Штам bacillus licheniformis – продуцент комплексу ферментів з целюлозолітичною активністю

Реферат: Штам В. licheniformis IMB-7515 - продуцент комплексу ферментів з целюлозолітичною активністю. UA 102309 U (12) UA 102309 U UA 102309 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології та біотехнології, а саме до нового штаму мікроорганізмів Bacillus licheniformis, що продукує целюлозолітичні ферменти, та може використовуватися у сільському господарстві для переробки целюлозовмісних матеріалів, зокрема пожнивних залишків. Целюлоза являє собою полісахарид, що є головним компонентом клітинних стінок вищих рослин та водоростей. Целюлоза - це полімер, що складається з ланцюгів молекул β-D-глюкози, з'єднаних β-1,4-глікозидними зв'язками. Ланцюги, у свою чергу, об'єднані в пучки (волокна). Волокна організовані таким чином, що гідрофільні групи целюлозних ланцюгів захищені від зовнішніх впливів. Волокна, крім того, оточені оболонкою, до складу якої входять віск і пектин. Все це надає целюлозним волокнам механічну міцність, робить їх не розчинними у воді та стійкими до різних хімічних впливів. Розкладати целюлозу в анаеробних та аеробних умовах здатні еубактерії, що належать до різних таксономічних груп: окремі представники роду Clostridium, ряд актиноміцетів, міксобактерії, деякі бактерії роду Pseudomonas, корінеформні бактерії, що відносяться до роду Cellulomonas, постійні мешканці шлунка жуйних тварин, що відносяться до родів Ruminicoccus, Bacteroides, Butyrivibrio та інші. Усі ці мікроорганізми об'єднує здатність синтезувати ферменти, то розщеплюють целюлозу. Ферментативне розкладання целюлози здійснюється за допомогою целюлазного комплексу та складається з декількох етапів. Спочатку ендо-β-1,4-глюканаза розриває глікозидні зв'язки всередині целюлозного ланцюга, що призводить до утворення досить великих фрагментів з вільними кінцями. Потім екзо-β-1,4-глюканаза каталізує відщеплення від кінця ланцюга дисахариду целобіози. І, нарешті, остання гідролізується до глюкози за допомогою βглюкозидази. Розкладання целюлози в аеробних умовах призводить до подальшого метаболізму глюкози в системі катаболічних процесів з надходженням водню (електронів) в дихальний ланцюг і переносу їх на О2. Таким чином, целюлази (целюлолітичні ферменти) належать до класу гідролаз, що каталізують гідроліз 1,4-глікозидних зв'язків в молекулі целюлози з утворенням ряду олігосахаридів різного ступеня полімеризації аж до мономера глюкози. Розрізняють два основних типи целюлаз: ендоглюканази (1,4-глюкан-4-глюканогідролази, ендо-1,4-глюканаза) і целобіогідролази (1,4-D-глюкан-4-целобіогідролази, екзоцелобіогідролази), що відрізняються за характером дії на молекули целюлози і, як правило, діють спільно. Целюлази першого типу гідролізують зв'язки у молекулі целюлози та деяких її розчинних похідних (карбоксиметил-, гідроксіетилцелюлоза та ін.) невпорядкованим чином, утворюючи набір полі- та олігомерних фрагментів різної довжини. Вони каталізують також реакцію трансглікозилювання (приєднання частини розщеплюваної молекули полі- або олігосахариду до кінцевого невідновлювального ангідроглюкозного залишку полі- або олігомерної молекули субстрату). Целюлази другого типу гідролізують молекули целюлози, утворюючи майже виключно целобіозу, яку вони відщеплюють від невідновлювальних кінців полісахариду. Характерна властивість двох типів целюлаз - наявність синергізму при їх спільній дії на високовпорядковані форми целюлози (бавовняне волокно, мікрокристалічна целюлоза). Продуценти целюлозолітичних ферментів, які каталізують розщеплення целюлози, можуть використовуватися для біодеградації целюлозо- та геміцелюлозовмісних субстратів, у тому числі відходів промисловості та сільського господарства, для конверсії рослинної біомаси та одержання цукрів та біоетанолу, для деструкції живих та мертвих клітинних стінок рослин, для гідролізу полісахаридів, відмінних від крохмалю, у харчовій промисловості, пивоварінні та при силосуванні кормів для збагачення їх доступними формами вуглеводів. Особливо перспективним зараз вважається застосування штамів, що синтезують целюлозолітичні ферменти, для утилізації пожнивних залишків, які передбачають більш повне їх залучення в біологічний кругообіг. Такі штами дозволяють прискорити процес деструкції та гуміфікації різноманітних органічних речовин, зокрема целюлози. У патенті UA62219 (опубл. 25.08.2011) описується штам Cellulomonas sp. 3-1 IMB В-7303, який призначений для деструкції целюлози паперу. Основною особливістю штаму є його висока активність щодо розкладання целюлози в присутності жирів та білків. Одним з недоліків вказаного штаму є те, що він в основному є ефективним для розкладання паперу при очищенні промислових та побутових стічних вод та є непридатним для осінньої та весняної обробки ґрунту з метою ферментації рослинних залишків зібраного врожаю. Патент UА95427 (опубл. 25.12.2014) описує штам гриба Chaetomium globosum IMB F100063, призначений для одержання комплексу целюлаз з метою розкладання рослинних решток та підвищення урожайності сільськогосподарських культур. У лабораторному досліді 1 UA 102309 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вивчали здатність гриба розкладати солому озимої пшениці. Ефективність деструкції за результатами лабораторного експерименту складала 31,5 %. Проте представники С. globosum являють собою алергени для людини та можуть виступати як опортуністичні агенти нігтьового панарицею та неврологічних інфекцій. З патенту RU2287571 (опубл. 20.11.2006) є відомими штам міцеліального гриба Trichoderma longibrachiatum BKM F-3865D, що є продуцентом комплексу карбогідраз, що містить целюлази, бета-глюканази, ксиланази, манази та пектинази. Даний винахід є вибраним як прототип заявленої корисної моделі. Проте ефективність вказаного штаму знижується при високих температурах, крім того, значний вплив на активність штаму виявляє також значення рН. Крім того, використання мікроорганізмів роду Trichoderma є обмеженим їх властивістю спороносити у культурі, що може призвести до забруднення навколишнього середовища та створювати загрозу для споживача такої продукції. Задача даної корисної моделі полягає у створенні штаму-продуцента ферментів з целюлозолітичною активністю, який є термостабільним та стійким у широкому діапазоні значень рН. Вказана задача вирішується за рахунок одержання нового штаму Bacillus licheniformis IMB В7515, який є продуцентом комплексу ферментів з целюлозолітичною активністю. Штам Bacillus licheniformis IMB В-7515 ізольований із шлунково-кишкового тракту морської свинки та класифікований у відповідності з Берджі (Определитель бактерий Берджи, 9-ое изд., М.: Мир, 1980). Штам отримують шляхом посіву на поживні середовища: МПА, ТСА, сусло-агар, Гаузе № 2, КА та інші. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні властивості заявленого штама: штам представлений грампозитивними аеробними спороутворювальними паличками, які продукують каталазу. На МПА, сусло-агарі, картопляному агарі спостерігається значний ріст. На МПА утворює складчасті колонії в'язкої консистенції, бежевого кольору, краї неправильної форми. На середовищі Гаузе 2 - колонії бежевого кольору, блискучі, в'язкої консистенції, краї рівні. В мазках з колоній, які виросли на МПА, через 18 годин можна побачити прямі паличковидні клітини 1,9 × 0,5 мкм, які розташовані поодиноко, попарно та зрідка ланцюгом. Клітина при спороутворенні не роздувається, після росту на глюкозному агарі в протоплазмі вакуолі не утворюються. На МПБ культура утворює плівку. Ферментує глюкозу, арабінозу, манніт, ксилозу з утворенням кислоти, дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера, гідролізує крохмаль, желатину, росте при 7 % NaCl, утилізує цитрат, не використовує пропіонат. Продукт, що синтезується штамом, являє собою комплекс гідролітичних ферментів, що здатні розщеплювати целюлозовмісні рослинні рештки. В лабораторних умовах штам Bacillus licheniformis IMB В-7515 здатний розщеплювати рослинні рештки на 20-60 % в залежності від їх типу. Умови культивування: культивується на таких середовищах, як сусло-агар, МПА, середовище Громико, картопляний агар. Спосіб визначення: штам культивується на мінеральному середовищі з доданням пожнивних залишків (1-2 %) як єдиного джерела карбону. Після закінчення культивування (10-12 діб) визначають зменшення маси рослинних решток на 15-20 % для соломи пшениці, 40-60 для кукурудзи та соняшника. Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового культивування штаму: штам зберігається на сусло-агарі, середовищі Громико (МПА+СА), агаризованому середовищі Гаузе № 2 під шаром стерильного вазелінового масла. Пересівання здійснюють 1 раз на рік. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму: розмноження можна проводити на середовищах аналогічного складу. Відомості про патогенність: штам не патогенний для теплокровних тварин. Приклад 1. Вирощування штаму Bacillus licheniformis 1MB В-7515 Культивування бактерій Bacillus licheniformis IMB В-7515 здійснювали в колбах місткістю 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 37 °C, рН 5,0-9,0 (оптимальне значення рН 6,0-8,0) упродовж 18-36 год. на рідкому мінеральному середовищі наступного складу (г/л): K2НРО4-6,0; KН2РО4-2,0; MgSO4×7Н2О - 0,2, (NH4)2SO4-1,15. Як джерело вуглецю та енергії використовували глюкозу (10 г/л), натрієвусіль карбоксиметилцелюлози (Na-КМЦ) 0,5 %, фільтрувальний папір 1 %, бавовняну вату 1 %, целобіозу 1 %, пшеничну солому 1 %, соняшник 1 % та кукурудзу 1 % (мас). Як посівний матеріал використовували добову культуру вказаного штаму, вирощену на МПА, а також культуру в експоненціальній фазі росту, вирощену на 2 UA 102309 U 5 10 15 20 25 середовищі, яке має приведений вище склад. Як джерело вуглецю і енергії при одержанні посівного матеріалу використовували глюкозу. Посівний матеріал вносили з розрахунку 5 об. % мікробної суспензії, оптична густина якої становила 10 од. за стандартом мутності ДІСК ім. Л.А. Тарасевича. Приклад 2. Дослідження целюлозолітичної активності штаму Bacillus licheniformis IMB В-7515 при різних температурах та значеннях рН. Ферментативну активність Bacillus licheniformis IMB В-7515 в умовах глибинного культивування визначали в безклітинних центрифугатах культуральних рідин після вирощування на синтетичному середовищі з заміною глюкози на відповідний субстрат-індуктор. Для індукції синтезу целюлозолітичних ферментів використовували як целюлозу та її похідні (Na-КМЦ, бавовняна вата, фільтрувальний папір, целобіоза), так і целюлозовмісні рослинні рештки (пшенична солома, кукурудза, соняшник). Активність ферментів вивчали за дією на субстрат (Na-КМЦ, фільтрувальний папір, бавовняна вата, целобіоза, ксилан, пектин) в реакційній суміші при 50 °C протягом 1 год. Реакційна суміш містила 2,5 мл розчину субстрату в фосфатному буфері (рН 8,0) та 1 мл ферментного розчину (у вигляді супернатанту). Супернатант отримували шляхом центрифугування (6000 об/хв упродовж 20 хв) культуральної рідини досліджуваного штаму. За одиницю активності ферментів приймали таку кількість ферменту, яка каталізувала утворення 1 мг глюкози та ксилози в інкубаційній суміші за 1 год. при 50 °C. Редукуючі речовини визначали модифікованим методом Шомоді-Нельсона. Для визначення ендоглюканазної (КМЦазної) активності застосовували спосіб, що базується на збільшенні редукуючої здатності реакційної суміші з 0,5 % Na-КМЦ. Екзоглюканазну активність вимірювали за кількістю редукуючих цукрів, що утворювались при гідролізі бавовняної ваги та фільтрувального паперу, відповідно. Целобіазну активність визначали за збільшенням редукуючої здатності реакційної суміші з 0,2 % розчином целобіози у 1/15 М фосфатному буфері. Реакційна суміш складалася з 2 мл відповідного субстрату в буфері та 1 мл розчину ферменту (культуральної рідини). Дані стосовно ферментативної активності запропонованого штаму в інтервалі значень рН від 4 до 9 приведені у Таблиці 1. У досліді також визначали ферментативну активність запропонованого штаму за високих температур (дані представлені у Таблиці 2). 30 Таблиця 1 Активність целюлозолітичних ферментів В. licheniformis IMB-7515 при різних значеннях рН рН середовища 4 5 6 7 8 9 Ендоглюканазна активність, од./мг В. licheniformis IMB-7515 0,06 0,23 0,27 0,27 0,29 0,25 Целобіазна активність, Екзоглюканазна активність од./мг В. licheniformis од./мг В. licheniformis IMBIMB-7515 7515 0,03 0,06 1,11 0,35 1,27 0,35 1,27 0,35 0,91 0,35 н/в 0,15 Таблиця 2 Активність целюлозолітичних ферментів В. licheniformis IMB-7515 за високих значень температури середовища Температура середовища, °C 30 40 50 60 35 Ендоглюканазна активність, од./мг В. licheniformis IMB-7515 0,0205 0,23 0,27 0,23 Целобіазна активність, Екзоглюканазна активність од./мг В. licheniformis од./мг В. licheniformis IMBIMB-7515 7515 0,84 0,02 1,13 0,22 1,3 0,29 0,55 0,11 Як видно з даних, приведених у Таблиці 1, стабільне значення активності комплексу целюлазних ферментів спостерігали у досить широкому інтервалі рН від 5 до 8 (а для ендоглюканазної активності навіть до рН 9,0). Як випливає з Таблиці 2, оптимальні значення 3 UA 102309 U 5 10 15 20 25 30 ферментативної активності спостерігається в межах температури середовища 40-50 °C. Проте здатність синтезувати целюлази різних класів зберігається в діапазоні температур від 30 до 60 °C. Таким чином, запропонований штам є термостабільним та демонструє ефективність в межах широкого діапазону значень рН. Приклад 3. Дослідження розкладання целюлозовмісних решток штамом В. licheniformis IMB7515 При дослідженні ступеню розкладання целюлозовмісних субстратів при використанні запропонованого штаму замість глюкози в синтетичне поживне середовище вносили поживні залишки із розрахунку 1 г абсолютно сухої маси целюлозовмісного субстрату на 100 мл поживного середовища. Після 14 діб культивування залишки целюлозовмісного субстрату відокремлювали від культуральної рідини, висушували та розраховували відсоток його розкладання за формулою:  A  A1    100 , A  1  0  A0    де A 0 - початкова вага субстрату; A1 - кінцева вага субстрату. Як пожнивні залишки у досліді використовували пшеничну солому, соняшникове та кукурудзяне бадилля, оскільки дані культури є основними продуцентами пожнивних решток в нашій країні та значно відрізняються один від одного полісахаридним складом. Так, до складу пшеничної соломи входять значні кількості целюлози та лігніну, соняшника - пектинових речовин, кукурудзяного бадилля - геміцелюлози. У досліді використовували різні джерела азотного живлення (сечовина та NH 4NO3). Було встановлено, що штам В. licheniformis IMB-7515 здатний до деструкції пшеничної соломи на рівні 10-24 %, соняшника - 37-38 % і кукурудзи - на рівні 21-42 % у залежності від типу використаного джерела азотного живлення. Дані експерименту приведені на Фіг. 1. Відомо, що на ефективність розкладання рослинних решток значно впливає кількісний вміст целюлозовмісних решток. Тому, нами було досліджено ефективність розкладання пожнивних залишків при їх різному вмісті в середовищі культивування (1 мас. % та 2 мас. %). Дані експерименту є приведеними на Фіг. 2. Як видно з приведених даних, штам В. licheniformis IMB-7515 є продуцентом ферментів з целюлозолітичною активністю, що розщеплюють пожнивні рослинні рештки різного походження. Вказаний штам може використовуватися у сільському господарстві для деструкції целюлозовмісних матеріалів з високою ефективністю. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Штам В. licheniformis IMB-7515 - продуцент комплексу ферментів з целюлозолітичною активністю. 4 UA 102309 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5