Протимікробна композиція для інгібування біоплівкоутворення pseudomonas aeruginosa

Реферат: Протимікробна композиція для інгібування біоплівкоутворення Pseudomonas aeruginosa містить антимікробний агент - катіонний поліпептид поліміксин. Вона містить додатково антимікробний агент карбопенем іміпенем. UA 82743 U (12) UA 82743 U UA 82743 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до засобів з антибактеріальною активністю і може бути використана як антисиньогнійна композиція з синергетичною дією, що інгібує біоплівкоутворення Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Грамнегативна бактерія P. aeruginosa характеризується величезними адаптаційними можливостями, екологічною пристосованістю і, як наслідок, широким розповсюдженням. В останній час P. aeruginosa привертає увагу як один з основних збудників нозокоміальних інфекцій, які характеризуються тяжким станом хворих, приводять до тяжких ускладнень зі смертельними випадками, приносять значні економічні збитки. Клінічно важливою особливістю вказаних бактерій є висока частота резистентності до різноманітних класів протимікробних засобів. В останнє десятиріччя процент пан-антибіотико-резистентних штамів швидко зростає [1]. Іншою не менш важливою особливістю штамів P. aeruginosa є надзвичайно висока здатність до формування біоплівки, структура та фізіологічні властивості якої забезпечують підвищену стійкість до протимікробних препаратів та допомагають подолати захисні сили макроорганізму при інфекції. Чутливість бактерій у планктонній формі та у формі біоплівки значно відрізняється - мінімальні інгібуючі концентрації антимікробних агентів зростають у 100-1000 разів, у результаті клітини P. aeruginosa стають практично непроникними для антибіотиків у терапевтичних концентраціях [2, 3]. Тобто, навіть адекватна антибіотикотерапія не завжди здатна зупинити інфекцію на етапі формування біоплівки, тому розробка ефективних засобів, що здатні блокувати цей процес є надзвичайно актуальною. У відсутності нових ефективних препаратів стратегія антисиньогнійної терапії базується сьогодні на застосуванні катіонних поліпептидів поліміксинів [4, 5]. Більшість грамнегативних бактерій (включаючи P. aeruginosa) є чутливими до поліміксинів, а формування резистентності до них відбувається повільно і спостерігається значно рідше у порівнянні з іншими антибіотиками [6]. Оскільки, з огляду на можливу нефротоксичність, просте збільшення дози поліміксинів не є способом оптимізації їх активності проти P. aeruginosa у формі біоплівки, великі потенційні можливості максимізувати ефективність поліміксинів при мінімізації небезпеки появи резистентності до них може мати комбінована терапія з іншими антибіотиками [7]. При цьому, як відомо, запобігання утворенню біоплівки потребує менших концентрацій антибіотика, ніж знищення уже утвореної біоплівки [8]. Застосування антибіотика, який у сублетальних концентраціях руйнує зовнішню мембрану грамнегативної бактерії, в комбінації з іншим антибіотиком, який через резистентність сам по собі не ефективний, розширює терапевтичні можливості (і тим самим підвищує терапевтичну ефективність) антибіотиків, що застосовуються. Відома антисептична композиція "Горостен" [9], що включає як активну речовину декаметоксин при наступному співвідношенні компонентів (в/о % %): декаметоксин 0,025-0,25 спирт етиловий 95 % 15,0-20,0 гліцерин 5,0-10,0 розчин вітралю спиртовий 1 % 0,25-0,5 вода очищена решта до 100. Як і в запропонованій корисній моделі використовується композиція протимікробних засобів, що має антисиньогнійну дію. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є обмежені показання для використання препарату, а саме застосування лише для профілактики та лікування інфекційних уражень шкіри. При цьому використання високих концентрації декаметоксину (31,2-83,3 мкг/мл) для досягнення бактеріостатичного/бактерицидного ефекту проти тест-штаму P. aeruginosa та відсутні дані щодо впливу композиції на процес біоплівкоутворення бактерій обмежують використання засобу. Відомий спосіб запобігання утворенню біоплівки P. aeruginosa, що включає застосування заряджених поліамінних сполук, зокрема позитивно заряджених поліпептидів (поліаргініну, полілізину та полігістидину) [10]. Ефективне запобігання утворенню біоплівки P. aeruginosa здійснювали додаванням до культури P. aeruginosa катіонного поліпептиду поліаргініну з молекулярною масою приблизно 11600 дальтон в концентрації 5 і 10 мкМ (58 і 116 мкг/мл, відповідно). Як і в запропонованій корисній моделі, для запобігання утворенню біоплівки P. aeruginosa використовували катіонний поліпептид, який також мав бактерицидну дію. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є висока концентрація катіонного поліпептиду, що підвищує ризик виникнення побічних ефектів та ускладнень та можливість розвитку резистентності бактерій до монопрепарату. 1 UA 82743 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відомий спосіб запобігання утворенню біоплівки P. aeruginosa, що включає застосування композицій у складі тіол-специфічного реагенту та катіонного поліпептиду [11]. Зниження формування біоплівки P. aeruginosa здійснювали додаванням до культури P. aeruginosa синергетичної антимікробної композиції у складі тіол-специфічного реагенту у концентрації 12.5200 мкг/мл у диметилсульфоксиді (або у метанолі, ацетоні або ацетонітрилі) та катіонного поліпептиду полілізину у концентрації 12,5200 мкг/мл в воді. Як і в запропонованій корисній моделі, для зниження формування біоплівки P. aeruginosa використовували антимікробну композицію, де однією із складових був катіонний поліпептид, який у цьому випадку мав незначний вплив на життєздатність бактеріальних клітин. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є використання як розчинника тіол-специфічного реагенту диметилсульфоксиду (або метанолу, ацетону або ацетонітрилу), що унеможливлює застосування композиції як лікувального препарату для внутрішнього застосування. Прототипом вибраний засіб інгібування утворення і росту біоплівки P. aeruginosa, що включає застосування синергетичної комбінації фіто-фенольної сполуки та антимікробного агенту - катіонного поліпептиду поліміксину [12]. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому засобі для інгібування утворення біоплівки застосовують комбінацію засобів, одним з яких є антибіотик катіонний поліпептид поліміксин. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є обмеження спектра антисиньогнійної дії композиції одним протимікробним засобом та неможливість зниження мінімальних інгібуючих концентрацій (МІК) по відношенню до тест-штамів P. aeruginosa. В основу корисної моделі поставлена задача створення протимікробної композиції, що інгібує біоплівкоутворення P. aeruginosa. Технічний результат, який може бути отриманий при використанні запропонованої корисної моделі, полягає у розширенні терапевтичних можливостей, зниженні терапевтичної дози (і тим самим підвищенні терапевтичної ефективності) засобу. Поставлена задача вирішується тим, що протимікробна композиція для інгібування біоплівкоутворення Pseudomonas aeruginosa, яка містить антимікробний агент - катіонний поліпептид поліміксин, додатково містить антимікробний агент карбопенем іміпенем при наступному співвідношенні інгредієнтів (мас. частин): катіонний поліпептид поліміксин 1 карбопенем іміпенем 8-16. Запропонована корисна модель відрізняється від прототипу тим, що композиція містить додатково антимікробний агент іміпенем при наступному співвідношенні інгредієнтів (масових частин): катіонний поліпептид поліміксин 1 карбопенем іміпенем 8-16. Поставлена задача вирішується тим, що в композиції використана двокомпонентна комбінація протимікробних засобів з різними та специфічно протилежними механізмами дії на P. aeruginosa. У результаті використання двох відомих засобів одержано препарат з синергідною протимікробною активністю, яка перевищує протимікробну дію у порівнянні із засобомпрототипом. Згідно з представленою корисною моделлю запропонована композиція, яка включає суміш представника карбопенемів, які за природною протипсевдомонадною активністю є одними з найбільш ефективних β-лактамних антибіотиків, та одного з представників катіонних поліпептидів. Синергетична комбінація, яка запобігає утворенню біоплівки P. aeruginosa, складається одночасно з двох протимікробних засобів, а саме β-лактамного антибіотика карбопенему іміпенему (Imipenem) - N-формімідоїлтієнаміцин (або (5S, 6R)-3-[[2-(формімідоїламіноетил)тіо]6-[R]-1-гідроксіетил]-7-оксо-1-азабіцикло[3.2.0]-гепт-2-ен-2-карбонова кислота) у мінімальних інгібуючих концентраціях та поліміксину В сульфату або поліміксину Μ сульфату, взятих у субінгібуючих концентраціях. Головний механізм стійкості P. aeruginosa до іміпенему пов'язаний з порушенням проникності мікробної клітини для антибіотика внаслідок втрати поринового каналу OprD у результаті мутацій. На фоні дії іміпенему досить швидко відбувається селекція таких мутантів, бактерії розмножуються та досягають концентрацій, при яких формується біоплівка. У результаті значення МІК іміпенему зростають, що супроводжується клінічною неефективністю лікування [1]. Механізм дії представників катіонних поліпептидів пов'язаний з порушенням цілісності зовнішньої мембрани бактерій за типом дії поверхнево активних речовин, тобто шлях для надходження інших протимікробних речовин, зокрема, іміпенему відкритий. Визначені субінгібуючі концентрації катіонних поліпептидів у складі композиції, що заявляється, є 2 UA 82743 U 5 10 15 20 ефективні для інгібування біоплівкоутворення P.aeruginosa та проявляють синергідний протимікробний ефект з іміпенемом. Композиція створюється таким чином. В основу вноситься розчин іміпенему у мінімальній інгібуючій для штамів P. aeruginosa концентрації (2-8 мкг/мл) та розчин катіонного поліпептиду у співвідношенні до іміпенему 1:8-1:16 (концентрація поліміксину субінгібуюча і становить 0,5-1,0 мкг/мл). Суттєвими ознаками корисної моделі слід вважати вибір препарату іміпенему як активного компонента, вибір співвідношення діючих речовин та кількісний склад композиції. Заявлена субінгібуюча концентрація поліміксинів від 0,5 до 1,0 мкг/мл є найбільш оптимальною, оскільки вміст поліміксинів менше 0,5 мкг/мл не забезпечує інгібування біоплівкоутворення штамів P. aeruginosa, а вміст більше 1,0 мкг/мл знижує синергідний протимікробний ефект та підвищує ризик виникнення побічних ефектів при застосуванні композиції. Приклад 1 Протимікробну активність антисиньогнійних препаратів та їх комбінацій з поліміксинами вивчали на референтному штамі P. aeruginosa АТСС 27853 та 33 циркулюючих полірезистентних штамах P. aeruginosa методом послідовних серійних розведень у рідкому поживному середовищі. Ефект комбінацій оцінювали шляхом визначення індексу FIC (fractional inhibitory concentration) як суму відношень МІК кожної сполуки у комбінації до МІК сполук при використанні окремо. При FIC0,5 ефект розцінювали як виражений синергідний, при FIC0,9 синергідний, при FIC=1,0 - адитивний, при FIO1,0 - антагоністичний. Результати досліджень наведені в таблиці 1. Протимікробна композиція для інгібування біоплівкоутворення Pseudomonas aeruginosa Таблиця 1 Комбінований ефект дії протимікробних препаратів на штами P.aeruginosa Значення індексу FIC Μ Фторхінолони 1,0±0,1 Аміноглікозиди 0,96±0,2 Цефалоспорини поколінь III-IV 1,0±0,0 Меропенем 0,94±0,4 Іміпенем 0,75±0,2 Протисиньогнійні препарати 25 30 35 у комбінації з поліміксинами (М±m) В 1,0±0,0 0,99±0,01 1,0±0,0 0,92±0,15 0,6±0,1 Порівняльне вивчення ефективності заявленої композиції стосовно штамів P. aeruginosa показало її синергідну активність перед іншими комбінаціями антисиньогнійних препаратів з поліміксинами. Приклад 2 Заявлена композиція створена шляхом введення розчину поліміксину В сульфату (виробник SIGMA-ALORICH, Швейцарія) у тверде поживне середовище (агар Мюллера-Хінтона) методом послідовних серійних розведень. На поверхню агару інокулювали суспензії тест-штамів P. aeruginosa у концентрації 0,5 одиниць McFarland. Після підсушування на поверхню агару наносили стандартизовані комерційні диски з іміпенемом. Контролями слугували чашки з агаром Мюллера-Хінтона без протимікробних засобів, засіяні тест-штамами (контроль культури); засіяні чашки з агаром Мюллера-Хінтона без поліміксину з внесеними дисками з іміпенемом та чашки з агаром Мюллера-Хінтона з поліміксином, засіяні тест-штамами без нанесення дисків з іміпенемом. Після інкубації проведено облік результатів шляхом вимірювання зон пригнічення росту навколо дисків та наявністю росту тест-штамів на контрольних чашках без дисків з іміпенемом. Дослідження проведено у троєкратних повтореннях. Результати представлені у таблиці 2. 40 Таблиця 2 Комбінований ефект дії іміпенему та поліміксину В сульфату на тест-штами P. aeruginosa Препарат або протимікробна композиція Іміпенем (контроль) Діаметри зон пригнічення росту тест-штамів P. aeruginosa у мм (М±m) P. aeruginosa ATCC P. aeruginosa № 13 P. aeruginosa № 46 27853 22±1,0 14±0,5 28±1,0 3 UA 82743 U Продовження таблиці 2 Іміпенем + поліміксин В сульфат 2 мгк/мл Іміпенем + поліміксин В сульфат 1 мгк/мл Іміпенем + поліміксин В сульфат 0,5 мгк/мл Іміпенем + поліміксин В сульфат 0,25 мгк/мл Поліміксин В сульфат 2 мгк/мл 24±2,0 17±1,0 30±2,0* 35±3,0* 33±2,0* 37±1,5* 40±2,0* 36±3,0* 40±2,0* 34±2,0* 30±2,0* 33±1,0 0 0 0 Примітка - * достовірна різниця між контролем (р