Спосіб клонування багряника японського in vitro

Реферат: Спосіб клонування багряника японського in vitro включає ініціацію органогенезу, намноження (мультиплікацію) і вкорінення (ризогенез). У клонуванні багряника японського in vitro застосоване модифіковане тверде поживне середовище Р24 із спеціально підібраним вмістом і концентрацією компонентів. UA 68705 U (54) СПОСІБ КЛОНУВАННЯ БАГРЯНИКА ЯПОНСЬКОГО IN VITRO UA 68705 U UA 68705 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до біотехнології і лісового господарства та може знайти застосування для масового відтворення багряника японського (Cercidiphyllum japonicum Sieb. & Zucc.) клонуванням in vitro. Аналіз стану питання по клональному мікророзмноженню багряника японського показав, що найкращим для введення в культуру тканин цього виду є середовище MS з певним вмістом і концентрацією регуляторів росту та відповідним рН [1]. Найбільш близьким прототипом пропонованого способу розмноження є клонування in vitro на середовищі MS за модифікацією китайського вченого Янь Лідзє [2]. При такому способі розмноження індукція відбувалась у 98,2%, вкорінення - у 90 %; коефіцієнт намноження k становив 5,3, що є недостатнім для масового відтворення екземплярів із цінними генотипами. В основу корисної моделі поставлено задачу підвищити відсоток ініційованих і вкорінених рослин та збільшити коефіцієнт намноження, що дасть можливість прискорити терміни і підвищити ефективність продукування регенерантів. Апробацію запропонованого способу клонування проводили в лабораторії культури тканин Національного лісотехнічного університету України (м. Львів). Суть способу полягає у культивуванні багряника японського на модифікованому поживному середовищі Р24 [3] для листяних деревних порід. Попередньо відібрані з 3-річних сіянців і деконтаміновані експланти (конуси наростання з листковими зачатками, розміром 2-3 мм) асептично переносили на тверде поживне середовище Р24 без фітогормонів. Після отримання стерильних експлантів їх пасажували на модифіковане живильне середовище Р24 для ініціації органогенезу. Модифікація середовища Р24 полягала: у виключенні на етапах ініціації та намноження з його складу NH4H2PO4, який пригнічував регенерацію пагонів (диференціацію клітин) і сприяв утворенню щільного калюсу; у збільшенні концентрації амінокислоти arginin.HCl у 1,5 рази до 600 мг/л з метою покращення метаболізму регенерантів; у збільшенні кількості заліза введенням замість 8,1 мг/л FeCb 27,8 мг/л FeSC>4 × 7Н2О (за рекомендаціями Murashige Т. and Skoog F. [4]) з метою активування окисно-відновних реакцій і усунення хлорозу регенерантів. Середовище готували на агарі (0,7 %) з додаванням сахарози (3,0 %). Десятинний логарифм концентрації водневих іонів (рН) середовища перед автоклавуванням доводили до 5,7. На кожному етапі культивування у середовище включали регулятори росту 6-ВА (6бензиламінопурин), NAA (-нафтилоцтову кислоту) та IB А (-індоліл-3-масляну кислоту) у відповідних концентраціях (табл. 1). Експланти вирощувались при температурі 28 °C вдень і 24 °C вночі, вологості повітря 70-80 % і тривалості світлового періоду 16 год. Освітлення проводилось флуоресцентними лампами (ЛБ) з інтенсивністю світла вночі 2800-3000 lx. Активацію меристем зафіксовано на 7-8-му добу культивування (фіг. 1). Після 14 днів ініціації регенеранти переносили на середовище для намноження. Субкультивування проводили 4-5 разів, кожне - по 21-28 днів (фіг. 2). У кінці кожного нового субкультивування вираховували коефіцієнт намноження, що визначався як пропорція кількості експлантів з аксилярними пагонами і середньої кількості нових сегментів на такий експлант. Після цього мікроживці пасажували на середовище для ризогенезу (фіг. 3). За 12-14 днів регенеранти розміром 3-6 см, які утворили 6-12 корінців завдовжки 4-11 мм, відмивались від середовища і переносились для адаптації до ґрунтових умов у стерильний субстрат міні-теплиці лабораторії, що складався з універсальної ґрунтосуміші і агроперліту (3:1) (фіг. 4, 5). Таблиця 1 Склад модифікованого поживного середовища Р24 [Teasdale R. (1992)] Компоненти KNO3 Ca(NO3)2×2H2O K2SO4 KH2PO4 Mg(NO3)2×6H2O NH4H2PO4 Myo-inositol Thiamin.HCl Nicotinsav Концентрація, мг/л 253 661 436 408 192 144 100 0,1 0,5 Етапи Ініціація + + + + + – + + + 45 1 культивування Намноження + + + + + – + + + in vitro Вкорінення + + + + + + + + + UA 68705 U Продовження таблиці 1 1 2 0,5 400 5,8 7,44 3,38 11,5 0,6 0,0425 2,5 0,05 0,0476 42,35 27,8 8,1 Piridoxin.HCl Arginin.HCl NaCl H3BO3 MnSO4×H2O ZnSO4×7H2O KІ Na2MoO4 CuSO4×5H2O CoCl2×6H2O NiCl2×6H2O FeNaEDTA FeSO4×7H2O FeCl3 6-BA NAA IBA 5 3 + x 1,5 + + + + + + + + + + + – 0,1 мг/л 0,1 мг/л – 4 + x 1,5 + + + + + + + + + + + – 0,5 мг/л – – 5 + x, 5 + + + + + + + + + + + – – – 1,0 мг/л Дослідження показали (табл. 2), що запропонований спосіб розмноження дозволяє отримати регенеранти багряника японського за короткі терміни, підвищує відсоток ініційованих і вкорінених рослин відповідно до 99,3 та 98,6 %, збільшує коефіцієнт намноження k до 8,8, а тому є ефективнішим у порівнянні з аналогами. Таблиця 2 Регенерація багряника японського in vitro при запропонованому способі розмноження Регенерованих рослин Запропонований спосіб Прототип [4] 99,3 % 98,2 % k=8,8 k=5,3 98,6 % 90,0 % Етапи клонування Ініціація органогенезу Намноження (мультиплікація) Ризогенез (вкорінення) 10 15 20 Це дає підстави для використання запропонованого способу клонування in vitro для масового відтворення багряника японського. Джерела інформації: 1. A preliminary study on the in vitro culture of Cercidiphyllum japonicum Sieb. et Zucc. [Електронний ресурс] / Mai Miaomiao, Shi Daxing, Wang Mili, Liao Jing, Han Shan // Sichuan Agricultural University: Acta Horticulturae Sinica, 2006. - № 33 (1). - P. 186-189. - Режим доступу : http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL-YYXB200601046.htm. 2. Tissue culture and rapid propagation of Cercidiphyllum japonicum Sieb. et Zucc. (Mai Miaomiao, Shi Daxine. Wang Mili) // (Plant physiology communications). - Zhongguo, 2005 - № 6, Vol.41. - P. 801). - ISSN: 04120922. 3. Patent № Europe 92902531.0. Formulation of plant culture media and applications therefore [Текст] / R. Teasdale; International publication № WO 92/07460; Filing Date 04.11.1991; Publication Date 14.05.1992. - Queensland, Australia: Forbio Pty Ltd., 1992.-10 P. 4. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures [Текст] / Т. Murashige, F. Skoog // Physiol. PI. - Copenhagen, 1962. - № 15. - P. 493-497. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб клонування багряника японського in vitro, що включає ініціацію органогенезу, намноження (мультиплікацію) і вкорінення (ризогенез), який відрізняється тим, що у клонуванні багряника японського in vitro застосоване модифіковане тверде поживне середовище Р24 із спеціально підібраним вмістом і концентрацією компонентів: KNO3 - 253 мг/л, Ca(NO3)2×2H2O 661 мг/л, K2SO4 - 436 мг/л, КН2РО4 - 408 мг/л, Mg(NO3)2 × 6H2O - 192 мг/л, NH4H2PO4 - 144 мг/л 2 UA 68705 U 5 (тільки для ризогенезу), myo-inositol - 100 мг/л, thiamin·HCl - 0,1 мг/л, nicotinsav - 0,5 мг/л, piridoxin·HCl - 0,5 мг/л, arginin·HCl - 600 мг/л, NaCl - 5,8 мг/л, Н3ВО3 - 7,44 мг/л, MnSO4×H2O - 3,38 мг/л, ZnSO4×7H2O - 11,5 мг/л, KI - 0,6 мг/л, Na2MoO4 - 0,0425 мг/л, CuSO4×5H2O - 2,5 мг/л, СоСl2×6Н2О - 0,05 мг/л, NiCl2×6H2O - 0,0476 мг/л, FeNaEDTA - 42,35 мг/л, FeSO4×7H2O - 27,8 мг/л, agar - 7 г/л, szacharoz - 30 г/л, 6-ВА (0,1 мг/л) + NAA (0,1 мг/л) - для ініціації, 6-ВА (0,5 мг/л) - для намноження, IB A (1,0 мг/л) - для вкорінення, рН = 5,7. 3 UA 68705 U 4 UA 68705 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5