Екзополімер

Изобретение относится к области иммунотерапии, к внеклеточному экзополимеру, обладающему иммуномодуляторными свойствами. Многочисленные заболевания, такие как аллергия, аутоиммунные болезни, инфекционные болезни и некоторые виды рака имеют общую черту - первичное или вторичное расстройство иммунной системы. В то время, как первичные иммунодефициты редки и побочно имеют генетическую причину, вторичные иммунодефициты более часто встречаются и их причины главным образом внешние, включающие, например, возвратные инфекции, воздействие иммунотоксических ве ществ и стресса. Иммунотерапия позволяет устранить симптомы первичного иммунодефицита и восстановить иммунный статус в случае втoричного иммунодефицита. Было разработано множество иммунотерапевтических агентов в виде иммуностимуляторов для иммуносупрессантов (см. например, пат. США № 4435389, кл. 536/123, 1984 г.; пат. США 1Мг 4645667, кл. 424/92, 1987 г.; пат. США Мг 4797589. кл. 536/1.1, 1989 г.). В целом иммуномодуляторы можно характеризовать как агенты, которые неспецифически улучшают специфическую реактивность хозяина и неспецифические эффекторные механизмы. Арсенал иммуномодуляторных агентов бактериального происхождения включает микобактерии и их продукты, липополисахариды грамотрицательных бактерий, энтеротоксины холерного вибриона, продукты стрептококка, липопротеины и гликопротеины различных грамотрицательных бактерий и полисахариды различного происхождения (см., например, Шимамура и др. Agric. Blol. Chem., 1990, vol. 54 (11), p. 2869; Хабу Дж. и др. -Journal of Biochemistry, 1987, vol. 102, No, 6, .pp..14231432). Однако среди известных агентов отсутствуют агенты, в частности, экзополимеры, которые обладали бы достаточно интенсивными иммуномодуляторными свойствами и в то же время были нетоксичными. Задачей настоящего изобретения является создание экзополимера, обладающего высокой иммуномодуляторной активностью и в то же время нетоксичного. Поставленная задача решена тем, что получен экзополимер, представляющий собой гликопротеин, выделенный из штамма Bifidobacterlum infantis longum, депонированный в Институте Пастера под номером 1-885, обладающий иммуностимуляторными свойствами и имеющий следующие свойства; молекулярный вес 10000100000 дальтон и может образовывать агрегаты молекулярного веса порядка 106 дальтон в равновесии с частицами более низкого молекулярного веса, полисахаридная часть состоит из глюкозы и галактозы в соотношении (1-4);1, а белковая фракция достигает 30% от веса экзополимера. Экзополимер, являющийся предметом настоящего изобретения, продуцируется при культивировании отобранных селекцией клеток недавно выведенного вида Bifidobacterlum Infantis longum грам-поло-жительной бактерии, которая имеет таксономические характеристики между BIfidobacterium infantis и Bifidobacterlum lungum. Обладая экспериментально продемонстрированными иммуномодуляторными свойствами, этот экзополимер представляет большой интерес для медицины и ветеринарии. Бактериальный штамм IBS BIfidobacterium Infantis longum, депонированный под номером 1-885 в Институте Пастера в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (НККМ), культивируют в анаэробных условиях в подходящей среде и после удаления микроорганизмов из культуральной среды, продуцированный ими экзополимер выделяют и осаждают путем добавления органического растворителя. Наконец, полученный путем осаждения продукт лиофилизируют, Штамм IBS может культивироваться на подходящей среде любого типа, компоненты которой имеют молекулярный вес менее 10 тыс. дальтон, в анаэробных условиях, предпочтительно при 37°С. Детально состав этой среды описывается ниже. Микроорганизмы удаляют из культуральной среды предпочтительно центрифугированием, й экзополимер выделяют, например, ультрафильтрацией на калиброванной пористой мембране с удерживающим порогом выше или равным 10 тыс. дальтон. Изолированный таким образом продукт затем концентрируют, подвергают диализу, осаждают добавлением органического растворителя, предпочтительно этанола, и наконец лиофилизируют. Полученный экзополимер имеет в основном полисахаридную природу, состоит в первую очередь из глюкозы и галактозы в соотношении от 1:1 до 4:1 и содержит белковую фракцию в количестве до 30 вес.%. Во фракции полисахаридов соотношение глюкозы и галактозы составляет 1:1 - 4:1, предпочтительно около 3:2. Экзополимер по настоящему изобретению имеет молекулярный вес, обнаруживаемый в диапазоне от 10 до 100 тыс. дальтон, предпочтительно 20-30 тыс. дэльтон. Он может образовывать агрегаты молекулярного веса порядка 106 дальтон в равновесии с частицами более низкого молекулярного веса. Он свободен также от нуклеиновых кислот, жиров и органических кислот. Этот, изолированный таким образом и очищенный экзополимер обладает иммуномодуляторными свойствами и при этом нетоксичен. Опыты, проведенные как "іn-''itro", так и "in-vivo", показали, что экзополимер, продуцированный штаммом IBS, ведет себя как иммуномодулятор, и увеличивает неспецифическое сопротивление хозяина. Этот экзополимер также обладает антилейкемическими (про воопухолевыми) свойствами, происхождение которых может быть связано с его иммуномодуляторными свойствами, описанными в "Определении иммуномодуляторных свойств экзополимера, продуцируемого штаммом IBS". Экзополимер, продуцируемый штаммом IBS, может быть успешно использован в качестве основного активного начала различных фармацевтических составов, которые могут применяться через рот, парентерально или местно. Эти фармацевтические составы могут быть представлены в виде форм, обычно используемых в медицине и ветеринарии, например, в виде простых или покрытых сахаром таблеток, капсул, маленьких пилюль,растворов, сиропов, суппозиториев, инъецируемых препаратов, пессариев, кремов, помад, лосьонов, капель и глазных мазей. Они все изготавливаются обычными методами. Основное активное начало (экзополимер) может вводиться в фармацевтические составы самостоятельно или вместе с другими фармацевтически активными агентами. Используемые носители и вспомогательные вещества, также обычные, такие как тальк. камедь, маннитол. крахмал, стеарат магния, кокосовое масло, водные или неводные носители, жировые вещества животного или растительного происхождения, производные парафина, гликоли, различные увлажняющие, диспергирующие или эмульгирующие агенты и консерванты. У животных заметные иммуномодуляторные эффекты наблюдались на мышах для доз между 4-400 мкг на мышь. Примеры, представленные ниже, иллюстрируют настоящее изобретение без его ограничения. Они касаются, в частности, приготовления экэополимера (также называемого PB3D) и его фармакологического действия. Пример 1. Получение экзополимера путем культивирования бактериального штамма IBS Bifidobacterium Infantis longum. Стадия А: культивирование штамма IBS. Штамм IBS культивируют в анаэробных условиях при 37°С (воздух удаляют в начале ферментации) в следующей питательной среде: Пентон (молекулярный вес 5 г/л 10 тыс.дальтон) NaCl 3 г/л Глюкоза 10 г/л Цистеин 0,5 г/л Ацетат натрия 2 г/л Na2HPO4 2,87 г/л КН2РO4 1,12 г/л MgSO4 0,09 г/л NaH2PO4 0,15 г/л NaHCO2 2,2 г/л Твин 1 мл/л Витаминный раствор 10 мл/л. Для повышения выхода к этой культуральной среде может быть с выгодой добавлена твердая основа, такая как CYTODEX или ее эквивалент. В эти х условиях штамм IBS продуцирует экзополимер, количество которого можно установить в надосадочной жидкости с использованием тестового метода ELISA. разработанного для этой цели и описанного ниже. 10 л указанной выше культуральной среды помещают в 12-литровый ферментер для ее стерилизации. Ферментер затем засевают 1000 мл культуры штамма IBS. выдержанной предварительно в такой же среде в течение 48 часов. Жидкость барботируют смесью 90% азотам 10% СO2 в течение 20 мин со скоростью 3 литра смеси в минуту. Инкубация осуществляется при 37°С при перемешивании 400 об/мин в атмосфере смеси N2/CO2 в обычном соотношении, которую вводят в среду в течение первых двух часов ферментации. Через 48 часов, по окончании ферментационного процесса, методом ELISA определяют количество продуцированного полисахарида. Минимальный выход составляет 35 мкг/мл. Стадия В: выделение и очистка полученного экзополимера. После завершения процесса ферментации, клетки отделяют центрифугированием. Послеосаждения клеток надосадочную жидкость ультрафильтруют. Сохраняются только молекулы тяжелее 10000 дальтон. Раствор, содержащий полученный экзополимер, концентрируют десятикратно и затем подвергают диализу. Концентрированный раствор осаждают спиртом (этанол: вода - 3:1 по объему). Наконец, осажденный спиртом продукт лиофилизируют. Таким образом получают беловатый продукт, который выглядит волокнистым. Из вышеупомянутой культуры получают 10 л надосадочной жидкости, которые концентрируют до 1 л путем ультрафильтрации. Объем доводят до 10 л дистиллированной водой и затем его снова уменьшают до 1 л ультрафильтрацией. Эту операцию производят дважды. Полученный таким образом 1 л концентрированного раствора осаждают этанолом (3:1 по объему). Полученный осадок лиофилизируют с получением около 400 г лиофилизата. Метод ELISA. Используемый антиген - препарат полисахарида, чистота которого обеспечивается дополнительной депротейнизацией фенолом. Начальную дозу 0,5 мг инъецируют кролику в двух инъекциях - одной внутриутробной и другой подкожной - вместе с полным адъювантом Фрейнда. Инъекцию повторяют на 15-й день, на этот раз с использованием неполного адьюванта Фрейнда. Пятнадцатью днями позже у кролика берут кровь с получением антисыворотки с высоким уровнем антител, которая позволяет методом ELISA узнать экзополимер, очищенный хроматографией на колон-HeSEPHADEX G200 и экзополимер, присутствующий в надосадочной жидкости культур Bifidobacterium после осаждения этанолом. Тест ELISA проводят на микрочастицах. Ан тиген адсорбируется. Затем выемки в оставшихся п устыми участках заполняют сывороточным альбумином. Зятем осуществляют инкубацию со специфическими антителами, полученными от кролика. Затем добавляют антитела, направленные против антител кролика. Они коньюгируют к щелочной фосфатазо. Наконец, добавляют субстрат (ортонитрофенил фосфат). После инкубации реакцию останавливают с использованием ЗМ раствора NaOH. Оптическая плотность (светопоглощение) измеряется при 405 нм на приборе ELISA. Этой процедурой получают достаточно высокие титры антител для получения положительной реакции для 10 разведении антисыворотки при концентрации очищенных антигенов 4 мкг. Характеристика экзополимера, продуцированного штаммом IBS. 1) Полученный продукт состоит существенно из глюцидов (измерено фенольно/сернокислым методом) и белков (измерено методом Лоури) в соотношении 5:1. Этот продукт не содержит никаких кислот согласно аналитическим данным, полученным ионно-исключающей хроматогра-фией или газовой хроматографией. Ни в одном из случаев гидролизат не содержит пентоз. Продукт свободен от липидов согласно результатам газовой хроматографии после экстрагирования н-гептаном. В нем нет и органических кислот согласно измерениям, сделанными ионноисключающей хроматографией. 2) Согласно результатам, полученным высокопроизводительной жидкостной хроматографией (HPLC) на колонне RP-8 300 А, продукт имеет гликопротеиновую природу, 3) Глюцидная часть состоит из глюкозы и галактозы согласно аналитическим данным, полученным ионноисключающей, тонкослойной и газовой хроматографией. 4) Глюкоза и галактоза присутствуют в соотношении 3:2 согласно результатам газовой хроматографии мономеров, гидролизо-ванных метанолизом и затем ацетилированныхтрифторацетилированием. 5) Полисахаридная часть имеет разнообразные связи 1-2, 1-3, 1-4, и 1-6 согласно хроматограмме, полученной газовой хроматографией метилированных (метанолизом) и затем ацетилированных (трифторацетили-рованием) мономеров. 6) Биологическая активность, измеряемая по способности стимулировать увеличение количества клеток, образующи х зоны гемолиза (PFC), проистекает из глюцидной части и поддерживается после обработки протеиназой К, повреждающей белковую часть. 7) Примерный молекулярный вес колеблется от 20 000 до 30 000 дальтон согласно результатам хроматографии на SEPHADEX G 200 (пик молекулярного веса). Экзополимер может образовать агрегаты молекулярного веса. порядка 10 дальтон в равновесии с частицами более низкого веса. Определение иммуномодуляторных свойств зкзополимера, продуцируемого штаммом IBS (тест "in vitro"). Пролиферация спленоцитов (селезеночным микрофагов). Пролиферация спленоцитов в присутствии митогена может быть измерена окислением МТТ/3-(4,5диметилтиазол-2-мл) -2,5-дифенил тетразол бромид) в формазан митохондриальной дегидрогеназой. Пролиферация (спленоцитов мыши C57BL/6) 'выражается оптической плотностью (светопоглощением) при 560 нм как і функция концентрации PB3D или концентрации IPS, служащей в качестве ссылки: PB3D вызывает пролиферацию, которая немного слабее пролиферации, вызываемой IPS. Определение иммуномодуляторных свойств экзополимера, продуцируемого штаммом IBS (тест "In-vi vo"). Стимулирование производства клеток, сингезирующи х антитела. У мышей, этот экзополимер неспецифически стимулирует производство клеток, синтезирующи х антитела при оральном введении вместе с эритроцитами овцы или внутрибрюшинно без эритроцитов овцы, Экзополимер также нормализует эту способность у мышей, когда она подавлена цик-лофосфамидом. Пример. После Б.-дневного орального введения PB3D и иммунизирующей дозы на 19-й и 20-й дни (оряанограмма А) или без иммунизирующей дозы(органограмма В), наблюдается увеличение количества PFC в селезенке мышей, в зависимости от введенных доз. Пример. После внутрибрюшинного введения разовой дозы 400 мкг/на мышь PB3D, наблюдается значительное увеличение количества PFC через 4 дня. Пример. Экзополимер, вводимый мышам, которые были иммуноподавлены циклофосфамидом, позволяет наблюдать у обработанных мышей снижение иммуноподавления или более быстрое восстановление нормального количества PFC по сравнению с необработанными мышами, Влияние на состав сывороточных протеинов. Различные иммуномодуляторы изменяют иммунозлектрофоретические характеристики сывороточных протеинов, определенных как X, L A и LВ. Экзополимер по настоящему изобретению вызывает такую модификацию. Пример. Внутрибрюшинное введение РВ31 в количестве 400 мкг на мышь вызывает через 24 часа и через 4 дня модификацию сывороточных протеинов, сравнимую с изменениями, вызываемыми липосахаридами Escherichia coil (LPS). Пример. Подобным образом, общее введение 400 мкл оральным путем с разбивкой на 5 последовательных дневных доз по 80 мкг вызывает модификацию протеинов, заметную через пять дней после введения экзополимера. Очищение коллоидного углерода. Экзополимер вводят внутривенно (по 2,5 мг на мышь) мышам Balb/c. Через 48 часов, внутривенно вводят 0,2 мл суспензии коллоидного углерода. Исчезновение коллоидного углерода из крови, называемое очищением. выражается логарифмической кривой уровня углерода во времени. Экзополимер усиливает процесс очищения. Увеличение неспецифической резистивности. У мышей, иммуноподавленных циклофосфамидом и помещенных в холод, можно наблюдать, что Экзополимер понастоящему изобретению увеличивает неспецифическую резистентность хозяина к бактериальной инфекции такой как, например, вызванной Pseudomonas на слизистых оболочках или к вирусной инфекции (вирус Coxseckle В). Пример. Иммуноподавление осуществляют введением внутрибрюшинно 200 мг/кг циклофосфамида. На третий день начинают пятидневную оральную обработку экзополимером (по 80 мкг на мышь в день). Контрольные мыши получают эквивалентное количество физ. раствора. Несколькими часами позже окончания курса обработки, мышей инфицируют интраназально штаммом Pseudomonas aeruginosa, сделанным патогенным для мышей. Процент выживания у обработанных мышей выше: Пример. Иммуноподавление создают разовым внутрибрюшинным введением 200 мг/кг циклофосфамида. На третий день начинают пятидневную обработку экзополимером (80 мкг на мышь в день). Контрольные мыши получают эквивалентное количество физ. раствора. Через несколько часов после окончания курса обработки, мышей инфицируют вн утрибрюшинно вирусом Coxsackie B5(0,5 мл с 107 PFC) и оценивали степень выживания, которая была выше у обработанных мышей: Тесты на спонтанную и индуцированную лейкемию. Экзополимер по настоящему изобретению способен задерживать появление лейкемий у мышей ARK (линия инбредных мышей очень часто развивает спонтанную лейкемию). Экзополимер также способен задерживать у мышей RF появление лейкемии, вызванной канцерогенным веществом, таким как метилхолантрен. (Линия RF является инбредной, у которой метилхолантрен вызывает очень скоро появляющуюся лейкемию). Пример. Две группы мышей AKR получали орально пятидневную терапию PB3D каждый месяц, тогда как третья группа не получала испытываемый продукт и служил а в качестве контроля. Из двух обработанных групп одна получала общую месячную дозу в 400 мкг (по 80 мкг в день пять последовательных доз), а другая получала общую месячную дозу 4 мкг (по 0.3 мкг в день на мышь пять последовательных дней). Полученные результаты показывают задержку появления лейкемии у обработанных мышей. Эта разница была отчетливо значительной у гр уппы, получавшей месячную дозу в 400 мкг. Эти данные были подтверждены другим опытом, при котором обработанные группы получали по 400 мкг и по 40 мкг PB3D соответственно. Пример. В течение двух месяцев до систематического введения метил хол антре на две группы мышей RF получали по два оральных введения с перерывом в три недели. Одной из групп давали общую месячную дозу 400 мкг (80 мкг в день на мышь пять последовательных дней), тогда как другая получала общую месячную дозу величиной 4 мкг (по 0.8 мкг в день на мышь пять последовательных дней). Контрольную группу не об-рабатывали. Лейкемию вызывали применением метилхолантрена на тщательно выбритый участок тела. Введение PB3D замедлило появление лейкемии. Эта задержка была ясно заметна у гр уппы, получавшей 400 мкг PB3D. Острая токсичность. Тесты на острую токсичность проводили путем внутривенного введения Экзополимера в следующи х дозах; 1 мкг, 10 мкг, 15 мкг, 100 мкг, 300 мкг, 600 мкг и 1200 мкг на мышь в хвостовую вену, по каждой дозе 5 мышам. Ни одна из доз не вызвала негативных реакций у мышей, которые все были живы еще два месяца после инъекции. Описание штамма. Штамм IBS 'был депонирован 6 июня 1989 г. в "Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов" (Институт Пастера, 25 rue de Decleur Roux, 75724, Paris, Cedex, France). Он носит депозитарний номер 1-885. Этот штамм был выделен из сточной воды, содержащей фекалии человека и представляет таксонометрические характеристики между Bifldobacterlum Infantis и Bifldobacterlum longum и может быть типирован по профилю структурных компонентов, по профилям ферментационных катаболитов D-глюкозы, по резистентности к антибиотикам и по предуцированию экзополимера по настоящему изобретению.