Штам streptomyces albus – продуцент комплексу літичних ферментів

Реферат: Винахід належить до біотехнологічної промисловості. Штам Streptomyces albus UN 44 продукує комплекс літичних ферментів, депонований під реєстраційним номером Streptomyces albus IMB Ас-5030 і має високу літичну активність. UA 109478 C2 (12) UA 109478 C2 UA 109478 C2 5 10 15 20 25 Винахід належить до біотехнологічної промисловості, а саме до культури роду Streptomyces виду Streptomyces albus, і може бути використаний при отриманні нового штаму, що має літичну активність. Найбільш близьким є штам Streptomyces recifensis var. lyticus (реіндентифікований як Streptomyces albus) IMB Ac-5001, продукуючий комплекс літичних ферментів (UA, патент України на винахід № 34119, опубліковано 15.02.2001). Відомий штам дозволяє здійснювати біосинтез ферментного комплексу, який використовується як субстанція для виділення клітинних структур та для отримання ферментних препаратів, що застосовуються в різних галузях промисловості і медицині як антисептик побутового, ветеринарного, косметичного, медичного та промислового призначення. Однак, при зберіганні активність штаму Streptomyces recifensis var. lyticus IMB Ac-5001 як продуцента знизилась і сьогодні літична активність культуральної рідини становить не більш як 6000 од/мл. Задачею винаходу є створення нового штаму Streptomyces albus, що має високу літичну активність. Поставлена задача вирішується штамом Streptomyces albus UN 44 - продуцент комплексу літичних ферментів, депонованим в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером Streptomyces albus IMB Ас-5030. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні ознаки культури. Штам Streptomyces albus UN 44 одержують в результаті ступінчастого індукованого мутагенезу при послідовній обробці суспензії спор вихідної культури штаму Streptomyces 2 recifensis var. lyticus IMB Ac-5001 ультрафіолетовим випромінюванням в дозі 240 Дж/м та азотистою кислотою (0,5 М NaNO2) протягом 50 хвилин. Вирощування здійснюють при температурі 28±1 °C та перемішуванні при швидкості до 220 об/хв. впродовж 48-72 годин на рідкому середовищі Чапека або іншому середовищі. Оптимальне рН середовища 6,5±1. Характер росту штаму Streptomyces albus UN 44 на різних середовищах та морфологія органів плодоношення показані у Таблиці. Таблиця Морфологія органів плодоношення штаму Streptomyces albus UN 44 при вирощуванні на різних середовищах Середовище культивування Характер росту Повітряний Субстратний Розчинний Форма міцелій міцелій пігмент спороносців Агар Чапека задовільний блідо-білий безбарвний немає прямі чи трохи хвилясті Вівсяний агар дуже добрий білий безбарвний немає прямі чи трохи хвилясті Мінеральний агар Гаузе добрий білий безбарвний немає прямі чи трохи хвилясті Органічний агар Гаузе дуже добрий білий до кремового безбарвний немає прямі чи трохи хвилясті Глюкозосвітло-сірий аспарагіновий задовільний з безбарвний агар жовтуватим немає прямі чи трохи хвилясті немає прямі чи трохи хвилясті Сусло-агар добрий світлокавовий безбарвний 1 Форма спор та спосіб утворення овальні гладкі, утворюються шляхом фрагментації овальні гладкі, утворюються шляхом фрагментації овальні гладкі, утворюються шляхом фрагментації овальні гладкі, утворюються шляхом фрагментації овальні гладкі, утворюються шляхом фрагментації овальні гладкі, утворюються шляхом фрагментації UA 109478 C2 5 10 15 20 25 30 35 Наприкінці вирощування в середовищі утворюється непрозора густа міцеліальна маса жовтувато-оливкового кольору з легким запахом дусту. Клітини штаму формуються у вигляді гіф діаметром 0,7-0,9 мкм. Як зазначено у Таблиці, спороносці короткі трохи хвилясті, мало розгалужені. Спори овальні, гладкі, утворюються шляхом фрагментації. Забарвлення повітряного міцелію коливається від білого до світлокавового, субстратний міцелій майже безбарвний. Добре розвинутий повітряний міцелій утворюється на більшості вказаних у Таблиці середовищах. Штам Streptomyces albus UN 44 ідентифікували за результатами генетичного аналізу, морфології та фізіолого-біохімічних ознак батьківського та отриманого штаму. Для короткострокового зберігання (до 2-х місяців) штам Streptomyces albus UN 44 підтримується на середовищі агар Гаузе органічний або середовищі Чапека при температурі 4 °C. Довготривале зберігання штаму Streptomyces albus UN 44 можливе у вигляді ліофілізованої спорової суспензії, запаяної у ампулах при температурі 4 °C. Захисне середовище під час висушування - глюкоза. Штам Streptomyces albus UN 44 на 3-4 добу продукує комплекс літичних ферментів - Цитал, з широким спектром бактеріолітичної активності щодо грампозитивних та частини грамнегативних мікроорганізмів. Ферментний комплекс Цитал характеризується термостійкістю в межах 60-65 °C, активність виявляється в діапазоні 37-60 °C. До складу ферментного комплексу входять ферменти різної специфічності - протеїнази, пептидази, мурамідази, ацетил глюкозамінідази. Крім того, штам Streptomyces albus UN 44 здатен розріджувати желатин, створоджувати молоко, відновлювати нітрати в нітрити. Не виявляє тирозиназної активності. Для росту штам Streptomyces albus UN 44 здатен використовувати: глюкозу, галактозу, фруктозу, ксилозу, арабінозу, мальтозу, маніт. Слабко використовує: лактозу, дульцит, інозит, сахарозу, рамнозу. Не зброджує: сорбіт. Літичну активність (ЛА) субстанції (у од/г) або культуральної рідини (фугату, у од./мл) визначали за здатністю до лізису суспензій тест-культур. За одиницю ЛА приймають кількість ферменту, яка знижує оптичну густину суспензії тест-культури на 0,001 за 1 хв. в 1 мл реакційної суміші, при розведенні ферменту (або культуральної рідини), що забезпечує лізис суспензії на 25-30 %. Визначення проводять турбідиметричним методом у наступній модифікації: до 4 мл суспензії тест-культури (оптичною густиною 0,7-0,8 ОД при λ=540 нм) додають 0,02-0,2 мл фугату культуральної рідини (в залежності від тест-культури) та інкубують впродовж 10-50 хв. при 50 °C. У контроль додають 0,02-0,2 мл дистильованої води та інкубують у таких самих умовах. Літичну активність (ЛА) розраховують за формулою: ЛА  40 ОГ вих  ОГ кін  С  N , од./мл, 0,001  де: ОГ вих - оптична густина суспензії до інкубації; ОГ кін - оптична густина суспензії після інкубації; С - коефіцієнт автолізу (відношення ОГ вих / ОГ кін контролю); 45 50 N - розведення проби в реакційній суміші, раз;  - час інкубації, хв.; 0,001 - коефіцієнт перерахунку на одиницю активності. Оптичну густину визначають на фотометрі КФК-3 при λ=540 нм у кюветі 0,5 см на фоні дистильованої води. Розведення проби в реакційній суміші N визначається за формулою: N  Vсусп  Vпроб  / Vпроб , де Vсусп - об'єм клітинної суспензії, мл; Vпроб - об'єм проби ферментного розчину у реакційній суміші, мл. 55 При визначенні ЛА сухого субстанції ферменту в реакційну суміш вносять замість культуральної рідини розчин ферменту у концентрації, що викликає 25-30 % зниження оптичної густини клітинної суспензії, враховуючи розведення ферменту у формулі розрахунку. Генетичні та інші особливості штаму. Штам є мутантом. Стійкість до антибіотиків та ауксотрофність не вивчалися. 2 UA 109478 C2 5 10 15 20 Приклад Вихідну культуру штаму Streptomyces albus UN 44, вирощену на поживному середовищі: глюкоза - 6,0; соєве борошно дезодороване - 8,0; NaCl - 14,0; K2НРО4×3Н2О - 2,0; СаСl2 - 4,5; MgSO4×7H2O - 5,8; МnСl2×4 Н2О - 0,04; пропінол Б-400 0,014 л; рН 7,8-8,2, вносять до поживного середовища для біосинтезу комплексу літичних ферментів штамом Streptomyces albus UN 44 у ферментаторі. Склад поживного середовища для біосинтезу: соєве борошно - 8,0; крохмаль картопляний гідролізований - 10,0; NaCl - 14,0; K2НРО4×3Н2О - 2,0; MgCl2 - 2,2; CaCl2 - 2,0; MnCl2×4H2O - 0,04; пропінол Б - 400; pH 7,8-8,2. Культуру вирощували при температурі 28 °C та перемішуванні при швидкості 220 об/хв. впродовж 3 діб у ферментері (V=1000 л, при аерації 0,4×Vпов/Vсер, Vпов - об'єм повітря, Vcep - об'єм середовища). Відділяють біомасу центрифугуванням. У фугаті культуральної рідини виділений комплекс ферментів Цитал, до складу якого входять: протеїнази, пептидази, мурамідази, ацетилглюкозамінідази. Літична активність культуральної рідини становить 10000 од/мл, концентрація білка - 2,0 мг/мл. Отриманий фугат культуральної рідини придатний для одержання субстанції для наукових цілей та для отримання антисептичних ферментних препаратів побутового, ветеринарного, косметичного, медичного та промислового призначення. Таким чином, запропонований Streptomyces albus UN 44 є продуцентом комплексу ферментів Цитал і має високу літичну активність. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Штам Streptomyces albus - продуцент комплексу літичних ферментів, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером Streptomyces albus IMB Ас-5030. 25 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3