Спосіб покращення селективності гібридизаційного днк-сенсора

Реферат: В способі покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора додатково використовують систему термостабілізації, контролю та регулювання температури в два етапи. На першому етапі вимірюють величину сенсорного відгуку у відповідь на гібридизацію одного виду ДНКмішеней з олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ при початковій температурі (Т 0), проводять післягібридизаційну обробку, під час якої нагрівають буферний розчин, що надходить до вимірювальної комірки приладу, до вибраної температури (Т 1), впродовж 5 хв. обробляють сенсорну поверхню буферним розчином, нагрітим до Т 1, після чого охолоджують вимірювальну комірку буферним розчином початкової температури (Т0), потім після такої обробки знову вимірюють величину сенсорного відгуку. Після регенерації біоселективного елемента на другому етапі повторюють процедуру гібридизації другого виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ, а саме вимірюють величину сенсорного відгуку при То, проводять післягібридизаційну обробку при Т 1 і після охолодження знову вимірюють величину сенсорного відгуку при Т 0. За результатами двох етапів визначають величини співвідношення сенсорного відгуку на один вид ДНК-мішеней до сенсорного відгуку на другий вид ДНК-мішеней і порівнюють величини такого співвідношення, отримані при Т0 та після післягібридизаційної обробки при Т 1 - суттєва зміна величини такого співвідношення буде показником покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора. UA 113761 U (12) UA 113761 U UA 113761 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пропонована корисна модель належить до галузі біотехнології, біофізики, аналітичної біохімії та медицини, а більш конкретно до способу покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора та може бути використана як для вивчення міжмолекулярних взаємодій, так і для розробки методів селективного розпізнавання послідовностей нуклеїнових кислот в діагностичних цілях. Досягнення сучасної молекулярної біології особливо в області розшифровки геномів різних організмів (від вірусів і бактерій до ссавців і людини) відкривають великі можливості для розробки ефективних засобів діагностики, моніторингу і профілактики багатьох інфекційних та генетичних захворювань. Для цих цілей в багатьох випадках можуть бути корисні такі засоби сучасної аналітичної біотехнології як біосенсори. Гібридизаційний ДНК-сенсор складається з фізичного перетворювача та іммобілізованих на його поверхні одноланцюгових олігонуклеотидів певної нуклеотидної послідовності, довжина яких, зазвичай, варіюється від 18 до 50 основ [1], і які можуть селективно взаємодіяти з комплементарними послідовностями нуклеїнових кислот в досліджуваних зразках. Визначення наявності тих чи інших мутацій, можна здійснити за допомогою ДНК-сенсора шляхом гібридизаційної дискримінації частково та повністю комплементарних послідовностей нуклеїнових кислот [2-4]. Це може бути досягнуто за рахунок використання різних факторів, що впливають на ефективність гібридизації, в тому числі, довжини ДНК-мішені, концентрації, температури, складу буферного розчину для гібридизації, умов післягібридизаційної обробки, а також комбінації таких факторів [5, 6]. Серед перерахованих факторів впливу на жорсткість умов гібридизації - зміна температури є найбільш гнучкою і технологічною. Вона є простим однофакторним, інтуїтивно зрозумілим рішенням. Крім цього існує багато програм і сервісів (наприклад DINAMelt [7]), що дозволяють розрахувати (для гомогенних умов) такі параметри, як зміна вільної енергії Гіббса та температура плавлення дволанцюгової ДНК в залежності від її нуклеотидної послідовності. Знання цих параметрів дозволяє прогнозувати результат взаємодії тих чи інших послідовностей нуклеїнових кислот з певними олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні. До найбільш класичного і широко відомого класу методів, що дозволяють встановити комплементарність одноланцюгових ДНК, визначити енергію їх взаємодії, належать спектрофотометричні та спектрофлуориметричні методи аналізу плавлення ДНК [8]. Відомий метод дослідження гібридизації ДНК за допомогою використання електрохімічної ДНК (Ε-ДНК) сенсорної платформи [9] при підвищеній температурі для розрізнення повністю та частково комплементарних одноланцюгових олігонуклеотидів [10]. Біоселективним елементом згаданої Ε-ДНКсенсорної платформи є ковалентно приєднані до робочого електрода одноланцюгові олігонуклеотиди-проби, які обов'язково мають бути мічені окислювальновідновними індикаторами (редокс-мітками). Тільки в такому випадку спостерігається сенсорний сигнал завдяки перенесенню електронів між редокс-мітками олігонуклеотидів-проб і поверхнею електрода (за відсутності олігонуклеотидів-мішеней). В присутності необхідної концентрації олігонуклеотидів-мішеней починається їх гібридизація з іммобілізованими на робочому електроді олігонуклеотидами-пробами, що просторово відділяє редокс-мітки від поверхні електрода, перешкоджає перенесенню електронів і, таким чином, викликає зменшення окислювально-відновного струму, тобто зміну сенсорного сигналу. Для експериментів при підвищеній температурі (47±1 °C) застосовували алюмінієвий нагрівальний блок "ThermoKool" як тримач для скляної електрохімічної комірки. Однак, щоб забезпечити рівномірний розподіл температури, перед кожним вимірюванням електрохімічну комірку витримували при відповідній температурі протягом, не менше 30 хв. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора, який був би більш зручним у користуванні, який точніше і в достатньо широкому діапазоні контролював би температуру процесу гібридизації ДНК, і який би не потребував ніякої молекулярної мітки. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора, відповідно до корисної моделі, додатково використовують систему термостабілізації, контролю та регулювання температури в два етапи, а саме на першому етапі вимірюють величину сенсорного відгуку у відповідь на гібридизацію одного виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ при початковій температурі (Т0), проводять післягібридизаційну обробку, під час якої нагрівають буферний розчин, що надходить до вимірювальної комірки приладу, до вибраної температури (Т 1), впродовж 5 хв. обробляють сенсорну поверхню буферним розчином, нагрітим до Т 1, після чого охолоджують вимірювальну комірку буферним розчином початкової температури (Т 0), потім після такої обробки знову вимірюють величину сенсорного відгуку, після регенерації біоселективного елемента на другому 1 UA 113761 U 5 10 15 20 25 30 35 40 етапі повторюють процедуру гібридизації другого виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидамипробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ, а саме вимірюють величину сенсорного відгуку при Т 0, проводять післягібридизаційну обробку при Т1 і після охолодження знову вимірюють величину сенсорного відгуку при Т 0, за результатами двох етапів визначають величини співвідношення сенсорного відгуку на один вид ДНК-мішеней до сенсорного відгуку на другий вид ДНК-мішеней і порівнюють величини такого співвідношення, отримані при Т0 та після після-гібридизаційної обробки при Т 1 - суттєва зміна величини такого співвідношення буде показником покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора. Прилад для аналізу біохімічних середовищ, що включає систему термостабілізації, контролю та регулювання температури розроблений колективом авторів (заявка на корисну модель № U201603382, подана 01.04.2016 р.; МПК (2015.01) G01N 21/55; Заявники: Дорожинський Г.В., Ушенін Ю.В., Самойлов А.В., Мацишин М.Й., Рачков О.Е.). Спосіб покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора полягає в тому, що додатково використовують розроблену для цього систему термостабілізації, контролю та регулювання температури, за допомогою якої при гібридизації повністю або частково комплементарних олігонуклеотидів-мішеней з іммобілізованими на сенсорній поверхні олігонуклеотидами-пробами досягають значно кращого співвідношення сенсорних відгуків на користь повністю комплементарних олігонуклеотидів-мішеней за рахунок вибору температури післягібридизаційної обробки, близької до температури плавлення (Т m) дволанцюгового комплекса з частково комплементарними олігонуклеотидами-мішенями. Використання згаданого вище веб-сервера DINAMelt значно спростило пошук такої температури Т1, під дією якої дволанцюговий комплекс одного виду ДНК-мішеней майже не зазнає змін, тоді як дволанцюговий комплекс другого виду ДНК-мішеней повністю (або в значній мірі) руйнується. Можливість регулювати температуру вимірювальної комірки с точністю 0,1 °C в діапазоні від 20 °C до 70 °C дозволяє швидко, зручно і без застосування молекулярних міток підібрати таку температуру, тобто добитися суттєвого покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора для будь-якої пари різних ДНК-мішеней. Приклад використання способу. При реалізації запропонованого способу були використані короткі послідовності нуклеїнових кислот (олігонуклеотиди), які є фрагментами гібридного гену bcr-abl, що пов'язаний з розвитком такого захворювання як хронічна мієлогенна лейкемія. На сенсорну поверхню приладу для аналізу біохімічних середовищ з системою термостабілізації, контролю та регулювання температури іммобілізували олігонуклеотиди-проби mod-Ph (SH-(CH2)6-GCT GAA GGG CTT TTG AAC TCT GCT). Для дослідження селективності процесу гібридизації використовували два різних вида ДНК-мішеней: 1) повністю комплементарні (до іммобілізованих олігонуклеотидів mod-Ph) олігонуклеотиди P1 (AGC AGA GTT CAA AAG ССС ТТС AGC); та 2) частково комплементарні (до іммобілізованих олігонуклеотидів mod-Ph) олігонуклеотиди Bcrex14 (CCA CTG GAT TTA AGC AGA GTT CAA). Веб-сервер DINAMelt дозволяє визначати температуру плавлення подвійної спіралі будьякої відомої нуклеотидної послідовності, що знаходиться у гомогенній системі (у розчині). Таким чином, були отримані термодинамічні параметри гібридизації двох пар досліджуваних олігонуклеотидів: зміна енергії Гіббса та температура плавлення (Табл.). Таблиця Оцінка за допомогою веб-сервера DINAMelt термодинамічних параметрів гібридизації + ++ досліджуваних олігонуклеотидів для СДНК - 200 нМ, [Na ]=0,4 Μ, [Mg ]=0 Μ. Проба і мішень mod-Ph і P1 mod-Ph і Bcrex14 ΔG(ккал/моль) -33,7 -14,6 Τm 64,0 °C 39,2 °C 45 50 Табличні дані свідчать про те, що в розчині при кімнатній температурі обидві пари досліджуваних олігонуклеотидів утворюють стійкі дволанцюгові структури, а при підвищенні температури до -40 °C значна частина дуплексів mod-Ph/Bcrex14 плавиться, тоді як дуплекси mod-Ph/P1 залишаються стабільними. Гібридизація в гетерогенній системі (при наявності твердої сенсорної поверхні, на якій іммобілізують олігонуклеотиди-проби) створює менш сприятливі умови для гібридизації і абсолютні значення AG та Тm мають дещо відрізнятися від зазначених в Табл. Якісна поведінка цих двох пар олігонуклеотидів буде такою ж: при 2 UA 113761 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поступовому підвищенні температури спочатку будуть руйнуватися тільки дуплекси modPh/Bcrex14. Для досягнення покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора для пари досліджуваних ДНК-мішеней як температуру Т1 було вибрано 40 °C, що є значно нижчою, ніж Т m дуплексів mod-Ph/P1, але дещо вище Тm дуплексів для дуплексів mod-Ph/Bcrex14, розрахованих для гомогенних умов. Відповідно до концепції методу, дослідження здійснювали в два етапи: спочатку вивчали гібридизацію повністю комплементарних олігонуклеотидів Р1, а потім - частково комплементарних олігонуклеотидів Bcrex14. Кожен етап складався з трьох кроків. Спочатку, при початковій температурі Т0=30 °C в робочий канал вимірювальної комірки було введено 200 нМ розчин комплементарної ДНК-мішені Р1 (в контрольний канал продовжували вводити буферний розчин), було проведено гібридизацію впродовж 10 хв. і промивання буферним розчином і вимірювання початкового відгуку біосенсора на гібридизацію цієї мішені. Потім, за допомогою терморегулюючої комірки було забезпечено нагрівання буферного розчину до вибраної температури 40 °C і здійснено обробку комірки цим розчином впродовж 5 хв. При цьому, дегібридизовані послідовності нуклеїнових кислот видалялися з вимірювальної комірки. Після цього температуру в комірці знов знижували до 30 °C. Третім кроком було визначення величини сенсорного відгуку після повернення температури до початкового значення. Порівнявши отриману величину з початковим сенсорним відгуком, визначали частку дволанцюгових комплексів, що залишились на сенсорній поверхні після зазначеної процедури. Суть запропонованої корисної моделі пояснюється наступними графічними матеріалами, де на: Фіг. 1 - схематично наведено сенсограму ППР, що відображає взаємодію Р1 з іммобілізованими на сенсорній поверхні mod-Ph та вплив на рівень такої взаємодії спочатку підвищення температури до 40 °C, а потім охолодження до початкової температури. Фіг. 2. схематично наведено сенсограму ППР, що відображає взаємодію Bcrex14 з іммобілізованими на сенсорній поверхні mod-Ph та вплив на рівень такої взаємодії спочатку підвищення температури до 40 °C, а потім охолодження до початкової температури. Як видно з Фіг. 1, підвищення температури до 40 °C майже не впливає на рівень взаємодії mod-Ph і Р1: при охолодженні до початкової температури сенсорний відгук складав 81 % від початкового. У випадку, коли замість повністю комплементарних олігонуклеотидів Р1 у вимірювальну комірку вводили частково комплементарні олігонуклеотиди Bcrex14 (Фіг. 2), після процедури нагрівання до 40 °C і охолодження до початкової температури спостерігали практично повну відсутність сенсорного відгуку. Це свідчить, що практично всі дуплекси mod-Ph/Bcrex14 не витримали зазначеної процедури. Таким чином, за допомогою запропонованого способу покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора на основі приладу для аналізу біохімічних середовищ з системою термостабілізації, контролю та регулювання температури при застосуванні нагрівання до 40 °C, що є значно нижчою температурою, ніж Τm дуплексів mod-Ph/P1, але дещо вище Tm дуплексів для дуплексів mod-Ph/ Bcrex14, розрахованих для гомогенних умов, вдалося показати не тільки різну стабільність двох видів дуплексів нуклеїнових кислот, але й досягнути цілковитої температурної дискримінації вказаних послідовностей нуклеїнових кислот, тобто було досягнуто покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора. Це було зроблено швидко, зручним способом і без застосування будь-яких молекулярних міток. Джерела інформації: 1. Gooding J.J. Electrochemical DNA Hybridization Biosensors // Electroanalysis. - 2002. - Vol. 14, № 17. - P. 1149-1156. 2. Lucarelli F. et al. Carbon and gold electrodes as electrochemical transducers for DNA hybridisation sensors // Biosens. Bioelectron. - 2004. - Vol. 19, № 6. - P. 515-530. 3. Wang J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics. // Biosens. Bioelectron. - 2006. - Vol. 21, № 10. - P. 1887-1892. 4. Teles F., Fonseca L. Trends in DNA biosensors // Talanta. - 2008. - Vol. 77, № 2. - P. 606-623. 5. Petersen J. et al. Use of a multi-thermal washer for DNA microarrays simplifies probe design and gives robust genotyping assays. //Nucleic Acids Res. - 2008. - Vol. 36, № 2. - P. e10. 6. Poulsen L. et al. Multi-stringency wash of partially hybridized 60-mer probes reveals that the stringency along the probe decreases with distance from the microarray surface. // Nucleic Acids Res. - 2008. - Vol. 36, № 20. - P. e132. 3 UA 113761 U 5 10 15 20 25 30 7. Zuker M. TheUNAFoldWeb Server [Електронний ресурс] /Μ. Zuker, N. Markham, // Rensselaer Polytechnic Institute. - 1995. http://unafold.rna.albany.edu/?q=dinamelt. 8. Wittwer С. Т. High-resolution DNA melting analysis: advancements and limitations //Human Mutation. - 2009. - № 30. - P. 857-859. 9. Ricci F., Lai R.Y., Plaxco K.W. Linear, redox modified DNA probes as electrochemical DNA sensors //Chem. Commun. - 2007. - P. 3768-3770. 10. Yang W., Lai R.Y. Effect of diluent chain length on the performance of the electrochemical DNA sensor at elevated temperature//Analyst. - 2011. - Vol. 136. - P. 134-139. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора, який відрізняється тим, що додатково використовують систему термостабілізації, контролю та регулювання температури в два етапи, а саме - на першому етапі вимірюють величину сенсорного відгуку у відповідь на гібридизацію одного виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ при початковій температурі (Т 0), проводять післягібридизаційну обробку, під час якої нагрівають буферний розчин, що надходить до вимірювальної комірки приладу, до вибраної температури (Т 1), впродовж 5 хв. обробляють сенсорну поверхню буферним розчином, нагрітим до Т 1, після чого охолоджують вимірювальну комірку буферним розчином початкової температури (Т 0), потім після такої обробки знову вимірюють величину сенсорного відгуку, після регенерації біоселективного елемента на другому етапі повторюють процедуру гібридизації другого виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидамипробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ, а саме, вимірюють величину сенсорного відгуку при То, проводять післягібридизаційну обробку при Т1 і після охолодження знову вимірюють величину сенсорного відгуку при Т 0, за результатами двох етапів визначають величини співвідношення сенсорного відгуку на один вид ДНК-мішеней до сенсорного відгуку на другий вид ДНК-мішеней і порівнюють величини такого співвідношення, отримані при Т0 та після після-гібридизаційної обробки при Т 1 - суттєва зміна величини такого співвідношення буде показником покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора. 4 UA 113761 U Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5