Лікарський засіб з імунотропною активністю

Реферат: Лікарський засіб з імунотропною активністю містить екстракт з лікарських рослин. Як екстракт лікарських рослин використовують густий екстракт листя персика звичайного на 30 % спирті етиловому при співвідношенні сировини до екстрагенту 1:10. UA 103001 U (12) UA 103001 U UA 103001 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до хіміко-фармацевтичної галузі, а саме до фармакології, і стосується розробки засобів рослинного походження на основі біологічно-активних речовин з листя персика звичайного, що мають імунотропну і антиоксидантну активність. Для профілактики та комплексного лікування хронічних і уповільнених захворювань, що превалюють в останні десятиліття у багатьох країнах, перспективними є пошук і розробка нових ефективних і малотоксичних лікарських засобів. Кількість імунокорегуючих препаратів дуже велика на даний момент, однак широке застосування синтетичних імуномодуляторів обмежене через наявність у них великої кількості побічних ефектів. В даний час все більше уваги дослідниками приділяється імунотропним препаратам рослинного походження, які завдяки наявності в них комплексу біологічно активних речовин м'яко впливають на організм, не викликають звикання і можуть застосовуватися в осіб з поєднаними патологіями. Інтерес також представляють біологічно-активні речовини з листя персика звичайного. Відомий імунотропний ліпосомальний препарат "Ковісцин" (пат. UA № 95901, А61К35/06. 12.01.2015, бюл. № 1), який містить вітаміни A, D3, Е, незамінну амінокислоту аргінін мікроелемент цинк, а також дистильовану воду, фосфоліпідний емульгатор в олії, селен та кобальт. Відомий імуномодулюючий препарат (пат. UA № 92914, А23В 7/024, 10.09.2014, бюл. № 17), містить вітаміни A, D3, Е, амінокислоту аргінін, мікроелемент цинк, а також дистильовану воду, фосфоліпідний емульгатор в олії, додатково містить селен. Недоліком існуючих препаратів є те, що це ветеринарні препарати, та в них короткотривала терапевтична дія і недостатня ефективність у місці введення. Відомий імунотропний препарат (пат. RU № 2132689, А61К 35/64, 10.07.1999), що включає екстракт рослин родини айстрові, що містить 3-окси-флавон-силібін 98-25 мас. %, монофлерний мед, який містить 3-окси-флавон-силібін 35-1 мас. % і флавоноїдну фракцію березового прополісу. Також відомі засоби, які мають протизапальну, антиоксидантну дію, на основі водних очищених концентрованих екстрактів з рослини очанки (патент RU №2308961), спиртової настоянки меліси (патент RU №2275931). Існує засіб (пат. RU № 2 496 508, А61К 36/004, 10.06.2013 Бюл. № 16). що має імунотропну та антиоксидантну активністю, який отримано шляхом екстрагування насіння Лотоса горіхоносного (Nelumbo nucifera) 50 %-ним етиловим спиртом, при певному співвідношенні компонентів. Вищеописаний засіб має виражену імунотропну і антиоксидантну дію. Недоліками препарату є його неефективність при лікуванні пухлинних хворих. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення лікарського засобу з імунотропною активністю шляхом використання екстракту з лікарських рослин щоб забезпечити імунотропну активність, тобто підвищувати загальну резистентність організму, прискорювати процеси регенерації стала підставою для їх широкого застосування в комплексній терапії імунодефіцитних станів, інфекційних та інфекційно-запальних захворювань, при в'ялому перебігу регенераційних процесів, для покращання імунного стану в онкологічних хворих при цитостатичній терапії. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому лікарському засобі з імунотропною активністю, що містить екстракт з лікарських рослин, згідно корисної моделі як екстракт лікарських рослин використовують густий екстракт листя персика звичайного на 30 % спирті етиловому при співвідношенні сировини до екстрагенту 1:10. Листя персика звичайного (Persica vulguris mill) містять органічні кислоти, танін, каротиноїди і флавоноїди, в тому числі нарингенин, персикозид. Каротиноїди підвищують загальну опірність організму, сприяють регенерації тканин, інтенсифікують процес загоєння ран, стимулюють роботу імунної системи. Органічні кислоти з флавоноїдами мають антисептичну, бактерицидну і протизапальну дію, знижують інтоксикацію організму, заспокоюють біль, зменшують запальні процеси. Нарингенин і персикозид надають як пряму дію на пухлинні клітини, так і опосередковану. Танін володіє капілярозміцнюючою, кровоспинною дією. Експериментальним шляхом встановлено, що ефективним при здійсненні заявленої корисної моделі є використання співвідношення сировини до екстрагенту як 1:10-1:12. При цьому, якщо співвідношення менше 1:10, не забезпечується достатня екстракція БАР. що приводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Навпаки, якщо співвідношення більше 1:12, це веде до ускладнення та подовження технологічного процесу, час упарювання та енерговитрати значно зростають. Оптимальне співвідношення 1:101:12 тричі тому, що забезпечується достатня екстракція БАР, час упарювання мінімальний, це дозволяє отримувати екстракт на стандартному обладнані без додаткового перезавантаження первинної сировини. 1 UA 103001 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Спосіб отримання густого екстракту листя персика звичайного полягає в наступному. Сировину, у вигляді сухого листя персика подрібнюють. Далі подрібнене листя екстрагують 30 % розчином етанолу при співвідношенні сировина:екстрагент 1:10, та настоювали протягом 2 годин при 80 °C, екстракцію повторювали тричі з новою порцією екстрагенту. Одержаний екстракт фільтрують, упарюють до 1/20-1/22 попереднього об'єму при температурі 85 °C під вакуумом у вакуум-циркуляційному апараті при розрідженні 690 мм рт.ст. до об'єму водного залишку 1 л, з подальшим відстоюванням на 2 доби у холодильнику, що забезпечує осадження механічних включень та гідрофобних речовин. Відстоювання в холодильнику також запобігає прокисанню водного екстракту. При більшому упарюванні залишок має більшу в'язкість та зменшується його текучість, що ускладнює роботу з екстрактом та збільшує його втрати в процесі виробництва. При меншому упарюванні значно подовжується процес сушки, та збільшуються енерговитрати. Одержаний після упарювання екстракт стерилізують будь-яким зручним у промислових умовах способом, наприклад в автоклаві при 120 °C протягом 3 годин. Стерилізація забезпечує усунення мікробної контамінації та спор мікроорганізмів, що підвищує якість продукту, безпечність при його застосуванні та збільшує строк збереження. Стерилізований екстракт сушать, наприклад, в вакуум-розпилювальному апараті при температурі на вході 160 °C та на виході 80-90 °C, до густого екстракту. Вихід готового продукту - 18,2 %. Одержаний густий екстракт - в'язка маса від світло-коричневого до коричневого кольору, зі специфічним запахом. Колір залежить від якості сировини та умов сушки. Отриманий готовий екстракт містить не менше ніж: 10 % поліфенольних сполук в перерахунку на галову кислоту; 7 % гідроксикоричних кислот в перерахунку на хлорогенову кислоту; 5 % флавоноїдних сполук в перерахунку на рутин. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. 1 кг подрібненого шляхом вальцювання до розмірів часток 2,5-3,0 мм сухого листя персика звичайного заливали 10 л 30 % розчину етанолу та настоювали протягом 2 годин при 80 °C, екстракцію повторювали тричі з новою порцією екстрагенту. Одержані спиртові (26,95 л) витяги упарювали при температурі 85 °C під вакуумом у вакуум-циркуляційному апараті при розрідженні 690 мм рт.ст. до об'єму водного залишку 1 л. Кубовий залишок являв собою густу прозору темно-коричневу рідину, яку залишали для відстоювання на 2 доби в холодильнику. Відокремлену надосадову рідину стерилізували та сушили у вакуум-циркуляційному апараті при розрідженні 690 мм рт.ст. до густого екстракту. Вихід готового продукту - 18,2 %. Приклад 2. Вивчення імунотропної активності. Для аналізу використовували 20 мг густого екстракту персика, який розчиняли у 10 мл (2 мг/мл - більша доза) або 50 мл (0,4 мг/мл - менша доза) розчину Хенкса без індикаторів і стерилізували пропусканням крізь фільтр Мillіроге. Тест-зразки зберігали при t 40 °C у холодильнику не більше 3-х суток. Для визначення впливу тест-зразків з екстрактом персика на життєздатність імунокомпетентних клітин у дослідах in vitro використовували клітини глоткової мигдалини дітей, отримані після операції аденотомії. Клітини отримували у відповідності до методичних рекомендацій (Мельников О.Ф., 1981), культивували у живильному середовищу 199 з вмістом глутаміна 290 мкг/мл і гентаміцина 40 мкг/мл. У пробі з трипановим синім розраховували відносне число загиблих клітин (виражене у %) до початку інкубації (1 година при t 370 °C) і після інкубації. Поставлено 5 серій дослідів. Екстракт з листя персика звичайного виявляє імуномоделюючу дію (табл. 1). 2 UA 103001 U Таблиця 1 Вплив різних доз густого екстракту персика на життєздатність імунокомпетентних клітин мигдалин Контроль № серії досліду Серія 1 Серія 2 Серія 3 Серія 4 Серія 5 6-11 11-13 6-12 8-11 9-14 Екстракт персика Екстракт персика 2 мг/мл 0,4 мг/мл Кількість загиблих, клітин, % 7-13 6-11 10-15 10-12 6-16 6-12 7-14 8-10 9-17 9-15 Примітки: перша цифра позначає відносне число клітин. (%), пофарбованих у синій колір, друга - після нього. 5 Приклад 3. Вплив тест-зразків з густим екстрактом персика на вміст імуноглобулінів IgA вивчали методом радіальної імунодифузії в гелі. Для цього 0,1 мл тест-зразків змішували з 0,1 мл стандартної сироватки людини, що містила в 1 мл 2 г/л IgA, після чого інкубували в стерильних умовах протягом 16-и годин. У першій контрольній пробі замість тест-зразків з густим екстрактом персика застосовували еквівалентну кількість розчину глюкози, у другій контрольній пробі використали розчин Хенкса. Імуностимулююча активність екстракту персика більш виражена в низькій концентрації 0.4 мг / мл, ніж в високій - 2 мг / мл (табл. 2). 10 Таблиця 2 Вміст імуноглобуліну IgA після інкубації з різними концентраціями екстракту персика густого, г/мл № серії Контроль 1 досліду (розчин глюкози) Серія 1 Серія 2 Серія 3 Серія 4 Серія 5 15 20 0,90 0,95 0,88 0,90 0,95 Контроль 2 (розчин Хенкса) Екстракт персика густий 2мг/мл 0,80 0,76 0,78 0,90 0,87 0,75 0,72 0,80 0,70 0,85 Екстракт персика густий 0,4 мг/мл 1,00 1,00 0,95 0,90 0,95 Приклад 4. Вплив тест зразків з екстрактом персика густим на експресію поверхневих антигенів за кластерами диференціації (CD) вивчали після інкубації еритроцитів з екстрактом персика в концентрації 0,4 мг/мл протягом 16-й годин в культурі in vitro с використанням методу розеток. Метод заснований на тому, що формалінізовані еритроцити, покриті відповідними моноклональними антитілами, формують розетку навколо лімфоцита з певним CD-фенотипом, які легко підраховуються в світловому мікроскопі. Показник виражається у відносній кількості (у %) клітин даного фенотипу на 100 лімфоцитів. Використовували такі маркери: CD4 (Тлімфоцити - хелпери), CD 16 (NK - натуральні кілери), CD25 (активовані лімфоцити), CD95 (клітини з маркером апоптозу). Екстракт персика густий суттєво не впливав на експресію поверхневих антигенів лімфоцитів (табл. 3). 3 UA 103001 U Таблиця 3 Вміст лімфоцитів певного фенотипу (CD) після інкубації з екстрактом персика густим в дозі 0,4 мг / мл № досліду 1 2 3 4 К CD4 36 31 22 19 CD4+ ЭП 36 37 26 22 Вміст клітин з маркерами CD, % CD 16+ К CD25 CD25+ ЭП К CD16 К CD 95 ЭП 11 19 14 12 10 13 11 17 18 12 14 13 15 19 12 14 17 17 22 6 СD95+ЭП 17 15 11 10 Примітка. К - контроль (відносне число клітин у вихідній суспензії до інкубації). 5 10 Приклад 5. Вплив екстракту персика густого на активність тканинних природних цитотоксичних клітин (ЕЦК) досліджували методом спектрофотометричної реєстрації цитолиза по виходу гемоглобіну з еритроцитів курчат. Клітини мигдалин отримували за методом, описаним вище. Співвідношення ефектор / мішень становило 5:1, час інкубації -16 годин. Середовищем для культивування був обраний збагачений безбарвний розчин Хенкса (2 % ембріональна теляча сироватка, виробництва компанії Serva; концентрат незамінних амінокислот, виробництва компанії Sigma; гентаміцин 40 мкг / мл). Дослідження проводили з використанням імуноферментного аналізатора Stat Fax 2100 (США). У попередніх дослідах велика концентрація екстракту персика гнітила активність ЕЦК, тому експеримент проводили тільки з малою дозою екстракту персика густого (0.4 мг / мл). Встановлено, що екстракт персика має помірно виражену стимулюючу дію відносно факторів вродженого імунітету (посилення природної цитотоксичності). Результати дослідів представлені в таблиці 4. 15 Таблиця 4 Вплив екстракту персика на активність ЕЦК (% деструкції мішеней) № серії Серія 1 Серія 2 Серія 3 Серія 4 Серія 5 20 25 30 Контроль Екстракт персика 0,4 мг/мл густий 5,2 3,1 6,2 3,8 6,2 2,4 0,3 0,9 0,3 2,9 Екстракт персика густий має помірно виражену стимулюючу дією як відносно факторів вродженого (посилення природної цитотоксичності), так набутого імунітету (посилення антитілоутворення) в тестах in vitro. Імуностимулююча активність екстракту персика густого більш виражена в низькій концентрації 0,4 мг / мл, ніж у високій - 2 мг / мл. Таким чином заявлений новий лікарський засіб з імунотропною активністю відзначається рядом переваг: 1) простота виконання та можливість здійснення на стандартному обладнанні в промислових умовах України; 2) використання як екстрагента 30 % розчину етанолу, тобто спосіб доступний, екологічно безпечний, дешевий, такий що не вимагає роботи з отруйними, вогненебезпечними й шкідливими для здоров'я людини реактивами; 3) використання як сировини листя персика звичайного, який широко культивується в Україні, що дозволяє більш раціонально використовувати природні ресурси; 4) наявність імунотропної активності густого екстракту з листя персика звичайного; 5) перспективність використання одержаного екстракту як лікарської субстанції для одержання різних лікарських форм; 6) тривалий термін зберігання засобу. 4 UA 103001 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Лікарський засіб з імунотропною активністю, що містить екстракт з лікарських рослин, який відрізняється тим, що як екстракт лікарських рослин використовують густий екстракт листя персика звичайного на 30 % спирті етиловому при співвідношенні сировини до екстрагенту 1:10. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5