Гепатозахисна та антиоксидантна активність штаму реліктових бактерій bacillus sp. f

Реферат: Винахід стосується використання штаму реліктових бактерій Bacillus sp. F як гепатозахисного та антиоксидантного засобу. UA 102047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біотехнологій, зокрема до промислових штамів мікроорганізмів, і отримання гепатопротекторних препаратів. Останніми роками спостерігається інтерес до вживання в медицині лікарських речовин рослинного походження. Цілющі властивості рослин були відкриті в результаті незліченних експериментів, що виконувалися мільйонами людей протягом тисячоліть. Встановлено, що природні речовини краще, ніж хімічно синтезовані, вписуються в обмін речовин організму і володіють мінімальною побічною дією. При цьому рекордною біологічною активністю володіють види рослин, що відносяться до реліктових форм життя (принцип Г.У. Ліхошерстних - "чим стародавніше - тим активніше"). Стародавні види виробили особливі захисні механізми, що дозволяють їм, врешті-решт, ставати абсолютно стійкими в еволюційному відношенні. Логічно тому вважати, що мікроорганізми, які збереглися до наших днів, саме бактерії, можуть стати активним продуцентом біологічно активної речовини і надалі - лікувальним засобом. Відомий штам бактерії Bacillus megaterium, призначений для деструкції фосфатоорганічних пестицидів (авт. свід. СРСР № 1735359, 1992 p.). Штам може виконувати важливу функцію очищення природних середовищ, але вузька направленість не дозволяє використовувати його як базу для виробництва лікарських засобів для людей і тварин. Відомий штам бактерій Bacillus mucilaginsous продукт біостимулятора неспецифічного імунітету телят (авт. свід. RU 1210452, 1996 р.). Недоліками зазначеного штаму є те, що він незадовільно росте в лабораторних умовах разом з низькою біологічною (ферментативною) активністю і складним технологічним процесом його отримання, який включає ультрафіолетове опромінення та заморожування у рідкому азоті. Відомі штами бактерій групи Bacillus subtilis (патенти UA 56348, 15.05.2003 та 80995, 26.11.2007), які одержані шляхом аналітичного селекціонування та виділені із ґрунтів відповідно, і які мають імуностимулюючу та протипухлинну активність. Відомий штам бактерії Bacillus subtilis P-1- переважно як продуцент протеази (патент RU 2208633, 2001 p.). Відомий також штам бактерій Bacillus macroides Excel 00, виділений з міцелію лікарського гриба Agaricus Blazei Murill, що проявляє імунну активність і здатність перешкоджати старінню і хворобам (заявка JP 2008-005702 А, 2008 p.). Основним недоліком вказаних штамів є тривалість процесу культивування і необхідність вирощування на дорогих живильних середовищах, що включають нестандартні і рідкісні харчові компоненти, а також нестабільність біологічних продуктів. Відомий штам бактерій Bacillus subtilis 1779 (прототип), по видовій подібності найближчий до штаму, що заявляється, виділений в природних умовах, проявляючий широкий спектр активності антагоніста, низьку адгезивну здатність, імуномодулюючу активність і продукуючий комплекс гідролітичних ферментів (патент RU 2298032, 2007 р.). Проте вузька сировинна база для штаму-прототипу, обмежений діапазон живильних середовищ для його культивування, відсутність даних про його гепатозахисні властивості і по фармакокінетиці в дослідженнях in vivo вимушують вести пошук інших штамів з більш високими споживчими характеристиками. В Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України 03 грудня 2010 р. задепоновано новий штам реліктової бактерії Bacillus sp. F (реєстровий номер Bacillus sp. ІMB В-7323), і в патенті UA96709, 2011 р. представлено технологію культивування штаму та його імуномодулюючі та геропрогекторні властивості. Гепатозахисні властивості не виявлені. В основу пропонованого винаходу поставлена задача застосування штаму реліктових бактерій Bacillus sp. F як гепатозахисного засобу. Для вирішення поставленої задачі пропонується застосування штаму реліктових бактерій Bacillus sp. F, задепонованого в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України, як гепатозахисного засобу. Штам виділений із стародавніх багаторічномерзлих порід верхньоплейстоценового віку в геологічному оголенні Мамонтової гори (Центральна Якутія). Штам являє собою слабо рухомі прямі палички із закругленими кінцями розмірами (11,2)×(3-10) мкм, по 1-2 ланцюжки і іноді до 7, ендоспори бацилярного типу, грампозитивний, психротолерантний, факультативний анаероб. На щільних живильних середовищах утворює непрозорі блискучі м'які колонії жовтуватого кольору. Зростання при температурі від +5 до + 43 °C і рН 5-12. Гепатозахисна активність штаму Bacillus sp. F вивчалась на моделях гострого та хронічного тетрахлорметанового гепатиту у щурів. 1 UA 102047 C2 5 Експериментальне пошкодження печінки викликали підшкірним введенням тетрахлорметану в дозі 0,2 мл/100 г протягом 60 діб. Як препарат порівняння вибрано еталонний гепатопротектор і антиоксидант силімарин під торговою маркою "Силібор" виробництва ФФ "Здоров'я" (Україна), табл. п/ο по 35 мг. Штам Bacillus sp. F у вигляді лізату та в дозі 1 мл/кг вводили внутрішньошлунково один раз на добу протягом 2 місяців. Результати дослідів наведено у таблиці. Показники 1 Виживаність, % Масовий коефіцієнт печінки, % АлАТ, мМ/год.×л Лужна фосфатаза, мккат/л Сечовина, мМ/л Загальний білок, г/л Холестерол, мМ/л Дієнові кон'югати, мкМ/г ТБК-АП, мкМ/г Відновлений глутатіон, мМ/г Каталаза, мккат/г Інтактний контроль 2 100 Контрольна патологія 3 70* Лізат Силібор 4 100** 5 90 2,8±0,2 5,9±0,3* 3,7±0,2*# 4,0±0,3*# 0,61±0,12 0,64±0,19 Сироватка крові 1,57±0,20* 1,43±0,21* 8,2±0,6* 51,0±2,1 * 1,62±0,21 3,26±0,30* Тканина печінки 8,3±0,7 14,7±1,2* 121,24±9,4 203,7±15,3 * 5,5±0,4# 62,7±1,0*# 1,22±0,25* 0,87±0,20# 32 4,2±0,3 68,3±1,6 ^ 0,73±0,14# 0,78±0,13# 6,7±0,5*# ^ 57,6±1,5*# ^ 2,19±0,11*# 9,1±0,7# ^ 141,8±10,1# 11,9±1,0* 180,9±12,2* 2,61±0,14*# ^ 0,46±0,02 0,28±0,03* 0,51±0,03# 0,47±0,03# 0,37±0,05 0,18±0,01* 0,34±0,04# 0,38±0,04# Примітки: 1. статистично значущі відмінності (р < 0,05): * - з групою інтактного контролю, # - з групою ^ контрольної патології, - з групою, лікованою силібором; 2. ТБК-АП - тіобарбітурової кислоти активні продукти. 10 15 20 25 30 Стан печінки визначали за наступними показниками: виживання тварин протягом досліду, масовий коефіцієнт печінки, рівень АлАТ, лужної фосфатази, вміст загального білка, сечовини, холестеролу у сироватці крові; рівень ТБК-Р, ДК, ВГ, каталази та глікогену в гомогенаті печінки; швидкість секреції жовчі, кількість жовчних кислот та холестеролу в жовчі. Як видно з таблиці, ураження печінки тетрахлоретаном супроводжувалося значним порушенням її функціонального стану. У щурів в групі контрольної патології спостерігалося збільшення МКП в 2 рази у порівнянні з групою інтактного контролю. Це свідчить про тяжку інтоксикацію і наявність запального процесу в тканині печінки, а також розвиток жирової дистрофії печінки під впливом тетрахлоретану [Гистология: учебник / под. ред. Э.Г. Улумбекова, Ю.А. Челышева.-2-е изд., перераб. и доп. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. 672 с.]. Достовірне підвищення активності АлАТ в гомогенаті печінки у 2 рази вказувало на розвиток цитолізу гепатоцитів. Поряд із цим відзначалося також підвищення активності ЛФ у сироватці крові в 2,3 рази, що обумовлено вивільненням ЛФ із ушкоджених гепатоцитів, а також з індуктивним її синтезом у жовчних канальцях. Дослідження в гомогенаті печінки вмісту продуктів ВРО показало збільшення рівня ДК в 1,8 разу й ТБК-Р в 1,7 рази. При цьому істотно постраждала антиоксидантна система - вміст ВГ зменшився в 1,7 разу, а каталази - в 2 рази. У результаті дії тетрахлорметану відбулося порушення вуглеводного обміну, а саме спостерігалося збідніння печінки тварин глікогеном в 2,4 разу в порівнянні з його вмістом у печінці інтактних тварин. Тетрахлорметанове пошкодження печінки також супроводжувалося пригніченням білково-синтетичної функції печінки. Вміст білка в сироватці крові вірогідно знизився в 1,4 рази. Тетрахлорметан викликав також пригнічення жовчоутворювальної функції печінки: показники швидкості секреції жовчі й вміст жовчних кислот значимо зменшувалися, відповідно в 2,5 й 1,5 рази. Спостерігалось також порушення обміну холестеролу - його рівень в жовчі знизився порівняно з інтактними тваринами в 1,6 рази, вміст холестеролу в сироватці крові збільшився в 2 рази. 2 UA 102047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До кінця експерименту 30 % тварин з групи контрольної патології загинуло, що сягає рівня статистично значущої відмінності з контролем (р