Спосіб отримання моделі радіаційно-індукованого дефекту антиінфекційної резистентності

1. Спосіб отримання моделі радіаційноіндукованого дефекту антиінфекційної резистентності, що передбачає одноразовий вплив низької дози γ-випромінювання на щурів лінії Вістар, який відрізняється тим, що тварин опромінюють в одномісячному віці в діапазоні 0,75-2 Гр та інфікують інтраперитонеально культурою S.typhimurium в 8 дозі 5×10 КУО. 2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що доза опромінення переважно складає 1 Гр. (19) (21) u200814367 (22) 15.12.2008 (24) 25.05.2009 (46) 25.05.2009, Бюл.№ 10, 2009 р. (72) КОЛЯДА ТЕТЯНА ІВАНІВНА, UA, БРУСНИК СВІТЛАНА ВАСИЛІВНА, UA, КРЕСТЕЦЬКА СВІТЛАНА ЛЕОНІДІВНА, UA, КОЛЯДА ОЛЕГ МИКОЛАЙОВИЧ, UA, ЄГОШИНА ВІКТОРІЯ ОЛЕКСІЇВНА, UA, МИХАЙЛИЧЕНКО МАРИНА СЕРГІЇВНА, UA, ВОЛЯНСЬКИЙ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, UA, КУЧМА ІРИНА ЮРІЇВНА, UA, ВОЛКОВ АНДРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, UA, ШАТІЛО ЮЛІЯ ВІКТОРІВНА, UA 3 стан функціональної декомпенсації імунної системи в умовах геномної нестабільності, що індукується іонізуючим випромінюванням, шляхом добору ізольованих генетично-детермінованих дефектів не уявляється можливим. Найближчим аналогом рішення, що заявляється, є спосіб отримання моделі радіаційноіндукованого імунодефіциту [3]. Самиць щурів лінії Вістар одноразово піддавали γ-випромінюванню в дозі 0,5Гр на ранній стадії вагітності, а саме на третю добу після запліднення. Отримане потомство, внаслідок радіаційного впливу в доімплантаційний період ембріогенезу, мало характерні порушення лімфогемопоетичного гомеостазу, підвищений рівень геномної нестабільності та достовірні функціональні дефекти як специфічної так і неспецифічної ланок імунітету. Суттєвими ознаками, що характеризують прототип, є обраний біологічний об'єкт (вагітні самиці щурів лінії Вістар), загальна доза опромінення (0,5Гр), кратність опромінення (одноразове). Ознаками, які збігаються з ознаками рішення, що заявляється, є: відтворення моделі на щурах лінії Вістар, застосування низьких доз γвипромінювання та кратність впливу. Причиною, що заважає отриманню бажаного технічного результату є відсутність у щурів лінії Вістар опромінених в дозі 0,5Гр в антенатальному періоді порушень резистентності, що мали б тенденцію до прояву на тлі інфекційного процесу. Крім того, ця модель не дозволяє досліджувати ранні ефекти, індуковані опроміненням. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб отримання моделі радіаційноіндукованого дефекту антиінфекційної резистентності у щурів лінії Вістар, в якому, за рахунок добору оптимальних умов опромінення та додаткового функціонального навантаження, забезпечити створення стандартної моделі з характерними ознаками функціональної декомпенсації системи антиінфекційної резистентності, придатної для оцінки ефектів імунотропних засобів. Поставлена задача вирішується в наступний спосіб: щурів лінії Вістар на 30 добу після народження одноразово піддають γ-випромінюванню в дозовому діапазоні 0,75-2Гр та інфікують культурою S.typhimurium в дозі 5×108 КУО інтраперитонеально. Термін інфікування обирається відповідно до задач дослідження: при розробці цієї моделі вивчалися ранні ефекти опромінення, у зв'язку з чим інфікування проводили безпосередньо після радіаційного впливу. Суттєвими ознаками, що характеризують спосіб отримання моделі, є обраний біологічний об'єкт (одномісячні щури лінії Вістар), доза опромінення (0,75-2Гр, переважно 1Гр), кратність опромінення (одноразове), використана модель інфекції (перитонеальний сепсис, викликаний введенням культури S.typhimurium в дозі 5×108 КУО). Інтраперитонеальне введення культури S.typhimurium викликає у інтактних щурів лінії Вістар розвиток сальмонельозного перитоніту та септичного стану, що супроводжується генералізацією інфекції, гематогенною диссемінацією та персистенцією збудника в крові і внутрішніх орга 41472 4 нах (печінці, селезінці, товстому кишечнику). Клінічна симптоматика (озноб, зниження моторної активності та апетиту) спостерігається протягом 3-5 діб. При дослідженні показників неспецифічної резистентності виявляються характерні ознаки активації імунної системи: перерозподіл основних пулів імунокомпетентних клітин із одночасною активацією відповідних гілок гемопоезу, стимуляція фагоцитарних функцій, підвищення рівня прозапальних цитокінів в сироватці крові, зниження рівня загального комплементу та підвищення концентрації ЦІК. Важкість перебігу та наслідки (тривалість персистенції S.typhimurium в організмі, ступінь ураження внутрішніх органів) визначається станом антиінфекційної резистентності піддослідної тварини, а також залежить від кількості збудника, введеного при зараженні. Доза для інфікування підбиралася експериментальним шляхом таким чином, щоб забезпечити у одномісячних щурів лінії Вістар нульовий показник летальності при мінімальному відсотку тварин, в яких септичного стану не виникає внаслідок локалізації процесу. За результатами проведених досліджень, доза 5×108 КУО забезпечує 100-90% рівень генералізації процесу на 7 добу інфекції з позитивною динамікою елімінації збудника протягом другого тижня після інфікування (дані наведені в таблиці 1). Зменшення дози може призвести до підвищення відсотку тварин, в яких не відбувається генералізації інфекції, що зменшує можливості спостереження за динамікою процесу. Збільшення дози може призвести до підвищення рівня летальності. Зміна збудника або типу лабораторної тварини потребує індивідуального добору дози, що забезпечувала би бажаний технічний результат. Зокрема це стосується і віку: підбір дози проводився на одномісячних щурах лінії Вістар, що мають певний, характерний для цього етапу онтогенезу, рівень чутливості до розробленої моделі інфекції та впливу застосованих доз іонізуючого опромінення. Дозовий діапазон, що заявляється (0,75-2Гр, переважно 1Гр), обґрунтовується відсутністю бажаного технічного результату за його межами: доза нижча ніж 0,75Гр не забезпечує бажаного дефекту імунної системи, доза вища, ніж 2Гр не дозволяє мінімізувати індуковані дефекти резистентності, що має наслідком підвищення чутливості до застосованої моделі інфекції з відповідним підвищенням рівня летальності серед тварин. Це підтверджено результатами проведених експериментальних досліджень (таблиця 1). Сальмонельозний перитоніт відтворювали на шости групах місячних щурів по 10 тварин в кожній: I група - неопромінені тварини; II група - опромінені антенатально в дозі 0,5Гр; III група - опромінені постнатально в дозі 0,75Гр; IV група - опромінені постнатально в дозі 1Гр; V група - опромінені постнатально в дозі 1,5Гр; VI група - опромінені постнатально в дозі 2Гр. 5 41472 Дослідження ступеню обсіменіння внутрішніх органів проводили на 7 та 14 добу після заражен 6 ня. Результати наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Результати бактеріологічного дослідження перебігу сальмонельозного сепсису у щурів лінії Вістар Групи тварин 1 І (n=10) II (n=10) III (n=10) IV (n=10) V (n=10) VI (n=10) Термін дослідження 2 7 днів 14 днів 7 днів 14 днів 7 днів 14 днів 7 днів 14 днів 7 днів 14 днів 7 днів 14 днів % тварин з генералізованою формою 3 90 60 90 70 100 70 100 80 100 90 100* 100 Ступінь обсіменіння внутрішніх органів КУО/г 1-20 21-50 51-100 >100 4 5 6 7 0 0 20 80 0 40 60 0 0 0 20 80 0 40 60 0 0 0 0 100 0 40 60 0 0 0 0 100 0 0 30 70 0 0 0 100 0 0 10 90 0 0 0 100 0 0 0 100 Примітки: * - дві тварини загинули протягом перших 5 діб після інфікування. Як видно з наведених даних, у тварин, опромінених антенатально в дозі 0,5Гр (група II), так саме, як і у опромінених постнатально в дозі 0,75Гр (III група), достовірних відмінностей в характері перебігу інфекційного процесу за динамікою зниження рівня обсіменіння внутрішніх органів з інфікованими неопроміненими тваринами (група І) не виявлено. Постнатальне опромінення в дозі 1Гр (IV група) впливає на чутливість щурів лінії Вістар до використаної моделі інфекції, однак не підвищує рівня летальності та дозволяє досліджувати динаміку процесу протягом 14 діб. Збільшення дози опромінення до 2Гр у місячних щурів лінії Вістар в межах застосованої моделі інфекції, підвищує рівень летальності та звужує спектр можливостей дослідження динаміки інфекційного процесу: для двох тварин V групи інфекція мала летальні наслідки; тварини, що вижили, мали фізикальні ознаки більш важкого перебігу захворювання з тривалішим періодом клінічної маніфестації. Як видно з наведених даних, за показниками генералізації процесу та ступенем обсіменіння внутрішніх органів на 14 добу в жодної з тварин цієї групи позитивної динаміки не спостерігалось. Кратність опромінення обрана мінімальна, оскільки, як свідчать наведені вище дані, вона дозволяє отримати бажаний технічний результат. Крім того, вважається, що варіювання кратності при застосуванні низькоінтенсивного іонізуючого випромінювання не доцільно у зв'язку з відсутністю принципових відмін в ефектах, характер яких, у цьому випадку, визначається лише загальною дозою опромінення. Можливість здійснення корисної моделі, що заявляється, а саме, - можливість індукції функці онального дисбалансу в системі антиінфекційної резистентності опромінених в дозі 1Гр одномісячних щурів лінії Вістар на тлі сальмонельозного сепсису, ілюструють дані, наведені в Прикладі 1. Мінімальним набором маркерних ознак відтворюваного типуфункціонального дефекту в діяльності імунної системи є достовірне зниження фагоцитарної активності нейтрофілів периферійної крові, неадекватна реакція-відповідь на інфекцію моноцитарно-макрофагальної системи, а також наявність вираженого дисбалансу в цитокіновому профілі за показником співвідношення TNF-α/IL4. Таким чином, використання обраного біологічного об'єкту (одномісячні щури лінії Вістар), режиму опромінення (одноразово у діапазоні 0,751,5Гр, переважно 1Гр), моделі інфекції (перитонеальний сепсис, викликаний введенням культури S.typhimurium в дозі 5×108 КУО) є необхідними та достатніми умовами отримання стандартної моделі радіаційно-індукованого дефекту антиінфекційної резистентності, що дозволяє оцінити наслідки опромінення на будь який момент після впливу. Можливість використання моделі, що заявляється для оцінки ефективності імунотропних препаратів при корекції даного типу порушень антиінфекційної резистентності, наведені в Прикладі 2. Приклад 1. Порівняльний аналіз стану антиінфекційної резистентності у 1-місячних щурів лінії Вістар, опромінених в дозі 1Гр (група А), інфікованих інтраперитонеально культурою S.typhimurium (група В), опромінених в дозі 1Гр та інфікованих (група С), опромінених в дозі 0,5Гр антенатально (за способом відповідно до прототипу) та інфікованих (група D) і інтактних тварин (контроль), проводився на основі даних, наведених в таблиці 2. 7 41472 8 Таблиця 2 Показники неспецифічної резистентності одномісячних щурів лінії Вістар. Показники Загальний комплемент, г.о. ЦІК, о.о.щ TNF-α, пг/мл IL-4, пг/мл Фагоцитарний індекс нейтрофілів, % Фагоцитарне число нейтрофілів, % Фагоцитарний індекс Мφ Фагоцитарне число перітонеальних Мφ перітонеальних 9 Лейкоцити, 10 /л Паличкоядерні нейтрофіли, % Сегментоядерні нейтрофіли, % Еозінофіли, % Моноцити, % Лімфоцити, % Група А Група В (n=10) (n=10) М 92,8 62,88** m ±3,41 ±2,78 М 0,005 0,007** m ±0,0004 ±0,0005 М 42,28 111,8** m ±0,52 ±3,64 М 21,11* 100,1** m ±0,29 ±1,53 М 46,2* 71,1 m ±1,8 ±3,5 М 5,1* 9,8 m ±0,1 ±1,3 М 34,2** 69,4** m ±2,3 ±2,8 М 4,3** 12,7** m ±0,2 ±1,3 Лейкограма периферійної крові М 3,88* 8,73** m ±0,12 ±0,14 М 1,3 3,5 m ±0,3 ±0,3 М 30,3* 39,6** m ±1,2 ±1,3 М 3,1** 3,3** m ±0,3 ±0,3 М 2,9 4,4* m ±0,3 ±0,3 М 62,4 49,2 m ±2,2 ±3,1 МУ m Група С (n=10) 36,75** ±1,75 0,009** ±0,0007 94,07 ±2,67 17,9** ±0,54 62,3 ±1,8 6,8 ±0,1 39,9* ±1,4 5,2** ±0,3 Група D (n=10) 60,01** ±2,2 0,007** ±0,0006 100,3** ±3,33 91,89** ±0,47 69,8 ±3,9 7,1 ±0,3 61,3 ±2,1 7,3 ±0,5 Контроль (n=10) 96,61 ±2,2 0,005 ±0,0006 39,18 ±0,33 35,89 ±0,3 67,1 ±3,2 8,7 ±0,3 52,8 ±2,5 9,5 ±0,2 6,13 ±0,27 2,1 ±0,4 32,7* ±1,3 4,6** ±0,4 3,1 ±0,4 57,5 ±4,2 7,56* ±0,11 3,1 ±0,3 35,6** ±1,5 3,2** ±0,3 4,1 ±0,56 53,87 ±3,5 5,94 ±0,66 2,2 ±0,3 24,2 ±1,1 1,1 ±0,1 3,1 ±0,2 69,4 ±3,3 Примітки: * - достовірність відмінності від контрольної групи р