому описі, означають будь-яку тварину, нагу, сигнали поліаденілування тощо можуть розміприклад, ссавця, наприклад, собаку, кішку, птаха, щуватись у безпосередній близькості до кодувавелику рогату худобу, і, відповідно до варіанта, льної ділянки гена у разі їх необхідності для якому віддається перевага, людину (наприклад, забезпечення відповідної ініціації транскрипції людину із захворюванням). та/або правильного процесингу первинного трансТерміни "молекула нуклеїнової кислоти, що крипту РНК. За альтернативним варіантом, кодукодує", "послідовність ДНК, що кодує" і "ДНК, що вальна ділянка, яку застосовують у експресійних кодує", які застосовуються у цьому описі, означавекторах за цим винаходом, може містити ендоють порядок або послідовність дезоксирибонуклегенні енхансери/промотори, точки сплайсингу, інтотидів у ланцюгу дезоксирибонуклеїнової кислоти. рони, сигнали поліаденілування тощо або комбіПорядок цих дезоксирибонуклеотидів визначає націю як ендогенних, так і екзогенних контрольних порядок амінокислот у ланцюгу поліпептиду (білелементів. ка). Послідовність ДНК таким чином кодує посліТерміни "комплементарний" або "комплемендовність амінокислот. тарність" застосовуються у цьому описі для визнаКажуть, що молекули ДНК мають "5' кінці" і "3' чення полінуклеотидів (тобто послідовності нуклекінці", оскільки під час реакції з утворення олігонуотидів), які об'єднуються за правилами клеотидів або полінуклеотидів мононуклеотиди комплементарного парування гетероциклічних реагують таким чином, що 5' фосфат одного пеноснов нуклеїнових кислот. Послідовність "A-G-T", тозного циклу мононуклеотиду приєднується до 3' наприклад, є комплементарною до послідовності кисню свого сусіда у одному напрямку через фос"Т-С-А". Комплементарність може бути "часткофодіефірний зв'язок. Таким чином, кінець олігонувою", у разі якої лише деякі основи нуклеїнових клеотиду або полінуклеотиду називають "5' кінкислот паруються за правилами комплементарноцем", якщо його 5' фосфат не є зв'язаним із 3' го парування гетероциклічних основ нуклеїнових киснем пентозного циклу мононуклеотиду і "3' кінкислот. Або ж, між нуклеїновими кислотами може цем", якщо його 3' кисень не є зв'язаним із 5' фосбути "повна" або "абсолютна" комплементарність. фатом пентозного циклу наступного мононуклеоСтупінь комплементарності між ланцюгами нуклеїтиду. Про нуклеїновокислотну послідовність нової кислоти виявляє значний вплив на ефектив(термін, який використовується у цьому описі), ність та інтенсивність гібридизації згаданих ланцюнавіть якщо вона є внутрішньою відносно більшого гів. Це набуває особливого значення у реакціях олігонуклеотиду або полінуклеотиду, також можна ампліфікації, а також у способах виявлення, які сказати, що вона має 5' і 3' кінці. Окремі елементи залежать від зв'язування між нуклеїновими кислоу лінійній або кільцевій молекулі ДНК також визнатами. чають як елементи, спрямовані у 5' або зворотноТермін "комплемент" даної послідовності, який му напрямку, чи у 3' або прямому напрямку. Ця застосовується у цьому описі, означає послідовтермінологія відображає той факт, що транскрипність, що є повністю комплементарною до даної ція вздовж ланцюга ДНК відбувається у напрямку послідовності вздовж усієї довжини останньої. На5'→3'. Промоторні і енхансерні елементи, які приклад, послідовність A-G-T-A є "комплементом" спрямовують транскрипцію зчепленого гена, знапослідовності Т-С-А-Т. ходяться, як правило, у 5' або зворотному напрямТермін "гомологія" (у разі застосування відноку відносно кодувальної ділянки. Однак енхансерні сно нуклеїновокислотних послідовностей) означає елементи можуть виявляти свій вплив навіть у разі 29 86605 30 ступінь комплементарності. Гомологія може бути містять ділянки ідентичної послідовності, вони бучастковою або повною (тобто ідентичність). Частдуть гібридизуватись із зондом, одержаним із цілоково комплементарною послідовністю є послідовго гена або частин гена, що містять послідовності, ність, яка щонайменше частково перешкоджає знайдеш у обох кДНК; два варіанти сплайсингу, гібридизації повністю комплементарної послідовзавдяки цьому, є значною мірою гомологічними з ності з цільовою нуклеїновою кислотою (нуклеїнотаким зондом і між собою. вою кислотою-мішенню), і така послідовність поТермін "по суті гомологічний", у разі застосузначається за допомогою функціонального терміну вання відносно одноланцюгової нуклеїновокислот"значною мірою гомологічна". Термін "інгібування ної послідовності, означає будь-який зонд, який зв'язування", у разі застосування відносно зв'язуможе гібридизуватись (тобто є комплементом) з вання нуклеїнових кислот, означає інгібування одноланцюговою нуклеїновокислотною послідовзв'язування, спричинене конкуренцією гомологічністю за умов зниженої жорсткості. них послідовностей за зв'язування з цільовою поТермін "гібридизація", який вживають у цьому слідовністю (послідовністю-мішенню). Інгібування описі, означає парування комплементарних нуклегібридизації повністю комплементарної послідовїнових кислот. На гібридизацію і інтенсивність гібності з послідовністю-мішенню може перевірятись ридизації (тобто інтенсивність зв'язку між нуклеїза допомогою аналізу гібридизації (саузерн- або новими кислотами) впливають такі фактори, як назерн-блотинг, гібридизація у розчині тощо) за ступінь комплементарності між нуклеїновими кисумов зниженої жорсткості. Значною мірою гомололотами, жорсткість застосованих умов, Тm одергічна послідовність або зонд буде конкурувати за і жаного гібриду і відношення G:C у межах нуклеїпригнічувати зв'язування (тобто гібридизацію) понових кислот. вністю гомологічної послідовності з мішенню за Термін "Тm ", який вживають у цьому описі, умов зниженої жорсткості. Це не означає, що умоозначає "температуру плавлення". Згаданою темви зниженої жорсткості є такими, що забезпечують пературою плавлення є температура, при якій поможливість неспецифічного зв'язування; умови пуляція дволанцюгових нуклеїновокислотних мозниженої жорсткості потребують того, щоб взаємлекул стає наполовину дисоційованою на не зв'язування двох послідовностей являло собою поодинокі ланцюги. Рівняння для обчислення Тm нуклеїнової кислоти є добре відомим у цій галузі. специфічну (тобто селективну) взаємодію. ВідсутЯк зазначено у стандартних довідниках, просте ність неспецифічного зв'язування може перевірявизначення значення Tm можна здійснити за допотись шляхом застосування другої мішені, якій брамогою рівняння: Tm=81,5+0,41(%G+C), коли нуклекує навіть часткового ступеню комплементарності їнова кислота знаходиться у 1 Μ водному розчині (наприклад, ідентичність менша приблизно за NaCl (дивись, наприклад, Андерсон (Anderson) і 30%); у разі відсутності неспецифічного зв'язуванЯнг (Young), Quantitative Filter Hybridization, Nucleic ня зонд не буде гібридизуватись з другою некомпAcid Hybridization [1985]). Інші довідники містять лементарною мішенню. більш складні обчислення, які при визначенні Тm У цій галузі добре відомо, що для одержання враховують як структурні характеристики, так і умов зниженої жорсткості можуть застосовуватись характеристики послідовності. У деяких випадках численні еквівалентні умови: розглядаються такі Тm можна визначити емпіричним шляхом, розпофактори, як довжина і природа (ДНК, РНК, склад чинаючи з обрахованої Тm з подальшими незначгетероциклічних основ) зонда і природа мішені ними підвищеннями або зниженнями температури (ДНК, РНК, склад гетероциклічних основ, присутніх і з перевіркою впливу на популяцію нуклеїновокиу розчині або іммобілізованих тощо), концентрація слотних молекул. солей та інших компонентів (наприклад, присутТермін "жорсткість", який вживають у цьому ність або відсутність формаміду, сульфату декописі, означає умови (температура, іонна сила і страну, поліетиленгліколю) і гібридизаційний розприсутність інших сполук, наприклад, органічних чин може змінюватись для одержання умов розчинників), за яких здійснюють гібридизацію нугібридизації зниженої жорсткості, які різняться, клеїнових кислот. Фахівцям у цій галузі буде зрооднак є еквівалентними до вищенаведених умов. зуміло, що умови "жорсткості" можуть бути змінені На додаток до цього, у цій галузі відомі умови, які шляхом зміни щойно описаних параметрів у індистимулюють гібридизацію за жорстких умов (навідуальному порядку або спільно. Парування гетеприклад, підвищення температури гібридизації роциклічних основ нуклеїнових кислот за "жорстта/або стадій промивання, застосування формаміких" умов буде відбуватись лише між ду у гібридизаційному розчині тощо). фрагментами нуклеїнових кислот, які мають висоНуклеїновокислотна послідовність (наприклад, ку частоту комплементарних послідовностей гетеяка кодує варіант Fc-ділянки або її частину) може роциклічних основ (наприклад, гібридизація за продукувати численні різновиди РНК, які одержу"жорстких" умов може відбуватись між гомологами ють шляхом диференційного сплайсингу первинз приблизно 85-100% ідентичністю, відповідно до ного транскрипту РНК. кДНК, які являють собою варіанта, якому віддається перевага, з приблизно варіанти сплайсингу одного й того самого гена, 70-100% ідентичністю). За умов жорсткості середбудуть містити ділянки ідентичної послідовності нього рівня, парування гетероциклічних основ нукабо повної гомології (які представляють присутлеїнових кислот буде відбуватись між нуклеїновиність того самого екзону або частини того самого ми кислотами з проміжною частотою екзону у обох кДНК) і абсолютно неідентичні ділякомплементарних послідовностей гетероциклічних нки (які представляють, наприклад, присутність основ (наприклад, гібридизація за умов "жорсткосекзону "А" на кДНК 1, у той час як кДНК 2 містить ті середнього рівня" може відбуватись між гомолозамість цього екзон "В"). Оскільки обидві кДНК 31 86605 32 гами з приблизно 50-70% ідентичністю). Таким нуклеотидів може (1) містити послідовність (тобто чином, у разі нуклеїнових кислот, одержаних із частину повної послідовності полінуклеотиду), яка генетично різних організмів, часто необхідними є є подібною між двома полінуклеотидами і (2) може умови "слабкої" або "зниженої" жорсткості, оскільдодатково містити послідовність, яка відрізняється ки частота комплементарних послідовностей за між двома полінуклеотидами, порівняння послідотаких обставин є, як правило, меншою. вностей між двома (або декількома) полінуклеотиТермін "жорсткі умови", у разі застосування дами здійснюють, як правило, шляхом порівняння його для визначення умов гібридизації нуклеїнових послідовностей двох полінуклеотидів у "вікні порікислот, означає умови, еквівалентні для зв'язуванвняння" для ідентифікації і порівняння локальних ня або гібридизації при температурі 42°С у розчиділянок подібності послідовностей. Словосполуні, до складу якого входить 5х SSPE (43,8 г/л NaCl, чення "вікно порівняння", яке вживають у цьому 6,9 г/л NaH2PO4 H2O і 1,85 г/л EDTA (етилендіамінописі, означає абстрактний сегмент щонайменше з тетраоцтова кислота), з рН доведеним до рівня 7,4 20 суміжних положень нуклеотидів, де послідовза допомогою NaOH), 0,5% SDS (додецилсульфат ність полінуклеотидів може порівнюватись з етанатрію), 5х розчину Денхардта і 100 мкг/мл деналонною послідовністю щонайменше з 20 суміжних турованої ДНК з молочка лососевих, із подальшим нуклеотидів і де частина послідовності полінуклеопромиванням у розчині, до складу якого входить тиду у вікні порівняння може містити 20% або ме0,1x SSPE, 1,0% SDS при температурі 42°С, у разі нше додаткових сегментів або делецій (тобто застосування зонда довжиною приблизно у 500 "проривів"), порівняно з еталонною послідовністю нуклеотидів. (яка не містить додаткових сегментів або делецій) Термін "умови жорсткості середнього рівня", у для оптимального впорядкованого розміщення разі застосування його для визначення умов гібдвох послідовностей для порівняльного аналізу. ридизації нуклеїнових кислот, означає умови, еквіОптимальне впорядковане розміщення послідоввалентні для зв'язування або гібридизації при темностей для вирівнювання вікна порівняння може пературі 42°С у розчині, до складу якого входить здійснюватись за допомогою алгоритму локальної 5х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4H2O і 1,85 гомології Сміта і Уотермена [Сміт (Smith) і Уотерг/л EDTA, з рН доведеним до рівня 7,4 за допомомен (Waterman), Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)], гою NaOH), 0,5% SDS, 5x розчину Денхардта і 100 алгоритму впорядкованого розміщення гомологій мкг/мл денатурованої ДНК з молочка лососевих, із Нідлмена і Вунша [Нідлмен (Needleman) і Вунш подальшим промиванням у розчині, до складу яко(Wunsch), /. Моl. Віоl. 48:443 (1970)], за методом го входить 0,1х SSPE, 1,0% SDS при температурі пошуку подібності Пірсона і Ліпмана [Пірсон 42°С, у разі застосування зонда довжиною при(Pearson) і Лілман (Lipman), Proc. Natl. Acad. Set близно у 500 нуклеотидів. (U.S.A.) 85:2444 (1988)], за допомогою комп'ютериТермін "умови зниженої жорсткості" означає зованого застосування цих алгоритмів (GAP, умови, еквівалентні для зв'язування або гібридиBESTFIT, FASTA і TFASTA у пакеті програм зації при температурі 42°С у розчині, до складу Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, якого входить 5х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л Genetics Computer Group, 575 Science Dr., NaH2PO4 H2O і 1,85 г/л EDTA, з рН доведеним до Madison, Wis.) або шляхом перевірки і вибору найрівня 7,4 за допомогою NaOH), 0,1% SDS, 5x розкращого впорядкованого розміщення (тобто яке чину Денхардта [50x розчину Денхардта містить на забезпечує найвищий відсоток гомології у вікні 500 мл: 5 г фіколу (тип 400, фірма Pharmacia), 5 г порівняння), одержаного за допомогою різних меBSA (альбумін сироватки великої рогатої худоби тодів. Термін "ідентичність послідовностей" озна(фракція V; фірма Sigma)] і 100 мкг/мл денатурочає, що дві полінуклеотидні послідовності у вікні ваної ДНК з молочка лососевих, із подальшим порівняння є ідентичними (тобто на основі почерпромиванням у розчині, до складу якого входить гового порівняння нуклеотидів). "Відсоток ідентич5х SSPE, 0,1% SDS при температурі 42°С, у разі ності послідовностей" обчислюють шляхом порівзастосування зонда довжиною приблизно у 500 няння двох оптимально впорядковано розміщених нуклеотидів. послідовностей у вікні порівняння, з визначенням Наведені нижче терміни застосовують для кількості положень, у яких, у обох послідовностях, опису взаємозв'язку послідовностей між двома або знаходиться ідентична основа нуклеїнової кислоти декількома полінуклеотидами: "еталонна послідо(наприклад, А, Т, С, G, U або І), з одержанням ківність", "ідентичність послідовностей" і "відсоток лькості спарованих положень, із подальшим діідентичності послідовностей". "Еталонною посліленням кількості спарованих положень на загальдовністю" є визначена послідовність, яка застосону кількість положень у вікні порівняння (тобто вується як основа для порівняння послідовностей; розмір вікна) і множенням результату на 100 для еталонна послідовність може бути піднабором одержання відсотка ідентичності послідовностей. більшої послідовності, наприклад, сегментом неТермін "вікно порівняння", який вживають у цьому процесованої послідовності кДНК, наведеної у описі, означає повну довжину згаданої еталонної лістингу послідовності, або може містити повну послідовності (тобто у разі, якщо еталонною попослідовність гена. Взагалі, довжина еталонної слідовністю запропоновано ПОСЛІДОВНІСТЬ № послідовності становить щонайменше 20 нуклео33, відсоток ідентичності послідовностей порівнютидів, часто вона дорівнює щонайменше 25 нуклеють по всій довжині ПОСЛІДОВНОСТІ № 33). отидам і часто її довжина становить щонайменше Термін "зонд", який вживають у цьому описі, 50 нуклеотидів (наприклад, будь-яка з ПОСЛІДОозначає олігонуклеотид (тобто послідовність нукВНОСТЕЙ № 32-37 може застосовуватись як еталеотидів) (чи то природний, наприклад, у очищелонна послідовність). Оскільки кожен із двох поліному рестрикційному гідролізаті, чи то одержаний 33 86605 34 синтетичним шляхом, рекомбінантними методами геномної ДНК, будь-яка олігонуклеотидна або поабо ПЛР-ампліфікацією), що є здатним гібридизулінуклеотидна послідовність може бути ампліфіковатись з іншим олігонуклеотидом, який становить вана з відповідним набором праймерних молекул. інтерес. Зонд може бути одноланцюговим або Зокрема, ампліфіковані сегменти, одержані за додволанцюговим. Зонди застосовують для виявпомогою самого процесу ПЛР, є, самі по собі, ефелення, ідентифікації і виділення послідовностей ктивними матрицями для подальшого ПЛРконкретного гена. Передбачається, що будь-який ампліфікування. зонд, який застосовується у цьому винаході, може Термін "виділена", у разі застосування відносбути міченим за допомогою будь-якої "репортерної но нуклеїнової кислоти, як, наприклад, у словомолекули" для забезпечення його віднаходження у сполученні "виділений олігонуклеотид" або "видібудь-який системі виявлення, у тому числі (але лений полінуклеотид", означає нуклеїновокислотну без обмеження) ферментній (наприклад, ELISA послідовність, яка є ідентифікованою і відокрем(твердофазний імуноферментний аналіз), а також леною від щонайменше однієї забруднювальної аналітичні гістохімічні системи на основі ферменнуклеїнової кислоти, з якою вона, як правило, є тів), флуоресцентній, радіоактивній і люмінесцентпов'язаною у своєму природному джерелі. Виділеній системах. Не передбачається обмеження цьона нуклеїнова кислота представлена у формі або у го винаходу будь-якою конкретною системою оточенні, яке відрізняється від того, у якому вона виявлення або міткою. знаходиться за природних умов. Виділені нуклеїТермін "полімеразна ланцюгова реакція" новокислотні молекули, таким чином, відрізняють("ПЛР"), який вживають у цьому описі, означає ся від нуклеїновокислотної молекули, яка існує у метод, описаний у патентах США № 4,683,195, № природних клітинах. Однак виділена нуклеїновоки4,683,202 і № 4,965,188, які включено до цього слотна молекула включає нуклеїновокислотну моопису шляхом посилання, які описують спосіб підлекулу, яка міститься у клітинах, що, за звичайних вищення концентрації сегмента цільової послідовумов, експресують поліпептид, де, наприклад, місності у суміші геномної ДНК без клонування або цезнаходження нуклеїновокислотної молекули у очищення. Цей процес ампліфікації цільової похромосомі відрізняється від місцезнаходження у слідовності полягає у введенні великого надлишку природних клітинах. Виділена нуклеїнова кислота, двох олігонуклеотидних праймерів до суміші ДНК, олігонуклеотид або полінуклеотид можуть бути що містить бажану цільову послідовність, з подапредставлені у одноланцюговій або дволанцюговій льшою точною послідовністю термоциклічної обформі. Коли виділена нуклеїнова кислота, олігонуробки у присутності ДНК-полімерази. Два праймеклеотид або полінуклеотид призначені для застори є комплементарними до своїх відповідних сування для експресії білка, олігонуклеотид або ланцюгів дволанцюгової цільової послідовності. полінуклеотид будуть мати мінімальний вміст смиДля здійснення ампліфікації, суміш денатурують і слового або кодувального ланцюга (тобто олігонупраймери об'єднують з їхніми комплементарними клеотид або полінуклеотид може бути одноланцюпослідовностями у межах цільової молекули. Після говим), однак можуть містити як смислові, так і об'єднання праймери подовжують полімеразою антисмислові ланцюги (тобто олігонуклеотид або таким чином, щоб одержати нову пару комплеменполінуклеотид може бути дволанцюговим). тарних ланцюгів. Стадії денатурації, праймерного Термін "частина", який вживають у цьому описі об'єднання і полімеразного подовження можуть у зв'язку з нуклеотидною послідовністю (як, наприповторюватись багаторазово (тобто денатурація, клад, у словосполученні "частина даної нуклеотиоб'єднання і подовження становлять один "цикл"; дної послідовності") означає фрагменти цієї посліможуть здійснюватись численні "цикли") для одедовності. Розмір фрагментів може коливатись у ржання високої концентрації ампліфікованого сегмежах від десяти нуклеотидів до повної нуклеотимента бажаної цільової послідовності. Довжина дної послідовності мінус один нуклеотид (наприампліфікованого сегмента бажаної цільової посліклад, 10 нуклеотидів, 20 нуклеотидів, 30 нуклеотидовності визначається взаємними відносними подів, 40 нуклеотидів, 50 нуклеотидів, 100 ложеннями праймерів і, таким чином, ця довжина нуклеотидів, 200 нуклеотидів тощо). є контрольованим параметром. Завдяки аспекту Термін "частина", який вживають у цьому описі цього процесу, який полягає у повторенні, згадау зв'язку з амінокислотною послідовністю (як, наний метод називають "полімеразною ланцюговою приклад, у словосполученні "частина даної амінореакцією" (у подальшому "ПЛР"). Оскільки бажані кислотної послідовності") означає фрагменти цієї ампліфіковані сегменти цільової послідовності послідовності. Розмір фрагментів може коливастають переважними послідовностями (з точки тись у межах від шести амінокислот до повної амізору концентрації) у суміші, про них кажуть, що нокислотної послідовності мінус одна амінокисловони є "ПЛР-ампліфікованими". та (наприклад, 6 амінокислот, 10 амінокислот, 20 ПЛР надає можливість ампліфікації однієї копії амінокислот, 30 амінокислот, 40 амінокислот, 75 специфічної цільової послідовності у геномній ДНК амінокислот, 200 амінокислот тощо). до рівня, який може виявлятись декількома різниТермін "очищений" або "очищати", який вжими методами (наприклад, гібридизація з міченим вають у цьому описі, означає видалення забрудзондом; включення біотинілованих праймерів із нювачів із проби. Наприклад, антиген-специфічні подальшим виявленням авідин-ферментним кон'антитіла можуть бути очищені шляхом видалення югатом; включення 32Р-мічених дезоксинуклеотидзабруднювальних неімуноглобулінових білків; вони трифосфатів, наприклад, dCTP (дезоксицитидинтакож очищаються шляхом видалення імуногло5'-трифосфат) або dATP (дезоксіаденозин-5'буліну, який не зв'язується з тим самим антигеном. трифосфат) до ампліфікованого сегмента). Окрім Результатом видалення неімуноглобулінових біл 35 86605 36 ків та/або видалення імуноглобулінів, які не зв'яТермін "антигенна детермінанта", який вживазуються з конкретним антигеном, є підвищення ють у цьому описі, означає ту частину антигену, відсотка антиген-специфічних імуноглобулінів у яка контактує з конкретним антитілом (тобто епіпробі. У іншому прикладі, рекомбінантні антигентоп). Коли білок або фрагмент білка застосовують специфічні поліпептиди експресують у бактеріальдля імунізації тварини-хазяїна, численні ділянки них клітинах-хазяях і поліпептиди очищають шлязгаданого білка можуть індукувати продукування хом видалення білків клітини-хазяїна; завдяки антитіл, які специфічно зв'язуються з даною ділянцьому відсоток рекомбінантних антигенкою або тривимірною структурою на згаданому специфічних поліпептидів у пробі збільшується. білку; ці ділянки або структури називають антигенТермін "молекула рекомбінантної ДНК", який ними детермінантами. Антигенна детермінанта вживають у цьому описі, означає молекулу ДНК, може конкурувати з інтактним антигеном (тобто яка складається із сегментів ДНК, об'єднаних за "імуногеном", застосованим для викликання імундопомогою методів молекулярної біології. ної реакції) за зв'язування з антитілом. Термін "рекомбінантяий білок" або "рекомбінаТермін "трансген", який вживають у цьому нтний поліпептид", який вживають у цьому описі, описі, означає чужорідний, гетерологічний або означає молекулу білка, експресовану молекулою автологічний ген, який потрапляє до організму рекомбінантної ДНК. шляхом введення гена до свіжозапліднених яйцеТермін "нативний білок", який вживають у клітин або зародків на початкових стадіях розвитцьому описі, вказує на те, що білок не містить аміку. Термін "чужорідний ген" означає будь-яку нукнокислотних залишків, які кодуються векторними леїнову кислоту (наприклад, послідовність гена), послідовностями; тобто нативний білок містить яка вводиться до геному тварини експерименталише ті амінокислоти, які знаходяться у білку, які є льними маніпуляціями і може включати послідовпоширені у природі. Нативний білок може продукуності генів, які знаходяться у організмі цієї тварини ватись рекомбінантними методами або може видідоти, доки введений ген не займає того ж самого лятись із природного джерела. місця, на якому знаходиться природний ген. ТерТермін "саузерн-блотинг" означає аналіз ДНК мін "автологічний ген" означає варіанти (наприна агарозному або акриламідному гелях для фраклад, поліморфи або мутанти) природного гена. кціонування ДНК за розміром, із подальшим переТермін "трансген", таким чином, охоплює значення несенням ДНК з гелю на твердофазну основу, назаміни природного гена варіантною формою гена. приклад, нітроцелюлозу або нейлонову мембрану. Термін "вектор", який вживають у цьому описі, Після цього іммобілізовану ДНК зондують міченим означає нуклеїновокислотні молекули, які перенозондом для виявлення різновидів ДНК, комплемесять сегмент(-и) ДНК з однієї клітини до іншої. Тентарних до застосованого зонда. ДНК може розрмін "носій" подеколи вживається взаємозамінно з щеплюватись рестриктазами перед електрофоретерміном "вектор". зом. Після електрофорезу ДНК може частково Термін "експресійний вектор", який вживають у депуринізуватись і денатуроватись перед або під цьому описі, означає молекулу рекомбінантної час перенесення на твердофазну основу. СауДНК, що містить необхідну кодувальну послідовзерн-блотинг є стандартним методом молекулярність і відповідні нуклеїновокислотні послідовності, ної біолога (Дж. Сембрук (J. Sambrook) та інші, необхідні для експресії функціонально зв'язаної Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring кодувальної послідовності у конкретному організHarbor Press, NY, стор. 9.31-9.58 [1989]). мі-хазяїні. Нуклеїновокислотні послідовності, неТермін "назерн-блотинг", який вживають у обхідні для експресії у прокаріотах, включають, як цьому описі, означає електрофоретичний аналіз правило, промотор, оператор (факультативно) і РНК на агарозних гелях для фракціонування РНК сайт зв'язування рибосом, часто разом з іншими за розміром, із подальшим перенесенням ДНК з послідовностями. Відомо, що клітини-еукаріоти гелю на твердофазну основу, наприклад, нітроцевикористовують промотори, енхансери і сигнали люлозу або нейлонову мембрану. Після цього імтермінації і поліаденілування. мобілізовану РНК зондують міченим зондом для Термін "клітина-хазяїн", який вживають у цьовиявлення різновидів РНК, комплементарних до му описі, означає будь-яку еукаріотну або прокарізастосованого зонда. Назерн-блотинг є стандартотну клітину (наприклад, бактеріальні клітини, наним методом молекулярної біології (Дж. Сембрук приклад, Е. соlі, клітини СНО (клітини яєчника (J. Sambrook) та інші, дивись вище, стор. 7.39-7.52 китайського хом'ячка), дріжджові клітини, клітини [1989]). ссавців, клітини птахів, клітини амфібій, клітини Термін "вестерн-блотинг" означає аналіз білрослин, клітини риб і клітини комах), розміщені in ка(-ів) (або поліпептидів), іммобілізованих на осноvitro або in vivo. Клітини-хазяї можуть, наприклад, ві, наприклад, нітроцелюлозі або мембрані. Білки бути розміщені у трансгенній тварині. пропускають через акриламідні гелі для відокремТерміни "трансфекція" і "трансформація", які лення білків, із подальшим перенесенням білка з вживають у цьому описі, означають введення чугелю на твердофазну основу, наприклад, нітроцежорідної ДНК до клітин (наприклад, еукаріотних і люлозу або нейлонову мембрану. Після цього імчи прокаріотних клітин). Трансфекція може мобілізовані білки піддають впливу антитіл із реакздійснюватись різноманітними способами, відомитивністю проти необхідного антигену. Зв'язування ми у цій галузі, у тому числі копреципітацією фосантитіл може виявлятись різними способами, у фату кальцію-ДНК, DEAE (діетиламіноетил)тому числі за допомогою антитіл із радіоізотопною декстран-опосередкованою трансфекцією, поліміткою. брен-опосередкованою трансфекцією, електропорацією, мікроін'єкцією, злиттям ліпосом, ліпофек 37 86605 38 цією, злиттям протопластів, ретровірусною інфекзу, означає утворення сигналу, який піддається цією і генетично модифікованими організмами. виявленню (наприклад, накопичення репортерного Термін "стабільна трансфекція" або "стабільно білка, підвищення концентрації іонів, накопичення трансфікований" означає введення і інтеграцію хімічного продукту, який піддається виявленню). чужорідної ДНК до геному трансфікованої клітини. Термін "репортерний ген", який вживають у Термін "стабільний трансфектант" означає клітину, цьому описі, означає ген, який кодує білок, що мощо має чужорідну ДНК, стабільно інтегровану до же піддаватись аналізу. Прикладами репортерних геномної ДНК. генів є (але без обмеження) люцифераза (дивись, Термін "тимчасова трансфекція" або "тимчанаприклад де Вет (de Wet) та інші, Мої. Cell. Biol. сово трансфікований" означає введення чужорід7:725 [1987] і патент США № 6,074,859, які вклюної ДНК до клітини, де чужорідній ДНК не вдається чено до цього опису за посиланням), зелений інтегруватися до геному трансфікованої клітини. флуоресцентний білок (наприклад, номер депонуЧужорідна ДНК зберігається у ядрі трансфікованої вання у GenBank U43284; ряд варіантів зеленого клітини впродовж декількох днів. Впродовж цього флуоресцентного білка (GFP) є комерційно доступеріоду часу чужорідна ДНК зазнає впливу регуляпним від фірми CLONTECH Laboratories, Palo Alto, торних контрольних механізмів, які управляють штат Каліфорнія), хлорамфеніколацетилтрансфеекспресією ендогенних генів у хромосомах. Термін раза, β-галактозидаза, лужна фосфатаза і перок"тимчасовий трансфектант" означає клітини, які сидаза з хрону. захопили чужорідну ДНК, однак інтегрувати цю Терміни "пам'ять комп'ютера" і "блок пам'яті ДНК не спромоглися. комп'ютера", які вживають у цьому описі, означаТермін "кальційфосфатна копреципітація" ють будь-який носій для зберігання інформації, означає спосіб введення нуклеїнових кислот до який зчитується процесором комп'ютера. Приклаклітини. Поглинання нуклеїнових кислот клітинами дами пам'яті комп'ютера є (але без обмеження) посилюється у тому разі, коли нуклеїнова кислота RAM (оперативний запам'ятовувальний пристрій, представлена у вигляді копреципітату фосфату ОЗП), ROM (постійний запам'ятовувальний прикальцію-нуклеїнової кислоти. Вихідний спосіб Грестрій, ПЗП), комп'ютерні мікросхеми, цифрові відхема і ван дер Еба (Грехем (Graham) і ван дер Еб еодиски (DVD), компакт-диски (CD), накопичувані (van der Eb), Virol., 52:456 [1973]) був модифікована жорстких магнітних дисках (HDD) і магнітна пліний декількома групами для оптимізації умов для вка. клітин конкретних типів. Ці численні модифікації є Термін "носій, зчитуваний комп'ютером", який добре відомими у цій галузі. вживають у цьому описі, означає будь-який приСловосполучення "композиція, що містить дастрій або систему для зберігання і надання інфорну полінуклеотидну послідовність", яке вживають у мації (наприклад, даних і інструкцій) процесору цьому описі, означає, у широкому значенні, будькомп'ютера. Прикладами носіїв, зчитуваних комяку композицію, що містить дану полінуклеотидну п'ютером, є (але без обмеження) цифрові відеодипослідовність. Згадана композиція може являти ски, компакт-диски, накопичувачі на жорстких магсобою водний розчин. Композиції, що містять понітних дисках, магнітна плівка і сервери для лінуклеотидні послідовності, які кодують, наприспрямування носіїв до мереж. клад, варіант Fc-ділянки або її фрагменти, можуть Словосполучення "носій, зчитуваний комп'юзастосовуватись як гібридизаційні зонди. У цьому тером, який кодує копію" нуклеїновокислотної або разі, полінуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотної послідовності, яке вживають у варіант Fc-ділянки, застосовують, як правило, у цьому описі, означає носій, зчитуваний комп'ютеводному розчині, що містить солі (наприклад, ром, який має збережену на ньому інформацію, NaCl), детергенти (наприклад, додецилсульфат яка, у разі надання її процесору, забезпечує можнатрію) та інші компоненти (наприклад, розчин ливість відтворення нуклеїновокислотної або аміДенхардта, сухе молоко, ДНК молочка лососевих нокислотної послідовності для користувача (натощо). приклад, у надрукованому або представленому на Термін "експериментальна сполука" або "споекрані дисплея вигляді). лука-кандидат" означає будь-яку хімічну складову, Терміни "процесор" і "центральний процесор фармацевтичний засіб, лікарський засіб тощо, які (CPU)", які вживають у цьому описі, використовуможуть застосовуватись для лікування або запобіються взаємозамінно і означають пристрій, здатгання хвороби, захворювання, нездужання або ний читати програму з пам'яті комп'ютера (наприрозладу функціонування організму або іншої зміни клад, постійний запам'ятовувальний пристрій або фізіологічного або клітинного статусу проби. Ексінша пам'ять комп'ютера) і здійснювати послідовпериментальні сполуки включають як відомі, так і ність стадій за цією програмою. потенційні терапевтичні сполуки. ЕкспериментальДля нумерації амінокислотних залишків важкона сполука може бути визначена, як терапевтична, го ланцюга імуноглобулінів, яка застосовується у шляхом відбору із застосуванням методик відбору цьому описі, застосовують формат індексації ЄС, за цим винаходом. Словосполучення "відома тенаведений у роботі Кабат (Kabat) та інші, рапевтична сполука" означає терапевтичну сполуSequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ку, яка, як було показано (наприклад, шляхом виEd. Public Health Service, National Institutes of пробувань на тваринах або попереднім досвідом Health, Bethesda, MD (1991), спеціально включеній застосування на людях) є ефективною у разі такодо цього опису шляхом посилання. Словосполуго лікування або запобігання. чення "формат індексації ЄС, наведений у роботі Термін "реакція", який вживають у цьому описі, Кабат" означає нумерацію залишків антитіла у разі застосування його по відношенню до аналі 39 86605 40 (людський IgG1) за системою європейського союдоменом) містить, як правило, фрагмент залишків зу. С-кінця до домену СН2 на Fc-ділянці (наприклад, Словосполучення "вихідний поліпептид", яке на Fc-ділянці людського IgG, від приблизно залишвживають у цьому описі, означає поліпептид, що ку амінокислоти 341 до приблизно залишку аміномістить амінокислотну послідовність, яка може кислоти 447). бути зміненою (наприклад, заміна, додання або За визначенням, яке застосовується у цьому делеція амінокислоти) з одержанням варіанта. описі, Fc-ділянка може мати "ефекторні функції", Відповідно до варіантів здійснення, яким віддаєтьякі відповідають за активацію або зниження біолося перевага, вихідний поліпептид містить принайгічної активності (наприклад, у суб'єкта). Приклади мні частину природної Fc-ділянки або Fc-ділянку з ефекторних функцій включають (але без обмемодифікаціями амінокислотної послідовності (наження): зв'язування Clq; комплементзалежну питоприклад, додання, делеції та/або заміни). Відповітоксичність (CDC); зв'язування Fc-рецептора; андно до певних варіантів здійснення, конкретно титілозалежну клітинноопосередковану передбачаються варіанти, що є коротшими або питотоксичність (ADCC); фагоцитоз; регуляцію довшими за вихідний поліпептид. Відповідно до рецепторів клітинної поверхні за типом зворотного варіантів здійснення, яким віддають особливу пезв'язку (наприклад, В-клітинних рецепторів; BCR) ревагу, вихідний поліпептид, порівняно з варіантощо. Такі ефекторні функції можуть потребувати том, різниться за функціями (наприклад, ефектороб'єднання Fc-ділянки зі зв'язувальним доменом на функція, зв'язування тощо). (наприклад, варіабельним доменом антитіла) і Термін "варіант вихідного поліпептиду", який можуть оцінюватись за допомогою різноманітних вживають у цьому описі, означає пептид, що місаналізів (наприклад, аналіз Fc-зв'язування, аналіз тить амінокислотну послідовність, яка відрізняєтьADCC, аналіз CDC; вичерпання клітин-мішеней з ся від амінокислотної послідовності вихідного попроби цільної або фракціонованої крові тощо). ліпептиду щонайменше однією амінокислотною Термін "Fc-ділянка з нативною послідовністю" модифікацією. Відповідно до певних варіантів або "Fc-ділянка дикого типу", який вживають у здійснення, варіант містить принаймні частину Fcцьому описі, означає амінокислотну послідовність, ділянки (наприклад, щонайменше 40%, 50%, 75% що є ідентичною амінокислотній послідовності Fcабо 90% Fc-ділянки). Відповідно до варіантів здійділянки, розповсюдженої за природних умов. Зразснення, яким віддається перевага, варіант містить кові людські Fc-ділянки з нативною послідовністю Fc-ділянку вихідного поліпептиду з щонайменше зображені на Фіг. 2 і включають Fc-ділянку людсьоднією амінокислотною модифікацією. кого IgG1 з нативною послідовністю (f і a,z алотиТермін "Fc-ділянка", який вживають у цьому пи); Fc-ділянку людського IgG2 з нативною посліописі, означає С-кінцеву ділянку важкого ланцюга довністю; Fc-ділянку людського IgG3 з нативною імуноглобуліну (наприклад, як показано на Фіг. 1). послідовністю; і Fc-ділянку людського IgG4 з нати"Fc-ділянка" може бути Fc-ділянкою з нативною вною послідовністю, а також їхні природні варіанпослідовністю або варіантом Fc-ділянки. Незвати. На Фіг. 2 показані також мишачі Fc-ділянки з жаючи на те, що загальноприйняті межі Fc-ділянки нативною послідовністю. Передбачаються також важкого ланцюга імуноглобуліну можуть змінюваінші послідовності, які легко одержують з різноматись, вважають, як правило, що Fc-ділянка важконітних веб-сайтів (наприклад, веб-сайт NCBI). го ланцюга людського IgG простягається від залиТермін "варіант Fc-ділянки", який вживають у шку амінокислоти у положенні Cys226 або від цьому описі, означає амінокислотну послідовність, Рrо230 до його карбоксильного кінця. Відповідно яка відрізняється від амінокислотної послідовності до певних варіантів здійснення, варіанти містять Fc-ділянки з нативною послідовністю (або її часлише частини Fc-ділянки і можуть включати або не тин) щонайменше однією амінокислотною модифівключати карбоксильний кінець. Fc-ділянка імунокацією (наприклад, заміна, інсерція або делеція), з глобуліну, як правило, містить два константні довключенням гетеродимерних варіантів, у яких взамени, СН2 і СН3, як показано, наприклад, на Фіг. 1. ємно відрізнятися можуть послідовності субланок Відповідно до певних варіантів здійснення, передважкого ланцюга. Відповідно до варіантів здійсбачаються варіанти, що мають один або декілька нення, яким віддається перевага, варіант Fcконстантних доменів. Відповідно до інших варіанділянки має щонайменше одну амінокислотну затів здійснення, передбачаються варіанти без таких міну, порівняно з Fc-ділянкою з нативною послідоконстантних доменів (або лише з частинами таких вністю (наприклад, заміни від приблизно однієї до константних доменів). приблизно десяти амінокислот, а відповідно до За визначенням, яке застосовується у цьому варіанта, якому віддається перевага, заміни від приблизно однієї до приблизно п'яти амінокислот описі, "домен СН2" (який називають також "Сg2" на Fc-ділянці з нативною послідовністю). Відповіддоменом) містить, як правило, фрагмент залишків, но до варіантів здійснення, яким віддається переякий, на Fc-ділянці (наприклад, на Fc-ділянці людвага, варіант Fc-ділянок буде мати щонайменше ського IgG) простягається від приблизно амінокисприблизно 80% гомологію з Fc-ділянкою з нативлоти 231 до приблизно амінокислоти 340. Унікальною послідовністю, відповідно до варіанта, якому ність домену СН2 полягає у тому, що він не є тісно віддається перевага, щонайменше приблизно спарованим з іншим доменом. 90%, і за варіантом, якому віддається найбільша Між двома СН2 доменами інтактної нативної перевага, щонайменше приблизно 95% гомологію. молекули IgG знаходиться два N-зв'язані розгалуТермін "гомологія", який вживають у цьому жені вуглеводні ланцюги. описі, у разі застосування його відносно амінокисЗа визначенням, яке застосовується у цьому лотних послідовностей, означає відсоток залишків описі, "домен СН3" (який називають також "Сg3" 41 86605 42 у варіанті амінокислотних послідовностей, які є зує будь-який один або декілька з вищевизначених ідентичними з нативною амінокислотною послідоFcR із більш високою зв'язувальною спорідненісвністю після впорядкованого розміщення послідотю, аніж вихідне антитіло, коли кількість варіанта вностей і введення "проривів", у разі необхідності, поліпептиду і вихідного поліпептиду у аналізі зв'ядля досягнення максимальної відсоткової гомолозування є по суті однаковою, а усі інші умови є гії. ідентичними. Наприклад, варіант поліпептиду з Термін "поліпептид, що містить Fc-ділянку", поліпшеною FcR-зв'язувальною спорідненістю означає поліпептид, наприклад, антитіло або імуможе демонструвати поліпшення (тобто підвиноадгезин (дивись визначення нижче), який місщення) FcR-зв'язувальної спорідненості, яке перетить Fc-ділянку. вищує відповідні характеристики вихідного поліпеТерміни "Fc-рецептор" і "FcR" застосовують птиду у приблизно 1,10-100 разів (частіше у для опису рецептора, який зв'язується з Fcприблизно 1,2-50 разів), де FcR-зв'язувальна споділянкою (наприклад, Fc-ділянкою антитіла або рідненість визначається, наприклад, за допомогою фрагмента антитіла). Згаданий термін включає ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз). рецептор новонароджених, FcRn, який відповідає Словосполучення "амінокислотна модифіказа перенесення материнських імуноглобулінів до ція", яке вживають у цьому описі, означає зміну зародка. амінокислотної послідовності даної амінокислотної Словосполучення "антитілозалежна клітиннопослідовності. Зразковими модифікаціями є (але опосередкована цитотоксичність" ("ADCC"), яке без обмеження) заміна, інсерція та/або делеція вживають у цьому описі, означає клітинноопосеамінокислоти. Відповідно до варіантів здійснення, редковану реакцію, у якій цитотоксичні клітини яким віддається перевага, амінокислотою модифі(наприклад, неспецифічні), що експресують FcR кацією є заміна (наприклад, на Fc-ділянці вихідно(наприклад, природні клітини-кілери (NK-клітини), го поліпептиду). нейтрофіли і макрофаги) розпізнають зв'язане Словосполучення "амінокислотна модифікаантитіло на клітині-мішені і у подальшому спричиція" у визначеному положенні (наприклад, на Fcнюють лізис згаданих клітин-мішеней. Основні кліділянці), яке вживають у цьому описі, означає затини для опосередковування ADCC, NK-клітини, міну або делецію визначеного залишку або інсерцію щонайменше одного амінокислотного залишку, експресують FcgRIII, у той час як моноцити експрилеглого до визначеного залишку. Під інсерцією, пресують FcgRI, FcgRII і FcgRIII. "прилеглою" до визначеного залишку, розуміють Словосполучення "ефекторні клітини", яке інсерцію у межах одного-двох залишків від нього. вживають у цьому описі, означає лейкоцити, які Згадана інсерція може бути N-кінцевою або Секспресують один або декілька FcR і здійснюють кінцевою відносно визначеного залишку. ефекторні функції. Відповідно до варіанта здійсСловосполучення "амінокислотна заміна", яке нення, якому віддається перевага, згадані клітини вживають у цьому описі, означає заміну щонаймеекспресують щонайменше FcgRIII і здійснюють нше одного існуючого амінокислотного залишку у ефекторну функцію ADCC. Прикладами лейкоциданій амінокислотній послідовності іншим "замінтів, які опосередковують ADCC, є мононуклеари ним" амінокислотним залишком. Згаданим замінпериферичної крові (РВМС), природні клітининим залишком або залишками можуть бути "прикілери (NK-клітини), моноцити, цитотоксичні Тродні амінокислотні залишки" (тобто кодовані клітини і нейтрофіли. Ефекторні клітини можуть генетичним кодом), вибрані з-посеред: аланіну виділятись із природного джерела (наприклад, із (Ala); аргініну (Arg); аспарагіну (Asn); аспарагінової крові). кислоти (Asp); цистеїну (Cys); глутаміну (Gin); глуСловосполучення "цільна кров", яке вживають тамінової кислоти (Glu); гліцину (Gly); гістидину у цьому описі, означає нефракціоновані проби (His); ізолейцину (lie); лейцину (Leu); лізину (Lys); крові. метіоніну (Met); фенілаланіну (Phe); проліну (Pro); Варіант поліпептиду зі "зміненою" FcRсерину (Ser); треоніну (Thr); триптофану (Тrр); тизв'язувальною спорідненістю або ADCC активнісрозину (Туr) і валіну (Val). Визначенням амінокистю, який застосовують у цьому винаході, являє лотної заміни, наведеним у цьому описі, передбасобою поліпептид, який має посилену (тобто підчається також заміна одним або декількома вищену) або ослаблену (тобто знижену) FcRнеприродними амінокислотними залишками. "Незв'язувальну активність та/або ADCC активність, природний амінокислотний залишок" означає запорівняно з вихідним поліпептидом або з поліпеплишок, що відрізняється від природних амінокистидом, що містить Fc-ділянку з нативною послідолотних залишків, наведених вище, який є здатним вністю. Варіант поліпептиду, який "демонструє до ковалентного зв'язування прилеглих амінокиспідвищене зв'язування" з FcR, зв'язує щонайменлотних залишків у поліпептидному ланцюзі. Прише один FcR із кращою спорідненістю, аніж вихідкладами неприродних амінокислотних залишків є ний поліпептид. Варіант поліпептиду, який "демоннорлейцин, орнітин, норвалін, гомосерин та інші струє знижене зв'язування" з FcR, зв'язує аналоги амінокислотних залишків, наприклад, опищонайменше один FcR з гіршою спорідненістю, сані у роботі Еллман (Ellman) та інші, Meth. Enzym. аніж вихідний поліпептид. Такі варіанти, які демон202: 301-336 (1991), яку включено до цього опису струють знижене зв'язування з FcR, можуть незнашляхом посилання. чно або зовсім не зв'язуватись із FcR, наприклад, Термін "амінокислотна інсерція", який вживадемонструвати 0-20% зв'язування з FcR, порівняно ють у цьому описі, означає включення щонайменз вихідним поліпептидом. Варіантом поліпептиду, ше однієї амінокислоти до даної амінокислотної який зв'язує FcR із "кращою спорідненістю", аніж послідовності. Відповідно до варіантів здійснення, вихідний поліпептид, є такий поліпептид, який зв'я 43 86605 44 яким віддається перевага, інсерцією, як правило, "C1q" являє собою поліпептид, який включає буде інсерція одного або двох амінокислотних засайт зв'язування Fc-ділянки імуноглобуліну. C1q лишків. Відповідно до інших варіантів здійснення, разом із двома сериновими протеазами, С1r і C1s, інсерція включає більші пептидні інсерційні сегмеутворює комплекс С1, першу складову шляху комнти (наприклад, інсерція від приблизно трьох до плементзалежної цитотоксичності (CDC). приблизно п'яти або навіть до приблизно десяти Термін "антитіло", який вживають у цьому опиамінокислотних залишків). сі, застосовується у найширшому значенні і, конкТермін "амінокислотна делеція", який вживаретно, означає моноклональні антитіла (у тому ють у цьому описі, означає видалення щонайменчислі непроцесовані моноклональні антитіла), поше одного амінокислотного залишку з даної аміноліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла кислотної послідовності. (наприклад, біспецифічні антитіла) і фрагменти Термін "аналітичний сигнал" означає кінцевий антитіл доти, доки вони демонструють бажану біорезультат будь-якого способу виявлення білоклогічну активність. білкових взаємодій, з включенням (але без обмеТермін "фрагменти антитіл", який вживають у ження) визначення оптичної густини за допомогою цьому описі, означає частину інтактного антитіла. колориметричного аналізу, інтенсивності флуореПрикладами фрагментів антитіл є (але без обмесценції або розпадів на хвилину. Аналітичні форження) лінійні антитіла; молекули одноланцюгових мати можуть включати ELISA, FACS (клітинний антитіл; Fc або Fc’ пептиди, Fab і Fab-фрагменти сортер зі збудженням флуоресценції) або інші мета мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагметоди. Зміна "аналітичного сигналу" може відобрантів антитіл. Фрагменти антитіл, відповідно до важати зміну життєздатності клітини та/або зміну ріанта, якому віддається перевага, зберігають кінетичної дисоціації, кінетичної асоціації або того і принаймні частину шарнірної ділянки і факультаіншого. "Підвищений аналітичний сигнал" означає тивно СН1 ділянки важкого ланцюга IgG. Відповідте, що визначений вихідний показник є більшим за но до інших варіантів здійснення, яким віддається інший показник (наприклад, варіант може мати перевага, фрагменти антитіл містять принаймні більш високий (більший) визначений показник у частину СН2 ділянки або СН2 ділянку у цілому. ELISA, порівняно з вихідним поліпептидом). "НижТермін "функціональний фрагмент", який вжичий" аналітичний сигнал означає те, що визначевають у цьому описі, у разі його застосування відний вихідний показник є меншим за інший показносно моноклонального антитіла, означає частину ник (наприклад, варіант може мати нижчий моноклонального антитіла, яка все ще зберігає (менший) визначений показник у ELISA, порівняно функціональну активність. Функціональною активз вихідним поліпептидом). ністю може бути, наприклад, антигензв'язувальна Термін "зв'язувальна спорідненість" означає активність або специфічність. Функціональні фраконстанту дисоціації у стані рівноваги (виражену у гменти моноклональних антитіл включають, наодиницях концентрації), пов'язану з кожною взаєприклад, окремі важкі або легкі ланцюги і їхні фрамодією Рс-рецептор-Рс-зв'язування. Зв'язувальна гменти, наприклад, VL, VH і Fd; моновалентні спорідненість безпосередньо пов'язується з відфрагменти, наприклад, Fv, Fab і Fab'; бівалентні ношенням показника кінетичної дисоціації (яка, як фрагменти, наприклад, F(ab')2; одноланцюговий Fv правило, виражається у одиницях оберненого ча(scFv); і Fc фрагменти. Опис таких термінів навесу, наприклад, с-1), поділеного на показник кінетидено, наприклад, у роботах Харлоу (Harlowe) і чної асоціації (яка, як правило, виражається у одиЛейн (Lane), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold ницях концентрації на одиницю часу, наприклад, Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. моль/с). Взагалі, неможливо однозначно стверBiology and Biotechnology: A Comprehensive Desk джувати, чи викликані зміни констант дисоціації у Reference (під редакцією Майєрс P.A. (Myers стані рівноваги різницями показників кінетичної R.A.)), New York: VCH Publisher, Inc.); Хастон дисоціації, показників кінетичної асоціації або того (Huston) та інші, Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); і іншого, якщо тільки кожен із цих параметрів не є Плактан (Pluckthun) і Скерра (Skerra), Meth. експериментально визначеним (наприклад, шляEnzymol., 178:497-515 (1989) та у роботі Дей Е.Д. хом визначень за допомогою BIACORE або (Day E.D.), Advanced Immunochemistry, Second Ed., SAPIDYNE). Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990), усі з яких Термін "шарнірна ділянка", який вживають у включено до цього опису шляхом посилання. Згацьому описі, означає відрізок амінокислот у людданий термін "функціональний фрагмент" означає, ському IgG1, який простягається від Glu216 до наприклад, фрагменти, одержані у разі протеазноРго230 людського IgG1. Шарнірні ділянки інших го гідролізу або відновлення моноклонального IgG ізотипів можуть впорядковано розміщатись антитіла і методами рекомбінантних ДНК, відомивідносно послідовності IgG1 шляхом розміщення у ми фахівцям у цій галузі. однакових положеннях першого і останнього цисТермін "гуманізовані" форми нелюдських (натеїнових залишків, які утворюють S-S зв'язки між приклад, мишачих) антитіл, який вживають у цьоважкими ланцюгами. му описі, означає антитіла, які містять мінімальну Термін "нижча шарнірна ділянка" Fc-ділянки, послідовність (або такої послідовності не містять), який вживають у цьому описі, означає відрізок аміодержану з нелюдського імуноглобуліну. Гуманізонокислотних залишків, який знаходиться безпосеваними антитілами, у більшості випадків, є людські редньо за шарнірною ділянкою і орієнтований у імуноглобуліни (антитіло-реципієнт), у яких залишнапрямку С-кінця (наприклад, залишки 233-239 Fcки гіперваріабельної ділянки реципієнта замінені ділянки IgG1). залишками гіперваріабельної ділянки нелюдського виду (антитіло-донор), наприклад, миші, пацюка, 45 86605 46 кролика або примату окрім людини, що мають неним члену суперсімейства імуноглобулінових обхідну специфічність, спорідненість і потенціал. У генів. Інші рецептори, які не є членами суперсідеяких випадках, залишки каркасної Fv-ділянки мейства імуноглобулінових генів, однак незважаю(FR) людського імуноглобуліну замінюють відповічи на це, специфічно підпадають під наведене дними нелюдськими залишками. На додаток до визначення, є рецепторами цитокінів і, зокрема, цього, гуманізовані антитіла можуть включати зарецепторами з тирозинкіназною активністю (рецелишки, які не знаходяться у антитілі-реципієнті або пторні тирозинкінази), членами суперсімейства у антитілі-донорі. Ці модифікації, як правило, здійрецепторів гемопоетину та фактора росту нервоснюють для додаткового поліпшення характерисвої тканини і молекулами клітинної адгезії (напритик антитіла. Взагалі, гуманізоване антитіло буде клад, Е-, L- і Р-селектини). містити по суті усі із щонайменше однієї, а, як праТермін "домен зв'язування рецептора", який вило, двох варіабельних ділянок, у яких усі або по вживають у цьому описі, означає будь-який нативсуті усі гіперваріабельні петлі відповідають гіперний ліганд рецептора, у тому числі молекули кліваріабельним петлям нелюдського імуноглобуліну, тинної адгезії або будь-яку ділянку або похідну а усі або по суті усі FR залишки є залишками потакого нативного ліганду, що зберігає принаймні слідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоваякісну здатність зв'язування рецептора відповідноне антитіло може також містити принаймні частину го нативного ліганду. константної ділянки імуноглобуліну (Fc), як правиТермін "антитіло-імуноадгезинова химера", ло, частину константної ділянки людського імуноякий вживають у цьому описі, означає молекулу, глобуліну. Приклади способів, застосованих для яка об'єднує щонайменше один зв'язувальний доодержання гуманізованих антитіл, описані у патенмен антитіла із щонайменше одним імуноадгезиті СІЛА № 5,225,539 на ім'я Вінтер (Winter) та інші ном. Приклади включають (але без обмеження) (який включено до цього опису шляхом посиланбіспецифічні CD4-IgG химери, описані у роботах ня). Берг (Berg) та інші, PNAS (USA) 88:4723-4727 Термін "гіперваріабельна ділянка", який вжи(1991) і Чарноу (Charnow) та інші, J. Immunol., вають у цьому описі, означає амінокислотні зали153:4268 (1994), обидві з яких включено до цього шки антитіла, які несуть відповідальність за зв'язуопису шляхом посилання. вання з антигеном. Гіперваріабельна ділянка Термін "виділений" поліпептид, який вживають містить амінокислотні залишки "гіперваріабельної у цьому описі, означає поліпептид, який був іденділянки" або "CDR" (тобто залишки 24-34 (L1), 50тифікований і відокремлений та/або виділений зі 56 (L2) і 89-97 (L3) у варіабельному домені легкого складової його природного оточення. Забруднюланцюга і 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) і 95-102 (Н3) у вальними складовими його природного оточення є варіабельному домені важкого ланцюга; Кабат матеріали, які могли б перешкоджати діагностич(Kabat) та інші, Sequences of Proteins of ному або терапевтичному застосуванням цього Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, поліпептиду, і вони можуть включати ферменти, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) гормони та інші білкові або небілкові розчинені та/або залишки "гіперваріабельної петлі" (тобто речовини. Відповідно до певних варіантів здійсзалишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у варіанення, виділений поліпептид очищають (1) до бібельному домені легкого ланцюга і 26-32 (Н1), 53льше ніж 95% за масою поліпептидів, як визнача55 (Н2) і 96-101 (Н3) у варіабельному домені важється за методом Лоурі, і відповідно до варіанта, кого ланцюга; Чотіа (Chothia) і Леск (Lesk), J. Моl. якому віддається перевага, до більше ніж 99% за Віоl 196: 901-917 (1987)). "Каркасними" або "FR" масою, (2) до рівня, достатнього для одержання залишками є ті залишки варіабельного домену, які щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрівідрізняються від залишків гіперваріабельної діляшньої амінокислотної послідовності за допомогою нки, як визначено у цьому описі. секвенатора з роторним барабаном або (3) до одТермін "імуноадгезин", який вживають у цьому норідності за допомогою SDS-PAGE (електрофоописі, означає антитілоподібні молекули, які об'єдрез у поліакриламідному гелі у присутності доденують зв'язувальний домен гетерологічного білкацилсульфату натрію) за відновних або "адгезину" (наприклад, рецептора, ліганду або невідновних умов із застосуванням барвника куферменту) з константним доменом імуноглобуліну. масі синього або срібла. Виділений поліпептид У структурному відношенні імуноадгезини являють включає поліпептид in situ у межах рекомбінантних собою результат злиття амінокислотної послідовклітин, оскільки щонайменше одна складова приності адгезину з бажаною зв'язувальною специфіродного оточення поліпептиду не буде присутчністю, яка відрізняється від розпізнання антигену, ньою. Однак, як правило, виділений поліпептид і зв'язувальної ділянки (антигензв'язувального буде одержуватись за допомогою щонайменше центра антитіла) антитіла (тобто є "гетерологічоднієї стадії очищення. ною) з послідовністю константного домену імуноТермін "лікування", який вживають у цьому глобуліну. описі, означає як терапевтичне лікування, так і Термін "домен зв'язування ліганду", який вжипрофілактичні або запобіжні заходи. До числа тих, вають у цьому описі, означає будь-який нативний хто потребує лікування, належать ті, хто вже має рецептор або будь-яку його ділянку чи похідну, що розлад, а також ті, у яких появі згаданого розладу зберігає щонайменше якісну зв'язувальну здатнеобхідно запобігти. ність ліганду відповідного нативного рецептора. Термін "розлад", який вживають у цьому описі, Відповідно до певних варіантів здійснення, згадаозначає будь-який стан, для якого було б благоний рецептор походить із мембранного поліпептитворним лікування варіантом поліпептиду, у тому ду, що має позаклітинний домен, який є гомологіччислі хронічні та гострі розлади або захворювання 47 86605 48 (наприклад, патологічні стани, які сприяють виниккодувальною послідовністю, якщо він займає таке ненню у пацієнта конкретного захворювання). Відположення, що це полегшує трансляцію. Відповідповідно до певних варіантів здійснення, згаданим но до варіантів здійснення, яким віддається перерозладом є рак. вага, "функціонально зв'язаний" означає, що зв'яТерміни "рак" і "раковий", які вживають у цьому зані послідовності ДНК є суміжними, а, у разі описі, означають або описують фізіологічний стан секреторної лідерної послідовності, суміжними і у у ссавців, який, як правило, характеризується немежах рамки зчитування. Однак енхансери, нарегульованим ростом клітин. Прикладами раку є приклад, не повинні бути суміжними. Зв'язування (але без обмеження) карцинома, лімфома, бласможе здійснюватись, наприклад, шляхом літувантома, саркома і лейкемія. Конкретнішими прикланя на відповідних сайтах рестрикції. Якщо такі сайдами таких раків є плоскоклітинний рак, дрібнокліти не існують, за традиційною практикою, можуть тинний рак легень, недрібноклітинний рак легень, застосовуватись синтетичні олігонуклеотидні адааденокарцинома легень, плоскоклітинна карциноптори або лінкери. ма легень, рак очеревини, злоякісна гепатома, рак Терміни "клітина", "клітинна лінія" і "культура шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової заклітин", які вживають у цьому описі, застосовуютьлози, гліобластома, рак шийки матки, рак яєчників, ся взаємозамінно і усі ці визначення включають рак печінки, рак сечового міхура, гепатома, рак потомство. Так, терміни "трансформант" і "трансмолочної залози, рак товстої кишки, рак анастомоформовані клітини" означають первинні клітини зу ободової та прямої кишок, карцинома ендометсуб'єкта і одержані з них культури, незалежно від рія або матки, карцинома слинних залоз, рак никількості перенесень посівного матеріалу. Зрозурок, рак передміхурової залози, рак зовнішніх міло також, що усе потомство може не бути точно жіночих статевих органів, рак щитовидної залози, ідентичним за вмістом ДНК унаслідок навмисних карцинома печінки і різні типи раку голови та шиї. або ненавмисних мутацій. Включають мутантне Словосполучення "рак, що експресує HER2", потомство, яке має таку саму функціональну або яке вживають у цьому описі, означає рак, який біологічну активність, за якою відбиралась вихідна включає клітини, що мають НЕR2-рецепторний клітина, яка зазнала трансформації. Там, де пебілок (наприклад, номер депонування у Genebank редбачаються визначення, які різняться між соX03363), присутній на поверхні згаданих клітин, бою, це буде зрозуміло з контексту. завдяки чому анти-НЕR2 антитіло може зв'язуваТермін "речовина, яку піддають аналізу", який тись зі згаданим раком. вживають у цьому описі, означає речовину, приТермін "мітка", який вживають у цьому описі, значену для аналізу. Речовиною, яку піддають означає сполуку або композицію, яка піддається аналізу, за варіантом, якому віддається перевага, виявленню і є безпосередньо або опосередковано є поліпептид, що містить Fc-ділянку, який повинен кон'югованою з поліпептидом. Виявлятись може аналізуватись на здатність до зв'язування Fcсама мітка (наприклад, радіоізотопні мітки або рецептора. флуоресцентні мітки) або, у разі ферментної мітки, Термін "рецептор", який вживають у цьому вона може каталізувати хімічну зміну субстратної описі, означає поліпептид, здатний до зв'язування сполуки або композиції, яка піддається виявленню. щонайменше одного ліганду. Рецептором, якому Терміни "контрольний елемент", "контрольна віддається перевага, є мембранний або розчинний послідовність" і "регуляторний елемент", які вжирецептор, що має позаклітинний лігандзв'язувальвають у цьому описі, означають генетичний елений домен і факультативно інші домени (напримент, який контролює який-небудь аспект експресії клад, трансмембранний домен, внутрішньоклітиннуклеїновокислотних послідовностей. Наприклад, ний домен та/або "мембранний якір"). Рецептором, промотор являє собою регуляторний елемент, призначеним для оцінки за допомогою наведеного який полегшує ініціацію транскрипції функціональу цьому описі аналізу, може бути інтактний рецепно зв'язаної кодувальної ділянки. Іншими регулятор або його фрагмент чи похідна (наприклад, гібторними елементами є сигнали сплайсингу, сигнаридний білок, що містить зв'язувальний домен ли поліаденілування, сигнали термінації тощо. згаданого рецептора, злитий з одним або декільКонтрольними елементами, придатними для прокома гетерологічними поліпептидами). Більше токаріотів, наприклад, є промотор, за факультативго, рецептор, призначений для оцінки за його зв'яним варіантом, операторна послідовність і сайт зувальними властивостями, може бути присутнім у зв'язування рибосом. Відомо, що клітини-еукаріоти клітині або виділеним і факультативно нанесеним використовують промотори, сигнали поліаденілуна аналітичний планшет або на якусь іншу тверду вання і енхансери. фазу або безпосередньо міченим і застосовуваНуклеїнова кислота, за описом, є "функціонаним як зонд. льно зв'язаною", коли вона знаходиться у функціСловосполучення "СНО-експресований поліональному взаємозв'язку з іншою нуклеїновокиспептид", яке вживають у цьому описі, означає полотною послідовністю. Наприклад, ДНК для ліпептид, рекомбінантно експресований у клітинах пресеквенувальної або секреторної лідерної пояєчника китайського хом'ячка (СНО). слідовності є функціонально зв'язаною з ДНК поліТермін "захворювання, яке реагує на антитіпептиду, якщо він експресується як попередник ла", який вживають у цьому описі, означає будьбілка, який бере участь у секреції поліпептиду; яке захворювання або медичний стан, який, як промотор або енхансер є функціонально зв'язаним показано, піддається лікуванню, принаймні часткоіз кодувальною послідовністю, якщо він впливає на во, терапією антитілами. Прикладами таких захвотранскрипцію згаданої послідовності; або сайт рювань і медичних станів є (але без обмеження) зв'язування рибосом є функціонально зв'язаним із лімфома (яка, як показано, піддається лікуванню 49 86605 50 RІTUXAN), інфекційні захворювання (які, як покаТермін "симптоми захворювання, яке реагує зано, піддаються лікуванню SYNAGIS), транспланна антитіло або імуноадгезин" означає симптоми, тат нирок (допомогу у цьому разі, як показано, наякі, як правило, пов'язуються з конкретним захводає ΖΕΝΑΡΑΧ), хвороба Крона і ревматоїдний рюванням. Наприклад, симптоми, які, як правило, артрит (які, як показано, піддаються лікуванню пов'язуються з хворобою Крона, включають: біль у REMICADE), рак молочної залози (який, як показачеревній порожнині, діарею, кровотечу з прямої но, піддається лікуванню HERCEPTIN) і рак товскишки, втрату ваги, пропасницю, втрату апетиту, тої кишки (який, як показано, піддається лікуванню зневоднення, анемію, здуття живота, фіброз, заEDRECOLOMAB). Термін "захворювання, яке реапалення кишечнику і порушення харчування. гує на імуноадгезини", який вживають у цьому опиСловосполучення "за умов, за яких симптоми сі, означає будь-яке захворювання або медичний зменшуються" означає будь-який ступінь якісного стан, який, як показано, піддається лікуванню, або кількісного зменшення симптомів, які піддапринаймні частково, терапією імуноадгезинами. ються виявленню, будь-якого захворювання, яке Варіант поліпептиду, який "опосередковує анреагує на антитіло або імуноадгезин, із включентитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксиням (але без обмеження) помітного впливу на чність (ADCC) у присутності людських ефекторних швидкість одужання від захворювання (наприклад, клітин із більшою ефективністю", аніж вихідне анприріст ваги) або зменшення щонайменше одного титіло, який застосовують у цьому винаході, являє із симптомів, які, за звичайних умов, пов'язуються собою поліпептид, який in vitro або in vivo є значно з конкретним захворюванням (наприклад, якщо ефективнішим щодо опосередковування ADCC, захворюванням, яке реагує на антитіло або імуноколи кількість варіанта поліпептиду і вихідного адгезин, була б хвороба Крона, зменшення щоантитіла, застосована у аналізі, є по суті однаконайменше одного з наведених нижче симптомів: вою. Наприклад, такий варіант спричинює більш болю у черевній порожнині, діареї, кровотечі з високий рівень лізису клітин-мішеней у даному прямої кишки, втрати ваги, пропасниці, втрати аналізі ADCC, аніж вихідний поліпептид у ідентичапетиту, зневоднення, анемії, здуття живота, фібному аналізі ADCC. Такі варіанти можуть ідентифірозу, запалення кишечнику і порушення харчуванкуватись, наприклад, за допомогою аналізу ADCC, ня). однак застосовуватись можуть і інші аналізи або Опис винаходу методи визначення активності ADCC (наприклад, Цей винахід пропонує варіанти поліпептидної тваринні моделі). Відповідно до варіантів здійсFc-ділянки і олігонуклеотиди, що кодують варіанти нення, яким віддається перевага, ефективність Fc-ділянки. Зокрема, цей винахід пропонує комповаріанта поліпептиду щодо опосередковування зиції, що містять нові варіанти Fc-ділянки, способи ADCC перевищує відповідний показник вихідного ідентифікування корисних варіантів Fc-ділянки та поліпептиду у приблизно 1,2 рази, 1,5 рази, 50 способи застосування варіантів Fc-ділянки для разів, 100 разів, приблизно 500 разів або приблизлікування захворювань. Опис винаходу наведено но 1000 разів. нижче у таких розділах: І) Fc-ділянки антитіл; II) Варіант поліпептиду, який "опосередковує анВаріанти Fc-ділянок; III) Варіанти комбінацій; IV) титілозалежне вичерпання В-клітин із цільної крові Аналізи варіантів поліпептидів; V) Зразкові молез більшою ефективністю", аніж вихідне антитіло, кули, що містить варіант Fc-ділянки; VI) Нуклеїнові який застосовують у цьому винаході, являє собою послідовності, які кодують варіанти Fc-ділянки; VII) поліпептид, який in vitro або in vivo є значно ефекТерапевтичне застосування і композиції; VIII) Дотивнішим щодо опосередковування вичерпання Вдаткове застосування варіантів Fc-ділянки. клітин, коли кількість варіанта поліпептиду і вихідІ. Fc-ділянки антитіл ного антитіла, застосована у аналізі, є по суті одЯк описувалось вище, антитіла мають ділянки, наковою. Наприклад, такий варіант спричинює головним чином, СН2 і СН3 ділянки, функції яких більш високий рівень вичерпання В-клітин у даноне мають відношення до зв'язування антигену. Ці му аналізі, аніж вихідний поліпептид у ідентичному ділянки, узяті разом, відомі під назвою Fc-ділянки, аналізі. Такий варіант також може вичерпати Ві вони виконують декілька ефекторних функцій, які клітини до такого самого рівня, однак із нижчими опосередковуються шляхом зв'язування ефекторконцентраціями, порівняно з вихідним поліпептиних молекул. дом у ідентичному аналізі. Такі варіанти можуть Ефекторні функції, які опосередковуються Fcідентифікуватись, наприклад, за допомогою аналіділянкою антитіла, можуть підрозділятись на дві зу ADCC, однак застосовуватись можуть і інші категорії: (1) ефекторні функції, які реалізуються аналізи або методи визначення активності ADCC після зв'язування антитіла з антигеном (ці функції (наприклад, тваринні моделі). Відповідно до варіавключають, наприклад, участь шляху активації нтів здійснення, яким віддається перевага, інтенкомплементу або клітин, що несуть Fc-рецептор сифікація вичерпання, порівняно з вихідним полі(FcR)); і (2) ефекторні функції, які реалізуються пептидом, не залежить від генотипу FcRIIIa у незалежно від зв'язування антигену (ці функції положенні 158 (V або F) і генотипу FcRIIa у полозабезпечують, наприклад, тривале перебування у женні 131 (Н або R), і ефективність варіанта полісистемі кровообігу і здатність до проходження чепептиду щодо опосередковування вичерпання Врез клітинні бар'єри завдяки трансцитозу). Наприклітин перевищує відповідний показник вихідного клад, зв'язування складової С1 комплементу з поліпептиду у приблизно 1,2 рази, 1,5 рази, 50 антитілами активізує систему комплементу. Після разів, 100 разів, приблизно 500 разів або приблизопсонізації, активація комплементу є важливою но 1000 разів. стадією у лізисі клітинних патогенів. Активація комплементу також стимулює запальну реакцію і 51 86605 52 ність ADCC носіїв 158F, можуть посилити клінічну може також бути залученою до автоімунної гіперефективність терапії раку антитілами. У людського чутливості. На додаток до цього, антитіла зв'язуються з клітинами через Fc-ділянку, причому сайт FcgRIIA (CD32) рецептора у положенні 131 у його зв'язування Fc-рецептора на Fc-ділянці антитіла позаклітинному домені, який кодує у цьому полозв'язується з Fc-рецептором (FcR) на клітині. Існує женні гістидин (Н) або аргінін (R), є присутнім таряд Fc-рецепторів, специфічних для різних класів кож генетичний поліморфізм. Було встановлено, антитіл, у тому числі IgG (гамма-рецептори), "IgE що поліморфізм у положенні 131 впливає на його (ета-рецептори), IgA (альфа-рецептори) і IgM (мюздатність до зв'язування людського IgG. Нещодаврецептори). Незважаючи на те, що цей винахід не но одержані дані також демонструють кореляцію обмежується жодним конкретним механізмом, між поліморфізмом FcgRIIA у положенні 131 і клінізв'язування антитіла з Fc-рецепторами на поверхні чною реакцією на Rituxan. У хворих, гомозиготних клітин ініціює ряд важливих і різноманітних біолопо НІ31 алелю, інтенсивність реакції є значно вигічних реакцій, у тому числі поглинання і знищення щою, аніж у 2 інших груп. частинок, вкритих антитілами, виведення імунних FcgRI, FcgRII і FcgRIII є рецепторами суперсікомплексів, лізис пасивно сенсибілізованих клітинмейства імуноглобулінів (IgSF); FcgRI має три IgSF мішеней клітинами-кілерами (який називають андомени на своєму позаклітинному домені, у той титілозалежною клітинноопосередкованою циточас як FcgRII і FcgRIII мають лише два IgSF домени токсичністю або ADCC), виділення медіаторів зана своїх позаклітинних доменах. палення, перехід через плаценту і контролювання Іншим типом Fc-рецептора є Fc-рецептор нопродукування імуноглобулінів. вонароджених (FcRn). FcRn є структурно подібним Декілька ефекторних функцій антитіла опоседо головного комплексу гістосумісності (МНС) і редковуються Fc-рецепторами (FcR), які зв'язують складається з сс-ланцюга, нековалентно зв'язаноFc-ділянку антитіла. FcR визначаються за їхньою го з р2-мікроглобуліном. специфічністю відносно ізотипів імуноглобулінів: II. Варіанти Fc-ділянок Fc-рецептори IgG антитіл називають FcgR, IgE Цей винахід пропонує варіанти поліпептидів, FceR, IgA - FcaR тощо. Було ідентифіковано три нуклеїновокислотні послідовності, що кодують вапідкласи FcgR: FcgRI (CD64), FcgRII (CD32) і FcgRIII ріанти поліпептидів і способи одержання варіантів (CD16). поліпептидів. Відповідно до варіантів здійснення, Оскільки кожен підклас FcgR кодується двома яким віддається перевага, варіанти поліпептидів або трьома генами і наслідком альтернативного за цим винаходом відрізняються від вихідного посплайсингу РНК є численні транскрипти, існує шиліпептиду щонайменше однією амінокислотною рока різноманітність ізоформ FcgR. Три гени, що модифікацією. "Вихідний", "дикого типу", "початковий" і "неваріантний" поліпептид, відповідно до кодують підклас FcgRI (FcgRIA, FcgRIB та FcgRIC), варіантів здійснення, яким віддається перевага, утворюють кластер на ділянці Iq21.1 довгого плеча містить принаймні частину Fc-ділянки антитіла і хромосоми 1; усі гени, що кодують ізоформи може бути одержаним за допомогою способів, доFcgRII (FcgRIIA, FcgRIIB та FcgRIIC) і два гени, що ступних у цій галузі для одержання поліпептидів, кодують FcgRIII (FcgRIIIA та FcgRIIIB), утворюють що містять Fc-ділянку або її частину. Відповідно до кластер на ділянці 1q22. Ці різні підтипи FcR ексваріантів здійснення, яким віддається перевага, пресують на клітинах різного типу (дивись, напривихідним поліпептидом є антитіло. Вихідним поліклад, Равеч (Ravetch) і Кінет (Kinet), Annu. Rev. пептидом може, однак, бути будь-який інший поліImmunol. 9: 457-492 (1991)). Наприклад, у людей, пептид, що містить принаймні частину Fc-ділянки FcgRIIIB знаходять лише на нейтрофілах, у той час (наприклад, імуноадгезин). Відповідно до певних як FcgRIIIA знаходять на макрофагах, моноцитах, варіантів здійснення, варіант Fc-ділянки може бути природних клітинах-кілерах (NK-клітинах) і субпоодержаним (наприклад, за способами, які розкрипуляції Т-клітин. Слід звернути увагу на те, що вають у цьому описі) і злитим із необхідним гетеFcgRIIIA є присутнім на NK-клітинах, тобто на клірологічним поліпептидом, наприклад, варіабельтинах одного з типів, які, як гадають, приймають ною ділянкою антитіла або зв'язувальним участь у ADCC. доменом рецептора чи ліганду. Людський рецептор FcgRIIIA (CD16) має спільВідповідно до варіантів здійснення, яким відний поліморфізм свого позаклітинного домену у дається перевага, вихідний поліпептид містить Fcположенні 158, який у цьому положенні кодує феділянку або її функціональну частину. Взагалі, Fcнілаланін або валін. V алель FcgRIIIA має більшу ділянка вихідного поліпептиду буде являти собою спорідненість до людського IgG1, аніж F алель. VI5 Fc-ділянку з нативною послідовністю і, відповідно 8 алель також ефективніше опосередковує ADCC. до варіанта, якому віддається перевага, людську Клінічні дані показують кореляцію між генотипом Fc-ділянку з нативною послідовністю. Однак FcFcgRIIIA рецептора у хворих, яких піддають лікуділянка вихідного поліпептиду може мати одну або ванню Rituxan, і терапевтичною реакцією. Було декілька попередньо існуючих змін або модифікапоказано, що як клінічні і молекулярні реакції, так і цій амінокислотної послідовності Fc-ділянки з начас до прогресування є кращими у хворих, гомозитивною послідовністю. Наприклад, попередньо готних по FcgRIIIA-158V генотипу (приблизно 20% могла бути змінена Clq зв'язувальна активність Fcпопуляції). У протилежність до цього, хворі, гетеділянки або попередньо могла бути змінена FcgR розиготні або гомозиготні по FcgRIIIA-158F генотизв'язувальна спорідненість Fc-ділянки. Відповідно пу нижчої спорідненості (приблизно 80% популядо додаткових варіантів здійснення, Fc-ділянка ції), реагували значно гірше. Ці дані дозволяють вихідного поліпептиду є абстрактною (наприклад, припустити, що Fc-мутації, які посилюють активумоглядною або візуальною копією на комп'ютері 53 86605 54 або папері) і, оскільки вона фізично не існує, генцифічний сайт рестрикції. У разі відсутності таких ний інженер, який займається конструюванням сайтів рестрикції, їх необхідно одержати за допоантитіл, може прийняти рішення відносно бажаної могою вищеописаного способу олігонуклеотидопоамінокислотної послідовності варіанта Fc-ділянки і середкованого мутагенезу для того, щоб ввести на одержати поліпептид, що містить таку послідоввідповідні місця вихідної поліпептидної ДНК. Планість або ДНК, що кодує бажану амінокислотну змідну ДНК на цих сайтах розрізають для того, послідовність варіанта Fc-ділянки. Однак, відповіщоб перевести її у лінійну форму. Дволанцюговий дно до варіантів здійснення, яким віддається пеолігонуклеотид, що кодує послідовність ДНК між ревага, нуклеїнова кислота, що кодує Fc-ділянку сайтами рестрикції, але який містить необхідну вихідного поліпептиду є доступною і ця нуклеїномутацію(-ії), синтезують за допомогою стандартвокислотна послідовність змінюється для одерних способів, де два ланцюги олігонуклеотиду синжання варіанта нуклеїновокислотної послідовності, тезують окремо, після чого об'єднують за стандарщо кодує варіант Fc-ділянки. тними способами. Цей дволанцюговий Нуклеїнову кислоту, що кодує варіант вихідноолігонуклеотид називають касетою. Ця касета го поліпептиду, можна одержати за способами, конструюється таким чином, щоб вона мала 5' і 3' відомими у цій галузі техніки із застосуванням вкакінці, які є сумісними з кінцями переведеної у лізівок цього опису для конкретних послідовностей. нійну форму плазміди, завдяки чому вона може Ці способи включають (але без обмеження) одербезпосередньо лігуватись до плазміди. Ця плазміжання сайт-спрямованим (або олігонуклеотидопода тепер містить мутовану послідовність ДНК. середкованим) мутагенезом, ПЛР-мутагенезом і За альтернативним варіантом, або додатково, касетним мутагенезом раніше одержаної нуклеїнеобхідна амінокислотна послідовність, що кодує нової кислоти, що кодує поліпептид. Сайтваріант поліпептиду, може бути визначеною, а спрямований мутагенез є способом одержання нуклеїновокислотна послідовність, що кодує такий варіантів, якому віддається перевага. Цей спосіб є варіант амінокислотної послідовності, може бути добре відомим у цій галузі (дивись, наприклад, одержана синтетичним шляхом. роботи Картер (Carter) та інші, Nucleic Acids Res. Амінокислотна послідовність вихідного поліпе13: 4431-4443 (1985) і Кункель (Kunkel) та інші, птиду може модифікуватись для одержання варіаProc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987), обидві з нта Fc-ділянки зі зміненою зв'язувальною спорідяких включено до цього опису шляхом посилання). неністю або активністю Fc-рецептора in vitro Стисло, при здійсненні сайт-спрямованого мутагета/або in vivo та/або зміненою антитілозалежною незу ДНК, вихідну ДНК спочатку змінюють шляхом клітинноопосередкованою цитотоксичною (ADCC) гібридизації одного або декількох олігонуклеотиактивністю in vitro та/або in vivo. Амінокислотна дів, що кодують бажану мутацію(-ії), з одним ланпослідовність вихідного поліпептиду може також цюгом цієї вихідної ДНК. Після гібридизації застомодифікуватись для одержання варіанта Fcсовують ДНК-полімеразу для синтезу повного ділянки зі зміненими властивостями зв'язування другого ланцюга, із застосуванням гібридизованокомплементу та/або часом половини строку життя го олігонуклеотиду(-ів) як праймеру і із застосуу системі кровообігу. ванням одного ланцюга вихідної ДНК як матриці; Суттєвих модифікацій біологічних властивосДНК-лігазу застосовують для літування другого тей Fc-ділянки можна досягти шляхом вибору заланцюга з одержанням кільцевої дволанцюгової мін, які суттєво різняться за їхнім впливом на зміну ДНК. Таким чином, олігонуклеотид, що кодує ба(а) структури поліпептидного каркаса на ділянці жану мутацію, включається до складу одержаної заміни, наприклад, складчастої або спіральної дволанцюгової ДНК. конформації, (b) заряду або гідрофобності молеПЛР-мутагенез також є придатним для одеркули на цільовому сайті або об'єму бічного ланцюжання варіантів амінокислотних послідовностей га, (d) взаємодії з вуглеводом або (e) гнучкості вихідного поліпептиду (дивись, наприклад, роботу руху домену. Природні залишки підрозділяються Валлетт (Vallette) та інші, Nuc. Acids Res. 17: 723на класи на основі спільних властивостей бічних 733 (1989), яку включено до цього опису шляхом ланцюгів: посилання). Стисло, коли невеликі кількості мат(1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; ричної ДНК застосовують як вихідний матеріал у (2) нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr; ПЛР, праймери, які дещо відрізняються за послі(3) кислотні: asp, glu; довністю від відповідної ділянки матричної ДНК, (4) основні: asn, gln, his, lys, arg; можуть застосовуватись для одержання відносно (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланвеликих кількостей специфічного фрагмента ДНК, цюга: gly, pro; і який відрізняється від матричної послідовності (6) ароматичні: trp, tyr, phe. лише положеннями, за якими праймери відрізняНеконсервативні заміни потягнуть за собою ються від матриці. заміну члена одного з цих класів членом іншого Основу іншого способу одержання варіантів, класу. Консервативні заміни потягнуть за собою касетного мутагенезу, описано у роботі Уеллс заміну члена одного з цих класів іншим членом (Wells) та інші, Gene 34: 315-323 (1985), яку вклютого самого класу. чено до цього опису шляхом посилання. Вихідним Як показано у наведених нижче Прикладах, матеріалом є плазміда (або інший вектор), що місможна сконструювати варіант Fc-ділянки зі змінетить вихідну поліпептидну ДНК, призначену для ною активністю (ефекторна функція(-ії) і фармакомутації. Ідентифікують кодон(-и) вихідної ДНК, кінетика). Можна, наприклад, модифікувати один призначений(-і) для мутації. На кожному боці іденабо декілька амінокислотних залишків Fc-ділянки з тифікованого сайту(-ів) мутації повинен бути спеметою зміни (наприклад, підвищення або знижен 55 86605 56 ня) ADCC активності. Відповідно до варіантів здійрідненістю при різних рН, аніж вихідний поліпепснення, яким віддається перевага, модифікація тид. Такі варіанти Fc-ділянки будуть, як правило, включає один або декілька залишків Fc-ділянки, містити щонайменше одну амінокислотну модифіідентифікованих у цьому описі (дивись, наприклад, кацію на Fc-ділянці. Приклад 2 і WO 0042072, яку включено до цього Відповідно до варіантів здійснення, яким відопису шляхом посилання для усіх цілей). Взагалі, дається перевага, вихідною Fc-ділянкою поліпепамінокислотна заміна на одному або декількох тиду є людська Fc-ділянка, наприклад, нативна залишках Fc-ділянки, ідентифікованих у цьому людська Fc-ділянка людського IgG1 (f і a, z алотиописі, як така, що впливає на ADCC активність, пи), IgG2, IgG3, IgG4 і усі відомі або відкриті аломоже здійснюватись для одержання такого варіантипи будь-якого виду. Такі ділянки мають послідота Fc-ділянки. Відповідно до варіантів здійснення, вності, наприклад, як послідовності, зображені на яким віддається перевага, видаленими або заміФіг. 2 (ПОСЛІДОВНОСТІ № 1-8), Фіг. З (ПОСЛІДОненими можуть бути не більше від одного до приВНОСТІ № 9-12) і Фіг. 5 (ПОСЛІДОВНОСТІ № 32близно десяти залишків Fc-ділянки. У такому разі, 37). Fc-ділянки, що містять одну або декілька амінокиВідповідно до певних варіантів здійснення, для слотних модифікацій (наприклад, замін), будуть одержання Fc-ділянки з поліпшеною ADCC активвідповідно до варіанта, якому віддається перевага, ністю, вихідний поліпептид, відповідно до варіанта, зберігати щонайменше приблизно 80%, відповідно якому віддається перевага, має попередньо існудо варіанта, якому віддається перевага, щонаймеючу ADCC активність (наприклад, вихідний поліпенше приблизно 90% і за варіантом, якому віддаптид містить Fc-ділянку людського IgG1 або людється найбільша перевага, щонайменше приблизського IgG3). Відповідно до певних варіантів но95% послідовності вихідної Fc-ділянки або здійснення, варіант із поліпшеною ADCC опосерелюдської Fc-ділянки з нативною послідовністю. дковує ADCC значно ефективніше за антитіло з Можна одержати також варіанти Fc-ділянки з Fc-ділянкою IgG1 або IgG3 з нативною послідовніамінокислотними вставками, де згадані варіанти стю (наприклад, варіанти P247L та І332Е). мають змінену ефекторну функцію. Наприклад, Відповідно до варіантів здійснення, яким відможна вставити щонайменше один амінокислотдається перевага, амінокислотну(-і) модифікацію(ний залишок (наприклад, від одного до двох аміноії) вводять на СН2 і/або СН3 доменах Fc-ділянки. кислотних залишків, а в загальній кількості, не біПридатні амінокислотні положення для модифікальше ніж десять залишків) на ділянці, прилеглій до ції з метою одержання варіанта Fc-ділянки IgG зі одного або декількох положень Fc-ділянки, які у зміненою ADCC активністю включають будь-яке цьому описі ідентифікуються як такі, що впливають одне або декілька з наведених амінокислотних на FcR зв'язування. "Прилегла" означає у межах положень: 247, 251, 256, 268, 269, 270, 272, 276, одного-двох амінокислотних залишків від залишку 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, Fc-ділянки, ідентифікованого у цьому описі. Такі 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 330, варіанти Fc-ділянки можуть демонструвати поси331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 360, лене або зменшене FcR зв'язування та/або ADCC 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439 або активність порівняно з вихідною молекулою. Для 440 Fc-ділянки. Відповідно до варіантів здійсненодержання таких інсерційних варіантів, можна ня, яким віддається перевага, вихідна Fc-ділянка, проаналізувати кокристалічну структуру поліпепзастосована як матриця для одержання таких ватиду, що містить зв'язувальну ділянку FcR (наприріантів, включає Fc-ділянку людського IgG. клад, позаклітинний домен необхідного FcR), і FcВідповідно до певних варіантів здійснення, цей ділянки, на яку повинен(-ні) вставлятись амінокисвинахід пропонує композиції, що містять варіант лотний(-і) залишок(-ки) (дивись, наприклад, роботи вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де згаСондерманн (Sondermann) та інші, Nature 406:267 даний варіант опосередковує антитілозалежну (2000); Дізенхофер (Deisenhofer), Biochemistry 20 клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у (9): 2361-2370 (1981); та Бурмейстер (Burmeister) присутності ефекторних клітин і містить щонаймета інші, Nature 342: 379-383, (1994), усі з яких нше одну амінокислотну модифікацію у положенні включені до цього опису шляхом посилання), для 247 на Fc-ділянці. Відповідно до певних варіантів раціонального конструювання варіанта Fc-ділянки здійснення, амінокислотною модифікацією є з, наприклад, поліпшеною FcR зв'язувальною здаP247L. Відповідно до інших варіантів здійснення, тністю. Відповідно до варіантів здійснення, яким амінокислотною модифікацією є Р247І або Р247Н. віддається перевага, таку(-і) вставку(-и) здійснюВідповідно до певних варіантів здійснення, цей ють на петлі Fc-ділянки, але не на вторинній струвинахід пропонує композиції, що містять варіант ктурі (тобто на β-ланцюзі) Fc-ділянки. вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де згаШляхом введення відповідних модифікацій даний варіант опосередковує антитілозалежну амінокислотних послідовностей до вихідної Fcклітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у ділянки можна одержати варіант Fc-ділянки, який присутності ефекторних клітин і містить щонайме(а) опосередковує антитілозалежну клітинноопонше одну амінокислотну модифікацію у положенні середковану цитотоксичність (ADCC) у присутності 251 на Fc-ділянці. Відповідно до певних варіантів людських ефекторних клітин більш або менш ефездійснення, згаданою амінокислотною модифікаціктивно та/або (b) опосередковує комплементзалеєю є L251F. жну цитотоксичність (CDC) у присутності людськоВідповідно до конкретних варіантів здійснення, го комплементу більш або менш ефективно і/або цей винахід пропонує композиції, що містять варіант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де (с) зв'язує Fc гамма-рецептор (FcgR) або Fcзгаданий варіант опосередковує антитілозалежну рецептор новонароджених (FcRn) із бажаною спо 57 86605 58 клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у здійснення, згаданою амінокислотною модифікаціприсутності ефекторних клітин і містить щонаймеєю є A378D. нше одну амінокислотну модифікацію у положенні Відповідно до конкретних варіантів здійснення, 256 на Fc-ділянці. Відповідно до певних варіантів цей винахід пропонує композиції, що містять варіздійснення, згаданою амінокислотною модифікаціант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де єю є Т256М або Т256Р. згаданий варіант опосередковує антитілозалежну Відповідно до конкретних варіантів здійснення, клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у цей винахід пропонує композиції, що містять варіприсутності ефекторних клітин і містить щонаймеант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де нше одну амінокислотну модифікацію у положенні згаданий варіант опосередковує антитілозалежну 440 на Fc-ділянці. Відповідно до певних варіантів клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у здійснення, згаданою амінокислотною модифікаціприсутності ефекторних клітин і містить щонаймеєю є S440Y. нше одну амінокислотну модифікацію у положенні Вищеописані варіанти поліпептидів можуть бу268 на Fc-ділянці. Відповідно до певних варіантів ти піддані додатковим модифікація у залежності здійснення, згаданою амінокислотною модифікацівід бажаного або гаданого застосування згаданого єю є H268D або Н268Е. поліпептиду. Такі модифікації можуть включати, Відповідно до конкретних варіантів здійснення, наприклад, додаткову зміну амінокислотної посліцей винахід пропонує композиції, що містять варідовності (заміна, інсерція та/або делеція амінокиант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де слотних залишків), модифікації вуглеводів, злиття згаданий варіант опосередковує антитілозалежну з гетерологічним(-и) полшептидом(-ами) та/або клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у ковалентні модифікації. Такі додаткові модифікації присутності ефекторних клітин і містить щонаймеможуть здійснюватись перед, одночасно з або нше одну амінокислотну модифікацію у положенні після амінокислотної модифікації(-ій), розкритої(280 на Fc-ділянці. Відповідно до певних варіантів их) вище, наслідком чого є зміна зв'язування Fcздійснення, згаданою амінокислотною модифікацірецептора та/або ADCC активності. єю є D280A або D280K. За альтернативним або додатковим варіанВідповідно до конкретних варіантів здійснення, том, корисним може виявитись комбінування аміцей винахід пропонує композиції, що містять варінокислотних модифікацій з однією або декількома ант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де додатковими амінокислотними модифікаціями, які згаданий варіант опосередковує антитілозалежну змінюють C1q зв'язування та/або функцію комплеклітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у ментзалежної цитотоксичності Fc-ділянки. Вихідприсутності ефекторних клітин і містить щонайменим поліпептидом, який у цьому разі становить нше одну амінокислотну модифікацію у положенні особливий інтерес, є поліпептид, який зв'язується 330 на Fc-ділянці. з C1q і демонструє комлементзалежну цитотоксиВідповідно до певних варіантів здійснення, чність (CDC). Амінокислотні заміни, опис яких назгаданою амінокислотною модифікацією є А330К ведено, можуть бути корисними для зміни здатноабо A330R. сті вихідного поліпептиду до зв'язування з C1q Відповідно до конкретних варіантів здійснення, та/або модифікування його функції комплементзацей винахід пропонує композиції, що містять варілежної цитотоксичності (наприклад, зменшення і, ант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згаданий варіант опосередковує антитілозалежну ліквідації цих ефекторних функцій). Однак цим клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у винаходом передбачаються поліпептиди, що місприсутності ефекторних клітин і містить щонайметять заміни у одному або декількох описаних понше одну амінокислотну модифікацію у положенні ложеннях із поліпшеним C1q зв'язуванням та/або 332 на Fc-ділянці. Відповідно до певних варіантів функцією комплементзалежної цитотоксичності здійснення, згаданою амінокислотною модифікаці(CDC). Наприклад, вихідний поліпептид може бути єю є I332D, І332Е, І332К або I332R. нездатним до зв'язування C1q та/або опосередкоВідповідно до конкретних варіантів здійснення, вування CDC і може бути модифікованим у відпоцей винахід пропонує композиції, що містять варівідності до наведених у цьому описі вказівок таким ант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де чином, що набуде ці додаткові ефекторні функції. згаданий варіант опосередковує антитілозалежну Більше того, поліпептиди з попередньо існуючою клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у C1q зв'язувальною активністю, які факультативно присутності ефекторних клітин і містить щонаймедодатково мають здатність до опосередковування нше одну амінокислотну модифікацію у положенні CDC, можуть бути модифіковані таким чином, що 339 на Fc-ділянці. Відповідно до певних варіантів одна або обидві згадані активності посилюються. здійснення, згаданою амінокислотною модифікаціАмінокислотні модифікації, які змінюють C1q єю є А339Т. та/або модифікують його функцію комплементзаВідповідно до конкретних варіантів здійснення, лежної цитотоксичності, описуються, наприклад, у цей винахід пропонує композиції, що містять варіWO 0042072, який включено до цього опису шляант вихідного поліпептиду, що має Fc-ділянку, де хом посилання. згаданий варіант опосередковує антитілозалежну Як розкрито вище, можна сконструювати Fcклітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у ділянку або її частину із зміненою ефекторною присутності ефекторних клітин і містить щонаймефункцією, наприклад, шляхом модифікування CDC нше одну амінокислотну модифікацію у положенні активності та/або ADCC активності. Наприклад, 378 на Fc-ділянці· Відповідно до певних варіантів можна одержати варіант Fc-ділянки з поліпшеною CDC активністю і поліпшеною ADCC активністю 59 86605 60 (наприклад, такий, що має як поліпшену ADCC неповерхневого залишку. Відповідно до додаткоактивність, так і поліпшену CDC активність). За вих варіантів здійснення, цей винахід включає ваальтернативним варіантом, у разі необхідності ріант вихідного поліпептиду, який має Fc-ділянку, зниження або ліквідації ефекторної функції, можна де згаданий варіант містить щонайменше одну сконструювати варіант Fc-ділянки зі зниженою поверхневу амінокислотну модифікацію і щонайCDC активністю та/або зниженою ADCC активнісменше одну неповерхневу амінокислотну модифітю. Відповідно до інших варіантів здійснення, мокацію. жна підвищити лише одну з цих активностей і фаIII. Варіанти комбінацій культативно також знизити іншу активність, Відповідно до певних варіантів здійснення, ванаприклад, одержати варіант Fc-ділянки з поліпріанти за цим винаходом містять дві або декілька шеною ADCC активністю, але зі зниженою CDC амінокислотних модифікацій (наприклад, замін). активністю і навпаки. На додаток до цього, можна Такі комбіновані варіанти можна одержати, наприсконструювати варіант Fc-ділянки з модифіковаклад, шляхом відбору двох або декількох докладною зв'язувальною спорідненістю до FcRn, білка А но описаних вище амінокислотних модифікацій. та/або інших Fc-зв'язувальних білків. Наведена нижче Таблиця 1 пропонує зразкові Амінокислотна заміна іншого типу корисна при комбінації двох або декількох амінокислотних зазміні схеми глікозилування поліпептиду. Цього мін. Наприклад, перший рядок Таблиці 1 показує можна досягти, наприклад, шляхом видалення можливі комбінації Р247Н з іншими амінокислотоднієї або декількох вуглеводних складових, які ними замінами у положеннях 251, 256, 268, 280, входять до складу поліпептиду, та/або додання 330, 332, 339, 378 і 440 (цей рядок, наприклад, одного або декількох сайтів глікозилування, яких показує комбінації двох, трьох, чотирьох, п'яти, поліпептид не має. За альтернативним варіантом, шести, семи, восьми, дев'яти і десяти амінокислоцього можна досягти опосередковано, шляхом тних модифікацій). заміни інших амінокислот, а не сайту глікозилування або шляхом конструювання клітин. Глікозилування поліпептидів є, як правило, N- або Озв'язаним. N-зв'язане глікозилування означає приєднання вуглеводної складової до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Пептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де X - будь-яка амінокислота окрім проліну, є розпізнавальними послідовностями для ферментного приєднання вуглеводної складової до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність будь-якої з цих пептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилування. О-зв'язане глікозилування означає приєднання одного з цукрів, N-ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози, до гідроксіамінокислоти, найчастіше до серину або треоніну, хоча використовуватись може також 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Додання сайтів глікозилування до поліпептиду традиційно здійснюється шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, щоб вона місВаріанти комбінацій, представлені у Таблиці 1, тила одну або декілька з вищеописаних трипептита інші варіанти комбінацій (наприклад, розкриті у дних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів WO 0042072) можуть перевірятись на дану активглікозилування). Зміна може також здійснюватись ність (наприклад, FcR зв'язувальна активність, шляхом додання (або заміни) одного або декількох ADCC активність і CDC активність) за допомогою залишків серину чи треоніну до послідовності вирізноманітних аналізів (дивись Розділ IV нижче). хідного поліпептиду (для О-зв'язаних сайтів глікоПодібним чином можуть бути ідентифіковані коризилування). Зразковий варіант глікозилування має сні варіанти комбінацій. амінокислотну заміну залишку Asn 297 важкого Відповідно до певних варіантів здійснення, ланцюга. яким віддається перевага, варіанти комбінацій за Відповідно до певних варіантів здійснення, цей цим винаходом мають одну амінокислотну модивинахід пропонує композиції, що містять варіант фікацію, яка підвищує ADCC активність, і одну вихідного поліпептиду, який має Fc-ділянку, де амінокислотну модифікацію, яка підвищує зв'язузгаданий варіант містить щонайменше одну аміновальну спорідненість Fc-рецептора новонароджекислотну модифікацію поверхневого залишку (диних (FcRn) (наприклад, при рН 6,0, але не при рН вись, наприклад, Дізенхофер (Deisenhofer), 7,0 або 7,4). Відповідно до інших варіантів здійсBiochemistry 28; 20 (9): 2361-2370, квітень 1981 p. нення, варіанти комбінацій за цим винаходом мата WO 0042072, обидві з яких включені до цього ють одну поверхневу амінокислотну модифікацію і опису шляхом посилання). Відповідно до інших одну неповерхневу амінокислотну модифікацію. варіантів здійснення, цей винахід пропонує компоДодаткові варіанти комбінацій можуть бути одерзиції, що містять варіант вихідного поліпептиду, жані шляхом комбінування двох або декількох аміякий має Fc-ділянку, де згаданий варіант містить нокислотних модифікацій, опис яких наводиться, щонайменше одну амінокислотну модифікацію або щонайменше однієї з амінокислотних модифі