Спосіб підвищення ростової активності бактерій

Реферат: Спосіб підвищення ростової активності бактерій Bradyrhizobium japonicum включає приготування окремо чистих посівних культур Bradyrhizobium japonicum і Azospirillum brasilense та їх сумісне культивування. Посівні культури Bradyrhizobium japonicum і Azospirillum brasilense (співвідношення бактерій становить 1:1) сумісно культивують у поживному середовищі. UA 79361 U (54) СПОСІБ ПІДВИЩЕННЯ РОСТОВОЇ АКТИВНОСТІ БАКТЕРІЙ UA 79361 U UA 79361 U 5 10 15 20 25 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології, а саме до способів регулювання ростової активності мікроорганізмів. Відомий спосіб культивування бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum у напівсинтетичному поживному середовищі на основі горохового відвару [1]. Проте, для покращення формування ефективного симбіозу рослин та бульбочкових бактерій при застосуванні препаратів на їх основі необхідно підвищити ростову активність цих мікроорганізмів. В основу корисної моделі поставлена задача підвищити ростову активність бактерій Bradyrhizobium japonicum. Поставлена задача вирішується шляхом сумісного культивування бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum та асоціативних азотофіксувальних бактерій Azospirillum brasilense на спеціально підібраному середовищі такого складу, мас. %: дріжджі кормові (сухі) 0,3 глюкоза 1,0 меляса 0,5 (NH4)2SO4 0,1 KН2РО4 × 2Н2О 0,015 K2НРО4 0,015 MgSO4 × 7H2O 0,01 СаСО3 0,05 вода дистильована до 100. Спосіб підвищення ростової активності бульбочкових та асоціативних азотфіксувальних бактерій передбачає виконання наступних етапів: 1. Приготування посівної культури Bradyrhizobium japonicum [2, 3]. Бактерії Bradyrhizobium japonicum вирощували в умовах періодичного культивування на мікробіологічній качалці при 220 об./хвилину при температурі 28±2 °C протягом 72 годин у рідкому поживному середовищі наступного складу, мас. %: відвар насіння гороху 10,0 глюкоза 1,0 сахароза 0,5 (NH4)2SO4 0,1 KН2РО4 × 2Н2О 0,05 K2НРО4 0,05 MgSO4 × 7H2O 0,02 СаСО3 0,03 вода дистильована до 100. 2. Приготування посівної культури Azospirillum brasilense [4, 5]. Бактерії Azospirillum brasilense вирощували в умовах періодичного культивування на мікробіологічній качалці при 220 об./хвилину при температурі 28±2 °C протягом 48 годин у рідкому поживному середовищі такого складу, мас. %: кукурудзяний екстракт 3,0 меляса 3,0 (NH4)2SO4 0,01 KН2РО4 × 2Н2О 0,025 K2НРО4 0,025 MgSO4 × 7H2O 0,02 СаСО3 0,03 вода дистильована до 100. 3. Сумісне культивування Bradyrhizobium japonicum і Azospirillum brasilense. Бактерії вирощували разом в умовах періодичного культивування на мікробіологічній качалці при 220 об./хвилину за температури 28±2 °C протягом 72 годин у рідкому поживному середовищі такого складу, мас. %: дріжджі кормові (сухі) 0,3 глюкоза 1,0 меляса 0,5 ((NH4)2SO4 0,1 KН2РО4 × 2Н2О 0,015 K2НРО4 0,015 MgSO4 × 7H2O 0,01 СаСО3 0,05 1 UA 79361 U 5 10 15 20 вода дистильована до 100. Посівний матеріал обох штамів бактерій вносять у поживне середовище у співвідношенні 1:1 (початкова концентрація клітин становить 0,272 млрд./см). У результаті сумісного культивування Bradyrhizobium japonicum І Azospirillum brasilense чисельність бульбочкових бактерій у змішаній культурі перевищувала титр цих мікроорганізмів у чистій культурі в середньому на 52 %. Суть корисної моделі пояснюється такими прикладами. Приклад 1 Одним із показників сумісності мікроорганізмів є симбіотичний індекс (S.I.). При S.I.=1 вважається, що взаємодія між популяціями бактерій відсутня, при S.I>1 відбувається стимуляція однієї культури іншою. Для визначення показників ростової активності В. japonicum і A. brasilense у чистих та змішаних культурах, до поживних середовищ із бактеріями одного виду вносили різну кількість інокулюму бактерій Іншого виду. Так, при мінімальній (min) концентрації бактеріальних клітин, їх 3 3 початковий титр становив 0,082 млрд./см , середній (mid) титр становив 0,272 млрд./см , а при максимальній (max) же концентрації мікробних клітин, їх початкова кількість у поживному 3 середовищі становила 0,680 млрд./см . Встановлено, що для бактерій В. japonicum M-8 симбіотичний індекс перевищував 1 в усіх варіантах, що свідчить про доцільність їх культивування у змішаних культурах (табл. 1). Проте, найвищий показник (2,90) було отримано за культивування бульбочкових бактерій у співвідношенні з азоспірилами 1:1 при внесенні їх у середній концентрації. У A. brasilense № 26 симбіотичний індекс був найвищим за їх культивування з середньою кількістю ризобій у співвідношенні 3:1. Таблиця 1 Симбіотичний індекс В. japonicum M-8 і A. brasilense № 26 за їх культивування в чистих і змішаних культурах Концентрація клітин Співвідношення кількості В. В. japonicum M-8 japonicum M-8 до A. brasilense № 26 1:1 min 1:3 1:8 3:1 mid 1:1 1:2,5 8:1 max 2,5:1 1:1 25 Симбіотичний індекс В. japonicum M-8 A. brasilense № 26 2,0 1,57 2,67 1,51 1,62 0,81 2,20 1,97 2,90 1,89 2,20 1,27 2,21 1,89 1,79 1,11 1,57 0,86 Аналогічні дані отримано за культивування В. japonicum M-8 із A. brasilense 410 (табл. 2). В усіх варіантах симбіотичний індекс був вище 1, як для В. japonicum M-8, так і для A. brasilense 410, що свідчить про взаємний стимулювальний вплив досліджуваних штамів бактерій один на одного. Таблиця 2 Симбіотичний індекс B. japonicum М-8 і A. brasilense 410 за їх культивування в чистих і змішаних культурах Концентрація клітин Співвідношення кількості В. В. japonicum М-8 japonicum М-8 до A. brasilense 410 1:1 min 1:3 1:8 3:1 mid 1:1 1:2,5 30 2 Симбіотичний індекс В. japonicum М-8 A. brasilense 410 3,77 3,44 3,34 3,32 2,99 2,78 3,56 3,64 3,73 4,16 2,66 2,76 UA 79361 U Продовження таблиці 2 Симбіотичний індекс B. japonicum М-8 і A. brasilense 410 за їх культивування в чистих і змішаних культурах Концентрація клітин Співвідношення кількості В. В. japonicum М-8 japonicum М-8 до A. brasilense 410 8:1 max 2,5:1 1:1 Симбіотичний індекс В. japonicum М-8 A. brasilense 410 4,19 3,32 4,22 3,66 3,95 3,18 Для В. japonicum 6346 симбіотичний індекс перевищував 1 в усіх варіантах, що свідчить про доцільність їх культивування із A. brasilense № 26 (табл. 3). 5 Таблиця 3 Симбіотичний індекс В. japonicum 6346 і A. brasilense № 26 за їх культивування в чистих і змішаних культурах Симбіотичний індекс Концентрація клітин Співвідношення кількості В. В. japonicum 634б japonicum 6346 до A. brasilense № 26 В. japonicum 634б A. brasilense № 26 1:1 3,57 1,90 min 1:3 3,06 1,88 1:8 3,02 1,40 3:1 2,28 2,30 mid 1:1 3,79 2,07 1:2,5 3,47 2,19 8:1 1,64 3,96 max 2,5:1 1,66 3,39 1:1 2,00 3,19 Аналогічні дані отримано за культивування В. japonicum 634б із A. brasilense 410 (табл. 4). Таблиця 4 Симбіотичний індекс В. japonicum 6346 і A brasilense 410 за їх культивування в чистих і змішаних культурах Концентрація клітин Співвідношення кількості В. В. japonicum 634б japonicum 6346 до A. brasilense 410 1:1 min 1:3 1:8 3:1 mid 1:1 1:2,5 8:1 max 2,5:1 1:1 10 15 Симбіотичний індекс В. japonicum 634б A. brasilense 410 2,89 1,83 3,35 1,52 3,40 1,58 3,90 2,00 4,83 1,97 4,01 1,87 3,93 2,14 3,24 1,74 3,77 1,82 Приклад 2 Бактерії Bradyrhizobium japonicum і Azospirillum brasilense вирощували при температурі 28±2 °C у рідкому середовищі для сумісного культивування протягом 72 годин на підвісних мікробіологічних качалках. При культивуванні бактерій у чистих культурах початкова концентрація клітин становила 0,272 млрд./мл. При сумісному культивуванні посівний матеріал обох штамів бактерій вносили в поживне середовище у співвідношенні 1:1 (початкова концентрація клітин становила 0,272 млрд./мл). 3 UA 79361 U Встановлено, що при сумісному культивуванні Bradyrhizobium japonicum із Azospirillum brasilense ростова активність бульбочкових бактерій збільшується в середньому у 1,5 рази (табл. 5, 6). Таблиця 5 Ростова активність Bradyrhizobium japonicum M-8 Варіант В. japonicum M-8 (культивовані у чистій культурі) В. japonicum M-8 культивовані сумісно з A. brasilense № 26 В. japonicum M-8 культивовані сумісно з A. brasilense 410 Чисельність мікроорганізмів, млрд./мл 2,7±0,23 4,1±0,27 3,9±0,20 5 Таблиця 6 Ростова активність Bradyrhizobium japonicum 634б Варіант В. japonicum 6346 (культивовані у чистій культурі) В. japonicum 6346 культивовані сумісно з A. brasilense № 26 В. japonicum 6346 культивовані сумісно з A. brasilense 410 10 15 20 25 Чисельність мікроорганізмів, млрд./мл 1,9±0,15 2,9±0,15 2,7±0,20 Джерела інформації: 1. Методические рекомендации для курсов повышения квалификации научных сотрудников по сельскохозяйственной микробиологии. Методы исследования клубеньковых бактерий / [ред. Л. М. Доросинский]. - Л.: 1981. - 47 с. 2. Пат. 39545 Україна, МПК (2006) 7 С 12 N 1/20, С 05 F 1/08. Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum M-8 KIRCHNER, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує урожайність сої / Толкачов М. 3., Патика В. П., Каменева І.О., Грітчіна Л.Ю.; заявник і патентовласник Південний філіал Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук. - 2000105680, заявл. 06.10.2000; опубл. 15.06.2001, Бюл. № 5. - 5 с. 5 3. А. с. 1034358 СССР, МПК С05F 11/08, С 12N1/20. Штамм клубеньковых бактерий сои 634 б, используемых для изготовления бактериального препарата нитрагина под сою / Новикова А. Т., Берестецкий О.А., Абхазава А.А., Георгадзе Л.И.; заявитель Всесоюзный научноисследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии. - № 3374602; заявл. 04.01.1982; опубл. 07.04.1984. 4. Пат. 40542 Україна, МПК (2006) С12N 1/20, С05F 11/08. Штам бактерій Azospirillum brasilense для виробництва бактеріального добрива під гречку / Лохова Валентина Іванівна; Надкернична Олена Володимирівна; заявник і патентовласник Український науково-дослідний інститут сількогосподарської мікробіології УААН.-4323845/SU, заявл. 02.11.1987. 5. Волкогон В. В. Мікробіологічні аспекти оптимізації азотного удобрення сільськогосподарських культур / В. В. Волкогон. - К.: Аграрна наука, 2007. - 144 с. 4 UA 79361 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб підвищення ростової активності бактерій Bradyrhizobium japonicum, що включає приготування окремо чистих посівних культур Bradyrhizobium japonicum і Azospirillum brasilense та їх сумісне культивування, який відрізняється тим, що посівні культури Bradyrhizobium japonicum і Azospirillum brasilense (співвідношення бактерій становить 1:1) сумісно культивують у поживному середовищі наступного складу, мас. %: дріжджі кормові (сухі) 0,3 глюкоза 1,0 меляса 0,5 (NH4)2SO4 0,1 KН2РО4 × 2Н2О 0,015 K2НРО4 0,015 MgSO4 × 7H2O 0,01 СаСО3 0,05 вода дистильована до 100. 10 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5