Спосіб оцінки ступеня ризику розвитку гепатоцелюлярної недостатності в експериментальних тварин

Реферат: Спосіб оцінки ступеня ризику розвитку гепатоцелюлярної недостатності включає визначення сироваткового рівня біохімічного показника, визначення рівня лептину (Ле), визначення рівня адипонектину (Ад), встановлення співвідношення рівня лептину до рівня адепонектину та розрахунок індексу Ле/Ад. При значенні індексу Ле/Ад менше 2 визначають відсутність ризику (в печінці немає ознак гепатоцелюлярної реорганізації та нормальна стрес-резистентність). При значенні індексу Ле/Ад в межах 2-3 - низький ризик (незначна гепатоцелюлярна реорганізація та незначно знижена стрес-резистентність). При значенні індексу 3-4 - помірний ризик (помірно виражена гепатоцелюлярна реорганізація та помірно знижена стрес-резистентність печінки). При значенні індексу Ле/Ад більше 4 - високий ризик (виражена гепатоцелюлярна реорганізація з явищами запалення та значно знижена стрес-резистентність печінки). UA 81958 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ СТУПЕНЯ РИЗИКУ РОЗВИТКУ ГЕПАТОЦЕЛЮЛЯРНОЇ НЕДОСТАТНОСТІ В ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ТВАРИН UA 81958 U UA 81958 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, зокрема способу оцінки функціонального стану печінки в експериментальних тварин, та може бути використана у скринінгових дослідженнях для оцінки факторів ризику розвитку гепатоцелюлярної недостатності та її визначення для прогнозування появи або розвитку метаболічних порушень печінки. Відомо, що печінка - це орган-мішень, який бере активну участь у процесах розвитку і прогресуванні метаболічних порушень та маніфестує так званою неалкогольною жировою хворобою печінки, що причинно-наслідково пов'язана з ожирінням, цукровим діабетом 2-го типу та інсулінорезистентністю [1], і займає перше рейтингове місце серед захворювань печінки як в дорослих, так і в дітей, що пов'язують із різким збільшенням ожиріння в популяції [2]. Поширеність такої патології печінки оцінюється у 19-20 %, а приблизно у 20 % пацієнтів із неалкогольною жировою хворобою печінки розвивається неалкогольний стеатогепатит, що у 10 % випадків трансформується в цироз печінки [3]. Згідно із найновішими даними, ключова роль у розвитку неалкогольної жирової хвороби печінки відводиться цитотоксичним ефектам вісцеральної жирової тканини, що синтезує прозапальні й гормонально активні медіатори - адипокіни, які є пусковим механізмом її розвитку. Найістотнішими для печінки серед адипокінів є лептин (Ле) і адипонектин (Ад). Так, наприклад, за результатами досліджень in vitro та in vivo встановлено наявність тісного зв'язку між рівнем лептину сироватки крові та розвитком фіброзу печінки, а також виявлено протективний ефект адипонектину при стеатогепатиті [4]. Сьогодні доведено, що гіперлептинемія стимулює прогресування неалкогольної жирової хвороби печінки, зокрема фіброз, тоді як, у свою чергу, адипонектин може запобігати ураженню печінки, пригнічуючи активність зіркових клітин [5]. Оскільки справжні адипокіни виявляють антагоністичний вплив на процеси запалення і фіброзування печінки, відповідно, їх співвідношення у сироватці крові хворих з метаболічними порушеннями чутливіший діагностичний маркер розвитку дисфункції печінки, ніж визначення їх рівня окремо [6]. Про стан печінки судять за багатьма показниками. Відомий спосіб оцінки функціонального стану печінки, що включає визначення білірубіну в сироватці крові пацієнта [7], лужної фосфатази і гамма-глютаміл-транспептидази [8], однак ці показники свідчать лише про наявність холестазу і синдром жовтяниці. Відомі також способи оцінки стану печінки, що включають визначення протеїнограми, протромбінового індексу в сироватці крові пацієнта [9] тощо. Проте жоден з наведених показників не дає змогу оцінити структурно-функціональний стан печінки за умов метаболічних порушень, оскільки не охоплює патогенетичні механізми, що призводять до розвитку гепатоцелюлярної недостатності. Для оцінки структурного стану печінки проводять інструментальні дослідження, наприклад, ультрасонографію та комп'ютерну томографію печінки, які, незважаючи на високу інформативність, мають ряд недоліків: високий кошт обладнання, залученого в дослідження, та неможливість скринінгових досліджень. Найінформативнішим методом дослідження печінки на сьогодні є черезшкірна пункційна біопсія печінки [10], що виконується під ультрасонографічним контролем, проте це інвазивний метод, який може призвести до розвитку ускладнень з приводу техніки виконання. Найближчим аналогом є спосіб оцінки функціонального стану печінки шляхом визначення вмісту в крові амінотрансфераз [11], які свідчать про альтеративні зміни гепатоцитів, проте, при достатній інформативності цього показника, він тільки констатує деструкцію гепатоцитів і не дає інформації про їх структурно-метаболічний статус та не враховує патогенетичних механізмів, що лежать в основі виникнення структурно-функціональних порушень печінки. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити доступний, інформативний, неінвазивний спосіб оцінки ступеня ризику розвитку гепатоцелюлярної недостатності та структурно-функціональних порушень печінки в експериментальних тварин для визначення груп ризику розвитку дисфункції печінки в аспекті неалкогольної жирової хвороби печінки. Поставлена задача вирішується тим, що у способі оцінки ступеня ризику розвитку гепатоцелюлярної недостатності, який включає визначення сироваткового рівня біохімічного показника, згідно з корисною моделлю, у сироватці крові експериментальних тварин визначають рівень лептину і адипонектину, встановлюють їх співвідношення, за яким розраховують індекс Ле/Ад, і при значенні індексу Ле/Ад менше 2 визначають відсутність ризику (в печінці немає ознак гепатоцелюлярної реорганізації та нормальна стрес-резистентність), при значенні індексу Ле/Ад в межах 2-3 - низький ризик (незначна гепатоцелюлярна реорганізація та незначно знижена стрес-резистентність), при значенні індексу 3-4 - помірний ризик (помірно виражена гепатоцелюлярна реорганізація та помірно знижена стрес-резистентність печінки), при значенні 1 UA 81958 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 індексу Ле/Ад більше 4 - високий ризик (виражена гепатоцелюлярна реорганізація з явищами запалення та значно знижена стрес-резистентність печінки). Враховуючи існуючі виняткові труднощі в діагностиці структурно-метаболічних порушень печінки, запропоновано ефективний неінвазивний спосіб оцінки ступеня ризику гепатоцелюлярної недостатності та структурно-функціональних порушень печінки в експериментальних тварин, при застосуванні якого провідне місце належить чинникам і процесам, що відіграють першорядну роль у виникненні гепатоцелюлярної реорганізації та зниженні гепатоцелюлярної резистентності як передумов для розвитку неалкогольної хвороби печінки. Запропонований спосіб здійснюють таким чином. У сироватці крові експериментальних тварин визначають рівень лептину і адипонектину. Шляхом встановлення співвідношення їх сироваткових рівнів визначають індекс Ле/Ад. При значенні індексу Ле/Ад менше 2 - відсутність ризику - в печінці немає ознак гепатоцелюлярної реорганізації та нормальна стрес-резистентність; при значенні індексу Ле/Ад в межах 2-3 низький ризик - незначна гепатоцелюлярна реорганізація та незначно знижена стресрезистентність; при значенні індексу 3-4 - помірний ризик - помірно виражена гепатоцелюлярна реорганізація та помірно знижена стрес-резистентність печінки; при значенні індексу Ле/Ад більше 4 - високий ризик - виражена гепатоцелюлярна реорганізація з явищами запалення та значно знижена стрес-резистентність печінки. Серійні модельні експериментальні дослідження проведено відповідно до положень та дозволу університетського комітету з біоетики (№ 4 від 11.04.2011 р.) та Міжнародних принципів "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментів та в інших наукових цілях" (Страсбург, 1986) які утримувались згідно з правилами "належної лабораторної практики" (GLP). В експеримент залучено білих нелінійних щурів самців (n=92, m=211±24 г) групи контролю (інтактні, 1 група) і нащадків матерів, яким під час вагітності індукували "соціально-емоційний" стрес за Pratt N.C. and all, 1989 і метаболічний стрес за такими моделями висококалорійного харчування: з домінуванням вуглеводів - за В.В. Козаром та ін., 2009 (2 група), жирів - за A. Lintermans, 2009 (3 група); 4 група - за умов бінарної дії означених екстремальних чинників. Для оцінки гепатоцелюлярної стрес-резистентності 3-місячним щурам індукували неерозивні пошкодження печінки за широковживаною моделлю водно-іммобілізаційного стресу (ВІС) за Takagi, 1964 та застосовували моделювання природної цитопротекції завчасним введенням неселективного блокатора циклооксигенази (ЦОГ) І та II, розділяючи кожну групу тварин на підгрупи: підгрупа А - інтактні; підгрупа В - ВІС з введенням плацебо (1,0 мл 0,9 % розчину NaCl) внутрішньочеревно; підгрупа С - комбінація ВІС з попереднім за 60 хвилин одноразовим внутрішньочеревним введенням індометацину ("Фармацевтична компанія "Здоров'я", м. Харків, Україна) у дозі 5 мг/кг, попередньо застосовуючи 24-годинну харчову депривацію з необмеженим доступом до води. Тварин виводили з експерименту під загальним знечуленням і здійснювали забір печінки для гістоморфологічного аналізу та крові - для визначення вмісту лептину і адипонектину у сироватці. Рівні лептину і адипонектину визначали за допомогою твердофазного методу імуноферментного аналізу (ELISA) та відповідних діагностичних наборів Leptin (rat); ("Enzo Life Science", Великобританія) та Adiponectin (rat); ("Adipogen", Швейцарія) та обчислювали їх співвідношення - індекс Ле/Ад. Розрахунки для зручності проводили на абсолютних величинах. Для гістоморфологічного дослідження тканину печінки фіксували у 10 % забуференому розчині формаліну, після чого піддавали рутинній обробці із введенням матеріалу у парафін та виготовленням зрізів товщиною 4-5 мкм. Основні гістологічні зміни досліджували при забарвленні гематоксилін-еозином. Для достовірної оцінки виявлених паренхіматозних та стромально-судинних змін печінки розроблено відповідні візуально-аналогові напівкількісні шкали з ранжуванням від 0 до 3 балів. Візуально-аналогова шкала для оцінки паренхіматозних змін: 0 - без патологічних змін; 1 - паренхіматозні клітини збережені, виявляються лише окремі гепатоцити із просвітленням цитоплазми; 2 - гепатоцити з нерівномірно забарвленою цитоплазмою за рахунок відмінностей у вмісті глікогену, дискомплексація балок; 3 - виражена дискомплексація балок за рахунок розповсюджених мікро-макровакуольних змін гепатоцитів, поодинокі клітини з ознаками некрозу, гіперемія центральної вени. Візуально-аналогова шкала для оцінки судинно-стромальних змін: 0 - в поодиноких гепатоцитах виявлялись вакуольні зміни, нерівномірний розподіл глікогену у цитоплазмі клітин; 1 - гіперемія центральної вени та незначне розширення центролобулярних синусоїдів; 2 - виражена дилятація та гіперемія перипортальних синусоїдів; 3 - гепатоцити з просвітленням цитоплазми за рахунок нерівномірного нагромадження глікогену; нерівномірна дилятація синусоїдів; портальний тракт з 2 UA 81958 U 5 10 15 помірно вираженою лейкоцитарною інфільтрацією. На основі шкал проводили розрахунок гістологічних індексів в балах: гістологічний індекс згідно із візуально-аналоговоою шкалою паренхіматозних змін (ГІ ВАШПЗ) та гістологічний індекс згідно із візуально-аналоговою шкалою судинно-стромальних змін (ГІ ВАШССЗ). Відеоаналіз мікропрепаратів печінки виконано на мікроскопі Leica DM 750/4 (Німеччина) з використанням ліцензованої системи відеозапису Leica Application Suit Version 3.8 (Німеччина). У контрольній 1А підгрупі концентрація ЛЕ становила 2,08±0,05 пкг/мл, АД - 1,71±0,13 мкг/мл та індекс ЛЕ/АД - 1,22±0,11, що потрактовано нами як вихідний базальний рівень, що відповідав "умовній нормі" (100 %). Абсолютні значення рівнів адипокінів у підгрупах інтактних експериментальних тварин із пренатальним стресом в анамнезі представлені в таблиці та віддзеркалюють збільшення показників лептину у порівнянні з контрольною групою: у 2А підгрупі - на 64 %; у 3А підгрупі - на 60 %; в 4А підгрупі - на 79 %. У той час як рівень адипонектину був нижчим у порівнянні з 1А підгрупою відповідно: у 2А підгрупі - на 36 %, у 3А підгрупі - на 32 %, в 4А підгрупі - на 41 %. Подібну тенденцію спостерігали також у підгрупах з постнатальним стресом в анамнезі. При порівнянні значень індексу Ле/Ад в інтактних пренатально стресованих тварин із 1А підгрупою отримано такі дані: у 2А підгрупі цей показник збільшився на 158 %, в 3А підгрупі - на 138 %, а в 4А підгрупі - на 204 %. Подібну тенденцію зареєстровано і у щурів із постнатальним стресом, що також представлено у таблиці. Таблиця Вміст лептину, адипонектину та індекс ЛЕ/АД у сироватці крові експериментальних тварин (М±S) Група 1А 1В 1С 2А 2В 2С 3А 3B 3C 4А 4В 4С Постнатнатальний стрес інтактні ВІС+плацебо ВІС+ЦОГ інтактні ВІС+плацебо ВІС+ЦОГ інтактні ВІС+плацебо ВІС+ЦОГ інтактні ВІС+плацебо ВІС+ЦОГ ЛЕ, нг/мл 2,08±0,05* 3,31±0,15* 3,55±0,02* 3,41±0,01* 3,94±0,08* 4,12±0,06* 3,33±0,20* 3,82±0,04* 4,08±0,03* 3,73±0,04* 4,42±0,028 4,62±0,06* АД, мг/мл 1,71±0,13* 1,56±0,11* 1,48±0,07* 1,09±0,07* 0,90±0,08* 0,69±0,06* 1,16±0,15* 1,00±0,12* 0,93±0,10* 1,01±0,11* 0,74±0,09* 0,54±0,09* ЛЕ/АД 1,22±0,11* 2,13±0,19* 2,41±0,11* 3,15±0,19* 4,40±0,37* 6,04±0,62* 2,91±0,48* 3,87±0,49* 4,46±0,49* 3,71±0,39* 6,07±0,74* 8,82±1,45* Примітка: *- р